KR101040468B1 - 새로운 노카르디아 속 균주 및 그의 발효 배양물의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 메티실린 내성 포도상구균 균주에 탁월한 항균 활성을 나타내는 화학물질을 생산하는 새로운 미생물 균주 및 이 균주에서 생산되는 항균 활성 물질을 함유하고 있는 배양액에 관한 것이다. 본 발명의 신규 미생물 및 이로부터 생산되는 항균활성 물질을 포함하는 배양액은 기존 항생제의 계속되는 사용으로 인한 메티실린 내성 균주의 내성화 문제의 해결에 활용될 수 있다. 특히 본 배양액은 동물사료용 항생제를 대체 할 수 있으며 동물성장을 촉진하고 사료효율을 개선시키는 사료첨가제 성분으로 효과적으로 사용될 수 있다.

나르제니신, 사료첨가제

Description

새로운 노카르디아 속 균주 및 그의 발효 배양물의 용도{New Nocardia sp. CS682 and use of fermentation product thereof}

본 발명은 새로운 노카르디아 속(Nocardia sp.) CS682 균주 및 상기 균주에 의하여 생산되는 메티실린 내성 포도상균주에 유효한 화합물을 포함하고 있는 배양액에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 토양으로부터 분리되어 메티실린 내성 포도상구균(methicillin-resistant staphylococcus aureus, 이하 "MRSA"라 칭함)에 유효한 화합물을 생산하는 새로운 노카르디아 속 CS682 균주 및 상기 균주에 의하여 생산되고, MRSA 균주에 대해서 우수한 항생능력을 보이는 화합물 및 상기 화합물의 용도에 관한 것이다.

방선균은 다양한 항암제, 항생제, 기타 생리활성 물질을 생산하는 미생물로 잘 알려져 있으며, 오늘날의 생물 산업에 있어서 상당히 중요한 위치를 차지하고 있다. 이들은 자연계 또는 인위적인 환경에 널리 분포하고, 유기 물질의 분해에 중요한 역할을 수행한다.

지난 수년 동안, 항생제에 대한 황색포도상구균의 선천적 또는 후천적 내성, 특히 β-락탐 및 글리코펩티드에 대한 내성은 주된 걱정거리가 되고 있다. MRSA는 특히 심각한 근본(underlying) 질환 또는 면역억제 관련 질환이 있는 환자에 있어서 건강에 위협을 야기한다. 메티실린이 출현하게 된 시점부터 생겨난 MRSA는 유럽에서 처음으로 사용되었고 그의 존재는 세계 곳곳에서 검출되었다. 병원에서 감염의 거의 80%가 MRSA에 기인하는 것으로 보인다. 한국에서는 VRE 균주인 Enterococcus duranswas가 1992년에 처음으로 단리되었고, 입원 환자의 VRE의 감염의 유행은 급격히 증가하고 있다. E. faecalis로부터 S. aureus로의 높은 수준의 반코마이신 내성의 변형 전이 또한 MRSA 및 VRE의 확산을 부채질한다. 궁극적으로, 인체용 의약 및 동물 성장 촉진제에 있어서 항미생물제의 사용 증가는 MRSA 및 VRE의 출현과 관계가 있다.

항생제 내성 병원균을 제어하기 위해, 반코마이신, 시너시드(synercid ), 리네졸리드 등 다양한 항생제가 인체용으로 개발되었고, 동물용으로도 모넨신, 레이들로마이신, 살리노마이신등이 개발되었으나, 최근에는 여러 가지 약물의 남용으로 인하여 MRSA의 분리 비율이 더욱 증가하고 있어 이에 대한 대책이 시급한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 MRSA에 대한 강력한 항균활성 물질을 스크린하기 위한 목적으로 수 백종의 방선균을 전남지역의 다양한 지역으로부터 토양 시료로부터 채 취하였으며, 그 중 본 발명자들이 CS682라고 명명한 하나의 방선균 단리물이 MRSA에 대하여 강력한 항균활성 물질을 생산하는 것을 발견하였고, 이를 더욱 확인하고자 이 균주가 생산하는 화합물의 구조결정 및 항균 효과 및 항산화 및 세포독성 등의 생물학적 특성을 체계적으로 수행한 결과, 상기 화합물은 MRSA 균주와 Micrococcus luteus 대하여 우수한 항균능력을 보일 뿐만 아니라 항산화 효능을 보였으며 사람의 세포주에 대한 세포독성은 매우 미약하였다. 또한 상기 화합물을 포함하는 본 균주의 발효 배양액은 세포독성이 없음은 물론 동물에 대한 사료효율을 현저히 증가시킴을 확인함으로써, 상기 발효 배양액이 항생제 대체용 동물사료 첨가제로 사용될 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 일면에 있어서 토양으로부터 분리한 신규한 노카르디아(Nocardia sp.) 속 CS682 균주를 제공하는데 있다.

본 발명의 추가의 목적은 토양으로부터 분리한 신규한 노카르디아 속 CS682 균주 및 상기 균주에 의하여 생산되는 메티실린 내성 균주에 대하여 항균 활성 효과를 보이는 화합물(이하, nargenicin이라고도 한다)을 함유하는 발효 배양액을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 추가의 목적은 상기 화합물을 유효성분으로 포함하는 항생제 대체용 동물사료 첨가제를 제공하는 데 있다.

본 발명의 더욱 추가의 목적은 상기 화합물의 제조 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 더욱 다른 추가의 목적은 상기 화합물을 포함하는 항산화물질을 제공하는 데 있다.

본 발명에 따른 화합물은 독성이 현저하게 낮으며, MRSA 및 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus)에 대한 뛰어난 항균 활성을 나타낸다. 또한 유사구조 화합물과 비교하여 우수한 항산화 효과를 나타낸다. 상기 화합물을 포함하는 미생물 발효 배양액은 독성이 없고 동물의 사료 효율을 현저하게 증가시키기 때문에 기존 동물사료용 항생제를 대신할 수 있는 사료첨가제 등으로서 널리 활용될 수 있다.

이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.

본 발명은 토양으로부터 분리한 신규한 노카르디아 속 CS682 균주를 제공한다.

본 발명자들은 MRSA에 유효한 항균활성물질을 개발하고자 전라남도에서 채취한 토양으로부터 600여 종류의 방선균을 분리하였으며, 분리된 토양 방선균 중에서 MRSA에 유효한 항균활성 물질을 생산하는 균주를 선별하였다.

생리학적인 분석 및 16s rDNA 유전자 염기서열 분석 결과, 상기 선별된 균주는 방선균류의 신규한 종임이 확인되었다. 유전학적인 증거 및 외관상 나타나는 표현형에 근거하여 본 발명의 신규한 균주는 노카르디아 속 (Nocardia sp.)의 타입 CS682로 명명하였다. 상기 균주는 한국생명공학연구원에 2008.03.06일자로 기탁되 어 기탁번호 KCTC 11297BP를 부여받았다.

본 발명에 따른 방선균 단리물인 Nocardia sp. CS682의 배양액은 메티실린 내성 Staphylococcus aureus (MRSA)에 특이적인 높은 항균 활성을 나타냈다. MRSA 및 Micrococcus leuteus에 대하여 활성을 갖는 CS-682로 부터의 정제 물질은 C₂₈H₃₇NO₈ (M+, 515.25)로서 특이한 구조의 마크로리드 항생제, 나르제니신(nargenicin)으로 확인되었다. 상기 화합물의 항-MRSA 활성은 옥사실린, 반코마이신, 모넨신, 에리쓰로마이신 및 스피로마이신 보다 강력하였다. 계통수 분석에 의하면 이 균주 CS682는 Nocardia tenerifensis DSM 44704T (AJ556157)와 유사하였으나, 나르제니신을 생산하는 능력은 특이한 것으로 밝혀졌다.

본 발명의 노카르디아 속 CS682 균주는 회백색 백색 기균사체를 형성하였다. 이 균주는 갈색의 확산성 색소를 생성하였으나, 멜라닌과 확산성 색소는 생성하지 않았다. 이 균주는 15℃ 이하, 40℃ 이상에서는 성장하지 않았고, 페놀 (0.1%), 포타슘 텔루라이트(tellurite), 탈로스 아세테이트(thallous acetate), 크리스탈 바이올렛, 및 소듐 아자이드의 존재하에서 성장하였다. CS682 균주는 아미카신(amikacin), 클로람페니콜(chloramphenicol), 날리딕산(nalidixic acid), 반코마이신(vancomycin), 젠타마이신(gentamycin) 및 테트라사이클린(tetracycline)에 대해서는 내성을 가졌으나, 폴리믹신(polymixin) 및 스트렙토마이신(streptomycin)에는 감수성을 나타냈다.

본 발명의 균주는 엘라스틴, 크산틴, 알란토인(allantoin), 우레아, 구아닌, 아부틴(arbutine) 및 크실란(xylan)을 분해할 수 있다. 이들은 리파아제 및 니트르산 환원효소(nitrate reductase)는 생산하지 못하며, 갈락토오스, 수우크로스, 푸락토오스, 락토오스, 만니톨, 라피노오스, D-멜레지토오스, 아도니톨, 덱스트란, 자일리톨, L-아라비노오스, D-크실로오스, 살리신 및 소듐 피루베이트를 이용할 수 있었다. 이 균주는 DL-α-아미노-n-부티르산, L-쓰테오닌, L-시스테인, L-발린, L-페닐알라닌, L-히스티닌, L-히드록시프롤린 및 포타슘 니트레이트를 단독의 질소원으로 이용할 수 있었다. CS682 균주의 배양 브로쓰는 황색포도상구균, M. luteus의 성장은 억제하였으나, 바실러스 섭틸리스, 대장균, 사카로마이세스 세레비시애는 억제하지 않았다.

또한, 본 발명의 노카르디아 속 CS682 균주는 16s rDNA 유전자 염기서열 분석결과 서열번호 1로 기재되는 서열을 포함하는 것으로 밝혀졌으며, 이 균주는 Nocardia sp. DSM 43395 및 Nocardia tenerifensis DSM 44704T 등의 Nocardia 속의 공지된 종들과 매우 유사하였다(도 1 참조). 그러나 CS682 균주의 생리학적 및 형태학적 특성은 이들 공지된 종들과는 다르다. 더욱이, 단리물의 나르제니신-생성 능력은 이들 두 이웃하는 종들에 비하여 고유한 특징이다.

또한, 본 발명은 추가의 일면에 있어서 상기 신규한 노카르디아 속 CS682 균주에 의하여 생산되는 메티실린 내성 균주에 대한 항균활성 물질을 제공한다.

본 발명자들은 노카르디아 속 CS682가 생산하는 화합물의 선택적 항균 활성을 확인한 결과, MRSA 및 M. luteus에 대하여 우수한 항미생물 활성을 나타내며, 대조적으로, VRE 및 VRSA를 포함하는 기타의 그람 양성 세균 및 모든 그람 음성 세 균에 대하여는 항미생물 활성을 나타내지 않았다. 기존에 사용되고 있는 항생제인 옥사실린(Oxacillin) 및 반코마이신(vancomycin) 과 비교하여도 MRSA 균주 에 대하여 더욱 우수한 항생능력을 보이는 것이 확인되었다. 이는 본 발명의 노카르디아 속 CS682 균주 및 이로부터 생산되는 항균 활성 물질이 기존의 항생제에 내성을 보이는 MRSA의 감염증 치료제로 이용될 수 있음을 의미한다.

본 발명은, 더욱 추가의 일면에 있어서, 상기 화합물의 용도, 특히 항산화제로의 용도를 제공한다.

본 발명자들은 상기 균주에서 추출된 화합물이 생리활성에 미치는 영향을 연구하던 중, 상기 화합물이 항산화 효능을 가지고 있음에 주목하게 되었는데, 유사구조의 화합물인 에리스로마이신이나 스피라마이신에 비하여 10배 이상의 항산화 효능을 나타내었다. 따라서 상기 화합물은 사람이나 동물의 노화방지나 건강유지에 사용될 수 있는 기능성 건강보조 물질이나 약품으로 개발될 수 있을 것으로 판단된다.

본 발명에 따른 항균 활성 효능 및 항산화 효능의 유효성분으로 함유되는 상기 화합물은 약학적으로 허용가능한 결합제(예, 폴리비닐피롤리돈, 하이드록시프로필셀룰로오스), 붕해제(예, 카복시메틸셀룰로오스칼슘, 전분글리콜산나트륨), 희석제(예, 옥수수전분, 유당, 콩기름, 결정셀룰로오스, 만니톨), 활택제(예, 스테아린산 마그네슘, 탈크), 감미제(예, 백당, 과당, 솔비톨, 아스파탐), 안정제(카복시메틸셀룰로오스나트륨, 알파 또는 베타 싸이클로덱스트린, 비타민 C, 구연산, 백납), 보존료(예, 파라옥시안식향산메틸, 파라옥시안식향산프로필, 안식향산나트륨) 및 향료(예, 에틸바닐린, 마스킹후레바, 멘톨후라보노, 허브향)와 혼합하여 정제, 캅셀제, 연질캅셀제, 액제, 연고제 또는 주사제와 같은 약학적 제제로 제조될 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 비경구제의 형태로 투여하는 것이 바람직할 수 있다.

<Nocardia sp. CS 682 균주가 생산하는 나르제니신을 포함하는 발효 배양액의 급성 독성 실험>

6 내지 7주령 된 비설치류 비글견을 대상으로 본 발명의 나르제니신을 포함하는 발효 배양액을 경구 투여하여 24시간 내의 개체 사망율을 조사하였으며, 이때 암컷은 6 내지 8㎏인 개체를, 수컷은 7 내지 9㎏인 개체를 각각 8마리 사용하였다. 그 결과, 5g/kg 까지 죽은 개체가 발생하지 않아, 본 발명의 발효 배양액은 kg당 5g까지도 급성독성을 관찰할 수 없을 만큼 안전하므로, 그의 세포 독성은 다른 임상적으로 이용되는 마크로라이드 항생제에 비하여 매우 낮았으므로 항균 활성 물질 및 항산화제로서 생체 내에 안전하게 투여할 수 있다.

<유효량>

본 발명에 있어서의 약제조성물 중 유효성분인 나르제니신 화합물의 투여량은 환자의 연령, 성별, 증상, 투여방법 또는 예방목적에 따라, 체중 kg 당 6 내지 30㎎을 일일 1회 내지 3회 분복할 수 있다. 특이 증상을 나타내는 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여 시간, 투여 방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 당업자가 투여량을 변화시킬 수도 있다.

<실시예>

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 항-MRSA 항균활성 물질을 생산하는 토양 방선균의 분리

항-MRSA 항균활성 물질을 생산하는 방선균을 분리하기 위하여, 본 발명자들은 전국에서 채취한 토양을 40℃에서 건조시켜 곱게 파쇄한 뒤, 방선균의 특징인 열에 강한 성질을 이용하여 다른 미생물로부터 선별하기 위하여 80℃ 건조 오븐(drying oven)에서 1 내지 2 시간 동안 열처리하였다. 열처리된 토양 시료 5 내지 10 g에 1% NaCl 및 0.01% Tween 80이 첨가된 멸균 증류수 10 내지 20 ml을 첨가하여 교반 배양한 후, 상층액에 항곰팡이제(antifungal agent)인 코모졸(comozol) 200 mg과 나이스타틴(nystatin) 100 mg 및 항박테리아제(antibacterial agent) 반코마이신(vancomycin) 5 mg을 각각 첨가하여 배지위에 접종하고 10 내지 15 일 동안 출현하는 방선균을 분리하였다.

상기한 과정을 통하여 총 600여 종류의 방선균을 분리하였으며, 분리된 방선균은 다시 고체배지에서 순수 배양하여 각각의 방선균의 포자를 20% 글리세롤(glycerol)에 넣어 -85℃에 보존하고 6 개월마다 계대 보존하였다.

상기 분리한 방선균을 OSYM-Agar 배지(2% 귀리분(oatmeal), 1% 건조효 모(dried yeast), 1% 만니톨, 1% 콩분(soy been meal) 및 2% 한천(agar)에서 성장시키고, 30 ℃에서 5~7일 동안 인큐베이션시켰다. 원심분리를 통하여 상층액만 회수하여 이를 항-MRSA 물질 검색용 시료로 사용하였다. MRSA 균주의 보존은 보관용 접시(vial)에 최종 글리세롤의 농도가 20%가 되도록 한 후, -80℃에 보존하여 사용하였다.

항균 활성 물질의 생산을 위하여, 말토오스 1%, 귀리분 0.3%, 효모 추출물 0.3%, 콩분 0.3% 및 CaCO₂(pH 7.0) 0.1%로 이루어진 배양액을 로타리식 교반기 상에서 30 ℃에서 180 rpm으로 인큐베이션시켰다. 배양 여액의 안티-MRSA 활성은 종이판 확산법에 의해 검사하였다. 균주 CS682의 배양액은 높은 안티-MRSA 활성을 나타내었으며, 이 균주를 항생제 생성을 위하여 단리하였다.

그 결과, CS-682는 불규칙적이고, 막대모양의 요소로 매우 쉽게 분획화되는 회백색의 영양성 균체를 형성하였다. 이 균주는 그람 양성이고, 옥시다아제-양성 및 비 항산성 세균이다. 이 균주는 갈색의 확산성 색소를 생성하였으나, 멜라닌은 생성하지 않았다. 이 균주는 15~40℃에서 성장하였고(최적 온도는 35 ℃), 페놀 (0.1%), 포타슘 텔루라이트(tellurite) (0.001%), 탈로스 아세테이트(thallous acetate) (0.001%), 크리스탈 바이올렛 (0.0001%), 및 소듐 아자이드(0.01%)의 존재하에서 성장하였다. CS682 균주는 아미카신(amikacin, 30 ㎍/디스크, 이하 단위 생략함), 클로람페니콜(chloramphenicol, 30), 날리딕산(nalidixic acid, 30), 반코마이신(vancomycin, 30), 젠타마이신(gentamycin, 10) 및 테트라사이클 린(tetracycline, 30)에 대해서는 내성을 가졌으나, 폴리믹신(polymixin, 300U) 및 스트렙토마이신(streptomycin, 10)에는 민감성을 나타냈다.

본 발명의 균주는 엘라스틴, 크산틴, 알란토인(allantoin), 우레아, 구아닌, 아부틴(arbutine) 및 크실란(xylan)을 분해할 수 있다. 이들은 리파아제 및 니트르산 환원효소(nitrate reductase)는 생산하지 못하며, 갈락토오스, 수우크로스, 푸락토오스, 락토오스, 만니톨, 라피노오스, D-멜레지토오스, 아도니톨, 덱스트란, 자일리톨, L-아라비노오스, D-크실로오스, 살리신 및 소듐 피루베이트를 이용할 수 있었다. 이 균주는 DL-α-아미노-n-부티르산, L-쓰테오닌, L-시스테인, L-발린, L-페닐알라닌, L-히스티닌, L-히드록시프롤린 및 포타슘 니트레이트를 단독의 질소원으로 이용할 수 있었다. CS682 균주의 배양 브로쓰는 황색포도상구균, M. luteus의 성장은 억제하였으나, 바실러스 섭틸리스, 대장균, 사카로마이세스 세레비시애는 억제하지 않았다. 관련 종들과 구분되는 CS682의 특성은 표 1에 기재하였다. 다음의 균주 CS682가 그의 가장 가까운 계통수 이웃과 구분되는 표현형 특징을 나타낸다. Strains: 1, CS682; 2, N. tenerifensis DSM 44704T 3, N. brasiliensis ATCC 19296T, 4. N. argentinensis ATCC31306. 참고 균주의 데이터는 후술하는 Yamamura et al. (2005) 및 Kampfer et al. (2004)의 것으로부터 취하였다. 모든 종들은 그람 염색, L-히스티딘, 메조-이노시톨에 대하여 양성이다.

항 목	균주 1	균주 2	균주 3	균주 4
온도 범위(℃)	15~40	25~30	10~43	5~45
분해
알란토인	+	+	ND	ND
아르부틴	+	-	-	ND
엘라스틴	+	ND	+	ND
우레아	+	+	+	ND
크산틴	+	-	-	-
크실란	+	-	ND	ND
H2S 생산	-	ND	ND	-
지질분해	-	ND	ND	ND
질산염환원	-	ND	+	+
단독 탄소원 상의 성장
아세테이트	+	+	+	ND
아도니톨	+	-	-	-
L-아라비노오스	+	-	-	w
시트레이트	+	+	+	ND
D-프락토오스	+	-	+	w
D-갈락토오스	+	+	+	-
D-글루코오스	+	+	ND	+
D-락토오스	+	-	-	-
만니톨	+	+	+	-
D-멜리비오스	+	-	-	w
D-멜레지토오스	+	ND	ND	-
프로피오네이트	+	+	+	ND
피루베이트	+	+	+	ND
라피노오스	+	ND	ND	w
L-람노오스	+	-	-	-
살리신	+	-	-	-
수크로오스	+	-	-	w
D-크실로오스	+	-	-	w
단독 질소원상의 성장	+	-	-	-
아스파르테이트	+	+	-	ND
L-히스티딘	+	+	w	ND
L-페닐알라닌	+	-	-	ND

주된 지방산은 C18:1 ω9c (30.9%), C16:0 (30.3%), iso-C15:0 2-OH 및/또는 C16:1 ω7c (14.7%) 및 TBSA (10Me C18:0) (11.0%)이었다(표 2 참조). 다음의 표 2는 CS682 균주와 Nocardia 종의 대표 균주의 지방산 조성(%)를 나타낸다. 균주: 1, CS682; 균주 2, N. tenerifensis DSM 44704T, 균주 3, N. brasiliensis DSM 43758T. 참고 균주의 데이터는 Yamamura et al. (2005) 및 Kampfer et al. (2004)의 것으로부터 취하였다.

지방산유형	균주 1	균주 2	균주 3
포화지방산
C12:0	Tr	-	Tr
C14:0	Tr	Tr	1.4
C15:0	1.1	Tr	1.2
C16:0	30.3	44.5	40
C17:0	-	Tr	1
C17:1	2	NA	NA
C18:0	5.2	4.3	7.9
불포화지방산
C17:1 ω 8c	1.9	Tr	Tr
C18:1 ω 9c	31	15	24
합한 형태3	14.7	11.3	8.3
합한 형태5	-	Tr	1.2
TSBA 10 Me 18:0	11	20.3	12.9
Tr, 미량(<1%); -, 검출되지 않음; NA, 적용 불가함. - 합한 형태는 MIDI 시스템을 갖춘 GLC에 의해 분리될 수 없는 둘 또는 세 개의 그룹임. - 합한 형태 3은 하나 또는 두 지방산 C16:1ω7c 및 C15:0 iso 2-OH을 함유하고, 합한 형태 5는 하나 또는 두 지방산 C18:0 ante 및 C18:2ω6, 9c.를 함유함.

실시예 2: CS682 균주의 형태 생리학적 특성 및 유전자 계통 분석

CS682 균주의 형태 및 생리학적 특성은 Hayakawa 등에 의한 광학현미경에 의해 관찰하였다(참조문헌: Hayakawa, M., T. Takeuchi, and Y. Toyohiko. 1996. Combined use of trimethoprim with nalidixic acid for the selective isolation and enumeration of actinomycetes from soil. Actinomycetologica 10, 8090. ). 구체적으로 공기 포자(aerial spore) 덩어리 색깔 및 포자쇄(spore chian) 형태는 무기 염-녹말 한천 배지(ISP medium 4, Difco)에서 결정하였다(Shirling, E. B. and D. Gottlieb. Int. J. Syst. Bacteriol.16: 313-340, 1966). 생리학적 및 생화학적 특성은 잘 정립된 절차에 따라 결정하였다(참조문헌: Gordon, R.E., D.A. Barnett, J.E. Handerhan, and C.H.N. Pang.1974. Nocardia coeliaca, Nocardia autotrophica, and the nocardin strain. Int. J. Syst. Bacteriol. 24, 5463.; Isik, K., J. Chun, Y.C. Hah, and M. Goodfellow. 1999. Nocardia salmonicida nom. rev., a fish pathogen. Int. J. Syst. Bacteriol.49, 833837). 항생제 내성은 25℃에서 일주일 동안 인큐베이션시킨 TSA 상의 상업적으로 입수한 항생제-함침 디스크(BBL, Becton Dickinson)을 사용하여 디스크 확산법으로 결정하였다. 이들 결과는 CLSI (2003)에 규정된 지침에 따라 해석하였다. 세포벽 가수분해물 중의 디아미노피멜릭산 이성질체는 Hasegawa 등의 방법에 기초하여 분석하였다(참조문헌: Hasegawa, T., M. Takizawa, and S. Tanida. 1983. A rapid analysis for chemical grouping of aerobic actinomycetes. J. Gen. Appl. Microbiol. 29, 319322). 28℃에서 7일 동안 트립틱 대두 브로쓰(TSB, Difco) 상에서 성장시킨 균주 CS682로 부터의 세포내 지방산을 준비하여 미생물 확인 시스템(MIDI, 1999)의 지침에 따라서 GLC에 의해 분석하였다.

염색체 DNA는 Chun and Goodfellow(1995)에 의한 절차를 사용하여 시험 균주로부터 단리하였다(참조: Chun, J. and M. Goodfellow. 1995. A phylogenetic analysis of the genus Nocardia With 16S rRNA gene sequences. Int.J. Syst. Bacteriol. 45, 240-245.). 16s rDNA의 PCR 증폭은 KIM 등의 방법으로 수행하였다(Kim, D. et al., Int. J. Syst. Bacteriol.46: 581-587, 1996). 증폭된 DNA 절편은 Taq DyeDeoxy terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems) 및 상기한 바의 올리코뉴클레오타이드 프라이머들을 이용하여 직접적으로 염기서열을 분석하였다. 젤 전기영동을 이용한 염기서열 분석은 Applied Biosystems DNA sequencer(model 373A) 및 제조사에서 제공한 소프트웨어를 이용하였다. 핵산 서열은 GenBank 데이터베이스로부터 생성시킨 대응하는 방선균 뉴클레오티드 서열에 대하여 수작업으로 정렬시켰다. 계통도는 이웃 연결(Saitou and Nei, 1987) 방법을 사용하여 모든 서열에 대해 유용한 영역들(위치 28-1433; Escherichia coli 계수 시스템) 로부터 추론하였다(참조: Saitou, N. and M. Nei. 1987. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol. 4, 406-425.). 진화적 거리 매트릭스는 Jukes 등의 방법에 따라 생성하였다(참조: Jukes, T. H. and C. R. Cantor. 1969. Evolution of protein molecules. In mammalian Protein Metabolism, vol. 3, pp. 21-132. Edited by H. N. Munro. New York: Academic Press). 결과의 계통수 위상학은 1,000개의 리샘플링에 기초하여 이웃 연결 방식의 부트스트랩 분석 (bootstrap analyses, Felsenstein, 1981)으로 평가하였다(참조문헌: Felsenstein J. 1981. Evolutionary trees from DNA sequences: a maximum likelihood approach. J Mol Evol. 17, 368-376.). 상기 정렬 및 계통 분석은 jPHYDIT program (Jeon et al., 2005; http://chunlab. snu.ac.kr/jphydit)을 사용하여 수행하였다(참조문헌: Jeon, Y.-S., H. Chung, S. Park, L. Hur, J.-H. Lee, and J. Chun. 2005. jPHYDIT: a JAVA-based integrated environment for molecular phylogeny of ribosomal RNA sequences. Bioinformatics 21, 3171-3173). 계통 분석은 16S rRNA 유전자의 비교 서열 분석 결과로 수행한 후 계통수를 작성하였다.

CS682 균주의 16S rRNA 유전자의 전체 뉴클레오타이드 서열(1,414 bp)를 분석하고 그 서열을 서열번호 1 및 도 3에 나타냈고, 그의 서열 유사성은 하기 표 3에 각각 나타내었다.

균주	입수번호	유사 %	nt 차이/비교
Nocardia sp. DSM 43395	AF430057	99.08	13/1412
Nocardia tenerifensis DSM 44704T	AJ556175	98.72	18/1410
Nocardia brasiliensis DSM 43758T	AF430038	98.44	22/1412
Nocardia alba DSM 44682T	AY222321	98.36	23/1400
Nocardia lijiangensis KCTC 19028T	AY779043	98.16	26/1412
Nocardia takedensis DSM 44801T	AB158277	98.16	26/1412
Nocardia asteroides DSM 43757T	AF430019	98.01	28/1410
Nocardia xishanensis AS 4.1860T	AY333115	98	28/1399
Nocardia pseudobrasiliensis DSM 44290T	AF430042	97.94	29/1410
Nocardia abscessus DSM 44432	AF218292	97.72	32/1405
Nocardia asiatica DSM 44668T	AB092566	97.53	34/1379
Nocardia cyriacigeorgica DSM 44484T	AF430027	97.52	35/1412
Nocardia farcinica DSM 43665T	AF430033	97.52	35/1412
Nocardia transvalensis DSM 43405T	AF430047	97.52	35/1412
Nocardia cyriacigeorgica DSM 44484T	AF282889	97.52	35/1412
Nocardia araoensis IFM 0575T	AB108779	97.45	36/1412
Nocardia soli DSM 44488T	AF430051	97.38	37/1412
Nocardia cummidelens DSM 44490T	AF430052	97.38	37/1412
Nocardia beijingensis IFO 16342T	AF154129	97.37	37/1409
Nocardia higoensis IFM 10084T	AB108778	97.31	38/1412
Nocardia nova JCM 6044T	AF430028	97.3	38/1410
Nocardia polyresistens YIM 33361T	AY626158	97.3	38/1409
Nocardia shimofusensis IFM 10084T	AB108775	97.24	39/1412
Nocardia fluminea DSM 44489T	AF430053	97.09	41/1407

이 계통수에 의하면 균주 CS682는 Nocardia 속의 일원을 포괄하는 방사 범위 내에서 진화적 계통을 형성한다(도 1참조). 도 1은 CS682와 노카르디시에 과(family Nocardiaceae)의 관련 미생물의 관계를 나타내는 거의 완전한 16S rRNA 유전자 서열에 기초한 이웃-연결계통수를 나타내는 도면이다. 각 노드(node)에서 백분율은 계통수 위상학은 1,000개의 리샘플링에 기초하여 이웃 연결 방식의 부트스트랩 서포트(support)의 수준이다. Rhodococcus corynebacterioides DSM 20151T (AF430066)의 서열을 외집단(outgroup)으로 사용하였다. 바(Bar)는 위치당 0.01 뉴클레오타이드 치환을 나타낸다. 균주 CS682와 이웃하는 Nocardia sp. DSM 43395 및 Nocardia tenerifensis DSM 44704T 사이의 16S rRNA 유전자 유사성의 수준은 각각 99.08% 및 98.72%이었다.

Celmer 등(1980)은 Nocardia argentinensis Huang^TM(ATCC 31306)으로부터 생성되는 새로운 항생제, CP-47,444 (nargenicin)를 동정하였다(참조문헌: Celmer, W.D, G.N. Chmurny, C.E. Moppet, R.S. Ware, P.C. Watts, and E.B. Whipple 1980. Structure of Natural antibiotic CP-47,444. J.Am.Chem.Soc. 102,4203-4209). 그러나, Huang 균주의 생화학적 특성은 CS682 균주와 비교적 낮은 유사성을 나타냈다 (표 4 참조). 표 4는 Nocardia argentinensis 와 구분되는 Nocardia sp. CS682 의 생화학적 특성을 나타낸다.

특징	균주-1	균주-2
온도범위(℃)	15~40	5~45
질소 환원	-	+
나르제니신의 생산	+	+
크산틴의 분해	+	-
단독 탄소원 상에서의 성장
아도니톨	+	-
L-아라비노오스	+	-
D-갈락토오스	+	-
라피노오스	+	-
L-람노오스	+	-
D-멜리비오스	+	-
Strains: 1, Nocardia sp. CS682 2, Nocardia argentinensis ND, 결정되지 않음; +, 양성반응; -, 음성반응, 참고 균주에 대한 데이터는 상기 Celmer et al. (1980)로부터 취하였다.

본 발명자들이 단리한 Nocardia sp. CS682는 나르제니신을 생산하는 덜 알려진 미생물이다. 계통학적으로, 이 균주는 Nocardia sp. DSM 43395 및 Nocardia tenerifensis DSM 44704T 등의 Nocardia 속의 공지된 종들과 매우 유사하다 (도 1 참조). 그러나 CS682 균주의 생리학적 및 형태학적 특성은 이들 공지된 종들(참조문헌:　Kampfer, P., Buczolits, S., Jackel, U., Grun-Wollny, I. & Busse, H.-J. 2004. Nocardia tenerifensis sp. nov. Int J Syst Evol Microbiol 54, 381383; 및 Yamamura, H., Hayakawa, M., Nakagawa, Y., Tamura T., Komatsu F. & Iimura, Y. 2005. Nocardia takedensis sp. nov., isolated from moat sediment and scumming activated sludge. Int J Syst Evol Microbiol 55, 433436). 과는 다르다. 더욱이, 단리물의 나르제니신-생성 능력은 이들 두 이웃하는 종들에 비하여 고유한 특징이다.

실시예 3: 항-MRSA 화합물의 생산

본 발명의 노카르디아 속 CS682 균주의 성장 및 항-MRSA 항균활성 물질의 최적 생산조건을 밝히기 위하여, 본 발명자들은 OSYM을 기본배지로 하여 질소원과 탄소원 및 무기염류의 적절한 배합으로 최적 생산 조건을 조사하였다. 10여 가지의 발효배지 50 ml을 각각 250 ml 삼각플라스크에 접종하여 4 일간 배양한 전 배양액 4 ml을 배지 200 ml가 들어있는 1 L 삼각플라스크에 접종하고, 교반 배양기(rotary shaking incubater)에서 180 rpm으로 27℃, 10 일간 배양하면서 균체량, pH 변화 및 항-MRSA 활성도를 측정하였다.

그 결과, OSYM에 CaCO₃ 및 미량원소 용액(trace elementary solution)을 첨가한 배지(2% 귀리분, 1% 콩분, 1% 건조효모, 1% 만니톨, 0.1% CaCO₃ 및 0.5% 미량원소용액)에서 가장 많은 항균 활성 물질을 생산함을 확인하였다.

CS682 균주의 성장은 배양을 개신한지 3일째에 최고조에 달했고, 이후 성장이 감소하였다. 이 균주는 배양을 개시한지 48시간 후에 항균 활성 물질을 분비하였으며, 이것의 생산은 발효한지 5일 동안 계속되었다(도 2 참조). 도 2는 Nocardia sp. CS682의 배양여액으로 부터 항-MRSA 물질의 생산 프로필을 나타내는 도면이다. 배지의 pH는 최대 활성의 시점에서 7.8~8.2이었다.

실시예 4: 항균 활성 물질의 분리정제

항균활성 물질의 생산은 자르(Jar) 발효기(Ko Biotec)를 이용하여 30℃에서 발효 배지에서 수행하였다. 항균활성 물질을 단리하기 위하여, 5일 동안 배양한 노카르디아 속 CS682 균주의 배양액(10L)를 8,000 x g로 20분 동안 원심분리시켰다. 마이셀 케이크를 버린 다음 수용액을 에틸아세테이트 5L로 2회 추출하였다. 추출된 에틸아세테이트 분획을 증발시키고 회전 증발기를 사용하여 35℃에서 건조시켰다. 건조된 잔류물 2g을 메탄올 5ml에 용해시켰다.

항균활성 물질의 추가의 정제는 세파덱스-LH20(291 ml, 1.5x120 ㎝) 상에서 겔 투과에 의해 수행하고, 이어서 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(Merck Kieselgel, 17 ml, 1.2 x 15 ㎝)를 수행하였다. 컬럼을 헥산, 헥산-에틸아세테이트(2:1)로 세척한 후, 활성 물질을 헥산-에틸아세테이트(2:1)로 용출하였다. 활성 분획을 합하여 진공중에 농축시켰다. 활성 물질(이하, 활성 분획이라고도 함) 30 mg을 백색 분말로 얻었다.

실시예 5: 항균활성 물질의 기계적 분석

호모 (¹H-¹H) 및 헤테로 (¹H-¹³C) COSY를 포함하는 ¹H 및 ¹³C NMR 스펙트럼은 주변 온도 (¹H NMR at 300 MHz and ¹³C NMR at 75 MHz)에서 CDCl₃ 용액을 사용하여 VARIAN UNITY-300 INOVA 분관광도계 (Varian, USA) 상에서 얻었다. IR 스펙트럼은 Bruker FTIR-Equinox55 분광광도계(Bruker, German)를 사용하여 기록하였다.ESI0MS는 Mariner(Perseptive Biosystem, USA)를 사용하여 수행하였다. 항균활성 물질의 원소 분석은 한국기초과학연구소(KBSI, 서울)에서 수행하였다. TLC는 60 F254 (Merck, German)로 코팅시킨 알루미늄 플레이트를 사용하여 수행하하고, 헥산:에틸아세테이트=1:1 혼합물 (Rf=0.35)을 전개용매로서 사용하였다.

항균활성 물질은 백색의 결정으로 얻어졌다. FTIR 데이터를 포함하는 모든 물리화학적 특성을 조사하였다. 양성 FAB-MS 스펙트럼, 1H NMR, 13C NMR, 1H-1H 및 1H-13C COSY (HMQC 및 HMBC) NMR 스펙트럼은 CS-682 항균 물질의 분자식은 C₂₈H₃₇NO₈(M+, 515.25)임을 나타냈다. 분석 결과, 항균활성 물질은 하기 화학식 1의 나르제니신(nargenicin)인 것으로 확인되었다.

실시예 6: 항미생물 활성

임상용 MRSA 및 VRSA 균주는 대웅제약 중앙 연구소에서 분양 받고, 닭의 내장에서 분리한 VRE 균주는 원광대학교 병원에서 분양받아 상기 항균활성 물질(이하, 나르제니신이라고도 한다)의 항미생물 활성을 시험하기 위한 표적 미생물로서 본 실험에 사용하였다. 또한 국내 병원에서 분리한 MRSA(methicillin-resistant Staphylococcus aureus) 693E, MRSA 88E, MRSA 295E 등 10여 가지의 균주를 참고로 사용하였다. 항생제(Sigma Co., USA)를 사용하여 항미생물 활성을 비교하였다. 나르제니신 참고 항생제의 MIC를 한천 희석 방법을 사용하여 결정하였다.

나르제니신의 항미생물 활성을 MRSA 및 VRE를 포함하는 다양한 종류의 미생물에 대하여 결정하고, 그 결과를 표 5에 나타내었다. 표 5은 나르제니신(nargenicin)의 MRSA and VRE (ug/ml)를 포함하는 다양한 세균에 대한 MIC를 나타낸다.

번호	미생물	나르제니신	모넨신	옥사실린	반코마이신	예리트로마이신	스피라마이신
1	Alcaligenes faecalis ATCC 1004	>80	>80	80	>80	20	80
2	Enterococcus faecalis ATCC 29212	>80	2.5	5	2.5	2.5	10
3	Bacillus subtilis ATCC 6633	>80	2.5	0.6	0.3	0.125	5
4	Staphylococcus aureus KCTC 1928	0.6	5	0.6	5	10	20
5	Microccus leteus ATCC9341	2.5	10	0.6	2.5	0.008	2.5
6	Mycobacterium smegmatis ATCC	>80	2.5	0.6	1.25	2.5	10
7	Salmonella typhimrium KCTC 1925	>80	>80	20	>80	2.5	>80
8	Escherrichia coli KCTC 1923	>80	>80	>80	>80	>80	>80
9	Pseudomonas aeruginosa KCTC	>80	>80	>80	>80	80	>80
10	MRSA 693E*	0.3	0.6	>80	1.25	2.5	2.5
11	MRSA 5-3*	0.3	5	>80	10	>80	>80
12	VRSA**	>80	5	>80	>80	>80	>80
13	VRE82***	>80	0.6	>80	>80	>80	>80
14	VRE 89***	>80	0.6	>80	>80	>80	>80
15	VRE 98***	>80	1.25	>80	>80	10	2.5

상기 표 5에 나타낸 바와 같이, 항균활성 물질(나르제니신)은 MRSA를 포함하는 Staphylococcus aureus 및 Micrococcus luteus에 대하여 항미생물 활성을 나타내었다. 대조적으로, VRE 및 VRSA를 포함하는 기타의 그람 양성 세균 및 모든 그람 음성 세균에 대하여는 항미생물 활성을 나타내지는 않았다. 본 발명 항균활성 물질의 이 특이한 항미생물 패턴은 나르제니신의 것과 일치된다. 특히, 항균활성물질은 MRSA에 대하여 임상적으로 사용되는 반코마이신 보다 더 강력한 항-MRSA 활성을 나타냈다. 또한, 항균활성 물질은 임상적으로 사용되는 마크로라이드 항생제인 에리트로마이신 및 스피라마이신 보다 강력한 항-MRSA 활성을 나타내었다.

상기한 결과를 종합 분석한 결과 본 발명의 항균 활성 물질은 기지물질인 나르제니신으로 판명되었다. 이는 본 발명의 노카르디아 속 CS682 균주 및 이로부터 생산되는 항균 활성 물질이 기존의 항생제에 내성을 보이는 MRSA의 감염증 치료제로 이용될 수 있음을 의미한다.

실시예 7: 항균활성 물질의 세포독성 분석 시험

항균활성물질(나르제니신), 에리쓰로마이신, 스피라마이신 및 모넨신의 시험관내 세포독성을 MTT[3-(4,5)-디메틸티아졸-2,5-디페닐 2H-테트라졸륨 브로마이드, Sigma]를 사용하여 수행하였다. 참조문헌: Pieters, R., D.R.Huismans, A. Leyva, and A.J. Veerman. 1988. Adaptation of the rapid automated tetrazolium dye based (MTT) assay for chemosensitivity testing in childhood leukemia, Cancer Lett. 41, 323-332. 세포독성연구를 위하여 시료에 소량의 DMSO (dimethylsulfoxide)를 가하여 세포독성 물질 검색용 시료를 준비하고, 시험 세포주로는 사람 폐암 세포주인 SK-MES-1/WT, 사람의 섬유아세포주인 HaCaT, 사람급성골수성백혈병세포주인 AML-2/WT를 사용하여 MTT 방법으로 세포독성을 측정하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 시험결과 항균활성 물질(cs 682)은 100ug/ml의 농도까지 전혀 세포독성이 없는 반면, 에리쓰로마이신 및시프라마이신은 10~20ug/ml에서 현저한 세포독성을 나타냈다. 항균활성 물질 및 이것의 발효 배양액의 항-MRSA 활성, 낮은 독성 및 항산화활성을 고려할 때, 본 발명의 물질들은 항생제 내성 병원균을 제어하기 위한 동물 사료 첨가제 및 성장 조절제로서의 용도가 뒷받침된다.

실시예 8: 항균활성 물질의 항산화 활성 분석

최근 동물의 노화 및 관련 질환의 원인으로 생체내에서 발생하는 하이드록실 라디칼(-OH), 슈퍼옥사이드라디칼(O₂ ^-), 과산화수소(H₂O₂) 등과 같은 활성산소종(reactive oxygen species)에 의한 산화적 대사과정의 부산물들이 중요 원인으로 대두되고 있다. 항균활성 물질의 항산화활성 조사를 통해 산화적 스트레스를 제거할 수 있는 효능을 확인하고자 본 실험을 실시하고 그 결과를 도 5에 나타냈다. 항산화 활성은 시료의 DPPH(1,1-diphenol-2-2picrylhydrazyl) 라디칼 제거 효능을 Schlesier 등 (2002, Free Radic Res 36:2, 117-187)의 방법으로 측정하여 평가하였다. 도 5는 항균활성 물질(cs 682), 에리쓰로마이신, 스파라마이신의 항산화 활성을 나타낸 그라프도이다. 도 5의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 항균활성 물질은 0.2 mg/ml의 농도에서부터 항산화 활성이 나타나기 시작하여 6 mg/ml의 농도에서 100% 활성을 보였다. 유사구조인 에리쓰로마이신이나 스파라마이신은 이 범위의 농도에서 항산화 활성이 거의 없었다. 따라서, 항균활성 물질 및 이것의 발효 배양액은 건강 유지 및 증진을 위해 유익하게 이용될 수 있음을 알 수 있다.

실시예 9: 동물 성장 촉진 시험/사료효율개선 시험

Nocardia sp. CS682의 배양액에 대하여, 항생제 내성 병원균을 제어하고 성장을 촉진하는 동물용 기능성 사료 첨가제로서 사용가능성에 대하여 육계(초생추, 100마리)를 대상으로 시험하였다. 구체적으로, 대조군에는 일반 육계용 사료를 급여하였고, 실험군에는 일반 사료에 항균활성 물질 첨가 기능성 사료를 각각 1%, 0.1%의 농도로 첨가하여 28일간 자유급여하고 다음의 항목에 대하여 시험하였다. 공통적으로 폐사율은 매일 측정하였고, 2주 째에는 체중을 측정하였으며, 4주후에는 체중 측정, 채혈, 안락사 후에 육안적 장기 검사를 수행하고 그 결과를 표 5 내지 8 및 도6에 나타내었다. 주요 시험 항목은 다음과 같다: (가) 시험기간 중 일반 증상과 사망률을 관찰하여 질병예방기능을 평가하고, (나) 시험개시 시와 2주 및 4주 후에 각 시험군의 체중을 측정하여 성장촉진 기능을 평가하였으며, (다) 사료효율기능검색: 시험기간 중 체중증가량과 사료섭취량을 측정하여 사료효율 평가, (라) 안전성평가: 혈액검사 및 부검소견을 통해 안전성 평가, (마) 자료의 통계처리: 군간간 차이를 검정하였다. 표 6은 항균활성 물질 함유 사료를 급여한 닭의 생존율 데이터이고, 표 7은 항균활성 물질 함유 사료를 급여한 닭의 평균 체중 변화 데이터이며, 표 8은 항균활성 물질 함유 사료를 급여한 닭의 사료전환율 데이터이고, 표 9는 항균활성 물질 함유 사료를 급여한 닭의 혈액학적 분석 데이터이다. 도 6은 병아리의 전체적인 부검 결과를 나타내는 산진이다.

항균활성 물질 함유 사료를 급여한 닭의 생존율 데이터

	시험군
	대조군	0.1%급여군	1%급여군
시험한 닭의 수	34	33	33
생존한 닭의수	34	33	33
사망개체수	0	0	0
사망률(%)	0	0	0
생존율(%)	100	100	100

항균활성 물질 함유 사료를 급여한 닭의 평균 체중 변화 데이터

	시험군
	대조군	0.1%급여군	1%급여군
시험한 닭의 수	34	33	33
체중 (g, 0일)	47.80	43.94	45.45
체중 (14일)	235.30	237.90	239.40
체중 (28일)	432.35	484.85	515.15

항균활성 물질 함유 사료를 급여한 닭의 사료전환율 데이터

항 목	시험군
	대조군	0.1%급여군	1%급여군
초기 체중(g/개체)	47.80	43.94	45.45
최종 체중(g/개체)	432.35	484.85	515.15
체중 증가(g/개체/일)	13.73	15.75	16.78
사료 섭취(g/개체/일)	28.47	28.25	28.36
사료전환율(급여/증가)	2.07	1.79	1.69

항균활성 물질 함유 사료를 급여한 닭의 혈액학적 분석 데이터

항 목	시험군
	대조군	0.1%급여군	1%급여군
시험 개체수	10	10	10
RBC (M/㎕)	2.92±0.24	3.02±0.28	15.72±0.19
Hb (g/dl)	15.14±0.72	15.7±0.89	15.72±1.15
HCT (%)	32.76±2.69	33.51±3.10	32.4±1.95
MCV (fl)	112.31±3.86	110.87±2.94	112.35±1.95
MCH( pg)	52.04±3.29	52.18±2.49	54.53±1.82
MCHC (g/dl)	44.44±3.52	47.09±2.18	48.5±1.93
RDW (%)	9.43±0.51	9.64±0.48	9.64±0.41
PLT( K/㎕)	264.71±203.27	293.1±285.12	137.9±16.81
WBC (K/㎕)	14.15±4.11	16.61±5.35	19.93±6.58
NE (K/㎕)	1.58±0.81	1.72±0.95	3.03±1.63
LY (K/㎕)	11.24±0.07	13.44±4.14	14.84±4.14
MO (K/㎕)	1.17±0.37	1.30±0.56	1.77±0.67
EO (K/㎕)	0.12±0.11	0.09±0.11	0.26±0.19
BA (K/㎕)	0.04±0.06	0.01±0.02	0.04±0.05
a 값은 평균±S.D로 나타냈다. RBC (red blood cells), HB (hemoglobin), HCT (hematocrit), MCV (mean corpuscular volume), MCH (mean corpuscular hemoglobin), MCHC (mean corpuscular hemoglobin concentration), RDW (red cell distribution width), PLT (platelet). WBC (white blood cells), NE (neutrophils), LY (lymphocytes), MO (monocytes), EO (eosinophils), BA (basophils).

이상의 결과로부터, 대조군 및 발효 배양물 0.1, 1% 첨가군 모두에서 100% 생존률을 보였으며, 실험개시 후 14일까지는 증체량 및 사료효율에서 군 간에 큰 차이를 보이지 않았으나(대조군과 비교하여 0.1%군-105%, 1%군-103.7%의 사료효율), 실험개시 후 28일째에 발효 배양물 0.1% 및 1% 첨가군은 대조군에 비해 증체량 및 사료효율이 크게 증가하였다(대조군과 비교하여 0.1%군-115.64, 1%군-122.49%의 사료효율). 또한, 발효 배양물의 급여는 생체 대사에 영향을 미치지 않았다. 세 군 모두 부검 시 근육(가슴살), 흉강 및 복강장기, 위점막, 뇌 등 모든 신체 장기가 육안적으로 정상이었다. 이러한 결과는 본 발명의 항균활성 물질 및 발효 배양액이 동물용 사료 첨가제로서 효율적으로 이용될 수 있음을 나타낸다.

이상에서 살펴 본 바와 같이, 본 발명의 토양으로부터 분리되어 메티실린 내성 균주에 유효한 화합물을 생산하는 새로운 노카르디아 속 CS682 균주 및 상기 균주에 의하여 생산되며 MRSA 균주와 M. luteus에 대해서 우수한 항생능력을 보이는 항균 활성 물질은 기존 항생제의 계속되는 사용으로 인한 감염균의 내성화 문제를 해결할 수 있으며, 특히 기존 항생제에 의하여 생긴 MRSA의 감염증 치료제 뿐만 아니라 항산화제, 동물사료 첨가제 등으로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 거의 완전한 16S rRNA 유전자 서열에 기초한 이웃-연결 계통도.

도2는 Nocardia sp. CS682의 배양 브로쓰로부터 항-MRSA 물질의 생산 프로필을 나타내는 도면.

도 3은 본 발명에 따른 신규 노카르디아 속의 16S rRNA의 서열을 나타내는 도면.

도 4는 항균활성 물질의 비교 독성을 나타내는 도면.

도 5는 본 발명의 항균활성 물질의 항산화 효과를 나타내는 그라프도.

도 6은 병아리의 전체적인 부검 결과를 나타내는 사진.

<110> Chosun University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> New Nocardia sp. CS682 and animal feed additive containing its compound acting against methicillin-resistant STAPHYLOCOCCUS aureus <130> pkr-0168 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1524 <212> DNA <213> Nocardia sp. <400> 1 gaacgctggc ggcgtgctta acacatgcaa gtcgagcggt aaggcccttc ggggtacacg 60 agcggcgaac gggtgagtaa cacgtgggtg atctgcctcg cacttcggga taagcctggg 120 aaactgggtc taataccgga tatgaccatg ggatgcatgt ttcgtggtgg aaagatttat 180 cggtgcgaga tgggcccgcg gcctatcagc ttgttggcgg ggtaacggcc caccaaggcg 240 acgacgggta gccgacctga gagggtgacc ggccacactg ggactgagac acggcccaga 300 ctcctacggg aggcagcagt ggggaatatt gcacaatggg cgaaagcctg atgcagcgac 360 gccgcgtgag ggatgacggc cttcgggttg taaacctctt tcgacaggga cgaagcgcaa 420 gtgacggtac ctgtagaaga agcaccggcc aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt 480 agggtgcgag cgttgtccgg aattactggg cgtaaagagc ttgtaggcgg tctgtcgcgt 540 cttctgtgaa aacttggggc tcaaccttaa gcttgcaggc gatacgggca gactagagta 600 cttcagggga gactggaatt cctggtgtag cggtgaaatg cgcagatatc aggaggaaca 660 ccggtggcga aggcgggtct ctgggaagta actgacgctg agaagcgaaa gcgtgggtag 720 cgaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg gtgggtacta ggtgtgggtt 780 tccttccacg ggatccgtgc cgtagctaac gcattaagta ccccgcctgg ggagtacggc 840 cgcaaggcta aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggcgga gcatgtggat 900 taattcgatg caacgcgaag aaccttacct gggtttgaca tacaccggaa acctgcagag 960 atgtaggccc ccttgtggtc ggtgtacagg tggtgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgtcgt 1020 gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttgt cctgtgttgc cagcgcgtaa 1080 tggcggggac tcgcaggaga ctgccggggt caactcggag gaaggtgggg acgacgtcaa 1140 gtcatcatgc cccttatgtc cagggcttca cacatgctac aatggccggt acagagggct 1200 gcgataccgt gaggtggagc gaatccctta aagccggtct cagttcggat cggggtctgc 1260 aactcgaccc cgtgaagttg gagtcgctag taatcgcaga tcagcaacgc tgcggtgaat 1320 acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacgtcatga aagtcggtaa cacccgaagc 1380 cggtggccta accccttgtg ggagggagcc gttcagcaac gctgcggtga atacgttccc 1440 gggccttgta cacaccgccc gtcacgtcat gaaagtcggt aacacccgaa gccggtggcc 1500 taaccccttg tgggagggag ccgt 1524

Claims (5)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 토양에서 분리된 노카르디아 속 (Nocardia sp.) CS682 균주 KCTC 11297BP를 발효 배양시켜서 얻은 나르제니신을 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화제.

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