KR100990768B1

KR100990768B1 - 초산성 생장 혼합 미생물 조성물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR100990768B1
Application number: KR1020090105264A
Authority: KR
Inventors: 이종수
Original assignee: 이종수; 운석식품(주)
Priority date: 2009-11-03
Filing date: 2009-11-03
Publication date: 2010-10-29
Also published as: WO2011055927A3; WO2011055927A2; KR20090123838A

Abstract

본 발명은 초산성 생장 혼합 미생물 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 혼합 조성물은 유산균 및 효모로 이루어져 있으며 초산성 조건에서 생장이 가능하다. 본 발명에 따른 미생물을 사료로 첨가하였을 때 위산에 의해 사멸되지 않고 장내까지 잘 도착하며, 장내 세균에 항균효과가 있어 병원성 미생물로부터 동물의 감염을 막아 동물의 생장을 촉진한다. 또한 상기 혼합미생물은 음식물 쓰레기 또는 가축 분뇨 등에서 나오는 냄새 등을 줄일 수 있다.

초산성 미생물, 동물 사료, 소취제

Description

초산성 생장 혼합 미생물 조성물 및 이의 용도{Composition of mixed microorganism growing in super highly acidic condition}

본 발명은 초산성 유산균 및 초산성 효모를 함유하는 미생물제제에 관한 것으로, 초산성에서 생장이 가능하여 강한 위산에 의해 사멸되지 않고 장내에 도달이 가능하여, 장내에서 살면서 발효를 통해 그의 고유 소화 효소, 고유 유기산 및 고유 박테리오신으로 구성된 천연 "칵테일"의 조성물을 제공하여 동물의 생장을 촉진할 수 있는 혼합 미생물제제에 관한 것이다.

돼지 뿐만 아니라 닭, 가금 및 새우와 같은 동물의 위 및 장 내에서의 병원성 세균 감염은 농부들뿐만 아니라 소비자에게도 커다란 문제 거리이다. 농부가 사육지에서 매우 엄격한 위생 기준을 지킨다 하더라도, 이러한 감염을 방지하는 것이 매우 어렵다. 젖을 뗀 새끼 돼지의 심한 설사증 발병은 장 내 천연 대장균과 젖산의 관계에 있어서의 면역학적 인자에 따라 좌우된다. 감염에 대항하기 위해 항생물질을 자주 사용하는 것은 생물농축 현상에 의해 상기 가축들을 식용으로 이용하는 인간에게 농축된 항생물질의 공급을 가져오고, 지속적인 항생제의 노출은 항생제 저항성 균주의 생존을 도와서 항생제 내성 균주가 발생되는 큰 문제가 된다. 이러 한 몇몇의 세균이 다수의 항생물질에 대해 내성을 갖게 되어, 그 결과 항생물질로 처치할지라도 동물이 죽게 된다. 일단 병원성 세균으로 인해 장내 균총의 불균형이 야기되면, 음식물의 소화능이 감소하므로 정상적인 방식으로는 동물의 체중을 늘일 수가 없다. 이러한 명백한 사육자의 경제적인 손실 외에도, 고기의 질이 저하되는 경우가 허다하고, 이 고기의 소비자가 감염될 수 있다는 위험도 존재한다. 세균 감염에 매우 민감한 일군의 동물들은 새끼 돼지로, 암퇘지로부터 빈번하게 감염되게 된다. 새끼 돼지들을 젖 뗄 무렵 암퇘지로부터 격리하여 고형 사료를 먹이기 시작하면, 이들은 장에서 심각한 문제를 보이게 된다. 이 문제는 새끼 돼지들이 죽을 정도로 심한 경우가 흔하다. 또한, 이러한 감염은, 몇몇 새끼 돼지들이 죽는 것뿐만 아니라 감염된 동물들의 사육 기간이 과도하게 길어지므로, 농부들에게 커다란 경제적인 문제를 야기하게 된다. 조류에 있어서 살모넬라 및 캄필로박터 감염은 매우 흔하며, 농부들에게 지대한 경제적인 손실을 야기하고 닭의 소비자에게 중증 감염 내지 치명적인 감염을 야기한다. 닭의 사육에 있어서 살모넬라 감염은 살모넬라 세균이 모든 종류의 항생물질에 대해 고도의 내성을 나타내게 됨에 따라, 전세계에 걸쳐 구제불능의 상태로 진전하고 있다.

이론적으로 상기 문제들을 해결하는 가장 좋은 방법은 아마도, 병원성 세균이 점액질 막 표면으로 부착되는 것을 막는 방법을 찾거나, 또는 세균총의 불균형으로 이미 고통을 받고 있는 동물들에 대해서는, 정상 세균총을 회복시키는 방법을 찾아내는 것이다.

락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) 미생물은 동형 또는 이형발효를 하는 젖산간균으로 사람을 포함한 동물의 장관 및 유제품이나 채소의 발효과정에서 흔히 볼 수 있다. 락토바실러스 속 미생물은 장내 pH를 산성으로 유지시켜 대장균(E. coli)이나 클로스트리디움(Clostridium)과 같은 유해균의 번식을 억제하고 설사와 변비를 개선할 뿐만 아니라 면역기능, 비타민 합성, 항암작용, 혈청콜레스테롤 저하 등의 역할을 한다. 젖산 간균에 의해 생산되는 아시도필린(acidophillin)은 이질균, 살모넬라균, 포도상구균, 대장균등의 성장을 저해한다고 알려져 있다. 또한, 설사 원인균의 증식을 억제하고 장내 균총을 정상화함으로 설사를 멈추게 하는 작용을 한다.

가축의 세균성 설사병은 증체율 감소와 폐사를 유발한다. 따라서, 이를 예방하여 가축의 생산성을 높이고자, 사료에 항생물질을 첨가하는 것이 일반적으로 널리 행해져 왔다. 그러나 항생물질에 대한 내성균의 출현과 축산물 내 잔류 항생물질 등의 문제 때문에 사료 내 항생물질의 사용을 규제하는 방향으로 정책이 추진되고 있으며 유기적인 가축 사육법이 강조되고 있다. 현재 항생물질 사용의 대체방법으로는 생균제(Probiotics)의 사용이 적극 권장되고 있다. 최근에 락토바실러스 속 미생물의 상기와 같은 특성을 이용하여 생균제 및 가축사료로 개발하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다.

유럽특허 제0861905호에는 신규한 락토바실러스 속 균주 및 이를 포함하는 위장질환의 치료를 위한 약학적 조성물 및 유제품이 개시된 바 있으며, 국제특허 제99/29833호에는 식품에 적용될 수 있는 생균제 및 천연약제로서 유용한 균주인 락토바실러스 파라카제이가 개시된 바 있다.

대한민국특허공개 제1998-78353호에는 유해미생물 억제 활성을 갖는 신규 내산성 락토바실러스 속 미생물 및 이를 함유하는 가축용 생균 활성제가 개시된 바 있다.

대한민국특허출원 제10-2001-0085666호는 김치의 발효액으로부터 분리 동정된 신규한 락토바실러스 속 미생물인 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) 및 이의 생균제, 사료제, 소취제 및 식품 첨가물로서의 용도를 개시하고 있다.

우가르트(Ugarte MB) 등은 2006년 식품 단백질 잡지(J. Food Prot.) 69권 2983-91페이지에서 아르헨티나 치즈로부터 락토바실러스 퍼로런스(Lactobacillus perolens), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토박실러스 플란타룸(Lactobacillus plantatum), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus, 락토바실러스 쿠바투스(Lactobacillus qubatus) 및 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus permentum)을 분리하였고, 모든 종들이 25ppm의 리소자임에 저항성이 있었으며, 0.3% 담즙산에 저항성이 있었으며, pH 2.0의 위산용액에서도 3.2 내지 7의 로그(log) 단위가 감소하며, 병원성 세균에 항균작용을 보인다고 보고하였다.

덱케라 브루셀렌시스 효모를 이용한 발명으로서는 일본 특허공보 3084348호(1995.06.2 출원)에서는 단시간에 위생적으로 홍차 키노코 음료를 공업적으로 생 산하는 방법에 관한 것으로 아세토박터 파스테우리아누스(Acetobacter pasteurianus) 아세토박터 아세티(Acetobacter aceti), 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomycesce cerevisiae), 브렛타노마이세스 브루셀렌시스(Brettanomyces bruxellensis), 및 자이고사카로마세스 바일이(Zygosaccharomycesce bailii)로 부터 선택된 1종 또는 2종 이상을 선택하는 것을 특징으로 하는 홍차 버섯 음료 생산균 및 홍차버섯 음료의 생산방법이 기재되어 있다.

미국특허공보 5512465호(출원일 1994.05.23일 출원)에서는 광학적으로 활성의 1.3-부탄에디올을 생산하는 방법으로서 덱케라 브루셀렌시스(Dekkera bruxellensis)를 사용한 바 있다.

2006년 콘테르노(L. Conterno) 등은 브렛타로마세스 브루셀렌시스( Brettanomyces bruxellensis ) 균주의 유전적 및 생리적 특징에 대해서 미국 포도주 및 포도재배방법 잡지(Am. J. Enol. Vitic 57(2):139-147)에서 발표하면서 비. 브루셀렌시스(B. bruxellensis) 의 47 균주 모두가 10% 알코올 농도에 내성이 있었으며, 균주 모두가 pH 2.5(이들중 94%는 pH 2.0에서 생존가능)에서 생장이 가능했고, 균주의 1/3는 10℃에서 성장이 가능했고, 다른 1/3은 37℃에서 생존할 수 있었다고 보고하였다.

또한, PCT/SE1997/00252호(1997.2.14일 출원)에서는 페디오코커스 펜토사세우스, 페디오코커스 아시딜락티시, 피키아 패리노사, 덱케라 브루셀렌시스, 바실러스, 스트렙토코커스, 스타필로코커스의 미생물 중 3 종 이상을 포함하는 비반추 동물 사료 첨가제에 대한 보고가 있었다. 상기 문헌에서는 상기 미생물이 위산에 내 성을 보이고, 인간에 무독하며, 살균효과 및 면역성 향상 효과를 보인다고 하였다.

그러나 덱케라 브루셀렌시스와 락토바실러스 카제이, 락토바실러스 페론런스의 혼합물이 항균효과, 동물 생장 촉진 효과, 악취제거효과가 있다는 보고는 없었다. 본 발명자는 초저산성에서 생장이 가능한 덱케라 브루셀렌시스와 초저산성에서 생장 가능한 유산균의 혼합물이 항균효과, 동물생장촉진 및 악취제거 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 항균효과, 동물 생장 촉진 효과, 악취제거효과가 있는 덱케라 브루셀렌시스와 락토바실러스 카제이, 락토바실러스 페론런스을 포함하는 미생물제제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

락토바실러스 카제이 WS-1(KCCM10896P), 락토바실러스 카제이 W-1(KCCM10897P), 락토바실러스 페로런스 W-3(KCCM10898P), 락토바실러스 카제이 W-4(KCCM10899P) 및 락토바실러스 카제이 W-6(KCCM10900P) 및 데케라 브루셀렌시스 WY-1 (KCCM10901P)로 이루어진 미생물제제를 제공한다.

본 발명은 초산성 생장 혼합 미생물 조성물은 유산균 및 효모로 이루어져 있으며 초산성 조건에서 생장이 가능하다. 본 발명에 따른 미생물을 사료로 첨가하였을 때 위산에 의해 사멸되지 않고 장내까지 잘 도착하며, 장내 세균에 항균효과가 있어 병원성 미생물로부터 동물의 감염을 막아 동물의 생장을 촉진한다. 또한 상기 혼합미생물은 음식물 쓰레기 또는 가축 분뇨 등에서 나오는 냄새를 효과적으로 제거한다. 따라서 동물사료에 첨가되는 항생제를 대체할 수 있어 인류의 건강에 기여할 수 있으며, 악취 제거 등에 효과적이어서 인간 생활 환경 개선에 효과적으로 사용될 수 있다.

본 발명은 락토바실러스 카제이 WS-1(KCCM10896P), 락토바실러스 카제이 W-1(KCCM10897P), 락토바실러스 페로런스 W-3(KCCM10898P), 락토바실러스 카제이 W-4(KCCM10899P) 및 락토바실러스 카제이 W-6(KCCM10900P) 및 데케라 브루셀렌시스 WY-1 (KCCM10901P)을 포함하는 것을 특징으로 하는 항균제 미생물 조성물을 제공한다. 상기 미생물 조성물에는 박테리오신 및 유기산 등과 같은 부가적인 물질을 추가로 포함할 수 있다. 상기 유기산은 젖산, 수산, 초성포도산, 호박산, 주석산, 말레익산, 사과산 및 구연산으로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 조합을 포함할 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 항균제 조성물에는 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 산제 및 과립제로 제형화될 수 있다. 예컨대 경구용 액제의 경우는 약제학적으로 허용 가능한 담체로서 증류수, 올레인산 에칠, 에탄올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등; 항산화제로서 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, 토코페롤 등; 보존제로서 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 파라옥시안식향산메칠, 벤질알코올 등을 이용하여 제조된다. 동물용 산제 및 과립제는 통상적으로 사용되는 비타민류, 글루코스, 락토스 등의 당류, 전분, 말분, 질석 또는 각종 분말 및 액상효소를 사용량 범위로 함유시켜 제조된다.

또한, 본 발명에 따른 복합항균제의 투여는 액제는 직접 경구 또는 음수에 혼합하여 투여하고 산제 및 과립제는 음수 및 사료에 혼합하여 투여한다.

본 발명의 제 2 태양은 락토바실러스 카제이 WS-1(KCCM10896P), 락토바실러스 카제이 W-1(KCCM10897P), 락토바실러스 페로런스 W-3(KCCM10898P), 락토바실러스 카제이 W-4(KCCM10899P) 및 락토바실러스 카제이 W-6(KCCM10900P) 및 데케라 브루셀렌시스 WY-1(KCCM10901P)을 포함하는 것을 특징으로 하는 동물 사료용 미생물 조성물을 제공한다. 이에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 상기 동물은 돼지 또는 닭이다.

상기 미생물 조성물에는 박테리오신 및 유기산등과 같은 부가적인 물질을 추가로 포함할 수 있다. 상기 유기산은 젖산, 수산, 초성포도산, 호박산, 주석산, 말레익산, 사과산 및 구연산으로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 조합을 포함할 수 있다.

상기 사료로는 옥수수, 소맥, 밀, 대두밀, 콩, 쌀, 등의 어느 하나 또는 이들의 혼합물을 분쇄하여 얻어지는 분쇄물과, 이들을 가공하는 과정에서 얻어지는 쌀겨, 밀겨, 보리겨와 같은 가공 부산물이 사용될 수 있다.

본 발명의 제 3의 태양은 락토바실러스 카제이 WS-1(KCCM10896P), 락토바실러스 카제이 W-1(KCCM10897P), 락토바실러스 페로런스 W-3(KCCM10898P), 락토바실러스 카제이 W-4(KCCM10899P) 및 락토바실러스 카제이 W-6(KCCM10900P) 및 데케라 브루셀렌시스 WY-1(KCCM10901P)을 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 미생물 조성물을 제공한다.

상기 미생물 조성물에는 박테리오신 및 유기산등과 같은 부가적인 물질을 추 가로 포함할 수 있다. 상기 유기산은 젖산, 수산, 초성포도산, 호박산, 주석산, 말레익산, 사과산 및 구연산으로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 조합을 포함할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 통상적인 방법에 따라 분말, 캅셀, 환, 정제 및 드링크제 등의 섭취하기에 간편한 형태로 제형화될 수 있다.

상기 조성물들은 또한 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 식품용 개발을 위하여 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 육류, 음료수, 초코렛, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 알코올음료류, 비타민 복합제, 건강보조식품류 등이 있다.

본 발명의 제 4 태양은 락토바실러스 카제이 WS-1(KCCM10896P), 락토바실러스 카제이 W-1(KCCM10897P), 락토바실러스 페로런스 W-3(KCCM10898P), 락토바실러스 카제이 W-4(KCCM10899P) 및 락토바실러스 카제이 W-6(KCCM10900P) 및 데케라 브루셀렌시스 WY-1(KCCM10901P)을 포함하는 것을 특징으로 하는 소취제 미생물 조성물을 제공한다.

상기 소취제 조성물을 위한 담체로는 분말상의 점토류, 활성탄, 코크스, 제 철소 폐슬래그, 화산재, 연소재로 구성되는 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 담지물질을 사용할 수 있으며, 점토류로는 제올라이트, 질석, 규조토, 고령토, 옹기토, 장석, 차지토, 활석 등을 사용할 수 있다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1 > 미생물 제제 피드프리 ™ 내 미생물의 종류 분석

1. 실험방법

1) 락토바실러스 균주의 분리

운석식품(주)의 피드프리™ 미생물제제로부터 유산균을 분리하기 위하여, MRS 평판배지에 형성된 균주 중 흰색 콜로니를 선택하여 분리하였다.

(1) 분리균주의 콜로니 형태 관찰

미생물제제로부터 분리된 균주을 0.002%의 브로모페놀 블루(bromophenol blue; BPB)가 첨가된 MRS 배지에 접종하고 37℃에서 24시간 배양 후, 콜로니의 색과 형태를 해부현미경(Zoom 2000, Leica) 하에서 관찰하였다.

(2) 분리균주의 그람염색

① 슬라이드에 세균을 도말하고 열 고정 후, 크리스탈 바이올렛(crystal violet) 용액으로 1분 동안 염색한다.

② 아이오다인(Iodine) 용액으로 1분 동안 염색처리한다.

③ 에탄올에 30초 동안 탈색시킨다.

④ 광학현미경(Nikon, Eclipse 80i)으로 관찰하여 그람염색성을 판정한다.

(3) 주사형 전자현미경(SEM)을 이용한 형태 관찰

① 균주의 배양

: 유산균 선택배지 MRS에 배양한다

② 글루타알데하이드(Glutaraldehyde고정)

: 배양된 유산균을 2.5%의 Glutaraldehyde에서 24시간 동안 고정한다.

③ 탈수

: 50% 및 70%, 80%, 90% 및 100% 농도의 에탄올을 순차적으로 처리한다.

④ 건조

: 50% 및 100%의 이소아밀 아세테이트(Isoamyl acetate)를 처리한다.

⑤ 금 코팅(Gold coating)을 한다.

⑥ 주사형전자현미경(XL30ESEM, philips)으로 관찰한다.

2) 효모 균주의 분리

피드프리™ 속의 효모는 효모전용배지 PDA(Potato Dextrose Agar, Difco) 배지에서 3일간 28℃에서 3일간 배양한 후 주사형전자현미경(XL30ESEM, philips)으로 형태를 관찰하였다.

3) 미생물 제제로부터 분리된 분리균주의 염기서열 분석

(1) 세균의 염기서열 분석

순수 분리된 분리균주를 트립티카아제 대두 한천배지(Trypticase Soy Brith Agar; TSA, Difco)에서 150rpm으로 진탕배양하였다. DNA는 QIAamp DNA 미니 키트(QIAamp DNA Mini Kit, QIAGEN)를 사용하여 추출하였다. 16S rDNA의 PCR 증폭에 사용된 프라이머는 표 1과 같다. PCR 증폭은 95℃에서 2분 동안 반응시킨 후, 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 45초로 30 사이클 반응시키고 72℃에서 5분 동안 반응시켰다.

16S rDNA의 PCR 증폭에 사용된 프라이머

F-프라이머	R-프라이머
27F	342R
261F	517R
530F	787R
802F	956R
1114F	1100R
	1492R

이렇게 증폭된 16S rDNA의 산물은 PCR 산물 분리 키트(product purification kit, Qiagen)를 사용하여 정제하였다. 염기서열 분석은 제네틱 어날라이저(Genetic analyzer 310A, Applied Biosystems)를 사용하였고, 데이터 해석은 DDBJ/NCBI/진뱅크(Genebank)의 데이타베이스를 이용하여 상동성 검색을 수행하였고, 계통수 작성은 CLUSTAL X 프로그램(Thompson et al., 1994) 및 PHYLIP 프로그램 (Felsenstein, 1993)을 이용하여 계통학적 위치를 확인하였다.

(2) 효모균주의 동정

벤질 클로라이드 방법에 의거하여 DNA를 추출하고, 26S rDNA 영역을 PCR을 하여 증폭하였다. 증폭에 사용된 프라이머는 YF (5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'-서열번호 1), YR (5'-GGTCCGTGTTTCAAGACG-3'-서열번호 2)을 이용하였다. PCR 조건은 95℃ 에서 2분; 94℃ 에서 30초, 55℃ 에서 30초, 72℃에서 45초를 30회 반복하였고, 75℃에서 5분간 유지한 후 16℃로 유지하였다. 증폭된 26S rDNA의 부분 염기서열은 PCR 산물 정제키트(Qiagen 사)을 이용하여 정제하였으며, PCR 정제산물은 제네틱 어날라이저 310A(Applied Biosystems)을 이용하여 염기서열을 분석하였다.

4) RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)를 이용한 동정

(1) 락토바실러스의 세밀한 동정

종, 아종 혹은 돌연변이 균주들 간의 유전적 유연관계를 16 rRNA 분석과 DNA-DNA 상동성 실험을 통하여 확인이 어려울 경우 Random Amplified Polymorphic DNA(RAPD)을 이용한다. RAPD 방법은 유전자 염기서열이 매우 유사한 균주에 대해서 무작위적인 프라이머를 사용하여 DNA를 증폭하여 증폭된 DNA 밴드패턴을 비교 조사함으로서 균주간 유전적 유연관계를 확인할 수 있다. 사용되어진 균주는 rDNA 분석만으로 효과적으로 종 확인이 되지 않았던, 락토바실러스 종 WS-1, W-1, W-4, W-6의 균주를 사용하였으며, 표준균주로는 락토바실러스 카제이 아종 톨러란스 ATCC 25599, 락토바실러스 카제이 ATCC 393, 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이 ATCC 27216 및 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이 ATCC 25302를 사용하였다.

사용되어진 프라이머는 OPL-05 (ACGCAGGCAC-서열번호 3), OPL-06 (CCCGTCAGCA-서열번호 4)을 이용하였고, PCR 조건은 94℃ 에서 5분; 94℃에서 1분, 32℃에서 2분, 72℃ 2분을 35번 순환한 후; 72℃에서 5분 동안 유지한 후 4℃로 유지하였다

2. 결 과

(1) 분리균주 WS -1의 콜로니 형태 특징

분리균주 WS-1 콜로니는 브로모페놀 블루(bromophenol blue; BPB)가 첨가된 MRS배지에서 둥근형태(circular, convex)를 나타내었으며, 콜로니 중앙에 진한 청색의 핵이 관찰되어 유산균 콜로니의 형태학적인 특징을 나타냈다. 분리균주 WS-1을 그람 염색하여 광학현미경(Nikon, Eclipse 80i× 1,000)으로 관찰한 결과, 분리균주 WS-1은 그람양성으로서 짧은 간균의 형태를 나타내었다. 주사형전자현미경(SEM)을 이용하여 분리균주 WS-1의 세포형태를 관찰한 결과, 0.8× 1.0㎛ ~ 1.0× 2.0㎛ 크기의 간균 형태를 나타내었다(도 1).

(2) 분리균주 W-1의 콜로니 형태 특징

분리균주 W-1의 콜로니는 브로모페놀 블루(bromophenol blue; BPB)가 첨가된 MRS배지에서 둥근형태(circular, convex)를 나타내었으며, 전체적으로 청색을 띄었다. 또한 콜로니 중앙에 진한 청색의 핵이 관찰되어 유산균 콜로니의 형태학적인 특징을 나타냈다. 분리균주 W-1을 그람 염색하여 광학현미경(Nikon, Eclipse 80i×1,000)으로 관찰한 결과, 분리균주 W-1은 그람양성으로 짧은 간균의 형태를 나타내었다. 주사형전자현미경(SEM)을 이용하여 분리균주 W-1의 세포형태를 관찰한 결과, 0.7×1.7㎛ ~ 0.7×3.3㎛ 크기의 간균 형태를 나타내었다(도 1).

(3) 분리균주 W-3의 콜로니 형태 특징

분리균주 W-3의 콜로니는 브로모페놀 블루(bromophenol blue; BPB)가 첨가된 MRS배지에서 불규칙한 형태(irregular, umbonate)를 나타내었으며, 전체적으로 청색을 띄었고 유산균 콜로니의 형태학적인 특징을 나타냈다. 분리균주 W-3을 그람 염색하여 광학현미경(Nikon, Eclipse 80i×1,000)으로 관찰한 결과, 분리균주 W-3은 그람양성으로 짧은 간균의 형태를 나타내었다. 주사형전자현미경(SEM)을 이용하여 분리균주 W-3의 세포형태를 관찰한 결과, 0.7×1.3㎛ ~ 0.7×2.0㎛ 크기의 간균 형태를 나타내었다(도 1).

(4) 분리균주 W-4의 콜로니 형태 특징

분리균주 W-4의 콜로니는 브로모페놀 블루(bromophenol blue; BPB)가 첨가된 MRS배지에서 둥근형태(circular, convex)를 나타내었으며, 전체적으로 청색을 띄었다. 또한 콜로니 중앙에 진한 청색의 핵이 관찰되어 유산균 콜로니의 형태학적인 특징을 나타냈다. 분리균주 W-4를 그람 염색하여 광학현미경(Nikon, Eclipse 80i×1,000)으로 관찰한 결과, 분리균주 W-4는 그람양성으로 짧은 간균의 형태를 나타내었다. 주사형전자현미경(SEM)을 이용하여 분리균주 W-4의 세포형태를 관찰한 결과, 0.6×0.8㎛ ~ 0.5×1.0㎛ 크기의 간균 형태를 나타내었다(도 1).

(5) 분리균주 W-6의 콜로니 형태 특징

분리균주 W-6의 콜로니는 브로모페놀 블루(bromophenol blue; BPB)가 첨가된 MRS배지에서 둥근형태(circular, convex)를 나타내었으며, 전체적으로 청색을 띄었다. 또한 콜로니 중앙에 진한 청색의 핵이 관찰되어 유산균 콜로니의 형태학적인 특징을 나타냈다. 분리균주 W-6을 그람 염색하여 광학현미경(Nikon, Eclipse 80i×1,000)으로 관찰한 결과, 분리균주 W-6은 그람양성으로 짧은 간균의 형태를 나타내었다. 주사형전자현미경(SEM)을 이용하여 분리균주 W-6의 세포형태를 관찰한 결과, 0.5×1.0㎛ ~ 0.8×2.9㎛ 크기의 간균 형태를 나타내었다(도 1).

(6) 분리균주 WY -1의 콜로니 형태 특징

주사형전자현미경(SEM)을 이용하여 분리균주 WY-1의 세포형태를 관찰한 결과, 0.8×1.0㎛ ~ 1.2×1.0㎛ 크기의 단간균 형태를 나타내었다(도 2).

(7) 염기서열 분석 결과

① 분리균주 WS-1균주는 16S rDNA 염기서열(1,417bp, 서열번호 5)에 기초한 분자계통학적 분석결과 락토바실러스(Lactobacillus) 속의 종을 포함하는 계통그룹에 속하는 균주로서, 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) 균주 (Lactobacillus casei ATCC 334; Accession No.= CP000423.1)와 99.99% (identities = 1415/1417, Gaps=1/1415)의 유연관계를 나타내었고, 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) 균주(Lactobacillus paracasei strain DJ1; Accession No.= DQ462440)와 99.99% (identities = 1415/1417, Gaps=1/1415)의 유연관계를 나타내는 것으로 확인되었다. 다른 락토바실러스 균주와의 계통분류를 수행해 본 결과 락토바실러스 파라카제이 또는 락토바실러스 카제이와 유연관계가 높았다(도 4).

② 분리균주 W-1 균주는 16S rDNA 전 염기서열(1,410bp, 서열번호 6)에 기초한 분자계통학적 분석결과 락토바실러스(Lactobacillus) 속의 종을 포함하는 계통그룹에 속하는 균주로서, 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) 균주 (Lactobacillus casei ATCC 334; Accession No.= CP000423.1)와 99.36% (identities = 1407/1416, Gaps=9/1416)의 유연관계를 나타내었고, 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) 균주(Lactobacillus paracasei strain DJ1; Accession No.= DQ462440)와 99.36% (identities = 1407/1417, Gaps=9/1416)의 유연관계를 나타내는 것으로 확인되었다. 다른 락토바실러스 균주와의 계통분류를 수행해 본 결과 락토바실러스 카제이 및 락토바실러스 파라카제이와 유연관계가 높았다(도 5).

③ 분리균주 W-3 균주는 16S rDNA 전 염기서열(1,417bp, 서열번호 7)에 기초한 분자계통학적 분석결과 락토바실러스(Lactobacillus) 속의 종을 포함하는 계통그룹에 속하는 균주로서, 락토바실러스 퍼로런스(Lactobacillus perolens) 균주 (Lactobacillus perolens L534; Accession No.= Y19168.1)와 99.07% (identities = 1397/1410, Gaps=8/1410)의 유연관계를 나타내었고, 다른 락토바실러스 균주와의 계통분류를 수행해 본 결과 락토바실러스 퍼로런스와 유연관계가 높았다(도 6).

④ 분리균주 W-4 균주는 16S rDNA 전 염기서열(1,390bp,서열번호 8)에 기초한 분자계통학적 분석결과 락토바실러스(Lactobacillus) 속의 종을 포함하는 계통그룹에 속하는 균주로서, 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) 균주 (Lactobacillus casei ATCC 334; Accession No.= CP000423.1)와 98.91% (identities = 1378/1393, Gaps=13/1393)의 유연관계를 나타내었고, 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) 균주 (Lactobacillus paracasei ; Accession No.=DQ462440.1)와 98.91% (identities = 1378/1393, Gaps=13/1393)의 유연관계를 나타내었다. 다른 락토바실러스 균주와의 계통분류를 수행해 본 결과 락토바실러스 카제이 및 락토바실러스 파라카제이에 유연관계가 높았다(도 7).

⑤ 분리균주 W-6 균주는 16S rDNA 전 염기서열(1,414bp, 서열번호 9)에 기초한 분자계통학적 분석결과 락토바실러스(Lactobacillus) 속의 종을 포함하는 계통그룹에 속하는 균주로서, 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) 균주 (Lactobacillus casei ATCC 334; Accession No.= CP000423.1)와 99.43% (identities = 1409/1417, Gaps=8/1417)의 유연관계를 나타내었고, 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) 균주 (Lactobacillus paracasei ; Accession No.=DQ462440.1)와 99.43% (identities = 1409/1417, Gaps=8/1417)의 유연관계를 나타내었다. 다른 락토바실러스 균주와의 계통분류를 수행해 본 결과 락토바실러스 카제이 및 락토바실러스 파라카제이와 유연관계가 높았다(도 8).

(8) RAPD ( Random Amplified Polymorphic DNA )를 이용한 동정 결과

PCR을 통하여 증폭된 결과물을 1.5% 아가로스겔, 50V에서 전기영동한 후 확인하였다. OPL-5 프라이머로 RAPD 한 결과를 도 3에 나타내었다. 모든 분리균주(strain WS-1, W-1, W-4와 W-6는 Lactobacillus casei 그룹인 ATCC 25599와 ATCC 393에서 나타나는 대표적인 1A 2A, 3A와 4A의 밴드 형태와 동일한 DNA 밴드를 나타내어 락토바실러스 종 WS-1, W-1, W-4, W-6의 균주는 락토바실러스 카제이로 동정되었다.

따라서 분리균주 WS-1은 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) WS-1로 명명하였다. 분리균주 W-1은 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) W-1로 명명하였다. 분리균주 W-3은 락토바실러스 퍼로런스(Lactobacillus perolens) W-3로 명명하였다. 분리균주 W-4은 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) W-4로 명명하였다. 따라서 분리균주 W-6은 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) W-6로 명명하였다.

(9) 효모 균주의 동정

분석된 염기서열은 서열번호 10과 같다.

염기서열은 DDBJ/NCBI/Genebank와 상동성 검색을 수행하고, 클러스털 X 프로그램(Thompson et al, 1994) 및 PHYLIP 프로그램 (Felsenstein)을 이용하여 계통학적 위치를 확인하였다. WY-1 균주의 26S rDNA 염기서열에 기초한 분자계통학적 분석에서 Dekkra 속의 종을 포함하는 계통학적 그룹에 속하는 균주로서, 데케라 브루셀렌시스(Dekkra bruxellensis) 균주와 99%의 유연관계를 나타내는 것으로 확인되었다. 따라서 효모 대표균주 WY-1는 데케라 브루셀렌시스(Dekkra bruxellensis)로 동정되었다(도 9). 데케라 브루셀렌시스(Dekkra bruxellensis) WY-1으로 명명되었다.

따라서 락토바실러스 균주들 및 효모 균주 각각은 2007년 12월 7일자에 한국종균협회에 기탁번호 KCCM10896P, KCCM10897P, KCCM10898P, KCCM10899P, KCCM10900P, KCCM10901P로 각각 기탁되었다.

< 실시예 2 > 미생물제제 피드프리 ™ 내의 유기산( Organic acid ) 분석

운석식품 피드프리™ 미생물제제를 0.02㎛의 필터를 이용하여 침전물을 제거한 후, 접종하여 28℃에서 15일 동안 배양한다. 이온 크로마토그래피 DX-500(Ion Choromatograph DX-500, Dionex, USA)로 분석하고 이온 팩 ASII (Ion Pac ASII) 프로그램으로 정량한다.

분석 대상 유기산

번호	분석 유기산 종류
1	수산(oxalic acid, OA)
2	말레익산(maleic acid, MEA)
3	주석산(tartaric acid, TA)
4	구연산(citric acid, CA)
5	초성포도산(pyruvic acid, PA )
6	초산(acetic acid, AA)
7	사과산(malic acid, MA)
8	젖산(lactic acid, LA)
9	호박산(succinic acid, SA)
10	개미산(formic acid, FA)

< 결 과 >

미생물제제 배양액에서 유기산 표준물질 10종류를 대상으로 유기산의 정성, 정량 분석결과, 미생물제제 내에서는 젖산(4940.074ppm)과 초산(2030.97ppm) 다량 검출 되었고, 그 외 수산(266.119ppm), 초성포도산(216.79ppm), 호박산(105.148ppm)과 주석산(49.831ppm)이 검출되었다. 또한 말레익산(0.604ppm), 사과산(21.125ppm), 구연산(2.214ppm)은 매우 적은 양이 분석되었으며, 개미산(formic aicd, FA)는 검출되지 않았다.

< 실시예 3 > 피드프리 ™ 내 미생물의 산성 pH 에서 생육능 조사

(1) 락토바실러스의 산성 pH에서 생육능 조사

유산균 선택배지인 락토바실라이 MRS 배지(Lactobacilli MRS Broth; MRS, Difco)의 pH를 pH 2.5, pH 3.0, pH 3.5, pH 4.0, pH 4.5, pH 5.0으로 조절하였다. pH가 조절된 MRS 배지에 미생물제제를 1㎖씩 접종하였다. 28℃에서 정치배양하며, 12시간 단위로 600nm에서 OD를 측정하였다.

< 결 과 >

MRS 배지를 pH 2.5 ~ 5.0 까지 조절한 후, 미생물제제를 접종하여 각 pH 별 생육도를 측정한 결과, pH 4.0, pH 4.5 및 pH 5.0에서 48시간 배양 이후 OD가 급격하게 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 pH 2.5, pH 3.0 및 pH 3.5에서는 72시간 배양 이후 증식이 더디게 진행되는 것처럼 보이지만 OD 값이 너무 낮아 증식의 유무를 확인할 수 없었다.

따라서 살아있는 생세포만을 선택적으로 염색하여 관찰할 수 있는 형광생체염색법을 사용하였다. 형광생체염색법은 형광색소인 카르복시 플루오르세인 디아세테이트(carboxy fluorescein diacetate; CFDA)를 사용하여 신속하고 정확하게 미생물을 계수할 수 있다.

형광생체염색법에 의해 각 pH 별 배지에서 생균수를 측정한 결과, 초산성 조건인 pH 2.5 배지에서도 유산균과 효모가 관찰되었으며 유산균 수가 약 100배 증가함을 확인할 수 있었다(도 10).

(2) 데케라 브루셀렌시스 WY-1(KCCM10901P)의 산성 pH에서 생육능 조사

순수분리된 데케라 브루셀렌시스 WY-1를 pH 2.0 ~ pH 4.5로 각각 조정한 PDA 평판배지에서 28℃에서 3일간 배양한 후 생균수를 측정한 결과는 다음과 같다. pH 2.0 PDA배지 : 8.8±4.8 × 10⁴cfu/㎖; pH 2.5 PDA배지 : 1.14±9.7 × 10⁵cfu/㎖; pH 3.0 PDA배지 : 7.0±7.5 × 10⁴cfu/㎖; pH 3.5 PDA배지 : 4.6±4.3 × 10⁴cfu/㎖; pH 4.0 PDA배지 : 1.2±2.2 × 10⁴cfu/㎖; pH 4.5 PDA배지에서는 7.5±3.3 × 10³cfu/㎖ 이었다. pH 2.0 ~ pH 4.5로 각각 조정한 PDB 액체배지에 접종한 후 카르복시 플루오르세인 디아세테이트(carboxy fluorescein diacetate; CFDA) 형광염색법을 이용한 효모의 생균수 측정한 결과는 다음과 같다. pH 2.0 PDA배지 : 1.06±0.2 × 10⁷cells/㎖: pH 2.5 PDA배지 : 1.92±0.2 × 10⁷cells/㎖; pH 3.0 PDA배지 : 9.52±0.2 × 10⁶cells/㎖; pH 3.5 PDA배지 : 5.48±0.1 × 10⁶cells/㎖; pH 4.0 PDA배지 : 4.0±0.1 × 10⁶cells/㎖; pH 4.5 PDA배지 : 3.92±0.1 × 10⁶cells/㎖ 이었다. 따라서 초산성 조건인 pH 2.0 배지에서도 데케라 브루셀렌시스 WY-1 (KCCM10901P)가 생육가능함을 보였다.

< 실시예 4 > 피드프리 ™ 항균작용

(1) 어병을 일으키는 미생물에 대한 항균작용

피드프리™의 항균력을 시험하기 위하여, 피드프리™를 0.45㎛ 막 여과기와 0.2㎛로 연속 2회 여과한 후 여과액을 냉장 보관하면서 시험에 사용하였다. 시험에 사용한 세균은 비브리오 오르다리(Vibro ordalii), 에드와르드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda), 테나시바쿨럼 종(Tenacibaculum sp.)과 스트렙토코쿠스 인이애(Streptococcus iniae)를 사용하였다. 항균시험은 비브리오 오르다리(Vibro ordalii), 에드와르드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda)과 스트렙토코쿠스 인이애(Streptococcus iniae)는 배양배지로 1.5% NaCl를 첨가한 트립틱 소이 아가(Tryptic soy agar; TSA)와 트립틱 소이 브로스(Tryptic soy broth)을 사용하였고, 테나시바쿨럼 종(Tenacibaculum sp.)은 1.5% NaCl 첨가 시토파가 아가(Cytophaga agar; CA)와 시토파가 브로스(Cytophaga broth; CB)를 사용하였다. 각각의 액체배지에서 진탕 배양한 균액을 비브리오 오르다리, 에드와르드시엘라 타르다와 그람 양성 세균인 스트렙토코쿠스 인이애는 약 10⁷ CFU/ml로, 테나시바쿨럼 종(Tenacibaculum sp.)은 약 10⁶ CFU/ml의 농도로 각각의 액체 배지에 현탁하여 배지 현탁시험균액을 준비하였다. 각 배지현탁시험균액을 교반기로 잘 섞은 후 각각 5ml씩 멸균시험관에 분주한 다음 피드프리™를 1%(v/v)되도록 첨가한 후 진탕배양하면서, 0, 3, 5, 10, 30분, 1시간째마다 세균 수를 540nm에서 흡광도 값으로 측정하였다. 대조구로는 피드프리™를 처리하지 않은 배지현탁균액에 각각의 배지를 1%(v/v)되게 첨가하여 같은 방법으로 측정하였다 흡광도 측정 결과는 흡광도 측정치이 1000배를 단위로 하여 나타내었으며, 시험은 3반복으로 실시되었다. 피드프리™의 항균력은 각각의 균종에 따라 차이가 났다. 스트렙토코쿠스 인이애균 시험구에서는 도 11에서 볼 수 있듯이 반응 개시 후 3분 유의적인 억제효과를 나타내기 시작하였으며, 그 효과가 시험 기간 동안 지속되는 것으로 나타났다. 따라서 여과액은 대조구에 비하여 유의적으로 높은 항균 효과를 나타내었다(도 11).

(2) 장내 병원성 미생물에 대한 항균작용

피드프리™가 병원성미생물에서도 살균력(억제력)이 있는가를 확인하기 위해서, 대표적 병원성균주인 세균을 대상으로 살균력 확인시험을 실시하였다.

시료조건 : 피드프리™( Feed - free ) 원액을 100배 희석한 액을 1%액을 시료로 하여 살균력을 시험하였다.

시험균주 : Escherichia coli ATCC 25922

Escherichia coli O157 ATCC 43895

Staphylococcus aureus ATCC 25923

Vibrio parahaemolyticus KCTC 2471

Salmonella typhi KCTC 2424

Pseudomonas aeruginosa KCTC 1636

Candida albicans KCTC 7965

시험방법 : 대장균, 대장균O157, 포도상구균, 비브리오균, 녹농균, 살모렐라균을 액체배지(Brain l leart lnfusion Broth)에 증균시켜서 시험에 사용하였다. 칸디다균은 Sabouraud Dextrose Broth를 시용하였다.

멸균된 생리식염수에 균을 접종하여 초기세균수를 측정한 후 시료를 1%되게 첨가하여 실온에 방치하였다. 30초 후, 2분 후, 5분 후, 24시간 후에 세균수를 측정하여 초기 세균에 대한 감소율을 알아보았다.

시험결과 :

표 3과 같이 원액을 100배 희석하여 만든 1%액의 조건에서도 세균의 살균력이 확인되었다.

병원성미생물에 대한 항균시험결과

시간	초기	30초후	2분후	5분후	24시간후
E. coli	3.1X10⁵	2.8X10⁵	2.6X10⁵	2.3X10⁵	67.7% 억제
E. coli 0157	2.8X10⁵	2.5X10⁵	2.4X10⁵	2.1X10⁵	71.2% 억제
S. aureus	2.7X10⁵	2.2X10⁵	1.4X10⁵	1.0X10⁵	70.5% 억제
V. parahaemolyticus	1.1X10⁵	7.5X10⁵	2.4X10⁵	4.8X10⁵	불검출
S. typhi	3.2X10⁵	2.8X10⁵	2.1X10⁵	1.0X10⁵	90.7% 억제
P. aeruginosa	4.8X10⁵	4.6X10⁵	4.2X10⁵	3.8X10⁵	70.8% 억제
C. albicans	3.4X10⁵	3.4X10⁵	3.4X10⁵	3.4X10⁵	0%

< 실시예 5 > 피드프리 ™에 의한 닭 및 돼지의 생장 촉진

1. 피드프리 ™의 첨가 급여가 돼지의 생산성에 미치는 영향

표 4는 피드프리™를 첨가 자돈에 급여하여 생산성에 미치는 영향을 나타냈다. 처리 구는 피드프리™를 급여하지 않은 대조구와 음수로 0.1과 0.2% 급여구로서 처리구당 암수 각각 6두씩 12두를 배치하였다. 개시 시 체중은 약 7kg으로 처리구간에 차이가 없도록 하였으며, 조사항목은 증체량, 사료섭취량, 사료요구율, 장내미생물로서 4주 단위로 측정하였다. 피드프리™를 급여한 4주 후에 대조구와 비교시에 피드프리™ 0.1% 처리 구는 증체량이 대조 구에 비하여 0.59kg 높았으며 사료요율은 0.035가 개선되었다. 그러나 0.2% 음수 급여 구는 사료요구율 및 증체가 대조구에 비하여 개선되지 못하였으므로 적정 수준보다 높음을 시사한다.

피드-프리™의 첨가급여가 이유자돈의 생산성에 미치는 영향

처리구(%)	증체량(Kg)	사료 섭취량(Kg)	사료요구율
대조구	13.85	22.35	1.614
피드프리™ 0.1	14.44	22.81	1.579
피드프리™ 0.2	14.35	22.76	1.692

체중이 약 22-23kg에서 피드프리™를 첨가 급여 시에 0.1% -0.2%처리 구에서는 대조 구에 비하여 사료 요구율 및 증체량이 개선되는 경향을 보였다. 0.2% 급여구는 대조 구에 비하여 사료요구율이 높게 나타났다(표 5).

피드-프리™의 첨가급여가 비육 중기 돈의 생산성에 미치는 영향

처 리 구(%)	체 중(Kg)	증 체 량(Kg)	사료 섭취량(Kg)	사료 요구율
대 조 구	46.48	24.72	53.13	2.150
피드프리™ 0.1	47.50	24.88	52.67	2.117
피드프리™ 0.2	45.07	23.32	51.05	2.189

2. 사료에 피드프리 ™의 첨가/급여가 이유자돈의 생산성에 미치는 영향

본 실험은 피드프리™가 LHD 삼원교잡 비육돈이며, 체중이 약 11Kg의 어린돼지의 생산성에 미치는 영향을 구명하고자 시행하였다. 처리구는 피드프리™를 첨가하지 않은 무처리 구 즉 대조구, 시판용 항생제 0.1% 처리 구, 피드프리™ 0.1, 0.2, 0.4% 처리 구로 하였다. 시험기간은 2000년 6월 17일부터 8주간 시행하였으며, 물과 사료는 무제한으로 급여하였다. 이외에도 마지막 처리구인 시판용 사료에 피드프리™ 0.2% 첨가구는 7월 15일부터 처리구를 기존의 처리 구와 체중을 비슷하게 약 23Kg에서 배치하였으며 출하시까지 사양실험을 동일하게 시행하였다.

약 11kg인 28일령부터 실험 개시 후 4주인 약 56일령에 증체량은 항생제와 피드프리™ 0.1과 0.2% 급여 구에서 대조구에 비하여 증가하는 경향을 나타냈으나 0.4% 급여 구에서는 대조구에 비하여 낮은 경향을 나타냈다. 사료섭취량은 전체적으로 피드프리™ 급여 구에서 증가하는 경향을 보였으나 첨가 수준이 증가함에 따라서 사료섭취량이 감소하는 경향을 보였다. 실험 개시 후 8주인 약 84일령에 증체량은 피드프리™ 0.1% 급여 구에서 다른 처리 구에 비하여 높았으며 사료요구율도 개선되는 경향을 보였다. 본 실험에서 피드프리™의 급여는 무 첨가 구인 대조 구에 비하여 사료 요구율을 개선하는 경향을 보였으나 0.2%보다 높은 수준의 급여구는 0.1% 급여 구에 비하여 증체량이 낮았으므로 약 11kg의 이유자돈부터 40kg까지의 비육돈에서는 0.1-0.2% 수준 사이의 첨가/급여가 필요함을 시사했다.

피드프리™의 사료에 첨가/급여가 약 12kg의 이유자돈의 생산성에 미치는 영향(2000. 6. 15 - 8. 12)

처 리 구(%)	증 체 량(Kg)	사료 섭취량(Kg)	사료요구 율
대 조 구	30.67	65.82	2.146
항생제 0.1	31.04	62.46	2.012
피드프리™ 0.1	31.79	63.77	2.006
피드프리™ 0.2	30.67	62.73	2.045
피드프리™ 0.4	29.74	62.06	2.087
시판용 사료 + 피드프리™ 0.2%	21.12	37.62	1.781

표 6에서 실험 개시 후 8주령에 약 40Kg의 체중에서 0.1% 피드프리™ 처리 구는 증체 및 사료요구율이 대조구에 비하여 개선되는 경향을 보였다.

3. 피드프리 ™에 의한 육계의 생산성 증가

현지 부화장으로부터 부화 45일의 생산량이 높은 어린 수육계를 얻는다. 모든 육계는 부화장에서 뉴캐슬 및 브론키티스(New Castle and Bronchitis) 스프레이 예방접종을 하고 다른 예방접종은 하지 않았다. 각 우리에 Feather-sexed 육계 30마리씩, 총 15개 우리(1.5 x 4.3M)에 넣었다. 각 우리에는 콘크리트 바닥에 대팻밥(톱밥)을 깔고 한개 관으로 된 사료 공급 장치와 니플 음용수 공급라인을 설치하여 사료와 음용수 접근부에 ad libitum을 제공하였다. 인공부화기 램프가 제공하는 열과 사이트 커텐의 올림과 내림을 통해 실내 온도를 조절하였다. 육계에게 옥수수-콩 기본 사용사료를 Meth 방식으로 먹였다(표 7).

육계용 기초 사료의 구성

성분 및 구성	0 -20일 개시용	22 - 49일 성장용
성분 및 구성	%
옥수수	56.12	60.79
Soybean meal, 48	37.50	32.61
Fat, poultry	3.07	3.43
석회석	0.73	0.78
탈불소화된 인산염	1.75	1.56
식염	0.29	0.32
비타민 프리믹스	0.25	0.25
미너럴 프리믹스	0.07	0.08
DL-98 메티오닌	0.20	0.17

계산된 조성비
조단백질, %	22.50	20.50
대사 에너지, kcal/kg	3,080	3,150
리신, %	1.26	1.12
칼슘, %	0.95	0.990
인산, %	0.45	0.41

* 비타민 프리믹스는 사료 kg 당 비타민 A 6614 IU; 콜레칼시페롤 705 IU; 비타민 E, 13 IU; 리보플라빈, 6.6 mg; Ca panthothenate, 12 mg, 니코틴산 , 39mg, 비타민 B₆, 1.9mg; 미나디온, 1.3mg; 엽산, 0.72mg; d-바이오틴, 0.055 mg; 티아민, 1.1 mg; 엑토시퀴인(ethoxyquin), 125 mg 을 포함한다.

* 미량 미너럴 프리믹스는 사료 kg 당 Mn 60mg, Zn 50mg, Fe 30mg, Cu 5 mg, I 1.5mg을 포함한다.

개시용(1일에서 21일) 및 성장용(22일에서 49일)의 요구조건을 만족하거나 그 이상으로 기본 사료를 배합한다. 어린 육계들은 무작위로 3종 사료 처리 중의 한가지를 지정한다. 사료의 조 구분은 다음과 같다. 750 g/mtons 의 coban60(구충억제제)가 들어 있는 기본 사료와 바시트라신(항생제)이 62.6 g/mton 함유한 기초사료(대조구), 또는 coban60(구충억제제)와 바시트라신(항생제)를 제외하고 피드프리™ 0.1 중량% 또는 0.2 중량% 보충한 사료로 구분된다.

실험 육계에 대하여 매일 2회 관찰하고 사망한 것은 제거하고 체중을 기록하였다. 다리에 심한 이상이 있는 비경제적인 것은 제거하고 체중을 기록하고 안락사 시켰다. 사망과 다리 이상이 발생하면 이를 기록하고 연구 마감시 사망율과 다리 이상이 있는 비율을 확인하였다. 육계에 대한 21일과 42일에 체중을 측정하고 체중 증가와 사료 변환을 계산하였다. 사료변환은 피더(feeder)에 투입된 중량과 21일 및 42일의 잔여 중량의 차를 통해 결정된다. 사망과 다리이상 육계의 체중 검량은 사료 소비를 조절하기 위해 사용되었다.

1-42일의 체중과 체중증가, 사료섭취, 체중 증가 대 사료비율, 사망율, 육계, 다리이상율은 표 8(피드프리™의 어린 육계의 증체량에 대한 효과)에 나타낸 바와 같다.

조사결과 1일 내지 42일에 0.1 중량% 또는 0.2 중량%의 생균을 보충한 사료를 먹인 육계의 체중이 대조군(구충제와 항생제를 먹인 군)과 비교하여 차이가 없는 것으로 나타났다(P > 0.05) 이와같은 결과를 통해, 피드프리™를 보충한 사료는 기초사료에 살충제 및 항생제를 보충한 것과 비교하여 육계의 성장에 효과적이라는 것을 보인다. 따라서 피드프리™는 항생제를 대체하여 닭의 생장을 촉진시켰다.

< 실시예 6 > 피드프리 ™에 의한 악취제거 효과

축산폐수 및 축분, 인분, 산업 및 가정 유기성 폐기물, 오폐수 처리장, 하수종말처리장 등에서 발생하는 악취는 주로 지방산 계열의 악취와 암모니아 및 아민 등의 VOC류가 대부분이다. 공지의 실험방법(대한민국특허출원 제10-2001-0085666호 등 참조)과 동일한 방법으로 피드프리™가 악취를 제거하는지 확인하였고, 결과를 표 9에 보였다.

피드프리™ 처리후 악취 성분의 감소

시험항목	시험결과
시험항목	초기	0.5시간	1 시간	3시간	6시간
트리메틸아민	60.0 ppm	24.0 ppm	13.0 ppm	7.0 ppm	3.0 ppm
암모니아	60.0 ppm	18.0 ppm	12.0 ppm	5.0 ppm	2.0 ppm

상기 표 9에서 보이듯이 피드프리™는 트리메틸아민을 6시간만에 95% 감소시켰으며, 암모니아는 97% 감소시켰다.

도 1은 브로모페놀 블루를 포함한 락토바실라이 MRS 배지(Lactobacilli MRS Broth; MRS, Difco) 평판배지에 형성된 분리된 락토바실러스 균주들의 콜로니 형태 및 주사형전자현미경(SEM) 세포 형태를 나타낸다.

도 2는 분리균주 WY-1(효모)의 주사형전자현미경(SEM) 세포 형태를 나타낸다.

도 3은 분리균주들을 랜덤 증폭 다형성 DNA(Random Amplified Polymorphic DNA; RAPD)를 이용한 동정 결과를 나타낸다.

도 4는 분리균주 WS-1의 16S rDNA 염기서열분석을 통한 계통도를 나타낸다.

도 5는 분리균주 W-1의 16S rDNA 염기서열분석을 통한 계통도를 나타낸다.

도 6은 분리균주 W-3의 16S rDNA 염기서열분석을 통한 계통도를 나타낸다.

도 7은 분리균주 W-4의 16S rDNA 염기서열분석을 통한 계통도를 나타낸다.

도 8은 분리균주 W-6의 16S rDNA 염기서열분석을 통한 계통도를 나타낸다.

도 9는 분리균주 WY-1의 16S rDNA 염기서열분석을 통한 계통도를 나타낸다.

도 10은 형광생체염색법에 의해 각 pH 별 배지에서 피드프리™ 내 생균수를 측정한 결과를 나타낸다.

도 11은 어병을 일으키는 미생물에 대한 피드프리™의 항균시험 결과를 나타낸다.

<110> WOONSUK FOOD CO.,LTD <120> Composition of mixed microorganism growing in super highly acidic condition <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gcatatcaat aagcggagga aaag 24 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ggtccgtgtt tcaagacg 18 <210> 3 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 acgcaggcac 10 <210> 4 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cccgtcagca 10 <210> 5 <211> 1417 <212> DNA <213> Lactobacillus casei <400> 5 acatggaacg agtggcggac gggtgagtaa cacgtgggta acctgccctt aagtggggga 60 taacatttgg aaacagatgc taataccgca tagatccaag aaccgcatgg ttcttggctg 120 aaagatggcg taagctatcg cttttggatg gacccgcggc gtattagcta gttggtgagg 180 taatggctca ccaaggcgat gatacgtagc cgaactgaga ggttgatcgg ccacattggg 240 cctgagacac ggcccaaact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc acaatggacg 300 caagtctgat ggagcaacgc cgcgtgagtg aagaaggctt 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Claims

락토바실러스 카제이 WS-1(KCCM10896P), 락토바실러스 카제이 W-1(KCCM10897P), 락토바실러스 페로런스 W-3(KCCM10898P), 락토바실러스 카제이 W-4(KCCM10899P), 락토바실러스 카제이 W-6(KCCM10900P) 및 데케라 브루셀렌시스 WY-1 (KCCM10901P)로 구성된 내산성의 동물생장 촉진 및 항균활성 조성물.
락토바실러스 카제이 WS-1(KCCM10896P), 락토바실러스 카제이 W-1(KCCM10897P), 락토바실러스 페로런스 W-3(KCCM10898P), 락토바실러스 카제이 W-4(KCCM10899P), 락토바실러스 카제이 W-6(KCCM10900P) 및 데케라 브루셀렌시스 WY-1 (KCCM10901P)이 필수적인 성분으로 구성된 것을 특징으로 하는 내산성의 동물생장촉진 및 항균활성 조성물.
제 1 항 또는 제 2 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동물은 돼지 또는 닭인 것을 특징으로 하는 내산성의 동물생장 촉진 및 항균활성 조성물.
락토바실러스 카제이 WS-1(KCCM10896P), 락토바실러스 카제이 W-1(KCCM10897P), 락토바실러스 페로런스 W-3(KCCM10898P), 락토바실러스 카제이 W-4(KCCM10899P) 및 락토바실러스 카제이 W-6(KCCM10900P)의 5종으로 이루어진 그룹에서 선택된 1 내지 4종의 원핵미생물 및 진핵생물인 데케라 브루셀렌시스 WY-1 (KCCM10901P)을 포함하는 것을 특징으로 하는 내산성의 동물생장 촉진 및 항균활성 사료첨가제.