본 발명은 노화억제용 배합물을 제공한다.
본 발명은 산화적 스트레스에 의한 노화를 억제할 수 있는 노화억제용 배합물을 나타낸다.
본 발명의 노화억제용 배합물은 하수오, 꾸지뽕잎을 포함한다.
상기에서 하수오는 노화억제용 배합물 전체 중량 대비 40∼80% 포함될 수 있고, 꾸지뽕잎은 노화억제용 배합물 전체 중량 대비 20∼60% 포함될 수 있다.
상기에서 하수오, 꾸지뽕잎을 포함하는 노화억제용 배합물은 고상(solid phase)으로 제형화 될 수 있다.
상기에서 하수오, 꾸지뽕잎을 포함하는 노화억제용 배합물은 산제(powder), 환(丸)제, 캡슐(capsule)제, 펠렛(pellet) 중에서 선택된 어느 하나의 고상으로 제형화 될 수 있다.
상기에서 하수오, 꾸지뽕잎을 포함하는 노화억제용 배합물은, 먼저 분쇄기로 하수오, 꾸지뽕잎을 각각 분말화한 다음, 이러한 하수오 분말, 꾸지뽕잎 분말로부터 산제, 환제, 캡슐제, 펠렛 중에서 선택된 어느 하나의 고상으로 제형화 될 수 있다. 이때 하수오 분말 및 꾸지뽕잎 분말에 부형제를 첨가하여 하수오, 꾸지뽕잎을 포함하고 산제, 환제, 캡슐제, 펠렛 중에서 선택된 어느 하나의 고상으로 제형화된 노화억제용 배합물을 얻을 수 있다.
상기 산제, 환제, 캡슐제, 펠렛 중에서 선택된 어느 하나의 고상으로 제형화된 노화억제용 배합물을 얻기 위한 부형제는 당업자가 적의 선택하여 실시할 수 있으므로 이하 이에 대한 자세한 내용은 생략하기로 한다.
상기에서 하수오, 꾸지뽕잎을 포함하는 노화억제용 배합물은 액상(liquid phase)으로 제형화될 수 있다.
상기에서 하수오, 꾸지뽕잎을 포함하는 노화억제용 배합물은 열수추출물, 유 기용매추출물 중에서 선택된 어느 하나의 액상으로 제형화될 수 있다.
상기에서 하수오, 꾸지뽕잎을 포함하는 노화억제용 배합물은 열수를 이용하여 하수오 열수추출물, 꾸지뽕잎 열수추출물을 얻은 후 각각의 하수오 열수추출물, 꾸지뽕잎 열수추출물을 혼합하여 액상 형태로 제형화될 수 있다.
상기 하수오 열수추출물은 하수오에 하수오 중량 대비 3∼10배량의 정제수가 첨가되고, 80∼100℃에서 최초 정제수의 부피 대비 10∼30%가 되도록 추출된 다음 추출물이 여과되고, 여과된 추출물의 농도가 10∼70브릭스(brix)가 되도록 농축되어 사용된다.
상기 꾸지뽕잎 열수추출물은 꾸지뽕잎에 꾸지뽕잎 중량 대비 3∼10배량의 정제수가 첨가되고, 80∼100℃에서 최초 정제수의 부피 대비 10∼30%가 되도록 추출된 다음 추출물이 여과되고, 여과된 추출물의 농도가 10∼70브릭스(brix)가 되도록 농축되어 사용된다.
상기에서 하수오, 꾸지뽕잎을 포함하는 노화억제용 배합물은 유기용매를 이용하여 하수오 유기용매추출물, 꾸지뽕잎 유기용매추출물을 얻은 후 각각의 하수오 유기용매추출물, 꾸지뽕잎 유기용매추출물을 혼합하여 액상 형태로 제형화될 수 있다.
상기에서 하수오 유기용매추출물, 꾸지뽕잎 유기용매추출물을 얻을 때 사용하는 유기용매로 탄소수가 2개 내지 7개인 알코올 용매를 사용할 수 있다.
상기에서 하수오 유기용매추출물, 꾸지뽕잎 유기용매추출물을 얻을 때 사용하는 유기용매로 에탄올을 사용할 수 있다.
상기 하수오 유기용매추출물은 하수오에 하수오 중량 대비 3∼5배량의 에탄올이 첨가되고, 60∼70℃에서 6시간∼48시간 동안 추출된 다음 추출물이 여과되고, 여과된 추출물의 농도가 10∼80브릭스(brix)가 되도록 농축되어 사용될 수 있다. 이때 70∼95% 농도의 에탄올을 사용할 수 있다.
상기 꾸지뽕잎 유기용매추출물은 꾸지뽕잎에 꾸지뽕잎 중량 대비 3∼5배량의 에탄올이 첨가되고, 60∼70℃에서 6시간∼48시간 동안 추출된 다음 추출물을 여과되고, 여과된 추출물의 농도가 10∼80브릭스(brix)가 되도록 농축되어 사용될 수 있다. 이때 70∼95% 농도의 에탄올을 사용할 수 있다.
본 발명은 노화억제용 배합물은 노화억제의 효과를 향상시키기 위해 상기의 하수오, 뽕잎을 포함하는 노화억제용 배합물에 첨가제를 추가로 더 포함할 수 있다.
본 발명의 노화억제용 배합물은 노화억제의 효과를 향상시키기 위해 상기의 하수오, 꾸지뽕잎을 포함하는 노화억제용 배합물 100중량부에 대하여 홍삼, 인삼, 수삼, 장뇌삼, 스쿠알렌, 아스파라긴산, 클로렐라, 루이보스티, 우롱차, 녹차, 포도껍질, 포도씨, 레즈베라트롤, 비타민 C, 비타민 B, 토코페롤, 버섯, 동충하초, 백복령, 산수유, 마늘, 검은콩, 브로콜리, 오가피, 안토시아닌, 가지, β-카로틴, 세사미놀, 세사몰, 세사몰린, 오디, 창출, 두충 중에서 선택된 어느 하나 이상의 첨가제 0.1∼10중량부를 추가로 더 포함할 수 있다.
본 발명의 노화억제 배합물에 있어서, 다양한 성분, 함량 등의 조건에 의한 노화억제 배합물을 조사한 바, 본 발명의 목적을 달성하기 위해서는 상기에서 언급한 조건에 의한 노화억제 배합물을 제공하는 것이 바람직하다.
이하 본 발명의 내용을 제조예, 실시예 및 시험예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
<제조예 1> 하수오 추출물 제조
하수오에 하수오 중량 대비 5배량의 정제수를 첨가하고, 100℃에서 최초 정제수의 중량 대비 10%가 되도록 추출하여, 하수오 추출물을 얻은 후 이를 여과하였다.
상기 여과한 하수오 추출물을 60Brix가 되도록 농축하여 하수오 열수추출물을 제조하였다.
<제조예 2> 꾸지뽕잎 추출물 제조
꾸지뽕잎에 꾸지뽕잎 중량 대비 5배량의 정제수를 첨가하고, 100℃에서 최초 정제수의 중량 대비 10%가 되도록 추출하여, 꾸지뽕잎 추출물을 얻은 후 이를 여과하였다.
상기 여과된 꾸지뽕잎 추출물을 60Brix가 되도록 농축하여 꾸지뽕잎 열수추출물을 제조하였다.
<실시예 1>
상기 제조예 1에서 얻은 60Brix 하수오 추출물 50중량%과 상기 제조예 2에서 얻은 60Brix 꾸지뽕잎 추출물 50중량%를 혼합하여 노화억제용 배합물을 제조하였다.
<실시예 2>
상기 제조예 1에서 얻은 60Brix 하수오 추출물 40중량%과 상기 제조예 2에서 얻은 60Brix 꾸지뽕잎 추출물 60중량%를 혼합하여 노화억제용 배합물을 제조하였다.
<실시예 3>
상기 제조예 1에서 얻은 60Brix 하수오 추출물 60중량%과 상기 제조예 2에서 얻은 60Brix 꾸지뽕잎 추출물 40중량%를 혼합하여 노화억제용 배합물을 제조하였다.
<실시예 4>
상기 제조예 1에서 얻은 60Brix 하수오 추출물 80중량%과 상기 제조예 2에서 얻은 60Brix 꾸지뽕잎 추출물 20중량%를 혼합하여 노화억제용 배합물을 제조하였다.
<실시예 5>
상기 제조예 1에서 얻은 60Brix 하수오 추출물 50중량%과 상기 제조예 2에서 얻은 60Brix 꾸지뽕잎 추출물 50중량%를 혼합하여 노화억제용 배합물을 제조하였다.
상기의 하수오, 꾸지뽕잎을 포함하는 노화억제용 배합물 100중량부에 대하여 첨가제로 산수유 추출물 5중량부를 첨가하여 하수오, 꾸지뽕잎 및 산수유를 포함하는 노화억제용 배합물을 제조하였다.
상기 산수유 추출물은 하수오 대신 산수유를 사용하는 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일한 방법에 의해 제조되었다.
<시험예> D-galactose로 노화가 유도된 생쥐에서 시료의 노화억제 작용 시험(Biogerontol. 4, 15 (2003) 참조)
(1)실험방법
Superoxide dismutase(SOD)와 total antioxidant status(TAS) 시험 키트(test kits)는 RANDOX(영국)에서 구입하였다.
Acetylthiocholine iodide, DTNB, trichloroacetic acid(TCA), thiobarbituric acid(TBA) 및 D-galactose는 Sigma에서 구입하였다.
3월령 C57 BL/6J male mice는 충북 음성의 대한바이오링크에서 구입했다. 생쥐는 45일간 매일 : ① 0.3ml PBS as vehicle control (정상 대조군); ② D- galactose at 0.5g/kg (5% D-galactose, 노화 대조군)가 피하주사되었다. 생쥐는 시험 마지막 날 도살되었고, 피, 혈청 및 장기는 ??70℃에서 보관되었다.
제조예 1의 하수오 추출물, 제조예 2의 꾸지뽕잎 추출물 및 실시예 1의 하수오 추출물과 꾸지뽕잎 추출물이 혼합된 시료는 10시와 17시 하루 2회 경구투여되었으며, 시료의 1일 투여량은 매주 쥐의 체중을 측정하여 사람의 1일 섭취량과 사람과 쥐의 평균 대사체중(체중3/4) 비율로부터 환산되었는데(Nutr. Res. 11, 1465 (1991)), 사람의 1일 권장 섭취량은 하수오 추출물 1.8g, 꾸지뽕잎 추출물 1.5g, 하수오와 꾸지뽕잎 추출물 배합물 3.3g (김창민 등, 완역 중약대사전, 도서출판 정담 (1998)), 그리고 사람의 평균 체중은 65kg으로 계산하였다. 쥐의 체중은 매주 측정되었다.
생쥐의 적혈구의 SOD 활성은 RANSOD(RANDOX)를 이용하여 toxic superoxide radical의 dismutation를 측정하였다. 30∼60% 범위에서 자유기(radical) 억제의 표준곡선을 그렸다. 간과 뇌는 PBS로 10% 균질액을 만들어 사용하였다.
혈청의 총 산화상태(total antioxidant status)는 RANDOX kit로 측정하였다.
MDA(malondialdehyde)를 측정하기 위하여 TCA(15ml, 100%), 0.375g TBA, 25ml HCl(1N) 및 40mg BHT(butylated hydroxytoluene)/에탄올(ethanol)를 혼합하고, 100ml이 되게 재증류수(redistilled water)를 넣어 TBA 용액을 만들었다. 간과 뇌의 10% PBS 균질액을 1ml TBA 용액과 섞고, 0.5ml 시료와 50mM BHT 15㎕를 100℃에서 15분간 반응시키고 얼음물로 냉각시켰다. 3000rpm에서 30분간 원심분리하고 535nm에서 흡광도를 측정하여 말론다이알데히드(malondialdehyde)를 정량하였다. 피는 그대로 사용하였다.
단백질 농도는 bovine serum albumin을 사용하여 Bradford 방법 (Bio-Rad)으로 측정하였다. 헤모글로빈(Hemoglobin) 농도는 SIGMA 525-A kit로 측정하였다.
측정치는 스튜던트 t 검정(Student's t-test) 또는 던칸 다중 범위 시험(Duncan's multiple range test)으로 분석되었다.
(2)실험결과
모든 군에서 시각적 이상이 발견되지 않았고, 정상적 체중증가를 보였다. 혈액의 생화학적 지표로 malondialdehyde(MDA), superoxide dismutase(SOD) 및 total antioxidant status(TAS)가 측정된 결과를 표 1에 나타내었다.
MDA는 지질 과산화의 지표물질이고, SOD는 활성산소를 감소시키는 효소이며, TAS는 산화적 스트레스(oxidative stress) 초기에 증가한다.
5% D-galactose로 처리된 노화 대조군은 정상 대조군에 비하여 혈청 MDA와 TAS가 증가했고 SOD가 감소했다 (P<0.05). MDA의 증가와 SOD의 감소에 의한 산화적 스트레스가 D-galactose에 의한 노화의 원인으로 알려져 있다 (Cell Mol Neurobiol. Aug 21 (2007) Temporal Gene Expression Profile in Hippocampus of Mice Treated with D -galactose). 하수오 추출물와 꾸지뽕잎 추출물이 혼합된 혼합물의 섭취가 5% D-galactose로 유도된 혈액 생화학 지표를 개선시켰다. 하수오 추출물군에서 SOD가 정상 대조군과 같은 수준으로 개선되었으며, 꾸지뽕잎 추출물 군에서는 TAS가 정상 대조군과 같은 수준으로 감소했다. 특히 중량 기준으로 50%의 하수오 추출물과 50%의 꾸지뽕잎 추출물이 배합된 실시예군에서는 MDA, SOD 및 TAS의 모든 측정치가 정상 대조군과 같은 수준으로 개선되어 두 추출물의 배합이 산화적 스트레스에 의한 생체의 노화를 효과적으로 억제시킬 수 있음을 보여주고 있다.
표 1. 생쥐 혈액의 MDA, SOD 및 TAS 측정치1
항목 |
MDA(μmol/g protein) |
SOD(U/mg Hb) |
TAS(mM) |
정상 대조군 |
1.02±0.16a |
136.81±31.83b |
0.17±0.09a |
노화 대조군 |
1.53±0.22b |
71.94±18.35a |
0.43±0.15b |
하수오 추출물 |
1.26±0.21ab |
114.74±16.24b |
0.24±0.10ab |
꾸지뽕잎 추출물 |
1.14±0.13a |
97.34±15.44ab |
0.27±0.15ab |
실시예 1 |
1.09±0.17a |
123.74±16.01b |
0.20±0.07a |
1평균치±SEM, 1군당 10마리. 같은 칼럼에서 서로 다른 위첨자를 갖는 값들은 유의차가 있음(P<0.05).
표 2는 하수오 추출물과 꾸지뽕잎 추출물의 배합비가 다른 실시예 2, 실시예 3, 실시예 4의 노화억제 배합물에 대한 생쥐 뇌 조직의 MDA와 SOD에 미치는 영향을 조사한 것이다. 노화 대조군에서 정상 대조군에 비하여 MDA가 증가하고 SOD가 감소했다 (P<0.05). 실시예 3의 노화억제 배합물(하수오 추출물과 꾸지뽕잎 추출물의 배합비가 60 : 40)일 때 노화억제 활성이 가장 우수하여 MDA와 SOD 모두 정상 대조군과 같은 수준으로 개선되었다. 실시예 2의 노화억제 배합물 및 실시예 4의 노화억제 배합물에서도 MDA와 SOD 수준이 개선되었으나 통계적 유의차는 없었다.
표 2. 하수오와 꾸지뽕잎 추출물 배합비가 뇌 조직의 MDA와 SOD에 미치는 영향1
항목 |
MDA(μmol/g protein) |
SOD(U/mg protein) |
정상 대조군 |
10.71±1.14a |
14.87±1.25b |
노화 대조군 |
13.85±2.49b |
12.76±1.89a |
실시예 2 |
11.27±1.38ab |
13.05±1.94a |
실시예 3 |
10.89±1.26a |
14.41±1.91b |
실시예 4 |
11.61±1.34b |
13.67±1.70ab |
1평균치±SEM, 1군당 10마리. 같은 칼럼에서 서로 다른 위첨자를 갖는 값들은 유의차가 있음(P<0.05).
표 3은 하수오 추출물과 꾸지뽕잎 추출물 배합비가 다른 노화억제용 배합물에 대한 생쥐 간 조직의 MDA와 SOD에 미치는 영향을 조사한 것이다.
실시예 2의 노화억제 배합물(하수오 추출물과 꾸지뽕잎 추출물의 배합비가 60 : 40)이 노화억제 활성이 가장 우수하여 MDA가 정상 대조군과 같은 수준으로 감소하였으며, SOD는 정상 대조군보다도 다소 증가하였다. 실시예 3의 노화억제 배합물, 실시예 4의 노화억제 배합물에서도 MDA와 SOD 수준이 개선되었으나 통계적 유의차는 없었다.
표 3. 하수오와 꾸지뽕잎 추출물 배합비가 간 조직의 MDA와 SOD에 미치는 영향1
항목 |
MDA(μmol/g protein) |
SOD(U/mg protein) |
정상 대조군 |
0.51±0.09a |
17.84±3.25a |
노화 대조군 |
0.68±0.13b |
17.76±4.89a |
40 : 60 |
0.59±0.12ab |
17.83±3.94a |
60 : 40 |
0.53±0.10a |
19.99±2.89b |
80 : 20 |
0.61±0.14b |
17.87±3.70a |
1평균치±SEM, 1군당 10마리. 같은 칼럼에서 서로 다른 위첨자를 갖는 값들은 유의차가 있음(P<0.05).
상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.