KR101062770B1

KR101062770B1 - ＦａｂＫ 저해활성을 갖는 신규한 항폐렴 화합물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 항폐렴용 약학 조성물

Info

Publication number: KR101062770B1
Application number: KR1020080122798A
Authority: KR
Inventors: 김원곤; 정창길; 손미진
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2008-12-04
Filing date: 2008-12-04
Publication date: 2011-09-07
Also published as: KR20100064270A

Abstract

본 발명은 신규한 항균 화합물에 관한 것으로, 구체적으로는 화학식 Ⅰ로 표시되는 Fab K 저해활성을 갖는 항균 화합물, 상기 화합물을 포함하는 폐렴 치료용 약제학적 조성물, 및 (a) 코스모스포라 코시니아(Cosmospora coccinea) 균주를 배양하는 단계, (b) 상기 (a)단계로부터 수득한 배양액을 아세톤으로 추출한 후, 에틸아세테이트로 추출하는 단계; 및 (c) 상기 (b)단계로부터 수득한 추출물에 크로마토그래피를 수행하여 상기 본 발명의 화합물을 얻는 단계를 포함하는 제조방법에 관한 것이다.

폐렴구균, 세팔로크로민, cephalochromin, 지방산 합성, Fab K, Fab I

Description

ＦａｂＫ 저해활성을 갖는 신규한 항폐렴 화합물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 항폐렴용 약학 조성물{NEW CLASS OF ANTI-PNEUMONIAE AGENT HAVING FAB K INHIBITION ACTIVITY, PROCESS FOR PRODUCING THE SAME AND ANTI-PNEUMONIAE PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING THE SAME}

일반적으로 병원성 미생물에 의한 직접 혹은 간접적인 피해는 경제, 환경, 의학적으로 많은 문제를 야기시키고 있다. 식품산업에서의 식품 유통 과정 중의 부패로 인한 손실, 농산업에서의 농작물에 대한 과량의 화학 살충제의 사용으로 인한 인체의 유해성 및 환경오염, 항생제의 오남용으로 인한 항생제 내성 균주의 출현 등 사회 전반에서 많은 문제들을 야기시키고 있다.

폐렴(Pneumonias)으로 매년 전세계적으로 100만명 이상의 5세 이하의 어린이가 사망하고는 것으로 추정되며 이는 심지어 AIDS나 말라리아 보다 높은 사망률을 보이고 있다고 WHO는 보고하고 있다. 특히 개발도상국에서 폐렴(Pneumonias)은 신생아의 가장 중요한 세균성 질환 중의 하나이다. 폐렴구균 (S. pneumoniae)은 아프리카 및 다른 개도국에서는 비유행성 소아 내수막염(nonepidemic childhood meningitis)을 일으키는 원인으로 알려져 있으며, 미국에서는 열 균혈증(febrile bacteraemia)으로 구분되어 중이염, 부비동염, 재발 기관지염을 일으키는 원인균으로 알려져 있다. 그러므로 미국에서만 일년에 700만명 이상이 뉴모니아(pneumoniae)에 의한 이염(otitis)에 감염되고 있다는 보고가 있다. 유럽과 미국에서 폐구균성폐렴(pneumococcal pneumonia)은 적어도 원외 폐렴(community-acquired pneumonia)의 30%이상이 입원을 요하고 있으며 매년 65세 혹은 그 이상의 노인층의 100,000만 명당 5500 내지 9200명 정도에서 발병을 하고 있으며 이중 10-30%의 치사율을 보이고 있다

약제내성 폐렴 연쇄구균 (Drug-resistant Streptococcus pneumoniae Disease): 폐렴구균 (Streptococcus pneumoniae)은 한가지 이상의 기존의 사용되는 항생제에 대하여 내성을 보이고 있다. 주로 7개의 혈청형(serotype) (6A,^B,9V,14,19A,19F, 및 23F)이 대부분 폐렴 연쇄구균(drug-resistant S. pneumoniae, DRSP)에 대한 약제내성을 보인다. 2000년까지는 폐렴구균 (Streptococcus pneumoniae)에 대하여 40%가 적어도 한 개 이상의 약제에 대한 내성을 보여 왔으며 2002년에 혼합백신이 사용된 이후 내성 정도가 34%로 줄어들긴 하였으나 여전히 높은 DRSP를 보이고 있으므로 주요한 국제적 보건 문제(global public health problem)가 되고 있다. 미국에서는 1987년 발병 이래 항생제 치료를 강력히 해 왔으나 어린아이들과 다른 의학적 문제점(medical problems)을 가지고 있는 환자들에게서 여전히 높은 전염성과 치사율을 보이고 있다고 미국의 CDC는 보고하고 있다. 1977년 서아프리카에서 최초로 페니실린에 대한 내성(penicillin resistant)이 높은 균주가 출현한 이후 페니실린(penicillin) 저항성과 다제약제 내성(multidrug resistance)이 세계적으로 퍼져있다. 현재 폐렴질환의 3-35%가 DRSP를 보인다고 보고되고 있으며 아시아의 경우 환자의 53%이상이 페니실린(penicillin) 저항성을 보이고, 80%이상이 에리트로마이신(erythromycin)에 저항성을 보이는 것으로 보고되고 있다. 따라서 이러한 항생제 내성 폐렴구균을 퇴치하기 위해서는 새로운 작용기전의 항생제가 절실히 요청되고 있다.

한편, 1990년 중반부터 시작한 병원 미생물 유전체 연구 결과, 새로운 항생제 표적이 발굴되어 새로운 개념의 항생제 개발 가능성을 열어주고 있다. 미생물 유전체 정보를 활용하여 발굴 검증된 새로운 항생제 표적 중 에노일 리덕테이즈 효소 (enoyl-ACP reductase)는 지방산 합성 주기(cycle) 중 연장(elongation) 마지막 단계를 담당하는 미생물 생장에 필수적인 효소로, 그람 양성균 및 그람 음성균에 모두 존재하며, 인간과 상동성(homolgy)이 매우 낮기 때문에 새로운 항생제 표적으로 주목받고 있다. 특히, 기존에 그 기전이 밝혀지지 않았던 살균제 트리클로산 (triclosan)과 결핵 치료제 이소니아지드(isoniazid)의 작용 표적으로 밝혀짐으로써, 항생제 개발 작용점으로 재확인된 바 있다. 에노일 리덕테이즈(enoyl reductase) 효소에는 Fab I, Fab K, Fab L 등 3 가지의 이성구조 (isoform)가 존재하는데, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 대장균(E. coli) 등 대부분의 주요한 병원성 세균에는 Fab I가 공통적으로 존재한 반면, 폐렴구균은 Fab K 만이 존재한다. 따라서 선택적 Fab K 저해 물질은 폐렴구균에 대한 선택적인 치료제로 매우 유망하다. 일본의 메이지 제과(Meiji Seika Kaisha) 회사는 페닐이미다졸(phenylimidazole)계의 AG205화합물을 Fab K 저해제로 개발하고 있으며(Antimicro. Agents Chemther. 50: 2869-2871 (2006)), 다국적 제약회사인 글락소스미스클라인사는 인돌 나프티리디온(indole naphthyridinone)계 물질을 Fab K 저해 물질로 개발하고 있다 (J. Med. Chem. 46: 1627-1635 (2003)).

이에 본 발명자들은 미생물, 식물 등 천연물로부터 Fab K 저해물질을 탐색하는 연구를 수행하던 중, 코스모스포라 코시니아(Cosmospora coccinea) 라는 곰팡이에서 세팔로크로민(Cephalochromin)이라는 물질이 강력한 Fab K 저해제로 분리하는 한편, 이 물질이 다른 세균보다는 폐렴구균에 강한 항균활성을 나타내는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 목적은 신규한 Fab K 저해활성을 갖는 항균 화합물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 항균 화합물을 포함하는 폐렴 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 (a) 코스모스포라 코시니아(Cosmospora coccinea) 균주를 배양하는 단계, (b) 상기 (a)단계로부터 수득한 배양액을 아세톤으로 추출한 후, 에틸아세테이트로 추출하는 단계; 및 (c) 상기 (b)단계로부터 수득한 추출물에 크로마토그래피를 수행하여 상기 본 발명의 화합물을 얻는 단계를 포함하는 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표기되는 Fab K 저해활성을 갖는 항균 화합물에 관한 것이다.

상기 화학실 1로 표시되는 화합물의 IUPAC명은 2,2',3,3'-테트라하이드로-5,5',6,6',8,8'-헥사하이드록시-2,2'-다이메틸-9,9'-바이-4H-나프토(2,3-b)피란-4,4'-다이온 (2,2',3,3'-tetrahydro-5,5',6,6',8,8'-hexahydroxy-2, 2'-dimethyl-9,9'-bi-4H-naphtho(2,3-b)pyran-4,4'-dione)이고, 세팔로크로민 (cephalochromin)이로 통칭되며, 분자량 517.7, 분자식 C₂₈H₂₂O₁₀인 갈색 분말의 성상의 화합물이다.

본 발명에서의 용어 "Fab K"란, 박테리아의 지방산 생합성의 각 주기에 포함된 네 개의 반응의 마지막 단계에서 에노일-아실(enocyl-acyl) 담체 단백질 (ACP) 환원 효소로 기능하는 것으로 여겨지는 박테리아성 효소를 말한다. 상기 효소는 박테리아 및 식물에 널리 분포된 것으로, 상기 Fab K 효소는 박테리아 생체막을 구성하는 지질을 합성하는데 필요한 단백질 효소이다. Fab K 효소를 저해시키는 경우, 항생 및 항균효과를 낼 수 있어 폐렴과 같은 질환의 치료를 위한 '표적단백질'로 활용될 수 있으며, 상기 효소를 저해시키는 결핵 치료제 '아이소니아지드', 비누, 세제 또는 치약에 항생 및 항균 효과를 내기위해 사용되는 '트리클로산'도 Fab K 효소를 억제하는 작용을 한다. 이러한 'Fab K'는 주로 폐렴 균주에 존재하고 있는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 상기 화합물이 Fab K에 대한 저해 활성이 있으며, 특히 폐렴구균에 대한 뛰어난 항균능을 보임을 확인하였다(실시예 4).

바람직하게 본 발명의 화합물은 그의 이성질체, 유도체 또는 약제학적으로 허용가능한 염을 포함한다. 이성질체란 화학식은 같으나 동일하지는 않은 화합물의 관계를 의미하며, 이러한 이성질체의 종류에는 구조 이성질체, 기하 이성질체, 광학 이성질체 및 기하 이성질체가 있다. 입체이성질체란, 동일한 화학적 구성을 갖지만, 공간 중에서 원자 또는 기의 배열의 측면에서 상이한 화합물 의미하고, 광학 이성질체 (거울상이성질체)는 서로 겹치지 않는 거울상을 갖는 한 화합물의 두 입체이성질체를 의미하며, 부분입체이성질체는 둘 이상의 비대칭 중심을 가지고 그것의 분자들이 서로 거울상이 아닌 입체이성질체를 의미한다.

본 발명에서의 용어 "약학적으로 허용가능한 염"은 화합물의 상대적으로 무독성인 무기 및 유기 산 부가염을 의미한다.

더욱 바람직하게 본 발명은 화학식 1의 화합물, 이의 이성질체, 유도체 또는 이들의 염에 약제학적으로 허용가능안 담체를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명에서의 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 임의의 대상 조성물 또는 성분을 하나의 기관, 또는 신체의 부분으로부터 다른 기관, 또는 신체의 부분으로의 운반 또는 수송하는 것에 관여하는 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질과 같은 제약상 허용가능한 물질, 조성물 또는 비히클을 지칭하며, 본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 스테아린산 마그네슘 및 광물유를 들 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는, 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 고형제제는 상기 화학식 1의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

뿐만 아니라, 본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 필요에 따라 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 병원성 세균 및 내성균에 대한 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 화합물은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라 합성할 수 있으며, 바람직하게는 균주로부터 생산되는 천연 화합물을 수득할 수도 있다. 바람직하게는 세팔로스포리움 속(Cephalosporium sp.), 버티실리움 속(Verticillium sp.), 넥트라 속(Nectra sp.) 균주 등에서 얻을 수 있으나, 상기 균주들에 의해 본 발명의 화합물을 수득할 수 있는 균주의 종류가 제한되는 것은 아니다. 더욱 바람직하게는 코스모스포라 코시니아 (Cosmospora coccinea)로 부터 생산할 수 있으며, 더더욱 바람직하게는 기탁번호 KCTC 11434BP 균주로부터 수득할 수 있다.

본 발명에 있어서 본 발명의 화합물을 생산하기 위한 곰팡이 코스모스포라 코시니아(Cosmospora coccinea) 균주 배양은 통상의 미생물이 사용할 수 있는 영양원을 함유하는 배지에서 배양할 수 있다. 균주의 영양원으로는 당업계에서 통상적으로 사용되는 영양원을 제한없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 종래 곰팡이의 배양에 이용되고 있는 공지의 영양원을 사용할 수 있다. 예를 들면 탄소원으로서는 글루코스, 물엿, 덱스트린, 전분, 당밀, 동물유, 식물유 등을 사용할 수 있으며, 질소원으로서는 밀기울, 대두박, 소맥, 맥아, 면실박, 어박, 콘스팁리커, 육즙, 효모추출물, 황산 암모늄, 질산소다, 요소 등을 사용할 수 있다. 필요에 따라 식염, 칼륨, 마그네슘,코발트, 염소, 인산, 황산 및 기타 이온생성을 촉진하는 무기염류를 첨가하면 매우 효과적이다. 배양방법으로는 호기적 조건에서는 진탕배양 혹은 정치배양이 가능하다.

배양온도는 상기의 각 조건들에서 배양할 경우 조건에 따라 약간씩 상이하기는 하나, 보통 20-37℃에서 배양하는 것이 적당하며, 바람직하게는 26-30℃에서 배양할 수 있다. 또한, 배양기간 역시 당업계에서 사용되는 공지의 기간 동안 배양할 수 있으며, 필요에 따라 기간이 조정될 수 있다. 바람직하게 진탕배양, 정치배양의 경우 모두 4일 내지 7일간 배양할 수 있으며, 상기 배양 기간일 때 본 발명의 화합물의 수득량이 최고치에 이르는 것을 확인하였다.

다른 하나의 양태로서 본 발명은, 상기 화합물을 포함하는 폐렴 치료용 약제학적 조성물에 관한 것으로, 바람직하게 상기 약제학적 조성물은 Fab K 저해 활성을 가짐으로써 폐렴균에 대한 항균능을 가지며, 더욱 바람직하게는 폐렴구균(S. pneumoniae)에 대한 항균능을 갖는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서의 용어 "폐렴"은 폐실질의 급성 염증질환의 일종으로 혈성 가래의 감염원은 주로 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae)와 크렙실라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae)이다. 연쇄상구균성 폐렴균에 의한 폐렴의 의학적 소견으로는 실모양의 혈흔 또는 전반적으로 핑크빛 또는 쇠의 녹슨 색깔이 도는 가래가 나타나는데, 크렙실라성 폐렴균에 의한 폐렴도 양상이 비슷하지만, 가래가 더 끈적거리며, 빨갛고 젤리모양을 보인다. 이러한 폐렴은 흔히 열, 오한, 호흡곤란, 흉통이 동반되어 나타난다(참조 : Goldstein et al., Antimicrob. Agents Chemother., 39:1580-1588, 1995).

폐렴의 증상 중에서 기침, 객담, 고열이 특징 증상인 것은 방사선검사상 폐침윤의 소견을 보이는데 폐렴의 원인균은 매우 다양하나 폐렴연쇄상구균, 마이코플라스마(Mycoplasma)균, 레지오넬라(Legionella)균 및 바이러스(virus)가 흔한 원인균들이다. 대개 급성으로 진행되고 객담이 화농성인 경우는 세균성 폐렴이며, 객담이 없거나 소량으로 비화농성인 경우는 마이코플라스마 또는 바이러스에 의한 폐렴인 경우가 많다(참조 : Johnson et al., Int. J. Antimicrob. Agents, 17:377-381, 2001). 폐렴의 절반을 차지하는 폐렴구균성 폐렴은 가장 흔한 증상으로 모든 폐렴 의 50%를 차지한다. 구강내 상재균으로 존재하며 상기도 감염후 잘 발생한다. 특히 심장질환, 비장적출, 알콜중독, 만성 폐질환, 신장이식 후 자주 발생한다. 증상은 심한 오한, 발열, 기침 및 흉통이 나타나고 객담은 혈담인 경우가 많으며 합병증으로 흉막염, 뇌막염, 심내막염, 복막염등을 일으킬 수 있다. 치료는 항생제로 페니실린제(penicillin)나 세팔로스포린(cephalosporin)제제를 사용하고 있으나 부작용이 심하여 사용이 제한되고 있는 실정이다(참조 : Stein et al., Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 39:181-185, 2001). 이러한 폐렴은 장기이식자나 항암치료중인 암환자 등의 감염시 치명적이며, 폐렴 균주는 폐렴 외에 중이염, 수막염, 정맥두염, 복막염, 관절염 등을 일으키는 원인이 되기도 한다.

폐렴과 관련된 유해 병원성 미생물로는 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae), 크렙실라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 마이코플라스마 뉴모니아(Mycoplasma pneumoniae) 및 레지오넬라 뉴모필라(Legionella

pneumophila)등이 있다. 본 발명의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물은 상기 증상 및 균주가 원인이 되는 폐렴질환에 대한 항균능을 가짐으로써, 폐렴 질환을 효과적으로 치료할 수 있으며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 본 발명의 화합물을 폐렴균을 가진 마우스의 복강 내 투여한 후, 생존률을 측정함으로써 항균능을 확인하였다.

본 발명에서의 용어 "치료"란, 약리학적 활성 물질에 의해 야기되는 동물, 특히 포유류, 및 더욱 특별히 인간에서의 국소적 또는 전신적인 효과를 가리킨다. 따라서, 상기 용어는 질환의 진단, 치료, 완화, 처치 또는 예방 또는 동물 또는 인간의 원하는 육체적 또는 정신적 발달 및/또는 상태의 향상에 있어서 사용될 의도의 임의의 물질을 포함한다.

본 발명에서의 용어, "폐렴구균(pneumococcus)"이라 칭하는 폐렴 연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae)은 일반적으로 인간 비인강(nasopharynx)의 점막 표면을 콜로니화하는 편리공생(commensal) 생물체이다. 숙주의 인자(factor)가 생물체의 하기도(lower respiratory tract) 접근을 허용하는 경우, 왕성한 염증 반응이 뒤이어 일어나고, 이로써 폐포 공간이 삼출물(exudate)를 채울 때 밀집한 경화(consolidation)를 야기시킨다. 이러한 상태를 통상 폐렴이라 칭한다. 폐렴구균 감염의 가장 심각한 징후(manifestation)는 패혈증(sepsis), 수막염(meningitis), 또는 패혈증과 수막염 모두에 의하여 악화될 수 있는 균혈증(bacteremia)이다. 성인의 균혈증은 일반적으로 폐렴의 합병증이다. 혈류 (즉, 옵소닌 식세포 현상(opsonophagocytosis))로부터 유래한 생물체의 클리어런스(clearance)의 주요 메카니즘에 견딜 수 있는 폐렴구균의 능력은 다당류 캡슐인 생물체의 주요 병독성(virulence) 인자의 발현을 필요로 한다(1931년 발행된 Avery 등의 문헌 및 1990년에 발행된 Watson 등의 문헌). 폐렴구균은 90개 이상의 구조적으로 독특한 캡슐 다당류(CPS)를 합성할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 화합물은 상기 폐렴구균에 대한 강력한 항균능을 가짐으로써, 폐렴을 가진 개체를 효과적으로 치료할 수 있다.

본 발명의 일 실시예로서, 본 발명의 화합물인 세팔로크로민(Cephalochromin)에 대한 생체 내(생체내(in vivo)) 및 시험관 내(in vitro) 에서의 폐렴구균에 대한 항균 실험을 한 결과, 본 발명의 세팔로크로민(Cephalochromin) 화합물은 황색포도상구균또는 MRSA, QRSA 균주보다는 폐렴구균에 대하여 2 - 4배 강한 항균활성을 나타내었으며, 세팔로크로민(Cephalochromin) 화합물은 동물 실험에서도 황색포도상구균보다 폐렴구균에 대하여 강한 항균활성을 나타냄을 확인하였다(실시예 4 및 5).

또한, 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 코스모스포라 코시니아(Cosmospora coccinea) 균주를 배양하는 단계, (b) 상기 (a)단계로부터 수득한 배양액을 아세톤으로 추출한 후, 에틸아세테이트로 추출하는 단계; 및 (c) 상기 (b)단계로부터 수득한 추출물에 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는, 본 발명의 화합물의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 일 실시예로서, 상기에서 기술한 바와 같은 조건으로 균주를 배양하면 본 발명의 화합물을 수득할 수 있으며(실시예 1,2), 본 물질은 배양액 내 뿐만 아니라 균체 내에도 존재할 수 있으므로, 효과적인 추출을 위하여 다음의 방법에 따라 효율적으로 분리, 정제할 수 있다.

화합물의 추출, 정제 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법이 제한 없이 사용될 수 있으며, 필요에 따라 배지의 종류, 배양 조건, 추출 정제 방법 등을 변화 시켜, 수득량 및 수득률을 조절할 수 있음은 자명하다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 아세톤 및 에틸아세테이트를 사용하여 추출을 수행하였는데, 구체적인 방법은 다음과 같다.

배양액 및 균사체에 아세톤 등의 유기용매를 가하여 교반하여 균체로부터 유효성분을 추출한 후 아세톤을 증발시키고 에틸아세테이트로로 용매추출을 수행한 후, 상기 유효성분을 함유하고 있는 에틸아세테이트 용매층을 감압농축하여 에틸아세테이트를 제거한 후 아세토나이트릴:물을 4:6, 5:5, 6:4, 7:3인 용매를 사용한 오디에스(ODS) 크로마토그래피를 실시하였다. 상기 얻어진 활성분획을 재차 HPLC를 하여서 순수한 본 발명의 물질을 수득하였다(실시예 4). 본 발명자들은 이와 같은 방법을 사용하면 코스모스포라 코시니아로부터 세팔로크로민만을 효과적으로 추출, 정제할 수 있음을 확인하였다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 화합물을 사용하면 Fab K 효소를 강력하게 저해함으로써, 폐렴질환에 대한 강력한 항균능을 가지며, 특히 폐렴구균 (Streptococcus pneumoniae)에 대하여 강력한 항균활성을 나타냄으로써, 폐렴의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

실시예 1. Cosmospora coccinea F508 균주의 분리

본 발명자들은 Fab K 저해활성을 갖는 물질을 생산하는 균주를 스크리닝하기 위하여, 전국 토양으로부터 세균, 곰팡이, 방선균 를 분리한 후 강력한 Fab K 저해 항균활성을 갖는 곰팡이 F508 균주를 분리하였다. 상기 세팔로크로민을 생산하는 F508 균주는 ITS 시퀀스(sequence)를 NCI 시퀀스 데이타베이스(sequence database)와 비교한 결과 코스모포라 코시니아 R.(Cosmospora coccinea R.)로 동정되었다. 형태학적으로는 코니디아(conidia)와 코니도포러스(conidiophores)의 왜상 형상(anamorphic shape)이 아크레모니움(Acremonium) 또는 레카니실리움 종(Lecanicillium species)과 비슷하였으나, F508균주는 긴 경자(phialides)와 약간 굽은 분생자(slightly bent conidia)를 가졌다. 코니도포러스(Conidiophores)는 unbranched 또는 rarely branched하였다. 분생포자(Conidiophores)의 크기는 39 - 58 μm이였다. 분생 포자 형성 세포(Conidiogenous cells)는 소시지 형(subcylindrical)이였고, 공기 중의 균사체(mycelia)는 PDA 배지에서 거의 생성되지 않았으며, 시네마타(Synnemata)가 가끔 생성되었다. 분생자(Conidia)는 번데기 유사형(pupa-like), 계란형의 타원형에서 타원체(oval to ellipsoid), 단세포(unicellular), 무색(colourless), 부드러운 벽(smooth-walled)을 가지고, 종종 약간 구부러진 형태(frequently slightly bent)였으며, 그 크기는 4.6-8.1 (av. 7.5) x 1.2-2.5 (av. 2.3) μm이였다. 이러한 ITS 서열(sequence) 및 배양, 형태 학적 결과로부터 본 균주는 코스모포라 코시니아 R.(Cosmospora coccinea R.)로 동정되어 코스모포라 코시니아 R.(Cosmospora coccinea R.) F508로 명명하였다. 기존에 세팔로크로민 화합물은 세팔로스포리움 속(Cephalosporium sp.), 버티실리움 속(Verticillium sp.), 넥트라 속(Nectra sp.) 균주에서 분리된 적은 있으나, 코스모포라 코시니아(Cosmospora coccinea)에서 분리되는 것은 본 발명에서 처음으로 보고 한다. 본 발명자들은 상기 균주를 2008년 12월 4일자로 한국생명공학연구원 유전자원센터에 기탁하였다 (수탁번호 : KCTC 11434BP).

실시예 2. Cosmospora coccinea R. F508 균주의 배양

상기 F508 균주를 배양하기 위하여 종 배지로는 효모 추출액(yeast extract) 0.3%, 맥아 추출액(malt extract) 0.3%, 트립톤(tryptone) 0.5%, 글루코오스(glucose) 1%을 함유한 배지를 멸균 전에 pH를 5.5로 조절한 후 사용하였다. 상기의 종배지 20ml가 담긴 100ml 용량의 삼각 플라스크를 121℃에서 20분간 멸균한 후 F508 균주의 사면배양 시험관으로부터 1 백금을 접종하여 28℃에서 3 일간 진탕 배양한 후 이것을 1차 종배양액으로 사용하였다. 그런 다음에 효모 추출액(yeast extract) 0.3%, 맥아 추출액(malt extract) 0.3%, 트립톤(tryptone) 0.5%, 글루코오스(glucose) 1%을 함유한 멸균된 배지가 들어 있는 500ml 용량의 삼각플라스크 (48 개)에 종배양액를 접종하여 28℃에서 7일간 진탕 배양하였다.

실시예 3. 본 발명의 화합물의 분리 및 정제

상기의 실시예 1에서 배양한 배양액 및 균사체의 아세톤 추출액를 에틸아세테이트로 3번 용매 추출하였다. 이와 같이 하여 얻어진 유효성분을 함유하고 있는 에틸아세테이트 용매층을 감압 농축하여 에틸아세테이트를 제거한 후 아세토나이트릴:물을 4:6, 5:5, 6:4, 7:3인 용매를 사용한 오디에스(ODS) 크로마토그래피를 수행하였다. 이와 같이 얻어진 활성분획을 재차 HPLC를 하여서 순수한 본 발명의 물질을 얻을 수 있었다. 활성 분획은 0.01% TFA를 함유한 60% 아세토나이트릴(acetonitrile)을 이동상으로 하는 HPLC (YMC ODS 150×20 mm, Flow rate : 7 ml/min, UV 300 nm)를 실시하여 세팔로크로민 물질을 얻었다.

즉, 배양액 및 균사체에 아세톤 등의 유기용매를 가하여 교반하여 균체로부터 유효성분을 추출한 후 아세톤을 증발시키고 에틸아세테이트로로 용매추출 하였다. 이와 같이 하여 얻어진 유효성분을 함유하고 있는 에틸아세테이트 용매층을 감압농축하여 에틸아세테이트를 제거한 후 아세토나이트릴:물을 4:6, 5:5, 6:4, 7:3인 용매를 사용한 오디에스(ODS) 크로마토그래피를 실시한다. 이와 같이 얻어진 활성분획을 재차 HPLC를 하여서 순수한 본 발명의 물질을 수득하였다.

이상과 같이 정제된 본 발명의 화합물의 이화학적 특성 및 화학구조는 다음과 같다.

화합물 1: 세팔로크로민(cephalochromin)

1)물질의 성상 : 갈색 분말

2) 질량분석스펙트럼(ESI-MS): 517.7 (M-H)-

3) 편광도([α]_D) : 468 (c 0.1, dioxane)

4) 분자식 : C28H22O10

5)핵자기 공명 (NMR) 흡수스펙트럼 : DMSO-d6 을 용매로하고 테트라메칠실란 (TMS)을 표준물질로 하여 측정한 수소 핵자기 공명스펙트럼 데이타는 다음과 같다.

¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d ₆ ): 14.9 (2H, brs, 5-OH), 9.76 (4H, brs, 6, 8-OH), 6.43 (2H, s, H-7), 5.64 (2H, s, H-10), 4.46 (2H, m, H-2), 2.84 (2H, d, J = 17.1, 11.7 Hz, H-3_a), 2.67 (2H, d, J = 17.1, 3.0 Hz, H-3_b), 1.27 (6H, d, J = 6.0 Hz, 2-CH₃) ¹³C-NMR (75 MHz, DMSO-d ₆ ): 198.1 (C-4), 164.8 (C-5), 160.0 (C-8), 158.7 (C-6), 154.9 (C-10_a), 141.5 (C-9_a), 107.1 (C-5_a), 104.2 (C-9), 101.6 (C-4_a), 100.0 (C-7), 98.5 (C-10), 72.9 (C-2), 42.7 (C-3), 20.5 (2-CH₃).

실시예 4. 본 발명의 화합물의 Fab K 및 Fab I 저해활성

본 발명에 따른 화합물의 Fab K 저해활성을 확인하기 위하여, 하기와 같은 효소 역가 측정 실험을 수행하였다.

효소 역가 측정을 위해서 Zheng 등의 방법[참조: J. Antibiotics 59(12): 808-812, 2006]을 이용하였다. 유전자 재조합 기술에 의해 제조된 폐렴구균 유래의 Fab K 효소를 사용하였다. 역가 측정은 50mM 인산나트륨 완충용액(pH 6.5) 중에서 수행하였으며, 기질로는 트랜스-2-옥테노일 N-아세틸시스테아민 티오에스터(trans-2-octenoyl N-acetylcysteamine thioester) 50 μM, NADH 200μM을 사용하였고, Fab K를 150 nM 사용하였다. 효소를 첨가하고 상온에서 60분간 반응시킨 후 UV-분광계(spectrometer)를 이용하여 340nm에서 NADH의 흡광도 감소를 측정하였다. 상기 실시예 2에서 제조한 세팔로크로민을 디메틸설폭사이드(DMSO) 용매에 용해시켜 전체 반응액의 2% 이내로 첨가하고 효소 저해능을 평가하였다. 효소 저해능은 시험 화합물이 없는 상태에서의 NADH 소실 정도에 대한 시험 화합물 존재하에서의 NADH 소실 정도를 백분율로 표시하며, 50%의 효소 활성을 저해하는 각 시험 화합물의 농도를 IC₅₀으로 결정하였다. 결과는 표 1에 나타내었다.

Fab I 역가 측정을 위해서 Ward 등의 방법 (참조: Biochemistry 38, 12514(1999))을 변형하여 이용하였다. 유전자 재조합 기술에 의해 제조된 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) Fab I를 사용하였다. 역가 측정은 50mM 인산나트륨 완충용액(pH 7.5) 중에서 수행하였으며, 기질로는 트랜스-2-옥테노일 N-아세틸시스테아민 티오에스터(trans-2-octenoyl N-acetylcysteamine thioester) 400μM, NADPH 200μM을 사용하였고, Fab I를 150 nM 사용하였다. 효소를 첨가하고 상온에서 60분간 반응시킨 후 UV-분광계(spectrometer)를 이용하여 340nm에서 NADPH의 흡광도 감소를 측정하였다. 결과는 표 2에 나타내었다.

세팔로크로민 화합물의 폐렴구균 Fab K 효소에 대한 저해활성

농도(μM)	세팔로크로민
0	0
0.3	19
1	49
3	76
10	98.5

표 1에서 나타난 바와 같이, 세팔로크로민 화합물은 농도 의존적으로 폐렴구균의 Fab K를 저해하였고, 1.0 μM의 IC₅₀ 값을 나타내었다.

세팔로크로민 화합물의 황색포도상구균의 Fab I 효소에 대한 저해활성

농도(μM)	세팔로크로민
0	0
0.3	30
1	32
3	53
10	81

표 2에서 나타난 바와 같이, 세팔로크로민 화합물은 농도 의존적으로 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)의 Fab I를 저해하였고, 1.9 μM의 IC₅₀ 값을 나타내었다.

실시예 5. 본 발명의 화합물의 시험관 내(in vitro) 항균 활성

폐렴구균 시험주를 배양할 때에는 5% 양 혈액(sheep blood)을 함유한 TSB(tryptic soy broth)에서 배양을 하였으며 액체 배지 희석법(broth microdilution)으로 항균활성을 측정하였다. 하룻밤 배양한 시험균를 2 x 100,000/ml 이 되도록 희석한 후 96 웰 플레이트(well plate)에 웰(well) 당 100㎕ 씩 분주한 다음, 화합물을 최고 128 μg/ml의 농도부터 점차 2-fold 희석하여 처리하였다. 화합물은 DMSO (dimethylsulxoside)에 희석하였고 DMSO의 농도는 1/100정도로 맞추어서 실험을 실시하였다. 20시간 배양 후 650 nm에서 OD 값을 측정하여 세균의 생육을 조사하였다. 세균의 생육을 완전히 저해한 화합물의 최소농도를 MIC로 결정하였다.

폐렴구균 이외의 다른 시험균주 즉, S. aureus, MRSA, QRSA 균주는 MHB (Mueller Hinton broth)에서 배양하였으며, 항균활성은 같은 방법인 액체 배지 희석법(broth microdilution)으로 측정하였다.

세팔로크로민의 항균활성

Strains	MIC(μg/ml)
S. pneumoniae KCTC 3932	4
S. pneumoniae KCTC 5412	4
S. aureus 503	8
S. aureus KCTC 1916	8
S. aureus RN4220	8
MRSA CCARM 3167	8
MRSA CCARM 3506	16
QRSA CCARM 3505	8
QRSA CCARM 3519	16

표 3에 나타난 바와 같이, 본 발명의 세팔로크로민 화합물은 황색포도상구균 또는 MRSA, QRSA 균주보다는 폐렴구균에 대하여 2 - 4배 강한 항균활성을 나타내었다.

실시예 5: 본 발명의 화합물의 생체 내(생체내(in vivo)) 항균 활성

마우스는 3주령 ICR male을 사용하였고 마우스 중량은 20g (1821g) 이었다. 시험균주는 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae ATCC6305) 을 사용하였다. 마우스에 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae ATCC6305) 균액 2×10⁶cfu/㎖를 0.5㎖ (1×10⁶ cfu/mouse)를 복강(i.p)에 주사하여 전신감염을 유도하였다. 화합물의 투여 시간은 1시간, 4시간 후에 시료액을 피하(s.c) 로 투여하였으며 투여 양은 모두 200㎕였다. 감염균액 및 시료액의 투여가 모두 끝난 마우스를 3 일간 사육관리 하면서 생존율을 기록하였다. 양성 대조군(positive control) 화합물로는 제미플록사신(gemifloxacin)를 사용하였다.

황색포도상구균에 대한 생체내(in vivo) 실험은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus giorgio)을 사용하여 같은 방법으로 실시하였다.

폐렴구균(S. pneumoniae ATCC6305)에 대한 피하 투여 시 생체내(in vivo) 결과 (생존율)(단위 : ㎎/㎏)

Time	Control	Gemifloxacin	세팔로크로민
		5	100	10
0h	4/4	4/4	5/5	5/5
24h	0/4	4/4	5/5	3/5
48h	0/4	4/4	2/5	0/5
72h	0/4	4/4	2/5	0/5
최종	0/4	4/4	2/5	0/5

표 4 에 나타난 바와 같이, 폐렴구균 감염모델에서 본 발명의 세팔로크로민 화합물을 100 mg/kg 투여시 24시간 경과시 100%, 72시간 경과시는 40%의 생존률을 보였다. 그리고 100 mg/kg 투여시 급성 독성은 없는 것으로 나타났다. 그러나, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus giorgio) 감염 마우스 모델에 대해서는 세팔로크로민 화합물을 100 mg/kg 투여시에도 전혀 항균활성이 관찰되지 않았다. 따라서 세팔로크로민 화합물은 동물실험에서도 황색포도상구균보다 폐렴구균에 대하여 강한 항균활성을 나타냄을 확인하였다.

본 발명에 따른 세팔로크로민(cephalochromin) 화합물은 우수한 Fab K 저해활성을 나타내고, 폐렴구균 (S. pneumoniae)에 대하여 강력한 항균활성을 나타냄으로써, 병원성 세균 및 내성균의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 폐렴의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물:

[화학식 1]

.
제1항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가적으로 포함하는 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화합물은 기탁번호 KCTC 11434BP의 균주에 의해 생산되는 것인 약제학적 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 화합물은 Fab K 저해 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화합물은 폐렴구균(S. pneumoniae)에 대한 항균능을 갖는 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화합물은 코스모스포라 코시니아(Cosmospora coccinea)로부터 생산된 약제학적 조성물.
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