KR100939073B1 - 신규 폴리펩티드 및 그 폴리펩티드를 코드하는폴리뉴클레오티드 및 이들의 이용 - Google Patents

Abstract

본 발명의 목적은 당쇄, 특히 항체에 결합되는 고 만노오스형 당쇄, 보다 바람

직하게는 닭 항체와 결합되는 당쇄에 결합하는 폴리펩티드를 발견하는 것, 및 상기 폴리펩티드의 대표적인 이용예인 항체(특히 닭 항체)의 정제 방법, 동 정제 수단을 제공하는 것에 있다. 본 발명에 따른 폴리펩티드 BML-17은 큰깃털말(Bryopsis maxima)로부터 단리된 168 아미노산으로 이루어진 신규 렉틴이다. 상기 BML-17을 이용함으로써, 항체(예를 들면, 닭 항체 등)의 정제를 간편하고 고효율로 수행할 수 있다.

폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 당쇄, 항체, 정제

Description

신규 폴리펩티드 및 그 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드 및 이들의 이용{NOVEL POLYPEPTIDE, POLYNUCLEOTIDE ENCODING THE POLYPEPTIDE AND USE THE POLYPEPTIDE AND POLYNUCLEOTIDE}

본 발명은 당쇄, 특히 고 만노오스형 당쇄와 결합하는 신규 폴리펩티드 및 그 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드 및 이들의 대표적 이용에 관한 것이다.

당쇄와 결합되는 단백질(폴리펩티드)로는 만노오스 결합 단백질, 섬유아세포 증식인자, 상피세포 증식인자 등의 당 결합 단백질, 렉틴, 렉틴 유사 물질이 알려져 있다. 상기 렉틴은 특정 당쇄 구조에 대하여 특이적으로 결합되는 성질을 갖기 때문에 당, 당쇄 혹은 복합 당질을 고정화한 칼럼을 이용하여 정제할 수 있다. 렉틴의 예로는 소맥배아 렉틴, 렌즈콩 렉틴 등을 들 수 있다.

소맥배아 렉틴과 당쇄 또는 당 펩티드와의 결합 활성을 조사한 바, 소맥배아 렉틴은 N-글리코시드 결합 당쇄중 하이브리드형 당쇄 혹은 시알산을 갖는 당쇄 또는 당 펩티드와의 결합성이 높은 것으로 시사되어 있다(비특허문헌1, 2 참조). 또한, 소맥배아 렉틴은 바이섹팅(bisecting) N-아세틸글루코사민을 갖는 당쇄 구조를 갖는 당 펩티드에 대하여 보다 강한 결합 활성을 갖는 것으로 시사되어 있다(비특 허문헌3 참조).

렌즈콩 렉틴은 단당인 α-D-만노오스, α-D-글루코오스를 인식하는 것으로 알려져 있다(비특허문헌4 참조). 또한, 렌즈콩 렉틴이 N-글리코시드 결합 당쇄의 아스파라긴에 가장 가까운 N-아세틸글루코사민 잔기에 L-푸코오스가 α1,6-결합된 당쇄 구조를 갖는 당 펩티드에 대하여 강한 결합성을 나타내는 것으로 알려져 있다(비특허문헌5, 6 참조).

그러나, 항체는 그 Fc 영역에 특이한 당쇄 구조를 갖는 것으로 알려져 있다. 따라서, 렉틴과 당쇄와의 결합을 이용하면 항체의 정제에 이용하는 것이 가능하다. 렉틴을 이용하여 항체(특히 사람 항체)를 정제하는 방법으로는, 예를 들면 특허문헌1이 알려져 있다.

닭은 계통 발생학적으로는 포유류 동물보다 하등이지만, 포유류 동물과 마찬가지로 정교하고 치밀한 면역 시스템을 구비하고 있는 동물이다. 특히, 포유류 동물과 계통 발생학적으로 떨어져 있기 때문에 많은 포유류 동물에게 보존되어 있는 단백질에 대하여 특이적 항체를 제작하기에 유용하다. 즉, 마우스나 래트(rats)를 이용하여 제작하기 곤란한 단백질(항원)에 대한 특이적 항체가 닭에게서는 제작 가능하다는 것이다. 예를 들면, 사람의 암(癌) 마커가 되는 항원인 N-글리코릴노이라민산(N-glycolylneuraminic acid)은 사람을 제외한 대부분의 포유류 동물에게 존재하기 때문에 마우스나 래트 등으로는 항체를 제작할 수 없지만, 닭을 비롯한 조류에게는 N-글리코릴노이라민산이 존재하지 않기 때문에 항체를 제작할 수 있다. 또한, 크로이츠펠트-야곱병이나 광우병의 병원체가 되는 프리온 단백질은 포유류 동 물간에서 90% 이상의 상동성이 있기 때문에 포유류 동물에서 항체를 제작하는 것이은 곤란하지만, 포유류 동물과 닭간의 상동성은 30%대이기 때문에 닭에서 그 항체의 제작은 가능하다. 사실, 본 발명자들은 세포 융합법에 의해 상기 N-글리코릴노이라민산, 프리온 단백질에 대한 닭 모노크로날 항체의 제작에 성공하였다. 또한, 그 이외의 닭 항체의 메리트로는 포유류 동물 항체와의 교차 반응성이 없기 때문에 닭 모노크로날 항체와 포유류 동물 모노크로날 항체를 이용함으로써, 비 특이적 반응이 없는 고감도 항원 검출계를 확립할 수 있다.

상기와 같이 닭 항체(닭이 생산하는 항체, 닭이 생산하는 항체와 같은 구조를 갖는 항체)의 유용성(검사용도, 의료용도 등)이 주목받고 있으며, 그 효율적 생산 방법 및 정제 방법의 확립이 요구되고 있다. 닭 항체의 생산 방법은 세포 융합법, 페이지 디스플레이법 등의 기술에 의해 확립되어 가고 있다. 그러나, 그 정제 방법에 대해서는 아직 확립되지 못한 것이 현상이다. 닭 항체는 포유류 동물의 IgG 항체의 정제용 리간드로 이용되는 프로테인 A 및 G하고는 결합하지 않는다. 따라서, 포유류 동물의 방법을 그대로 적용할 수 없다.

본 발명자들은 닭 항체의 정제 기술을 개발하고자, 먼저 마우스 모노크로날 항체를 이용한 어피니티 칼럼에 의한 닭 항체의 정제를 시도하였다. 그러나, 상기 방법으로는 닭 항체를 정제할 수 없었다. 다음으로, 본 발명자들은 겔 여과 및 이온 교환 칼럼을 이용하여 닭 항체의 정제를 수행하였다. 그 결과, 전기영동적으로 단일한 항체의 정제에 성공하였다. 그러나, 상기 방법은 많은 스텝을 요하며 번잡한 점, 회수율이 현저히 낮은 점, 정제한 항체의 역가가 낮은 점 등의 문제점이 있 었다.

이에 본 발명자들은, 상기 문제점을 해결하고자 닭 항체에 고 만노오스형 당쇄가 결합되어 있다는 것을 이용하여 고 만노오스형 당쇄와 특이적으로 결합하는 식물 유래 렉틴(바위취 유래 렉틴, 렌즈콩 유래 렉틴 및 Con A)을 사용하여 닭 항체의 정제를 시도하였다. 그러나, 바위취 유래 렉틴, 렌즈콩 유래 렉틴을 이용하는 경우에 닭 항체가 렉틴에 흡착되기는 하지만, 상기 항체를 용출시킬 수 없었다. 또한, Con A를 이용한 경우에는 닭 항체가 흡착되어 α-메틸글루코시드에 의해 상기 항체를 용출시킬 수 있었다. 그러나, 전기영동적으로 단일 항체를 얻을 수 없었다. 이는 닭 항체와 결합하는 당쇄의 특이적인 구조에 기인하는 것으로 생각된다.

닭 항체(닭 모노크로날 항체)의 당쇄 구조에 대해서는 거의 해석되지 않은 것이 현상이다. 최근에 닭 난황 항체(이하, 'IgY 항체'라고 한다)의 N-아스파라긴 결합형 당쇄(이하 'N형 당쇄'라고 한다)에는 십몇 %의 글루코오스가 존재한다는 것이 보고되었다{Ohta, M. et al., Glycoconj. J., 8, 400-413(1991)}. 포유류 동물의 IgG 항체의 N형 당쇄에는 글루코오스가 존재하지 않는 점에서 닭 항체의 당쇄 구조가 특이하다는 것을 알 수 있다. 따라서, 포유류 동물의 항체를 정제할 수 있는 렉틴을 닭 항체의 정제에 그대로 유용하는 것은 곤란하다고 할 수 있다. 또한, 본 발명자들의 당쇄 해석에 따르면, 닭 항체에는 고 만노오스형 당쇄 및 복합형 당쇄가 결합되어 있으며, 당쇄의 비환원 말단에는 여러 개의 글루코오스가 존재하고 있는 것, 특히 닭 IgY 항체의 당쇄의 비환원 말단에는 1개의 글루코오스가 존재한다는 것이 추찰되었다.

본 발명은 상기의 문제점에 비추어 이루어진 것으로, 그 목적은 당쇄, 특히 항체와 결합되어 있는 고 만노오스형 당쇄, 보다 바람직하게는 닭 항체와 결합되어 있는 당쇄와 결합하는 폴리펩티드(예를 들면, 렉틴)를 발견하는 것, 및 상기 폴리펩티드의 대표적인 이용예로서, 항체(특히 닭 항체)의 정제 방법, 동 정제 수단을 제공하는 것에 있다. 나아가, 상기 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리펩티드와 결합하는 항체 및 이들의 이용 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

[특허문헌1]

국제공개 제02/30954호 팜플렛(공개일 : 2002년 4월 18일)

[비특허문헌1]

Biochemistry, 16, 4426, 1977

[비특허문헌2]

The Journal of Biological Chemistry, 254, 4000, 1979

[비특허문헌3]

Biochmistry, 20, 5894, 1981

[비특허문헌4]

The Journal of Biological Chmistry, 268, 7668, 1993

[비특허문헌5]

Carbohydrate Research, 40, 111, 1975

[비특허문헌6]

Carbohydrate Reserch, 110, 283, 1975

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위하여, 렉틴 특히, 조류(해조) 유래 렉틴에 착안하여 닭 항체에 특이적인 비환원 말단에 글루코오스를 갖는 고 만노오스형 당쇄와 결합할 수 있는 렉틴의 검색을 수행하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 발견하기에 이르렀다.

즉, 본 발명에 따른 폴리펩티드는, 상기 과제를 해결하기 위하여, 당쇄와 결합하는 폴리펩티드에 있어서, (a) 배열번호 2에 나타낸 아미노산 배열; 또는 (b) 배열번호 2에 나타낸 아미노산 배열에 있어서, 1개 혹은 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 혹은 부가된 아미노산 배열로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 따른 폴리펩티드는, 상기 과제를 해결하기 위하여, 상기 당쇄가 고 만노오스형 당쇄이어도 된다.

또한, 본 발명에 따른 폴리펩티드는, 상기 과제를 해결하기 위하여, 상기 당쇄가 비환원 말단에 글루코오스가 적어도 하나 이상 결합된 당쇄이어도 된다.

한편, 본 발명에 따른 항체는, 상기 과제를 해결하기 위하여, 상기 본 발명에 따른 폴리펩티드와 결합하는 것을 특징으로 한다.

한편, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는, 상기 과제를 해결하기 위하여, 상기 본 발명에 따른 폴리펩티드를 코드하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는, 상기 과제를 해결하기 위하여, 하기의 (a) 또는 (b)중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 상기의 폴리뉴클레오티드: (a) 배열번호 1에 나타낸 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는 (b) 이하의 (i) 혹은 (ii)중 어느 하나와 스트린전트(stringent)한 조건하에서 하이브리다이즈되는 폴리뉴클레오티드: (i) 배열번호 1에 나타낸 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 혹은 (ii) 배열번호 1에 나타낸 염기 배열과 상보적인 염기 배열로 이루어지는 것이어도 된다.

한편, 본 발명에 따른 벡터는, 상기 과제를 해결하기 위하여, 상기 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 한다.

한편, 본 발명에 따른 폴리펩티드의 생산 방법은, 상기 과제를 해결하기 위하여, 상기 본 발명에 따른 벡터를 이용하는 것을 특징으로 한다.

한편, 본 발명에 따른 형질전환체는, 상기 과제를 해결하기 위하여, 상기 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드가 도입되어 있는 것을 특징으로 한다.

한편, 본 발명에 따른 폴리펩티드의 생산 방법은, 상기 과제를 해결하기 위하여, 상기 본 발명에 따른 형질전환체를 이용하는 것을 특징으로 한다.

한편, 본 발명에 따른 검출 기구는, 상기 과제를 해결하기 위하여, 상기 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드가 기판상에 고정화되어 있는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 따른 검출 기구는, 상기 과제를 해결하기 위하여, 상기 본 발명에 따른 폴리펩티드가 기판상에 고정화되어 있는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 따른 검출 기구는, 상기 과제를 해결하기 위하여, 상기 본 발명에 따른 항체가 기판상에 고정화되어 있는 구성이어도 된다.

한편, 폴리펩티드의 정제 방법은, 상기 과제를 해결하기 위하여, 상기 본 발명에 따른 항체를 이용하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 따른 항체의 정제 방법은, 상기 과제를 해결하기 위하여, 상기 본 발명에 따른 폴리펩티드를 이용하는 것을 특징으로 한다. 또한, 본 발명에 따른 항체의 정제 방법은, 상기 과제를 해결하기 위하여, 상기 본 발명에 따른 폴리펩티드에 더하여 Carnin을 이용하는 방법이어도 된다. 또한, 본 발명에 따른 항체의 정제 방법은, 상기 과제를 해결하기 위하여, 상기 본 발명에 따른 폴리펩티드 및 Carnin 중 어느 한쪽 또는 양쪽을 이용하는 방법이어도 된다.

또한, 본 발명에 따른 항체의 정제 방법은, 상기 과제를 해결하기 위하여, 상기 항체가 닭 항체인 것을 특징으로 한다.

한편, 본 발명에 따른 담체는, 상기 과제를 해결하기 위하여, 상기 본 발명에 따른 폴리펩티드가 고정화되어 있는 것을 특징으로 한다. 또한, 본 발명에 따른 담체는, 상기 과제를 해결하기 위하여, 상기 본 발명에 따른 폴리펩티드에 더하여 Carnin이 고정화되어 있어도 된다. 또한, 본 발명에 따른 담체는, 상기 과제를 해결하기 위하여, 상기 본 발명에 따른 폴리펩티드 및 Carnin 중 어느 한쪽 또는 양쪽을 이용하는 것이어도 된다.

본 발명에 따른 폴리펩티드는 당쇄, 특히 고 만노오스형 당쇄와 결합 가능하기 때문에 상기 폴리펩티드를 이용하여 각종 항체의 정제를 수행할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 닭 항체에 특이적인 당쇄, 즉 비환원 말단에 적어도 하나 이상의 글루코오스가 존재하는 고 만노오스형 당쇄와 결합할 수 있기 때문에 닭 항체의 정제에 특히 최적이며, 정제를 효율적으로 수행할 수 있다는 효과가 있다. 또한, 공지의 렉틴 Carnin에 대해서도 마찬가지로 이용 가능하다.

본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 상기 본 발명에 따른 폴리펩티드를 코드한다. 따라서, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 이 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 이 폴리뉴클레오티드가 도입된 형질전환체를 이용함으로써, 상기 본 발명에 따른 폴리펩티드를 간편하고 또한 대량으로 조제할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 항체는 본 발명에 따른 폴리펩티드와 결합할 수 있다. 이에, 상기 항체를 예를 들면 담체에 고정화하여 어피니티 크로마토그래피를 수행함으로써, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함하는 미정제 용액으로부터 상기 펩티드를 효율적으로 정제할 수 있다는 효과를 갖는다.

본 발명의 다른 목적, 특징 및 우수한 점은 이하의 기재에 의해 충분히 이해할 수 있을 것이다. 또한, 본 발명의 이익은 다음의 설명에서 명백해질 것이다.

도 1은 닭 항체의 당쇄 구조를 도시한 도면.

도 2는 BML-17의 전장 cDNA의 염기 배열 및 그 염기 배열에서 구한 아미노산 배열을 도시한 도면.

도 3은 실시예5에서 소의 티로글로불린 고정화 칩에 대하여 각종 렉틴(ESA-2, Solnin B, BML-17, Carnin, Hypnin A-1, Con A)의 결합, 해리, 용리를 수행한 결과를 도시한 히스토그램.

도 4a는 실시예6에 나타낸 실험에서 렉틴을 고정화한 칼럼(BML-17 칼럼)에 닭 난황 항체를 통과시키고, D-만노오스로 용리한 경우의 단백질 거동을 UV280㎚의 흡수(A₂₈₀)로 모니터한 결과를 도시한 도면.

도 4b는 실시예6에 나타낸 실험에서 렉틴을 고정화한 칼럼(Carnin 칼럼)에 닭 난황 항체를 통과시키고, D-만노오스로 용리한 경우의 단백질 거동을 UV280㎚의 흡수(A₂₈₀)로 모니터한 결과를 도시한 도면.

도 4c는 실시예6에 나타낸 실험에서 렉틴을 고정화한 칼럼(Con A 칼럼)에 닭 난황 항체를 통과시키고, D-만노오스로 용리한 경우의 단백질 거동을 UV280㎚의 흡수(A₂₈₀)로 모니터한 결과를 도시한 도면.

도 4d는 실시예6에 나타낸 실험에서 IgY 정제용 칼럼(시판 제품)에 닭 난황 항체를 통과시키고, 용출 버퍼(시판 제품)로 용리한 경우의 단백질 거동을 UV280㎚의 흡수(A₂₈₀)로 모니터한 결과를 도시한 도면.

도 5a는 실시예7에 나타낸 실험에서 렉틴을 고정화한 칼럼(BML-17 칼럼)에 g하이브리도마 배양 상청을 통과시키고, 500mM D-만노오스로 용리한 경우의 단백질 거동을 UV280㎚의 흡수(A₂₈₀)로 모니터한 결과를 도시한 도면.

도 5b는 실시예7에 나타낸 실험에서 렉틴을 고정화한 칼럼(Carnin 칼럼)에 g하이브리도마 배양 상청을 통과시키고, 500mM D-만노오스로 용리한 경우의 단백질 거동을 UV280㎚의 흡수(A₂₈₀)로 모니터한 결과를 도시한 도면.

도 5c는 실시예7에 나타낸 실험에서 렉틴을 고정화한 칼럼(Con A 칼럼)에 하이브리도마 배양 상청을 통과시키고, 500mM D-만노오스로 용리한 경우의 단백질 거 동을 UV280㎚의 흡수(A₂₈₀)로 모니터한 결과를 도시한 도면.

도 5d는 실시예7에 나타낸 실험에서 렉틴을 고정화한 칼럼(Con A-Hitrap 칼럼)에 하이브리도마 배양 상청을 통과시키고, 500mM D-만노오스로 용리한 경우의 단백질 거동을 UV280㎚의 흡수(A₂₈₀)로 모니터한 결과를 도시한 도면.

도 5e는 실시예7에 나타낸 실험에서 IgY 정제용 칼럼(시판 제품)에 하이브리도마 배양 상청을 통과시키고, 용출 버퍼(시판 제품)로 용리한 경우의 단백질 거동을 UV280㎚의 흡수(A₂₈₀)로 모니터한 결과를 도시한 도면.

도 6a는 실시예7에 있어서 각종 렉틴을 고정화한 칼럼(BML-17 칼럼, Carnin 칼럼, Con A 칼럼, Con A-HiTrap 칼럼) 및 IgY 정제용 칼럼에 하이브리도마 배양 상청을 통과시키고, 500mM D-만노오스로 또는 용출 버퍼로 용리한 경우의 용출액을 웨스턴 브롯에 제공한 결과를 도시한 도면.

도 6b는 실시예7에 있어서 각종 렉틴을 고정화한 칼럼(BML-17 칼럼, Carnin 칼럼, Con A 칼럼, Con A-HiTrap 칼럼) 및 IgY 정제용 칼럼에 하이브리도마 배양 상청을 통과시키고, 500mM D-만노오스로 또는 용출 버퍼로 용리한 경우의 용출액을 SDS-PAGE에 제공한 결과를 도시한 도면

도 7은 실시예1에 있어서 조류(Bryopsis maxima)로부터의 정제획분을 SDS-PAGE(10%겔)에 제공한 결과를 도시한 도면.

도 8은 BML-17의 N말단 아미노산 배열 및 이제까지 단리된 깃털말(Bryopsis) 렉틴(BCL, BPL, Bry-1, Bry-2)의 N말단 아미노산 배열을 도시한 도면.

도 9는 고정화 티로글로불린과 각종 렉틴의 상호 작용을 도시한 센서그램(Sensorgram).

본 발명의 실시 형태에 대하여 설명하면 다음과 같다. 또한, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드 및 이들의 이용에 대하여 상술한다.

(1) 폴리펩티드

본 발명자들은 해조(Bryopsis maxima)로부터 단리한 폴리펩티드(이하 'BML-17'이라 한다)가 당쇄, 특히 고 만노오스형 당쇄, 나아가 닭 항체에 특이적인 당쇄(즉, 비환원 말단에 글루코오스가 적어도 하나 이상 결합된 고 만노오스형 당쇄)와 결합한다는 것, 및 상기 BML-17이 닭 항체(IgY 항체 등)의 정제에 적합하게 이용 가능하다는 것을 발견하여 발명을 완성하기에 이르렀다. 또한, 종래 공지의 조류(Carpopeltis flabellate = C. prorifera) 유래 렉틴인 Carnin에 대해서도 동일한 효과가 있다는 것을 확인하였다.

본 명세서 중에서 사용되는 것처럼, 용어 '폴리펩티드'는 '펩티드' 또는 '단백질'과 교환 가능하게 사용된다. 본 발명에 따른 폴리펩티드는 또한 천연 공급원으로부터 단리되어도 화학합성되어도 된다.

용어 '단리된' 폴리펩티드 또는 단백질은, 천연의 환경으로부터 추출된 폴리펩티드 또는 단백질을 의도한다. 예를 들면, 숙주 세포 중에서 발현된 재조합 폴리 펩티드 및 단백질은 임의의 적절한 기술에 의해 실질적으로 정제되어 있는 천연 또는 재조합 폴리펩티드 및 단백질과 마찬가지로 단리되어 있다고 생각할 수 있다.

본 발명에 따른 폴리펩티드는 천연의 정제 산물, 화학합성 과정의 산물, 및 원핵 생물 숙주 또는 진핵 생물 숙주(예를 들면, 세균세포, 효모세포, 고등식물세포, 곤충세포, 및 포유동물세포를 포함)로부터 재조합 기술에 의해 생산된 산물을 포함한다. 재조합 과정에서 이용되는 숙주에 의존하여, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 글리코실화되거나 비글리코실화될 수 있다. 아울러, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 또한 몇 가지의 경우에서는 숙주 매개 프로세스의 결과로서 스타트 모디화이드 메티오닌 잔기(start modified methionine residue)를 포함할 수 있다.

본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드를 제공한다. 일 실시 형태에 있어서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 배열번호 2에 나타낸 아미노산 배열로 이루어진 폴리펩티드, 또는 배열번호 2에 나타낸 아미노산 배열로 이루어진 폴리펩티드의 변이체이면서 또한 본 발명에 따른 폴리펩티드이다.

변이체로는 결실(缺失), 삽입, 역전, 반복 및 타입 치환(예를 들면, 친수성 잔기의 다른 잔기로의 치환, 그러나 통상은 강 친수성 잔기를 강 소수성 잔기로 치환하지 않는다)을 포함하는 변이체를 들 수 있다. 특히, 폴리펩티드에서의 '중성' 아미노산 치환은 일반적으로 그 폴리펩티드의 활성에 거의 영향을 주지 않는다.

폴리펩티드의 아미노산 배열중 몇 개의 아미노산이 이 폴리펩티드의 구조 또는 기능에 유의미한 영향을 끼치지 않으며 용이하게 개변될 수 있다는 것은 해당 분야에서 주지의 사실이다. 나아가, 인위적으로 개변시킬 뿐만 아니라 천연 단백질 에 있어서 해당 단백질의 구조 또는 기능을 유의미하게 변화시키지 않는 변이체가 존재한다는 것도 주지의 사실이다.

당업자는 주지의 기술을 사용하여 폴리펩티드의 아미노산 배열에서 1 또는 복수의 아미노산을 용이하게 변이시킬 수 있다. 예를 들면, 공지의 점변이 도입법에 따르면, 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드의 임의의 염기를 변이시킬 수 있다. 또한, 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드의 임의의 부위에 대응하는 프라이머를 설계하여 결실 변이체 또는 부가 변이체를 제작할 수 있다. 더욱이, 본 명세서 중에 기재된 방법을 이용하면, 제작된 변이체가 소망하는 본 발명에 따른 것인지 여부를 용이하게 결정할 수 있다.

바람직한 변이체는 보존성 혹은 비보존성 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 갖는다. 바람직하게는 사일런트 치환, 첨가 및 결실이며, 특히 바람직하게는 보존성 치환이다. 이들은 본 발명에 따른 폴리펩티드 활성을 변화시키지 않는다.

대표적인 보존성 치환으로 볼 수 있는 것은, 지방족 아미노산 Ala, Val, Leu 및 Ile 중에서 하나의 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환; 히드록실 잔기 Ser 및 Thr의 교환, 산성 잔기 Asp 및 Glu의 교환, 아미드 잔기 Asn 및 Gln간의 치환, 염기성 잔기 Lys 및 Arg의 교환, 및 방향족 잔기 Phe, Tyr간의 치환이다.

상기에 상세히 나타낸 바와 같이, 어느 아미노산의 변화가 표현형적으로 사일런트인지(즉, 기능에 대하여 유의미하게 유해한 효과를 갖지 않았는지)에 관한 한층 더한 가이던스는 Bowie, J.U.들 'Deciphering the Message in Protein Sequences : Tolerance to Amino Acid Substitutions', Science 247 : 1306- 1310(1990)(본 명세서 중에 참고로 원용됨)에서 찾아볼 수 있다.

본 실시 형태에 따른 폴리펩티드는 당쇄와 결합하는 폴리펩티드로서,

(a) 배열번호 2에 나타낸 아미노산 배열; 또는

(b) 배열번호 2에 나타낸 아미노산 배열에 있어서, 1개 혹은 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 혹은 부가된 아미노산 배열

로 이루어지는 폴리펩티드인 것이 바람직하다.

상기 '1개 혹은 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 혹은 첨가된'이란, 부위 특이적 돌연 변이 유발법 등의 공지의 변이 폴리펩티드 제작법에 의해 치환, 결실, 삽입 혹은 부가할 수 있는 정도의 숫자(바람직하게는 10개 이하, 보다 바람직하게는 7개 이하, 더욱 바람직하게는 5개 이하)의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 혹은 부가되어 있다는 것을 의미한다. 이와 같은 변이 폴리펩티드는, 상술한 바와 같이 공지의 변이 폴리펩티드 제작법에 의해 인위적으로 도입된 변이를 갖는 폴리펩티드에 한정되는 것은 아니며, 천연에 존재하는 폴리펩티드를 단리 정제한 것이어도 된다.

또한, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 아미노산이 펩티드 결합되어 있는 폴리펩티드이면 되지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 폴리펩티드 이외의 구조를 포함하는 복합 폴리펩티드이어도 된다. 본 명세서 중에서 사용되는 것처럼, '폴리펩티드 이외의 구조'로는, 당쇄나 이소프레노이드기 등을 들 수 있지만, 특별히 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 부가적인 폴리펩티드를 포함하는 것이어 도 된다. 부가적인 폴리펩티드로는, 예를 들면 His나 Myc, Flag 등의 에피토프 표식 폴리펩티드를 들 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 후술하는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드(본 발명에 따른 폴리펩티드를 코드하는 유전자)를 숙주 세포에 도입하고, 그 폴리펩티드를 세포내 발현시킨 상태이어도 되고, 세포, 조직 등으로부터 단리 정제된 경우이어도 된다. 또한, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 화학합성된 것이어도 된다.

다른 실시 형태에 있어서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 융합 단백질과 같은 개변된 형태로 재조합될 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 폴리펩티드의 부가적인 아미노산, 특히 하전성 아미노산 영역이 숙주 세포 내에서의 정제 동안 또는 이어지는 조작 및 보존 동안의 안정성 및 지속성을 개선하기 위하여 폴리펩티드의 N말단에 부가될 수 있다.

본 실시 형태에 따른 폴리펩티드는, 예를 들면 융합된 폴리펩티드의 정제를 용이하게 하는 펩티드를 코드하는 배열인 태그 표식(태그 배열 또는 마커 배열)에 N말단 또는 C말단으로 부가될 수 있다. 이와 같은 배열은 폴리펩티드의 최종 조제 전에 제거될 수 있다. 본 발명의 이러한 측면의 특정 바람직한 실시 형태에 있어서, 태그 아미노산 배열은 헥사히스티딘 펩티드{예를 들면 pQE 벡터(Qiagen, Inc.)에서 제공하는 태그}이며, 다른 것 중에서 이들의 대부분은 공적 및/또는 상업적으로 입수 가능하다. 예를 들면, Gentz 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 : 821-824(1989)(본 명세서 중에서 참고로 원용됨)에 기재되어 있는 바와 같이, 헥사히스 티딘은 융합 단백질의 간편한 정제를 제공한다. 'HA' 태그는, 인플루엔자 적혈구 응집소(HA) 단백질 유래 에피토프에 대응하는 정제를 위하여 유용한 다른 펩티드로서, 이는 Wilson 등의 Cell 37 : 767(1984)(본 명세서 중에서 참고로 원용됨)에 기재되어 있다. 다른 그와 같은 융합 단백질은 N 또는 C말단에서 Fc에 융합되는 본 실시 형태에 따른 폴리펩티드 또는 그 프래그먼트를 포함한다.

다른 실시 형태에 있어서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 하기에서 상술되는 바와 같이 재조합되어도 화학합성되어도 된다.

재조합은 해당 분야에서 주지된 방법을 사용하여 수행할 수 있는데, 예를 들면 이하에 상술되는 바와 같은 벡터 및 세포를 이용하여 수행할 수 있다.

합성 펩티드는 화학합성의 공지의 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 예를 들어, Houghten은 4주 미만으로 조제되며 특징지어진 HA1 폴리펩티드 세그먼트의 단일 아미노산 개변체를 나타내는 10~20㎎의 248의 서로 다른 13잔기 펩티드와 같은 다수의 펩티드 합성을 위한 간단한 방법을 기재하고 있다. Houghten, R. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 5131-5135(1985). 이 'Simultaneous Multiple Peptide Synthesis(SMPS)' 프로세스는, 더욱이 Houghten 등(1986)의 미국특허 제4,631,211호에 기재되어 있다. 이 프로세스에 있어서, 여러 펩티드의 고상 합성을 위한 개개의 수지는 서로 다른 용매 투과성 패킷에 포함되어 있으며, 고상법에 관련된 많은 동일한 반복 공정의 최적 사용을 가능하게 한다. 완전한 매뉴얼 프로세스는 500~1000 이상의 합성이 동시에 수행될 수 있게 한다(Houghten 등, 상기 개재물, 5134). 이들 문헌은 본 명세서 중에 참고로 원용된다.

이하에 상세하게 기재하는 바와 같이, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 항체(특히 닭 항체)의 정제 방법 및 키트에 유용하다.

본 발명자들은 본 발명에 따른 폴리펩티드가 당쇄, 특히 고 만노오스형 당쇄, 나아가 비환원 말단에 글루코오스가 적어도 하나 이상 결합된 고 만노오스형 당쇄와 결합하는 것을 발견하였다. 여기서 '당쇄'란, 직쇄 또는 분기된 올리고당 또는 다당을 의미한다. 또한, 상기 당쇄에는 단백질과의 결합 양식에 따라 아스파라긴과 결합하는 N-글리코시드 결합 당쇄(이하, 'N형 당쇄'라고 함) 및 세린, 트레오닌 등과 결합하는 O-글리코시드 결합 당쇄(이하, 'O형 당쇄'라고 함)로 크게 나누어진다. 아울러, N형 당쇄에는 고 만노오스형 당쇄, 복합형 당쇄, 혼성형 당쇄가 있다. 본 발명에서는 상기 당쇄가 모두 포함된다.

또한, 올리고당이란, 단당 또는 단당의 치환 유도체가 2~10개 탈수 결합하여 생긴 것을 말한다. 나아가, 다수의 단당이 결합되어 있는 당질을 다당이라 한다. 다당은, 구성 당의 종류에 따라 다르지만, 우론산이나 에스테르황산을 많이 포함하는 당질을 산성 다당, 중성당뿐인 것을 중성 다당이라 한다. 다당 중 뮤코 다당이라 불리는 일군의 다당은 대부분이 단백질과 결합되어 있으며, 프로테오글리칸이라 한다. 단당이란, 당쇄의 구성 단위가 되는 것으로, 가수분해에 의해 더 간단한 분자가 되지 않는 기본적 물질이다.

나아가, 단당은 칼복실기 등의 산성 측쇄를 갖는 산성당, 히드록실기가 아미노기로 치환된 아미노당, 그 이외의 중성당의 3개로 크게 나누어진다. 생체 내에 존재하는 단당으로, 산성당은 N-아세틸노이라민산이나 N-글리코릴노이라민산(이하, 'Neu5Gc'라 한다) 등의 시알산이나 우론산 등이 있으며, 아미노당으로는 N-아세틸글루코사민(이하 'GlcNAc'라고 한다)이나 N-아세틸갈락토사민 등이 있으며, 중성당으로는 글루코오스, 만노오스, 갈락토오스, 푸코오스 등을 들 수 있다.

또한, 항체와 결합하는 당쇄로는 N형 당쇄의 3개의 타입 모두를 포함한다. N형 당쇄는 모두 '트리만노실 코어'라 불리는 〔Manα1-6(Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc〕로 이루어진 공통 모핵 구조를 가지고 있다. 고 만노오스형 당쇄란, 트리만노실 코어에 더하여 분기 구조 부분에 α-만노오스 잔기만을 포함한다. 이 당쇄에는 〔Manα1-6(Manα1-3)Manα1-6(Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc〕라는 7당이 공통의 모핵으로 포함되어 있다. 또한, 혼성형 당쇄는 복합형과 고 만노오스형의 양쪽 특징을 아울러 갖는다는 점에서 그렇게 불리고 있다. 하나 또는 2개의 α-만노실기가, 고 만노오스형의 경우와 마찬가지로, 트리만노실 코어의 Manα1-6아암(arm)과 결합하고, 복합형 당쇄의 측쇄와 같은 것이 코어의 Manα1-3아암과 결합되어 있다. 트리만노실코어의 환원 말단에 위치하는 GlcNAc의 C-6위로의 푸코오스의 결합 유무, 또한 β만노실 잔기의 C-4위로의 β-GlcNAc의 결합(바이섹팅 GlcNAc라 불린다)의 유무는 복합형이나 혼성형 당쇄 구조의 다양성에 기여하고 있다. 3개의 N-형 당쇄 사이에서 복합형이 가장 다양한 구조를 포함하고 있다. 이 다양성은 주로 2개의 요소에 의해 만들어지며, 트리만노실 코어에 1개에서 5개의 측쇄가 각각 서로 다른 결합 위치에서 결합되어 1, 2, 3, 4 또는 5개 측쇄 당쇄를 형성하고 있다. 3개 측쇄의 복합형 당쇄로는, 〔GlcNAcβ1-4(GlcNAcβ1-2)Manα1-3〕 혹은 〔GlcNAcβ1-6(GlcNAcβ1-2)Manα1-6〕 중 어느 하나를 포함하는 2개의 이성 체가 발견되었다.

또한, 상기 트리만노실 코어에 있어서, 아스파라긴과 결합하는 당쇄의 말단, 즉 GlcNAc측 말단을 환원 말단, 그 반대쪽, 즉 Man측 말단을 비환원 말단이라 한다. 본 발명자들의 당쇄 해석에 따르면, 닭 항체(닭형 IgY 항체 등)에는 고 만노오스형 당쇄 및 복합형 당쇄가 결합되어 있으며, 또한 고 만노오스형 당쇄의 비환원 말단에는 적어도 1개 이상의 글루코오스가 존재하고 있다는 것이 밝혀졌다. 특히 닭형 IgY 항체의 고 만노오스형 당쇄의 비환원 말단에는 1개의 글루코오스가 존재한다는 것이 밝혀졌다. 도 1에 닭 항체의 당쇄 구조를 나타내었다. 도 1의 좌측에 닭 항체와 결합하는 고 만노오스형 당쇄의 구조를 나타내고, 동 도면의 우측에 복합형 당쇄의 구조를 나타내었다. 상술과 같이, 닭 항체에는 비환원 말단에 1개의 글루코오스 또는 2개의 글루코오스가 존재하고 있다. 특히, 닭형 IgY 항체 당쇄의 비환원 말단에는 1개의 글루코오스가 존재하고 있다. 또한, 복합형 당쇄의 결합에 대해서는 면역 글로불린의 등급에 상관없이 공통이다.

폴리펩티드가 당쇄와 결합하는지 여부는, 예를 들면 표적이 되는 당쇄 또는 당쇄가 결합한 항체 혹은 당단백질 등을 고정화한 칼럼에 시험 대상인 폴리펩티드를 통과시키고, 상기 칼럼에 폴리펩티드가 결합되었는지 여부를 그 통과액에 포함된 폴리펩티드의 양, 또는 특이적 용출제에 의해 칼럼으로부터 용출된 폴리펩티드의 양에 따라 평가할 수 있다. 또한, 표적이 되는 당쇄가 결합된 항체를 멤브레인 등에 고정화하고, 비오틴, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 페르옥시다제 등으로 표식한 폴리펩티드를 이용하여 검출하는 웨스턴 브롯법(법의학의 실제와 연구, 37, 155, 1994 참조), 도트 브롯법(Analytical Biochemistry, 204(1), 198, 1992 참조)을 이용하여 평가할 수 있다. 또한, 표적이 되는 당쇄 또는 당쇄가 결합된 항체 혹은 당단백질 등을 고정화한 칩과 시험 대상인 폴리펩티드와의 친화성을 표면 플라즈몬 공명법(SPR법)을 이용하여 측정하면 된다. 상기 방법에 따르면, 그 친화성 유무뿐만 아니라 그 강도까지 측정할 수 있기 때문에 바람직한 방법이라 할 수 있다. 이때 얻어지는 친화 정수(K_A)가 10(M^-1) 이상, 보다 바람직하게는 10³(M^-1) 이상, 가장 바람직하게는 10⁴(M^-1) 이상이면 폴리펩티드와 당쇄가 결합하였다고 판단할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 적어도 배열번호 2에 나타낸 아미노산 배열을 포함하고 있으면 된다고 할 수 있다. 즉, 배열번호 2에 나타낸 아미노산 배열과 특정 기능(예를 들면 태그)을 갖는 임의의 아미노산 배열로 이루어진 폴리펩티드도 본 발명에 포함된다는 것을 유념해야 할 것이다. 또한, 배열번호 2에 나타낸 아미노산 배열 및 상기 임의의 아미노산 배열은 각각의 기능을 저해하지 않도록 적절한 링커 펩티드로 연결되어 있어도 된다.

즉, 본 발명의 목적은 본 발명에 따른 폴리펩티드를 제공하는 것에 있는 것으로, 본 명세서 중에 구체적으로 기재한 폴리펩티드 제작 방법 등에 있는 것이 아니다. 따라서, 상기 각 방법 이외에 의해 취득되는 본 발명에 따른 폴리펩티드도 본 발명의 기술적 범위에 속한다는 것을 유념해야 한다.

(2) 폴리뉴클레오티드

본 발명은 당쇄와 결합하는 폴리펩티드(이하 '본 발명에 따른 폴리펩티드'라 한다)를 코드하는 뉴클레오티드를 제공한다. 본 명세서 중에서 사용되는 것처럼, 용어 '폴리뉴클레오티드'는 '핵산' 또는 '핵산 분자'와 교환 가능하게 사용되며, 뉴클레오티드의 중합체가 의도된다. 본 명세서 중에서 사용되는 것처럼, 용어 '염기 배열'은 '핵산 배열' 또는 '뉴클레오티드 배열'과 교환 가능하게 사용되고, 디옥시리보뉴클레오티드(A, G, C 및 T로 생략된다)의 배열로 나타내어진다.

본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 RNA(예를 들면 mRNA)의 형태, 또는 DNA의 형태(예를 들면 cDNA 또는 게놈 DNA)로 존재할 수 있다. DNA는 2개쇄 또는 1개쇄일 수 있다. 1개쇄 DNA 또는 RNA는 코드쇄(센스쇄로도 알려져 있다)이거나, 또는 비코드쇄(안티 센스쇄로도 알려져 있다)일 수 있다.

본 명세서 중에서 사용되는 것처럼, 용어 '올리고뉴클레오티드'는 뉴클레오티드가 몇 개 내지 몇십 개 결합된 것이 의도되고, '폴리뉴클레오티드'와 교환 가능하게 사용된다. 올리고뉴클레오티드는, 짧은 것은 디뉴클레오티드(이량체), 트리뉴클레오티드(삼량체)라 불리며, 긴 것은 30mer 또는 100mer와 같이 중합되어 있는 뉴클레오티드의 수로 나타내어진다. 올리고뉴클레오티드는 보다 긴 폴리뉴클레오티드의 프래그먼트로서 생성되어도, 화합합성되어도 된다.

본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드의 프래그먼트는 적어도 12nt(뉴클레오티드), 바람직하게는 약 15nt, 그리고 보다 바람직하게는 적어도 약 20nt, 더욱 바람직하게는 적어도 약 30nt, 그리고 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 40nt의 길이의 프래그먼트가 의도된다. 적어도 20nt 길이의 프래그먼트에 의해, 예를 들면 배열번 호 1에 나타낸 염기 배열로부터의 20 이상의 연속된 염기를 포함하는 프래그먼트가 의도된다. 본 명세서를 참조하면 배열번호 1에 나타낸 염기 배열이 제공되므로, 당업자는 배열번호 1에 의거한 DNA 프래그먼트를 용이하게 제작할 수 있다. 예를 들면, 제한 엔도뉴클레아제 절단 또는 초음파에 의한 전단이 여러 사이즈의 프래그먼트를 제작하기 위해 용이하게 사용될 수 있다. 혹은, 이와 같은 프래그먼트가 합성적으로 제작될 수 있다. 적절한 프래그먼트(올리고뉴클레오티드)가 Applied Biosystems Incorporated(ABI, 850 Lincoln Center Dr., Foster City, CA 94404) 392형 신서사이저 등에 의해 합성된다.

또한, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 그 5'측 또는 3'측에서 상술한 태그 표식(태그 배열 또는 마커 배열)을 코드하는 폴리뉴클레오티드와 융합될 수 있다.

본 발명은 더욱이 본 발명에 따른 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드의 변이체에 관한 것이다. 변이체는 천연의 대립유전자 변이체와 같이 천연으로 발생할 수 있다. '대립유전자 변이체'에 의한 생물의 염색체상의 소정 유전자 자리를 차지하는 유전자의 몇 개의 교환 가능한 형태중 하나가 의도된다. 천연에 존재하지 않는 변이체는, 예를 들면 해당 분야에서 주지의 변이 유발 기술을 이용하여 생성될 수 있다.

이와 같은 변이체로는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드의 염기 배열에서 1 또는 복수의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 변이체를 들 수 있다. 변이체는 코드 혹은 비코드 영역, 또는 그 양쪽에서 변이될 수 있다. 코 드 영역에서의 변이는 보존적 혹은 비보존적인 아미노산 결실, 치환 또는 부가를 생성할 수 있다.

본 발명은 더욱이 스트리전트한 하이브리다이제이션 조건하에서 본 발명에 따른 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드에 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

일 실시 형태에 있어서, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드로서, 또한

(a) 배열번호 2에 나타낸 아미노산 배열로 이루어진 폴리펩티드; 또는

(b) 배열번호 2에 나타낸 아미노산 배열에서 1개 혹은 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 혹은 부가된 아미노산 배열로 이루어진 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드,

중 어느 하나인 것이 바람직하다.

다른 실시 형태에 있어서, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드로서, 이하의 (a) 또는 (b):

(a) 배열번호 1에 나타낸 염기 배열로 이루어진 폴리뉴클레오티드; 또는

(b) 이하의 (i) 혹은 (ii) 중 어느 하나와 스트린전트한 조건하에서 하이브리다이즈되는 폴리뉴클레오티드:

(i) 배열번호 1에 나타낸 염기 배열로 이루어진 폴리뉴클레오티드; 혹은

(ii) 배열번호 1에 나타낸 염기 배열과 상보적인 염기 배열로 이루어진 폴리 뉴클레오티드,

중 어느 하나인 것이 바람직하다.

또한, 상기 '스트리전트한 조건'이란, 적어도 90% 이상의 동일성, 바람직하게는 적어도 95% 이상의 동일성, 가장 바람직하게는 97%의 동일성이 배열간에 존재할 때에만 하이브리다이제이션이 일어나는 것을 의미한다.

상기 하이브리다이제이션은 Sambrook 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory(1989)에 기재된 방법과 같은 주지의 방법으로 수행할 수 있다. 통상 온도가 높을수록, 염농도가 낮을수록 스트리전시가 높아져(하이브리다이즈하기 어려워진다) 보다 상동인 폴리뉴클레오티드를 취득할 수 있다. 하이브리다이제이션의 조건으로는 종래 공지의 조건을 적합하게 이용할 수 있는데, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 42℃, 6×SSPE, 50% 포름아미드, 1% SDS, 100㎍/㎖ 연어 정자 DNA, 5×덴하르트액(단, 1×SSPE; 0.18M 염화나트륨, 10mM 인산나트륨, pH7.7, 1mM EDTA. 5×덴하르트액; 0.1% 우혈청 알부민, 0.1% 피콜, 0.1% 폴리비닐피로리돈)을 들 수 있다.

본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 2개쇄 DNA뿐만 아니라, 그것을 구성하는 센스쇄 및 안티 센스쇄와 같은 각 1개쇄 DNA나 RNA를 포함한다. 또한, DNA에는 예를 들면 클로닝이나 화학 합성 기술 또는 이들의 조합으로 얻어지는 cDNA나 게놈 DNA 등이 포함된다. 아울러, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 언트렌스레이티드 영역(UTR)의 배열이나 벡터 배열(발현 벡터 배열 포함) 등의 배열을 포함하는 것이어도 된다.

본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 취득하는 방법으로, 공지의 기술을 통해 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 DNA 단편을 단리하고, 클로닝하는 방법을 들 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 있어서의 폴리뉴클레오티드의 염기 배열의 일부와 특이적으로 하이브리다이즈하는 프로브를 조제하고, 게놈 DNA 라이브러리나 cDNA 라이브러리를 스크리닝하면 된다. 이와 같은 프로브로는, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드의 염기 배열 또는 그 상보 배열의 적어도 일부에 특이적으로 하이브리다이즈하는 프로브라면 어떠한 배열 및/또는 길이의 것을 이용하여도 된다.

또한, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 취득하는 방법으로, PCR 등의 증폭 수단을 이용하는 방법을 들 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 있어서의 폴리뉴클레오티드의 cDNA 중 5'측 및 3'측 배열(또는 그 상보 배열) 중에서 각각 프라이머를 조제하고, 이들 프라이머를 이용하여 게놈 DNA(또는 cDNA) 등을 주형으로 하여 PCR 등을 수행하고, 양 프라이머 사이에 낀 DNA 영역을 증폭함으로써, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA 단편을 대량으로 취득할 수 있다.

본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 취득하기 위한 공급원으로는, 특히 한정되지 않지만, 소망하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 생물 재료인 것이 바람직하고, 특히 본 발명에 따른 폴리펩티드의 기원인 Bryopsis maxima가 바람직하다. 단, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 목적은 본 발명에 따른 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드와 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드를 제 공하는 것으로, 본 명세서 중에 구체적으로 기재한 폴리뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드의 제작 방법 등에 있는 것은 아니다. 따라서, 상기 각 방법 이외에 의해 취득된 본 발명에 따른 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드 역시 본 발명의 기술적 범위에 속한다는 것을 유념하여야 한다.

(3) 항체

본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 본 명세서 중에서 사용되는 것처럼, 용어 '항체'는 면역 글로불린(IgA, IgD, IgE, IgY, IgG, IgM 및 이들 Fab 프래그먼트, F(ab')₂ 프래그먼트, Fc 프래그먼트)을 의미하고, 예로는 폴리크로날 항체, 모노크로날 항체, 단쇄 항체, 항이디오타이프 항체 및 사람화 항체를 들 수 있는데, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 따른 항체는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 발현하는 생물 재료를 선택할 때 유용할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함하는 미정제 용액으로부터 상기 펩티드를 정제할 때에도 유용하다.

'항체'는 여러 공지의 방법{예를 들면 HarLow 등, 'Antibodies : A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York(1988)', 이와사키 등, '단 클론 항체 하이브리도마와 ELISA, 코단사(1991)'}에 따라 제작할 수 있다.

펩티드 항체는 당해 분야에서 주지의 방법에 의해 제작된다. 예를 들면, Chow, M. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 910-914; 및 Bittle, F.J. 등, J. Gen. Virol. 66 : 2347-2354(1985)(본 명세서 중에 참고로 원용됨)을 참조할 것. 일반적으로 동물은 유리 펩티드로 면역화될 수 있다; 그러나, 항펩티드 항체 역가는 펩티드를 고분자 캐리어{예를 들면 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 또는 파상풍 톡소이드}에 커플링함으로써 추가 면역될 수 있다. 예를 들면, 시스틴을 함유하는 펩티드는 m-말레이미드벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르(MBS)와 같은 링커를 사용해서 캐리어에 커플링될 수 있는 반면, 다른 펩티드는 글루타르알데히드와 같은 보다 일반적인 연결제를 사용하여 캐리어에 커플링될 수 있다. 토끼, 래트 및 마우스와 같은 동물은 유리 또는 캐리어 커플링 펩티드 중 어느 하나로, 예를 들면 약 100㎍의 펩티드 또는 캐리어 단백질 및 Freund의 애주번트를 포함하는 에멀젼의 복강 내 및/또는 피내 주사에 의해 면역화된다. 몇 번의 추가 면역 주사가, 예를 들면 고체 표면에 흡착된 유리 펩티드를 사용하여 ELISA법에 의해 검출될 수 있는 유용한 역가의 항펩티드 항체를 제공하기 때문에, 예를 들면 약 2주간의 간격으로 필요할 수 있다. 면역화 동물로부터의 혈청에서의 항펩티드 항체의 역가는 항펩티드 항체의 선택에 의해, 예를 들면 당해 분야에서 주지의 방법에 따른 고체 지지체상의 펩티드로의 흡착 및 선택된 항체의 용출에 의해 증가될 수 있다.

본 명세서 중에서 사용되는 것처럼, 용어 '본 발명에 따른 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체'는 본 발명에 따른 폴리펩티드 항원에 특이적으로 결합될 수 있는 완전한 항체 분자 및 항체 프래그먼트(예를 들면 Fab 및 F(ab')₂ 프래그먼트)를 포함하는 것을 의미한다. Fab 및 F(ab')₂ 프래그먼트는 완전한 항체의 Fc 부분이 결여되어 있으며, 순환에 따라 더욱 신속히 제거되고, 완전한 항체의 비특이 적 조직 결합을 거의 가질 수 없다{Wahl 등, J. Nucl. Med. 24 : 316-325(1983)(본 명세서 중에 참고로 원용됨)}. 따라서, 이들 프래그먼트가 바람직하다.

나아가, 본 발명에 따른 폴리펩티드의 펩티드 항원에 결합될 수 있는 항체는 항이디오타이프 항체의 사용을 통해 2 공정 절차에 의해 생산될 수 있다. 이와 같은 방법은 항체 그 자체가 항원이라는 사실을 사용하며, 따라서 2차 항체와 결합하는 항체를 얻을 수 있다. 이 방법에 따라 본 발명에 따른 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체는 동물(바람직하게는 마우스)을 면역하기 위해 사용된다. 이어서, 이와 같은 동물의 지라 세포는 하이브리도마 세포를 생산하기 위해 사용되고, 하이브리도마 세포는 본 발명에 따른 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체와 결합하는 능력이 본 발명에 따른 폴리펩티드 항원에 의해 블록될 수 있는 항체를 생산하는 클론을 고정하기 위하여 스크리닝된다. 이와 같은 항체는 본 발명에 따른 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체에 대한 항이디오타이프 항체를 포함하며, 더욱이 본 발명에 따른 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체의 형성을 유도하기 위하여 동물을 면역하기 위해 사용될 수 있다.

Fab와 F(ab')₂ 및 본 발명에 따른 항체의 다른 프래그먼트가 본 명세서 중에 개시되어 있는 방법에 따라 사용될 수 있다는 것은 명백하다. 이와 같은 프래그먼트는 대표적으로 파파인(Fab 프래그먼트를 발생한다) 또는 펩신{F(ab')₂ 프래그먼트를 발생한다}과 같은 효소를 사용하는 단백질 분해에 의한 절단에 의해 생산된다. 또한 본 발명에 따른 폴리펩티드 결합 프래그먼트는 재조합 DNA 기술의 적용 또는 합성화학에 의해 생산될 수 있다.

이와 같이 본 발명에 따른 항체는 적어도 본 발명에 따른 폴리펩티드를 인식하는 항체 프래그먼트{예를 들면 Fab 및 F(ab')₂ 프래그먼트}를 구비하고 있으면 된다고 할 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 인식하는 항체 프래그먼트와 서로 다른 항체 분자의 Fc 프래그먼트로 이루어진 면역 글로불린도 본 발명에 포함된다는 것을 유념하여야 할 것이다.

즉, 본 발명의 목적은 본 발명에 따른 폴리펩티드를 인식하는 항체를 제공하는 것에 있는 것으로, 본 명세서 중에 구체적으로 기재한 개개의 면역 글로불린의 종류(IgA, IgD, IgE, IgY, IgG 또는 IgM), 키메라 항체 제작 방법, 펩티드 항원 제작 방법 등에 있는 것은 아니다. 따라서, 상기 각 방법 이외에 의해 취득되는 항체도 본 발명의 기술적 범위에 속한다는 것을 유념하여야 한다.

(4) 본 발명에 따른 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드의 이용

(4-1) 벡터

본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드를 생성하기 위해 사용되는 벡터를 제공한다. 본 발명에 따른 벡터는 인 비트로 트랜스레이션(in vitro translation)에 이용하는 벡터이어도, 재조합 발현에 이용하는 벡터이어도 된다.

본 발명에 따른 벡터는 상술한 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 코드하는 폴로뉴클레오티드의 cDNA가 삽입된 재조합 발현 벡터 등을 들 수 있다. 재조합 발현 벡터의 제작 방법으로는, 플라스미드, 페이지 또는 코스미드 등을 이용하는 방법을 들 수 있지만 특별히 한정되지 않는다.

벡터의 구체적인 종류는 특별히 한정되지 않으며, 숙주 세포 중에서 발현 가능한 벡터를 적절하게 선택하면 된다. 즉, 숙주 세포의 종류에 따라 확실하게 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위하여 적절하게 프로모터 배열을 선택하고, 이와 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 각종 플라스미드 등에 넣은 벡터를 발현 벡터로 이용하면 된다.

발현 벡터는, 바람직하게는 적어도 하나의 선택 마커를 포함한다. 이와 같은 마커로, 진핵 생물 세포 배양에 대해서는 디히드로 엽산 환원 효소 또는 네오마이신 내성, 및 E. coli과 다른 세균의 배양에 대해서는 테트라사이클린 내성 유전자 또는 암피실린 내성 유전자를 들 수 있다.

상기 선택 마커를 이용하면, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포에 도입되었는지 여부, 나아가 숙주 세포 중에서 확실하게 발현되었는지 여부를 확인할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 융합 폴리펩티드로 발현시켜도 되는데, 예를 들면 애쿼리아 빅토리아(Aequorea victoria) 유래의 녹색 형광 폴리펩티드 GFP(Green Fluorescent Protein)를 마커로 이용하여 본 발명에 따른 폴리펩티드를 GFP 융합 폴리펩티드로 발현시켜도 된다.

상기의 숙주 세포는 특별히 한정되지 않으며, 종래 공지의 각종 세포를 적절하게 이용할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 대장균(Escherichia coli) 등의 세균, 효모(출아효모 Saccharomyces cerevisiae, 분열효모 chizosaccharomyces pombe), 선충(Caenorhabditis elegans), 아프리카 발톱 개구리(Xenopus laevis)의 난모세포 등을 들 수 있는데, 특별히 한정되는 것은 아니다. 상기의 숙주 세포를 위한 적절한 배양 배지 및 조건은 당해 분야에서 주지이다.

상기 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하는 방법, 즉 형질전환법도 특별히 한정되는 것은 아니며, 전기 천공법, 인산칼슘법, 리포솜법, DEAE 덱스트란법 등의 종래 공지의 방법을 적절하게 이용할 수 있다. 또한, 예를 들면 본 발명에 따른 폴리펩티드를 곤충에서 전이 발현시킬 경우에는 바큐로바이러스를 이용한 발현계를 이용하면 된다.

이와 같이, 본 발명에 따른 벡터는 적어도 본 발명에 따른 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하면 된다고 할 수 있다. 즉, 발현 벡터 이외의 벡터도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다는 점을 유념하여야 할 것이다.

즉, 본 발명의 목적은 본 발명에 따른 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터를 제공하는 것에 있는 것으로, 본 명세서 중에 구체적으로 기재한 개개의 벡터종, 세포종, 벡터 제작 방법 및 세포 도입 방법에 있는 것은 아니다. 따라서, 상기 이외의 벡터종 및 벡터 제작 방법을 이용하여 취득한 벡터도 본 발명의 기술적 범위에 속한다는 점을 유념하여야 한다.

(4-2) 형질전환체 또는 세포

본 발명은 상술한 본 발명에 따른 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 형질전환체 또는 세포를 제공한다. 여기서 '형질전환체'란, 조직 또는 기관뿐만 아니라 생물 개체를 포함하는 것을 의미한다.

형질전환체 또는 세포의 제작 방법(생산 방법)은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 상술한 재조합 벡터를 숙주에 도입하여 형질전환하는 방법을 들 수 있다. 또한, 형질전환의 대상이 되는 생물도 특별히 한정되는 것은 아니며, 상기 숙주 세포에서 예시한 각종 미생물, 식물 또는 동물을 들 수 있다.

본 발명에 따른 형질전환체 또는 세포는, 조류 혹은 그 자손, 또는 이들 유래의 조직인 것이 바람직하며, 큰깃털말(Bryopsis maxima)인 것이 특히 바람직하다.

본 발명에 따른 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질전환체는, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 상기 유전자가 발현될 수 있도록 숙주 세포 중에 도입함으로써 얻을 수 있다.

이하, 숙주 세포로서 식물을 이용한 경우를 예로 설명한다. 또한, 본 발명에서 사용하는 숙주 세포는 식물에 한정되는 것은 아니다. 식물체의 형질전환에 이용되는 재조합 발현 벡터는, 해당 식물 내에서 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 발현시킬 수 있는 벡터라면 특별히 한정되지 않는다. 이와 같은 벡터로는, 예를 들면 식물 세포 내에서 폴리뉴클레오티드를 구성적으로 발현시키는 프로모터(예를 들면 컬리플라워 모자이크 바이러스의 35S 프로모터)를 갖는 벡터, 또는 외적인 자극에 의해 유도성으로 활성화되는 프로모터를 갖는 벡터를 들 수 있다.

본 발명에서 형질전환의 대상이 되는 식물은 식물체 전체, 식물 기관(예를 들면 잎, 꽃잎, 줄기, 뿌리, 종자 등), 식물 조직(예를 들면 표피, 체관부, 유조직, 물관부, 유관속, 책상 조직, 해면상 조직 등) 또는 식물 배양 세포, 혹은 여러 형태의 식물 세포(예를 들면 현탁 배양 세포), 원형질체(Protoplasts), 잎 절편, 유합 조직(Calluses) 등의 모두를 의미한다. 형질전환에 이용되는 식물로는, 특별히 한정되지 않으며, 외떡잎 식물강 또는 쌍떡잎 식물강 중 어느 것이어도 된다.

식물로의 유전자 도입에는 당업자에게 공지된 형질전환 방법(예를 들면 아그로박테리움법, 유전자총, PEG법, 일렉트로포레이션법 등)이 이용된다. 예를 들면, 아그로박테리움을 통한 방법과 직접 식물 세포에 도입하는 방법은 주지이다. 아그로박테리움법을 이용하는 경우에는 구축한 식물용 발현 벡터를 적당한 아그로박테리움{예를 들면 아그로박테리움 투메파키엔스(Agrobacterium tumefaciens)}에 도입하고, 이것을 리프 티스크법(우치미야 히로후미 저, 식물 유전자조작 매뉴얼, 1990, 27-31pp, 코단사 사이엔티픽, 도쿄) 등에 따라 무균 배양 잎에 감염시켜 형질전환 식물을 얻을 수 있다. 또한, Negel 등의 방법{Micribiol. Lett., 67, 325(1990)}이 이용될 수 있다. 이 방법은, 먼저 예를 들면 발현 벡터를 아그로박테리움에 도입하고, 이어서 형질전환된 아그로박테리움을 Plant Molecular Biology Manual(S. B. Gelvin들, Academic Press Publishers)에 기재된 방법으로 식물 세포 또는 식물 조직에 도입하는 방법이다. 여기서, '식물 조직'이란, 식물 세포의 배양에 의해 얻어지는 유합 조직을 포함한다. 아그로박테리움법을 이용하여 형질전환을 수행하는 경우에는 바이너리 벡터(pBI121 또는 pPZP202 등)를 사용할 수 있다.

또한, 유전자를 직접 식물 세포 또는 식물 조직에 도입하는 방법으로는 일렉트로포레이션법, 유전자총법이 알려져 있다. 유전자총을 이용하는 경우에는 식물체, 식물 기관, 식물 조직 자체를 그대로 사용하여도 되고, 절편을 조제한 후에 사 용하여도 되ㅁ며, 프로토플라스트를 조제하여 사용하여도 된다. 이와 같이 조제한 시료를 유전자 도입 장치{예를 들면, PDS-1000(BIO-RAD사) 등}를 이용하여 처리할 수 있다. 처리 조건은 식물 또는 시료에 따라 서로 다르지만, 통상 450~2000psi 정도의 압력, 4~12㎝ 정도의 거리로 수행한다.

유전자가 도입된 세포 또는 식물 조직은, 먼저 하이그로마이신 내성 등의 약제 내성에 의해 선택되고, 이어서 정법에 의해 식물체에 재생된다. 형질전환 세포로부터 식물체의 재생은 식물 세포의 종류에 따라 당업자가 공지의 방법으로 수행할 수 있다.

식물 배양 세포를 숙주로 이용하는 경우, 형질전환은 재조합 벡터를 유전자총, 일렉트로포레이션법 등으로 배양 세포에 도입한다. 형질전환의 결과 얻어지는 유합 조직이나 슛(Shoots), 모상근 등은 그대로 세포 배양, 조직 배양 또는 기관 배양에 이용할 수 있으며, 또한 종래 알려져 있는 식물 조직 배양법을 이용하여 적당한 농도의 식물 호르몬(오옥신, 사이트카이닌, 지베렐린, 아브시진산, 에틸렌, 브라시놀라이드 등)의 투여 등에 의해 식물체에 재생시킬 수 있다.

유전자가 식물에 도입되었는지 여부의 확인은 PCR법, 서던 하이브리다이제이션법, 노던 하이브리다이제이션법 등에 의해 수행할 수 있다. 예를 들면, 형질전환 식물로부터 DNA를 조제하고, DNA 특이적 프라이머를 설계하여 PCR을 수행한다. PCR은 상기 플라스미드를 조제하기 위하여 사용한 조건과 동일한 조건으로 수행할 수 있다. 그 이후에는 증폭 산물에 대하여 아가로스 겔 전기영동, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 캐필러리 전기영동 등을 수행하여 취화 애티듐(Ethidium bromide), SYBR Green액 등을 통해 염색하고, 증폭 산물을 1개의 밴드로 검출함으로써, 형질전환된 것을 인식할 수 있다. 또한, 미리 형광 색소 등을 통해 표식한 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 증폭 산물을 검출할 수도 있다. 아울러, 마이크로 플레이트 등의 고상에 증폭 산물을 결합시키고, 형광 또는 효소 반응 등을 통해 증폭 산물을 인식하는 방법도 채용할 수 있다.

본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드가 게놈 내에서 조합된 형질전환 식물체가 일단 얻어지면, 해당 식물체의 유성 생식 또는 무성 생식에 의해 자손을 얻을 수 있다. 또한, 해당 식물체 또는 그 자손, 혹은 이들 클론으로부터, 예를 들면 종자, 과실, 자른 가지, 괴경, 괴근, 그루터기, 유합 조직, 프로토플라스트 등을 얻고, 이들을 바탕으로 해당 식물체를 양산할 수 있다. 따라서, 본 발명에는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드가 발현 가능하게 도입된 식물체, 혹은 해당 식물체와 동일한 성질을 갖는 해당 식물체의 자손 또는 이들 유래 조직도 포함된다.

이와 같이, 본 발명에 따른 형질전환체 또는 세포는 적어도 본 발명에 따른 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드가 도입되어 있으면 된다고 할 수 있다. 즉, 재조합 발현 벡터 이외의 수단에 의해 생성되는 형질전환체 또는 세포도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다는 점을 유념하여야 한다.

본 발명의 목적은 본 발명에 따른 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 형질전환체 또는 세포를 제공하는 것에 있는 것으로, 본 명세서 중에 구체적으로 기재한 개개의 벡터종 및 도입 방법에 있는 것이 아니다. 따라서, 상기 이외의 벡터종 및 세포종, 아울러 벡터 제작 방법 및 세 포 도입 방법을 이용하여 취득한 형질전환체 또는 세포도 본 발명의 기술적 범위에 속한다는 점을 유념하여야야 한다.

(4-3) 폴리펩티드의 생산 방법

본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드를 생산하는 방법을 제공한다.

일 실시 형태에 있어서, 본 발명에 따른 폴리펩티드의 생산 방법은 본 발명에 따른 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 이용하는 것을 특징으로 한다.

본 실시 형태의 하나의 국면에 있어서, 본 실시 형태에 따른 폴리펩티드의 생산 방법은 상기 벡터를 무세포 단백질 합성계에 이용하는 것이 바람직하다. 무세포 단백질 합성계를 이용하는 경우, 여러 시판 키트를 이용하면 된다. 바람직하게는, 본 실시 형태에 따른 폴리펩티드의 생산 방법은 상기 벡터와 무세포 단백질 합성액을 인큐베이트하는 공정을 포함한다.

본 실시 형태의 다른 국면에 있어서, 본 실시 형태에 따른 폴리펩티드의 생산 방법은 재조합 발현계를 이용하는 것이 바람직하다. 재조합 발현계를 이용하는 경우, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 재조합 발현 벡터에 조합한 후, 공지의 방법에 의해 발현 가능한 숙주에 도입하고, 숙주 내에서 트랜스레이션되어 얻어지는 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법 등을 채용할 수 있다. 재조합 발현 벡터는 플라스미드이어도 되며, 숙주에 목적 폴리뉴클레오티드를 도입할 수 있으면 된다. 바람직하게는, 본 실시 형태에 따른 폴리펩티드의 생산 방법은 상기 벡터를 숙주에 도입하는 공정을 포함한다.

이와 같이 숙주에 외래 폴리뉴클레오티드를 도입하는 경우, 발현 벡터는 외래 폴리뉴클레오티드를 발현하도록 숙주 내에서 기능하는 프로모터가 조합되어 있는 것이 바람직하다. 재조합으로 생산된 폴리펩티드를 정제하는 방법은 이용한 숙주, 폴리펩티드의 성질에 따라 다르지만, 태그의 이용 등에 의해 비교적 용이하게 목적의 폴리펩티드를 정제할 수 있다.

본 실시 형태에 따른 폴리펩티드의 생산 방법은, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함하는 세포 또는 조직 추출액으로부터 당해 폴리펩티드를 정제하는 공정을 더 포함하는 것이 바람직하다. 폴리펩티드를 정제하는 공정은 주지의 방법(예를 들면 세포 또는 조직을 파괴한 후에 원심분리하여 가용성 획분을 회수하는 방법)으로 세포나 조직으로부터 세포 추출액을 조제한 후, 이 세포 추출액으로부터 주지의 방법(예를 들면 황안 침전 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 소수 상호 작용 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 히드록시 아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피)을 통해 정제하는 공정이 바람직하지만, 이에 한정되지 않는다. 가장 바람직하게는, 고속 액체 크로마토그래피('HPLC')가 정제를 위해 이용된다.

다른 실시 형태에 있어서, 본 발명에 따른 폴리펩티드의 생산 방법은 본 발명에 따른 폴리펩티드를 천연으로 발현하는 세포 또는 조직으로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 것을 특징으로 한다. 본 실시 형태에 따른 폴리펩티드의 생산 방법은, 상술한 항체 또는 올리고뉴클레오티드를 이용하여 본 발명에 따른 폴리펩티드를 천연으로 발현하는 세포 또는 조직을 동정(同定)하는 공정을 포함하는 것이 바 람직하다. 또한, 본 실시 형태에 따른 폴리펩티드의 생산 방법은, 상술한 폴리펩티드를 정제하는 공정을 더 포함하는 것이 바람직하다.

또 다른 실시 형태에 있어서, 본 발명에 따른 폴리펩티드의 생산 방법은 본 발명에 따른 폴리펩티드를 화학합성하는 것을 특징으로 한다. 당업자는 본 명세서 중에 기재되어 있는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 아미노산 배열에 의거하여 주지의 화학합성 기술을 적용하면, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 화학합성할 수 있다는 것을 용이하게 이해할 수 있다.

이상과 같이, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 생산하는 방법에 의해 취득되는 폴리펩티드는 천연에 존재하는 변이 폴리펩티드이어도, 인위적으로 제작된 변이 폴리펩티드이어도 된다.

변이 폴리펩티드를 제작하는 방법도 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 부위 특이적 변이 유발법{예를 들면, Hashimoto-Gotoh, Gene 152, 271-275(1995) 참조}, PCR법을 이용하여 염기 배열에 점변이를 도입하여 변이 폴리펩티드를 제작하는 방법, 또는 트랜스포존의 삽입에 의한 돌연변이주 제작법 등의 주지의 변이 폴리펩티드 제작법을 이용함으로써, 변이 폴리펩티드를 제작할 수 있다. 변이 폴리펩티드의 제작에는 시판 키트를 이용하여도 된다.

이와 같이, 본 발명에 따른 폴리펩티드의 생산 방법은 적어도 본 발명에 따른 폴리펩티드의 아미노산 배열, 또는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드의 염기 배열에 의거하여 공지 관용 기술을 이용하면 된다고 할 수 있다.

즉, 본 발명의 목적은 본 발명에 따른 폴리펩티드의 생산 방법을 제공하는 것에 있는 것으로, 상술한 여러 공정 이외의 공정을 포함하는 생산 방법도 본 발명의 기술적 범위에 속한다는 점을 유념하여야 한다.

(4-4) 검출 기구

본 발명은 여러 검출 기구도 제공한다. 본 발명에 따른 검출 기구는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 혹은 프래그먼트가 기판상에 고정화된 것, 또는 본 발명에 따른 폴리펩티드 혹은 항체가 기판상에 고정화된 것이며, 여러 조건하에서 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 발현 패턴의 검출·측정 등에 이용할 수 있다.

일 실시 형태에 있어서, 본 발명에 따른 검출 기구는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 및/또는 올리고뉴클레오티드가 기판상에 고정화되어 있는 것을 특징으로 한다. 본 실시 형태의 바람직한 국면에 있어서, 본 실시 형태에 따른 검출 기구는 소위 DNA 칩이다. 본 명세서 중에서 사용되는 것처럼, 용어 'DNA 칩'이란, 합성한 올리고뉴클레오티드를 기판상에 고정화한 합성형 DNA 칩을 의미하지만, 이에 한정되지 않으며, PCR 산물 등의 cDNA를 기판상에 고정화한 접착형 DNA 마이크로어레이도 포함한다. DNA 칩으로는, 예를 들면 본 발명의 유전자와 특이적으로 하이브리다이즈하는 프로브(즉, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드)를 기판(담체)상에 고정화한 DNA 칩을 들 수 있다.

프로브로 이용하는 배열은 cDNA 배열 중에서 특징적인 배열을 특정하는 공지의 방법{예를 들면 SAGE법(Serial Analysis of Gene Expression법)(Science 276: 1268, 1997: Cell 88 :243, 1997; Science 270: 484, 1995; Nature 389: 300, 1997; 미국특허 제5,695,937호) 등을 들 수 있는데, 이에 한정되지 않는다}을 통해 결정할 수 있다.

또한, DNA 칩의 제조에는 공지의 방법을 채용하면 된다. 예를 들면, 올리고뉴클레오티드로서 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하는 경우에는 포토리쏘그래피(Photolithography) 기술과 고상법 DNA 합성 기술과의 조합을 통해 기판상에서 올리고뉴클레오티드를 합성하면 된다. 한편, 올리고뉴클레오티드로서 cDNA를 이용하는 경우에는 어레이기를 이용하여 기판상에 접합하면 된다.

또한, 일반적인 DNA 칩과 마찬가지로 퍼펙트 매치 프로브(올리고뉴클레오티드)와 상기 퍼펙트 매치 프로브에 있어서 일염기 치환된 미스 매치 프로브를 배치하여 폴리뉴클레오티드의 검출 정밀도를 보다 향상시켜도 된다. 아울러, 서로 다른 폴리뉴클레오티드를 병행하여 검출하기 위하여, 여러 종의 올리고뉴클레오티드를 동일 기판상에 고정화하여 DNA 칩을 구성하여도 된다.

본 실시 형태에 따른 검출 기구에 이용하는 기판의 재질로는, 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 안정되게 고정화할 수 있는 것이면 된다. 상기한 기판 이외에는, 예를 들면 폴라카보네이트나 플라스틱 등의 합성수지, 유리 등을 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 기판의 형태도 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 판형, 필름형 등의 기판을 적절하게 이용할 수 있다. 본 실시 형태의 바람직한 국면에 있어서, 본 실시 형태에 따른 검출 기구는 여러 생물 또는 그 조직 혹은 세포로부터 제작한 cDNA 라이브러리를 표적 샘플로 하는 검출에 이용된다.

다른 실시 형태에 있어서, 본 발명에 따른 검출 기구는 본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 항체가 기판상에 고정화되어 있는 것을 특징으로 한다. 본 실시 형태의 바람직한 국면에서, 본 실시 형태에 따른 검출 기구는 소위 프로테인 칩이다.

본 명세서 중에서 사용되는 것처럼, 용어 '기판'은 목적물(예를 들면, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 단백질)을 담지할 수 있는 물질이 의도되며, 용어 '지지체'와 교환 가능하게 사용된다. 바람직한 기판(지지체)으로는 비드(예를 들면 폴리스틸렌 비드), 고상(예를 들면, 유리 튜브, 시약 스트립, 폴리스틸렌제 마이크로타이터 플레이트 또는 아미노기 결합형 마이크로타이터 플레이트) 등을 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 목적물을 이들 기판에 고정화하는 방법은 당업자에게 주지이며, 예를 들면 Nature 357: 519-520(1992)(본 명세서 중에 참고로 원용됨)에 기재되어 있다.

본 실시 형태에 따른 검출 기구에 이용하는 기판의 재질로는, 폴리펩티드 또는 항체를 안정되게 고정할 수 있는 것이면 된다. 상기한 기판 이외에는, 예를 들면 폴라카보네이트나 플라스틱 등의 합성수지, 유리 등을 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 기판의 형태도 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 판형, 필름형 등의 기판을 적합하게 이용할 수 있다.

상기의 방법 이외의 폴리펩티드 또는 항체를 기판상에 고정화하는 방법으로는, 예를 들면 니트로셀룰로오스막이나 PDVF막에 폴리펩티드나 항체를 도트 브롯(blot)의 요령으로 스폿하는 물리흡착법 또는 폴리펩티드나 항체의 변성을 경감시키기 위하여 슬라이드 유리 위에 폴리아크릴아미드의 패드를 접합하고, 이에 폴 리펩티드나 항체를 스폿하는 방법을 들 수 있다. 나아가, 폴리펩티드나 항체를 기판 표면에 흡착시킬 뿐만 아니라 강고하게 결합시키기 위하여 알데히드 수식 유리를 이용한 방법{G. MacBeath, S. L. Schreiber, Science, 289, 1760(2000)}을 이용할 수도 있다. 또한, 기판상에서의 폴리펩티드의 배향을 가지런히 하여 고정화하는 방법으로는 올리고히스티딘 태그를 통해 니켈 착체로 표면 수식한 기판에 고정하는 방법{H. Zhu, M. Bilgin, R. Bangham, D. Hall, A. Casamayor, P. Bertone, N. Lan, R. Jansen, S. Bidlingmaier, T. Houfek, T. Mitchell, P. Miller, R. A. Dean, M. Gerstein, M. Snyder, Science, 293, 2101(2001)}을 이용할 수 있다.

본 실시 형태의 바람직한 국면에 있어서, 본 실시 형태에 따른 검출 기구는 여러 생물 또는 그 조직 혹은 세포로부터의 추출액을 표적 샘플로 하는 검출에 이용된다.

이와 같이, 본 발명에 따른 검출 기구는 적어도 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 혹은 올리고뉴클레오티드, 또는 본 발명에 따른 폴리펩티드 혹은 상기 폴리펩티드와 결합하는 항체가 지지체상에 고정화되어 있으면 된다고 할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 검출 기구는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 혹은 올리고뉴클레오티드, 또는 본 발명에 따른 폴리펩티드 혹은 상기 폴리펩티드와 결합하는 항체가 고정화되어 있는 기판을 구비하고 있으면 된다고 할 수 있다. 즉, 이들 지지체(기판을 포함) 이외의 구성 부재를 구비하는 경우에도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다는 점을 유념하여야 한다.

즉, 본 발명의 목적은 본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 본 발명에 따른 폴리 뉴클레오티드, 혹은 본 발명에 따른 항체와 결합하는 폴리펩티드를 검출하는 기구를 제공하는 것에 있는 것으로, 본 명세서 중에 구체적으로 기재한 개개의 지지체의 종류, 고정화 방법에 있는 것은 아니다. 따라서, 상기 지지체 이외의 구성 부재를 포함하는 검출 기구도 본 발명의 기술적 범위에 속한다는 것을 유념하여야 한다.

(4-5) 본 발명에 따른 폴리펩티드를 이용한 항체의 정제

본 발명에서 정제되는 항체로는, 동물에 항원을 면역하는 것으로 얻어진 항혈청, 동물에게 항원을 면역하고 면역 동물의 지라 세포로부터 제작한 하이브리도마 세포가 분비하는 모노크로날 항체, 유전자 조작 기술에 의해 제작된 항체, 즉 항체 유전자를 삽입한 항체 발현 벡터를 숙주 세포에 도입함으로써 취득된 항체 등 어떠한 것이어도 된다. 또한, 항체의 Fc 영역을 융합시킨 융합 단백질 등도 본 발명에서는 항체로서 포함된다. 또한, 정제되는 항체로는 닭 항체가 바람직하다. 본 발명에 따른 폴리펩티드는 닭 항체에 결합하는 당쇄와의 친화성이 높기 때문이다. 또한, 닭 항체란, 항원을 면역된 닭이 생산하는 항체(IgY, IgE 등), 및 닭 이외의 동물에게서 생산되는 닭 유래 항체와 동일 구조를 갖는 항체도 포함한다. 또한, 상기 항체는 모노크로날 항체이어도, 폴리크로날 항체이어도 된다. 이 항체에 대해서는 '(3) 항체'의 기재를 적절하게 참조할 수 있다.

본 발명에 따른 항체의 정제 방법은, 예를 들면 본 발명에 따른 폴리펩티드를 고정한 담체를 이용한 크로마토그래피에 의해 달성된다. 본 발명에 따른 폴리펩티드가 고정화된 담체로는 아가로오스, 아크릴계 합성수지의 폴리머 등을 들 수 있 으며, 바람직하게는 아크릴산 에스테르의 폴리머를 들 수 있다. 그 이외에 시판의 어피니티 담체를 적절하게 선택하여 사용하면 된다. 예를 들면, HiTrap NHS-activated HP columns(Amersham Bioscience Corp제), CNBr-activated Sepharose 4 Fast Flow Lab Packs(Amersham Bioscience Corp제)가 이용 가능하다. 또한, 고속 액체 크로마토그래피(이하, 'HPLC'라고 표기한다) 시스템을 사용하는 경우에는 일반적으로 시판되고 있는 HPLC 시스템이라면 어떠한 것이어도 된다. 예를 들면, LC-6A(Shimadzu사 제조) 등을 들 수 있다. 고정화 방법에 대해서는 담체에 따라 적절하게 최적의 방법을 적용하면 된다.

이하에 HPLC 시스템을 사용한 정제 방법의 일 예를 나타낸다. 용리액은 10~100(m㏖/l) 트리스-염산 완충액, 10~100(m㏖/l) 인산 완충액 등을 이용한다. pH는 7~8 정도 사이가 바람직하다. 먼저, 10~100(m㏖/l) 트리스-염산 완충액, 또는 10~100(m㏖/l) 인산 완충액 등의 초기 완충액으로 칼럼을 충분히 평형화한다. 시료를 HPLC 시스템에 통과시키고, 용출당을 포함하는 10~100(m㏖/l) 트리스-염산 완충액 또는 10~100(m㏖/l) 인산 완충액을 이용하여 용출시킨다. 용출에 이용하는 당은 적절하게 검토하여 적용하면 되지만, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 고정화한 경우에는 용출에 이용하는 당으로 0.02~0.5㏖/l D-만노오스나 0.02~0.5㏖/l 메틸-α-D-만노시드를 이용한다. 용출은 스텝와이즈법 또는 그라디엔트법을 통해 용출한다. 단백질(항체)은, 예를 들면 자외선 흡수, 전기영동(SDS-PAGE 등), ELISA법, 웨스턴브롯법 등의 방법을 통해 검출할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 항체의 정제 방법은 본 발명에 따른 폴리펩티드 대신 에, 또는 본 발명에 따른 폴리펩티드에 더하여 종래 공지의 렉틴인 Carnin을 이용하는 것으로도 달성된다. 즉, 본 발명에 따른 항체의 정제 방법은 상기 표제를 해결하기 위하여 상기 본 발명에 따른 폴리펩티드를 이용하는 방법, 상기 본 발명에 따른 폴리펩티드에 더하여 Carnin을 이용하는 방법, 또는 상기 본 발명에 따른 폴리펩티드 및 Carnin 중 어느 한쪽 또는 양쪽을 이용하는 방법이어도 된다.

또한, 본 발명에 따른 담체에 대해서도 마찬가지로 상기 본 발명에 따른 폴리펩티드가 고정화되어 있는 것, 상기 본 발명에 따른 폴리펩티드에 더하여 Carnin이 고정화되어 있는 것, 또는 상기 본 발명에 따른 폴리펩티드 및 Carnin 중 어느 한쪽 또는 양쪽을 이용하는 것이어도 된다. 조류(Carpopeltis flabellata = C. prorifera) 유래 Carnin에 대해서는 "Hori, K., Matsuda, H., Miyazawa, K. and Ito, K.: A mitogenic agglutinin from the red alga Carpopeltis flabellata. Phytochemistry, 26, 1335-1338(1987)"에 기재되어 있으며, 본 명세서중에 참고로 원용된다.

본 발명은 이하의 실시예에 따라 더욱 상세히 설명되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예

[ 실시예 1 : 조류( Bryopsis maxima )로부터 폴리펩티드( BML -17)의 단리]

(추출액의 조제 및 황안 침전)

녹조 큰깃털말(Bryopsis maxima)의 동결 건조 분말 12.2g에 200㎖의 20mM PBSA(Phosphate-buffer saline sodium azide;0.2% 아지화나트륨이 들어있는 20mM PBS;pH7.0)을 가하고, 4℃에서 하룻밤 교반한 후 원심분리를 수행하여 추출액을 얻었다. 이 조작을 3번 반복하여 추출액 1~3을 얻었다.

상기 추출액에 황안 분말을 20% 포화가 되도록 조금씩 교반하면서 가하고, 이 혼합액을 4℃에서 하룻밤 정치하였다. 이것을 원심분리(10,000rpm, 30분간)하여 얻어진 침전을 PBSA에 용해한 후, 동일 용액에 대하여 충분히 투석하였다. 투석 종료후 내액을 원심분리하여 얻어진 상청액을 20% 포화 황안염석 침전획분으로 하였다. 한편, 20% 포화 황안염석 처리로 얻어진 상청액에 황안 분말을 60% 포화가 되도록 가하고, 동일하게 처리하여 20~60% 포화 황안염석 침전획분을 얻었다.

(응집 활성의 검토)

적혈구 응집 활성은 마이크로타이터법을 이용하여 측정하였다. 생리식염수로 조제한 각 정제 획분 용액의 2배 단계 희석액, 각 25㎖를 마이크로타이터 플레이트상에 제작하였다. 각 희석액에 2% 적혈구 부유액 25㎕를 가하여 가볍게 교반하고, 실온에서 1.5시간 정치후 응집능을 관찰하였다. 응집능은 육안으로 판정하고, 적혈구의 50% 이상이 응집되어 있는 경우를 양성으로 하였다. 응집 활성은 응집소가(역가), 즉 응집 활성을 나타내는 최대 희석액의 단백질 농도로 나타내었다.

본 실시 형태에서는 적혈구로서 트립신 처리 토끼 적혈구(TRBC)를 이용하였다. 또한, 적혈구 부유액의 조제는 다음과 같이 수행하였다. 먼저, 실험실에서 사육중인 토끼의 귀로부터 혈액 2㎖를 채취하고, 이것을 약 50㎖의 생리식염수로 3번 세정한 후, 50㎖의 생리식염수를 더하여 2%의 토끼 적혈구 부유액을 조제하였다. 여기에 1/10볼륨의 0.5% 트립신-생리식염수를 가하고 37℃에서 1.5시간 정치하였다. 이 트립신 처리 적혈구를 생리식염수로 3번 세정한 후, 45㎖의 생리식염수를 더하여 트립신 처리 2% 토끼 적혈구 부유액(TRBC)으로 하였다.

트립신 처리 토끼 적혈구(TRBC)에 대한 응집 활성 성분을 검토한 바, 상기 추출액 1~3에서 동(同) 응집 활성이 검출되었다. 추출액 1의 응집 활성성(THA) 및 가용성 단백질의 함량이 추출액 2 및 3에 비해 높은 값을 나타낸다는 점에서, 응집 활성 성분의 대부분은 추출액 1에서 회수된다는 것을 알았다. 또한, THA 및 가용성 단백질의 대부분이 20~60% 포화 황안염석 침전획분에서 회수되었다는 것을 알았다.

(겔 여과)

추출액 1의 20~60% 포화 황안염석 침전획분을 겔 여과 칼럼(토소사 제조, Toyopearl HW-55 칼럼, 4.4×900㎝, Vt=1368㎖)에 제공하였다. 구체적으로는, 동 침전획분 16㎖를, 20mM PBSA(pH7.0)로 평형화한 Toyopearl HW-55 칼럼에 첨가하고, PBSA를 이용하여 유속 60㎖/h로 용출하였다. 용출액은 15㎖ 분취하고, 각 프렉션의 UV280㎚ 및 응집 활성을 측정하였다.

(소수 크로마토그래피)

겔 여과로 얻어진 응집 활성을 갖는 획분 110㎖를 0.86M 황안을 포함하는 20mM 트리스-염산 완충액(pH7.0)에 대하여 투석을 수행하고, 내액 80㎖을 얻었다. 얻어진 내액을 동 완충액으로 평형화한 TSKgel Phenyl-5PW 칼럼(7.5×75㎜)에 주입하고, 20mM 트리스-염산 완충액, pH7.0(용매 A)와, 0.86M 황안을 포함하는 동 완충액(용매 B)의 2액을 이용하는 농도 구배법을 통해 용출하였다. 농도 구배[용매 B 100%(20분), 용매 B 0%-용매 A 100%(20-60분), 용매 A 100%(60-90분)]는 그라디언트 프로그래머(CCP 컨트롤러, 토소사 제조)를 이용하여 설정하고, 유속은 0.5㎖/분으로 하였다. 용출액은 UV280㎚을 모니터하는 동시에 각 피크를 분취하여 응집 활성을 측정하였다.

(SDS-PAGE)

상기 소수 크로마토그래피에서 얻어진 응집 활성을 갖는 획분(정제 획분)을 SDS-PAGE(10%겔)에 제공하였다.

결과를 도 7에 도시하였다. 도면중 레인 1은 분자량 마커(각 밴드는 위로부터 94kDa, 67kDa, 43kDa, 30kDa, 20.1kDa, 14.4kDa)를 나타내고, 레인 2는 비환원하(2-메르캅토에탄올 처리 없음)의 정제 획분을 나타내며, 레인 3은 환원하(2-메르캅토에탄올 처리 있음)의 정제 획분을 나타내고, 동 도면중 레인 4는 분자량 마커(각 밴드는 위로부터 16.9kDa, 14.4dDa, 10.7kDa, 8.2kDa, 6.2kDa, 2.5kDa)를 나타낸 것이다. 또한, 단백 염색은 CBB(Coomassie brilliant blue R-250) 염색을 수행하였다.

도 7에서 정제 획분은 SDS-PAGE에 있어서 비환원하에서 비교 분자량 약 17kDa, 환원하에서 18kDa의 단일 밴드를 부여하는 것이었다. 또한, 환원하 및 비환원하에서 분자량이 서로 다르다는 점에서, 동 정제 획분 내에 디슬피드 결합(S-S 결합)의 존재가 시사되었다. 상기 정제 과정에 의해 최종적으로 2.1㎎의 정제 획분이 얻어졌다. 본 발명자들은 당해 정제 획분을 'BML-17'이라 명명하였다.

(BML-17의 분자량 검토)

BML-17 및 피리딜에틸화(Pyridylethylated)(PE) 처리한 BML-17의 0.1TFA-70% 아세트니트릴 용액(500㎍/㎖)을 일렉트론 스프레이 이온화 질량 분석(ESI-MS, LCQ, Finigan)에 제공하여 분자량을 측정하였다.

PE 처리는 이하와 같이 하였다. BML-17(200㎍)을 100㎕의 완충액(6M 구아니딘염산염 및 1mM EDTA를 포함하는 0.25M 트리스-염산 완충액, pH8.5)에 용해하고, 200㎍의 디티오트이톨을 첨가하고, 용기 내를 질소로 치환하여 2시간 정치하였다. 다음으로, 2㎕의 4-비닐필리딘(나카라이 테스크 제조)을 첨가하여 잘 혼합하였다. 이 혼합 용액을 암소에서 하룻밤 정치하여 충분히 반응시킨 후, 초순수에 대하여 충분히 투석을 수행하여 염 및 과잉 시약을 제거하고, 내액을 '피리딜에틸화(PE) 처리한 BML-17'로 하였다.

BML-17의 비교 분자량은 SDS-PAGE의 결과로부터 비환원 조건하에서는 약 17kDa, 환원 조건하에서는 18kDa로 추정되었다. 상기 ESI-MS에서의 분자량 측정치는 17,293Da이었다. 또한, PE처리한 BML-17의 분자량은 17,945Da이었다. 양자의 분자량 차이는 6개의 피리딜에틸기의 분자량에 거의 상당한다는 점에서, BML-17은 시스테인 6 잔기를 포함한다고 추정되었다.

(BML-17의 아미노산 조성 분석)

BML-17의 아미노산 조성 분석은 다브실화법(Dabsylation method)을 이용하여 수행하였다. 또한, 아미노산 조성 분석에는 PE처리한 BML-17을 이용하였다.

상기 아미노산 조성 분석의 결과, BML-17의 아미노산 조성은 이하와 같았다. 아스파라긴 또는 아스파라긴산(Asx)이 11.8㏖%, 글루타민 또는 글루타민산(Glx)이 6.8㏖%, 셀린(Ser)이 9.6㏖%, 트레오닌(Thr)이 6.0㏖%, 글리신(Gly)이 11.4㏖%, 알라닌(Ala)이 7.9㏖%, 프롤린(Pro)이 3.4㏖%, 발린(Val)이 6.9㏖%, 아르기닌(Arg)이 3.9㏖%, 메티오닌(Met)이 2.7㏖%, 이소류신(Ile)이 4.5㏖%, 류신(Leu)이 4.4㏖%이며, 페닐알라닌(Phe)이 3.7㏖%이며, 리신(Lys)이 4.6㏖%이며, 히스티딘(His)이 2.6㏖%이며, 티로신(Tyr)이 4.9㏖%이며, 트립토판(Trp)이 3.4㏖%이었다. 또한, 시스테인(Cys)에 대해서는 분석을 수행하지 않았다.

이상의 결과에서 BML-17은, 종래 공지의 렉틴과 마찬가지로 글리신 및 산성 아미노산을 많이 포함하는 것이었다. 또한, 셀린을 다량으로 포함하는 것이었다.

(BML-17의 N말단 아미노산 분석)

BML-17의 N말단 아미노산 배열은 에드만법에 따른 휴렛패커드사 제조 자동 분석 장치: 프로테인 시퀀서(G1005A형)를 이용하여 분석을 수행하였다. 또한, BML-17의 100p㏖ 상당량을 상기 N말단 아미노산 분석에 이용하였다.

도 8에 BML-17의 N말단 아미노산 배열(도면 중 BML로 표기), 및 이제까지 단리된 깃털말속 렉틴(BCL, BPL, Bry-1, Bry-2)의 N말단 아미노산 배열을 도시하였다. 동 도면에 의해, BML-17은 종래 공지의 깃털말속 유래 렉틴과는 N말단 아미노산 배열이 전혀 다른 신규 렉틴이라는 것을 알았다. BML-17의 N말단 아미노산 배열을 배열번호 13에 나타내고, BCL의 N말단 아미노산 배열을 배열번호 14에 나타내고, BPL의 N말단 아미노산 배열을 배열번호 15에 나타내고, Bry-1의 N말단 아미노산 배열을 배열번호 16에 나타내고, Bry-2의 N말단 아미노산 배열을 배열번호 17에 나타내었다.

(BML-17의 온도 안정화 및 pH 안정성)

트립신 처리 토끼 적혈구(TRBC)에 대한 응집 활성을 지표로, BML-17의 온도 안정성 및 pH 안정성 검토를 수행하였다.

BML-17의 응집 활성은 60℃ 이상, 30분간의 열처리에 의해 저하된다는 점에서, 내열성이 낮다는 것을 알았다. 또한, 동 활성은 pH4.0~11.0에서 안정적이었다.

(BML-17의 2가 금속 이온 요구성)

BML-17의 응집 활성은 EDTA 처리 후에도 변화되지 않았다. 또한, EDTA 처리 용액의 응집 활성은 2가 금속 이온을 첨가 후에도 변화되지 않는다는 점에서, BML-17은 응집 활성의 발현에 2가 금속 이온을 필요로 하지 않는다는 것을 알았다.

(적혈구 응집 저해 시험)

적혈구 응집 저해 시험은 이하와 같이 하여 수행하였다. 먼저, 생리식염수로 조제한 당용액의 2배 단계 희석액, 각 25㎕를 마이크로타이터 플레이트상에 제작하였다. 또한, 사용한 당류의 원액 농도는 단당 및 소당의 경우에는 100mM, 당단백질의 경우에는 2㎎/㎖로 하였다. 여기에 응집소가(역가) 4로 조정된 BML-17 용액, 각 25㎕를 가하고 가볍게 교반한 후, 실온에서 1.5시간 정치하였다. 여기에 25㎕의 TRBC를 가하고, 실온에서 2시간 정치한 후, 응집 저해능을 관찰하였다. 응집 저해능의 유무는 육안으로 판정하고, 적혈구의 약 100%가 응집되지 않은 경우를 양성으로 하였다. 응집 저해능(응집 저해 활성)은 최소 저해 농도, 즉 응집 저해능을 나타내는 최소 농도(mM 또는 ㎎/㎖)로 표시하였다.

또한, 본 적혈구 응집 저해 시험에는 단당류 및 소당류로서 D-글루코오스, D-갈락토오스, D-만노오스, N-아세틸-D-글루코사민, N-아세틸-D-갈락토사민, D-크실로오스, L-푸코오스, 프룩토오스, 락토오스, 라피노오스를 이용하고, 당단백질로서 뮤신(소 턱밑샘) 및 이 아시아로체(asialomucin), 피투인(Fetuin)(타입 Ⅲ, 송아지 혈청) 및 이 아시아로체(asialofetuin), 트랜스페린(사람) 및 이 아시아로체(asialotransferrin), α1-산성 당단백질(사람) 및 이 아시아로체(alialo-α1-acid glycoprotein), 및 이스트 만난을 이용하였다.

결과를 [표2]에 나타내었다. BML-17의 응집 활성은 단당류 중에서는 D-만노오스에 의해 저해되었다. 이당류에서는 저해되지 않았다. 또한, 당단백질 중에서는 트랜스페린, 피투인, 뮤신 및 이들 아시아로체, 아울러 이스트 만난에 의해 저해된다는 것을 알았다. 당단백질의 저해능은 뮤신을 제외하고 시아로체(Sialo)보다 아시아로체 쪽이 강했다. 또한, 이스트 만난이 가장 강한 저해능을 나타내었다. 이상의 결과에서, BML-17은 N-글리코시드형 당쇄의 고 만노오스형 당쇄에 높은 친화성을 갖는다는 것이 시사되었다.

(당쇄 결합성 시험)

공시 당쇄로는 피리딜아미노화 당쇄(이하 'PA화 당쇄'라고 한다)를 44종 사용하였다. 보다 구체적으로는, N-글리코시드형 당쇄의 복합형 12종, 고 만노오스형 13종, 혼성형 3종, 공통 코어 구조 1종 및 공통 코어 관련 당쇄 1종, 당지질계 당쇄 8종, 올리고만노오스 5종 및 PA-만노오스를 이용하였다. 상기 테스트 당을 [표3], [표4]에 나타내었다. [표3], [표4]에는 각종 테스트 당의 당쇄 구조와, 그 우측에 각종 당쇄의 번호(1~4)를 붙여놓았다. 이는 각종 테스트 당 중 PA-올리고만노 오스를 제외하고, 다른 PA화 당쇄는 시판품(타카라 바이오사 제조, Ajinoki사 제조)을 이용하였다. PA-올리고만노오스는 발명자들이 합성한 것을 이용하였다.

상기 당쇄 결합성 시험은 원심 한외여과법을 이용하였다. 구체적으로는 아래와 같다. 50mM 트리스-염산 완충액(pH7.0)으로 조제한 500nM BML-17 용액 90㎕(45p㏖)와 300nM PA화 당쇄 용액 10㎕(3p㏖)을 가볍게 혼합한 후, 실온에서 60분간 보온하였다. 이 반응액을 미량 원심 한외여과기(NanoSpinPlus, 분획 분자량 10,000, GelmanScience)를 이용하여 원심여과(10,000g, 30초)하고, 여액의 20㎕를 HPLC에 제공하고, 용출하는 PA화 당쇄량을 측정하여 유리 당쇄량으로 하였다. 다음으로, 50mM 트리스-염산 완충액(pH7.0)의 90㎕와 PA화 당쇄 수용액 10㎕를 혼합한 후, 상기와 동일한 처리를 수행하고, 그 후의 여액의 20㎕를 HPLC에 제공하고, 용출하는 PA화 당쇄량을 측정하여 첨가 당쇄량으로 하였다. 결합 당쇄량은 첨가 당쇄량으로부터 반응후의 유리 당쇄량을 뺀 값으로 산출하였다. BML-17의 당쇄 결합 활성은 통합률, 즉 첨가 당쇄량에 대한 결합 당쇄량의 비율{Binding activity(%)}로 나타내었다. 또한, 상기 당쇄 결합성 시험은 각 당쇄에 대하여 2회씩 수행하고, 당쇄 결합 활성은 그 평균치로 하였다.

결과를 [표5]에 나타내었다. 또한, [표5]의 'Oligosaccharide'란의 1~44는 [표3], [표4]의 각종 테스트 당의 번호와 대응한다.

[표5]에서 BML-17은 테스트 당쇄중 N-글리코시드형 당쇄의 고 만노오스형 당쇄(번호 18~28)에 대하여 높은 결합 활성을 갖는다는 것을 알았다. 고 만노오스형 당쇄에 대한 결합 활성은 비환원 말단에 α1-2만노오스(이하 'α1-2Man'이라 표기) 잔기를 가장 많이 갖는 당쇄(번호 20)가 가장 높았으나, 비환원 말단의 α1-2Man 잔기의 유무에 상관없이 결합한다는 것을 알았다. 또한, BML-17은 N-글리코시드형 당쇄의 공통 코어 구조(번호 13) 및 L-Fuc 함유 공통 코어 구조(번호 14)에 결합할 뿐만 아니라, 분기 당쇄 부분인 유리의 만노펜타새커라이드(Mannopentasaccharide)(번호 35)와도 약하지만 결합하였다. 그러나, 공통 코어 구조나 분기 당쇄를 구성하는 유리의 트리만노오스(34)나 만노디새커라이드(Mannodisaccharide)(31~33)와는 전혀 결합하지 않았다. 아울러, 번호 13의 당쇄(결합 활성 19.8%)와 번호 34의 당쇄(동 0%) 및 번호 18의 당쇄(동 32.7%), 번호 35의 당쇄(동 14.2%) 사이의 결합 활성 비교에서, BML-17의 고 만노오스형 당쇄 결합성에 관하여 분기 당쇄 부분을 인식하지만, 환원 말단 부분의 GlcNAcβ1-4GlcNAc부분도 동 결합에 보조적으로 기여하고 있다는 것을 알았다. 아울러, BML-17의 고 만노오스형 당쇄와의 결합에는 공통 코어 구조의 Manα1-6 아암에 Manα1-6(Manα1-3) 잔기가 부가된 것(번호 28)이 최소 당쇄 구조로서 필요하다는 것이 당쇄 번호 28(동 19.1%)와 번호 29(동 0%) 및 번호 30(동 0%) 사이의 결합 활성 비교에서 시사되었다. 또한, N-글리코시드형 당쇄의 복합형 당쇄(번호 1, 5, 6, 10)와도 약한 결합 활성을 나타내었다. 이는 BML-17이 공통 코어 구조를 약하게나마 인식하는데 기인하는 것으로 생각된다.

이제까지 밝혀진 해조 유래 고 만노오스형 당쇄 특이적 렉틴은 모두가 만노오스를 포함하는 당쇄, 올리고만노오스, 고 만노오스형 당쇄의 공통 코어 구조와는 결합하지 않는다. 또한, 그들은 고 만노오스형 당쇄의 분기 부분을 인식 부위로 하 며, 비환원 말단에 α1-2Man 잔기를 갖지 않은 것에 강한 결합 활성을 나타내는 것, 비환원 말단에 α1-2Man 잔기를 갖는 것하고만 결합 활성을 나타내는 것의 2종류로 분류되었다. 그러나, BML-17은 고 만노오스형 당쇄 결합 특이성을 갖지만, 코어 구조 및 올리고만노오스에도 약한 친화성을 나타내고, 비환원 말단의 α1-2Man 잔기의 유무에 상관없이 결합한다는 점에서, 종래 공지의 고 만노오스형 당쇄 특이적 렉틴과는 다른 신규 렉틴이라는 것을 알았다. 따라서, BML-17은 신규의 당쇄 프로브로서 응용 가치가 높다고 할 수 있다.

또한, 흥미로운 것은 겔 여과에 있어서의 정제 획분의 응집 활성이 D-Man 및 이스트 만난으로는 전혀 저지되지 않으며, 동 획분에서는 Con A 결합성의 당단백질의 존재가 웨스턴 브롯팅 결과에 의해 확인되었다. 따라서, 렉틴 단백질은 혼재하는 고 만노오스형 당쇄 함유 당단백질과 회합하여 소수 환경 하에서만 해리될 가능성도 시사되었다.

그러나, '렉틴'이란, 일반적으로 '동식물 혹은 세균에서 발견되는 면역학적 산물이 아닌 당결합성 단백질로, 결합가가 2가 이상이고 동식물 세포를 응집하며, 다당류나 복합당질을 침강시키고, 그 결합 특이성이 단당이나 올리고당을 이용한 응집 혹은 침강 저해 시험 등으로 규정할 수 있는 것'으로 되어 있다.

[ 실시예 2 : BML -17의 cDNA 의 클로닝 ]

이하에 나타낸 조작을 수행하여 cDNA 라이브러리로부터 BML-17의 cDNA의 클로닝을 수행하였다. 또한, 특별히 기재하지 않는 한, 표준 조건에서 조작을 수행하 였다. 또한, 각종 키트를 이용한 경우에는 해당 키트의 매뉴얼에 기재된 방법에 준하여 조작을 수행하였다.

큰깃털말(Bryopsis maxima)의 배양 조체로부터 AGPC법(Acid Guanidiumu-Phenol-Chloroform method)을 이용하여 전체 RNA를 추출한 후, OligotexTM-dt30 mRNA Purification Kit(타카라 바이오 제조)를 이용하여 mRNA를 정제하였다.

다음으로, RT-PCR을 이용하여 2개쇄 cDNA를 합성하고, 플라스미드 벡터 pBSK(+)/E/N(STRATAGENE 제조)로 도입하였다. 상기 플라스미드 벡터를 컴피턴트 셀(E.coli DH10B)에 ElectroMaxDH10B(GIBCO BRL 제조)를 이용하여 도입하고, cDNA 라이브러리를 구축하였다.

다음으로, BML-17의 N말단 영역의 아미노산 배열 정보를 바탕으로 축중(縮重) 프라이머를 설계하였다. BML-17의 N말단 영역 10~20 잔기째의 아미노산 배열(DMFAKIPMPGH : 배열번호 3)을 바탕으로 축중 프라이머 SP1-17을 설계하였다. 또한, BML-17의 N말단 영역 46~54잔기째의 아미노산 배열(AKGMVEAY : 배열번호 4)을 바탕으로 축중 프라이머 SP2-17을 설계하였다. 또한, BML-17의 N말단 영역 3~13잔기째의 아미노산 배열(YQDPVTSDMFE : 배열번호 5)을 바탕으로 축중 프라이머 SP3-17을 설계하였다.

SP1-17의 염기 배열은 GACATGTTCGCNAAGATYCCNATGCCNGGNCA(배열번호 6)이다.

SP2-17의 염기 배열은 GTACGCCTCGACCACCACGCCCTTAGCATCCA(배열번호 7)이다.

SP3-17의 염기 배열은 CCAAGACCCCGTAACTTCAGATATGTTCG(배열번호 8)이다.

SP1-17과 벡터의 염기 배열로부터 설계한 프라이머 AP2를 이용하여 3'RACE를 수행하여 3' 측의 미지 영역을 결정하였다.

또한, SP2-17과 벡터의 염기 배열로부터 설계한 프라이머 AP3를 이용하여 5'RACE를 수행하여 5'측의 미지 영역을 결정하였다.

아울러, SP3-17과 AP3를 이용하여 nested PCR을 수행하였다.

또한, AP2의 염기 배열은 AACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGA(배열번호 9)이다.

또한, AP3의 염기 배열은 TTGTAATACGACTCACTATAGGGCGA(배열번호 10)이다.

얻어진 PCR 산물을 저융점 아가로오스를 통해 정제한 후, pGEM-T Easy Vector System(PROMEGA 제조)을 이용하여 서브 클로닝을 수행하고, 얻어진 클론으로부터 정제 플라스미드를 회수하고, 다이디옥시법을 통해 염기 배열의 결정을 수행하였다.

BML-17의 cDNA의 염기 배열, 및 그 염기 배열로부터 구한 아미노산 배열을 도 2에 나타내었다. 클로닝된 BML-17의 cDNA는 23 아미노산 잔기로 이루어진 시그널 펩티드의 일부(도 2의 사각으로 둘러싸인 부분)와 168 아미노산 잔기로 이루어진 폴리펩티드를 코드하고 있다는 것을 알았다. 또한, 상기 클로닝된 cDNA의 전체 염기 배열을 배열번호 11에 나타내고, 그 추정 아미노산 배열을 배열번호 12에 나타내었다. 또한, BML-17의 염기 배열을 배열번호 1에 나타내고, 그 추정 아미노산 배열을 배열번호 2에 나타내었다.

[ 실시예 3 : 닭 난황 항체(닭 IgY 항체)와 결합하는 렉틴의 검색]

(공시 렉틴)

조류(해조) 유래 렉틴: Eucheuma serra 유래 렉틴 ESA-2{Kawakubo, A., Makino, H., Ohnishi, J., Hirohara, H. and Hori, K.: The marine red alga Eucheuma serra J. Agardh, a high yielding source of two isolectins. J. Appl. Phycol., 9, 331-338(1997) 참조}, Solieria robusta 유래 렉틴 Solnin B{Hori, K., Ikegami, S., Miyazawa, K. and Ito, K.: Mitogenic and antineoplastic isoagglutinins from the red alga Solieria robusta. Phytochmistry, 27, 2063-2067(1988) 참조}, Boodlea coacta 유래 렉틴 BCL{Hori, K., Miyazawa, K., and Ito, K.: Isolation and characterization of glycoc onjugate-specific isoagglutinins from a marine green alga Boodlea coacta(Dickie) Murray et De Toni. Bot. Mar., 29, 323-328(1986) 참조}, Carpopeltis flabellata 유래 렉틴 Carnin{Hori, K., Matsuda, H., Miyazawa, K. and Ito, K.: A mitogenic agglutinin from the red alga Carpopeltis flabellata. Phytochemistry, 26, 1335-1338(1987) 참조}, Hypnea Japonica 유래 렉틴 Hypnin A-1{Hori, K., Miyazawa, K., Fusetani, N., Hashimoto, K. and Ito, K.: Hypnins, low-molecular weight peptidic aggl utinins isolated from a marine red alga, Hypnea japonica. Biochim. Biophys. Acta, 873, 228-236(1986); Hori, K., Matsubara, K. and Miyazawa, K.: Primary structures of two hemagglutinins from marine red alga, Hypnea japonica. Biochim. Biophys. Acta, 28, 226-236(2000) 참조}, BML-17, Bryopsis plumosa 유래 렉틴 BPL-54, Codium fragile 유래 렉틴 CFA.

육상 식물 유래 렉틴: Canavallia ensiformis 유래 렉틴 Con A{Edelman, G. M. et al., PNAS, USA, 62, 2580-2585(1972)), Ulex europaeus 유래 렉틴 UEA-I(Hore jsi, V. and Kocourek, J., Biochim. Biophys. Acta, 336, 329-337(1974)}, Arachis hypogaes 유래 렉틴 PNA{Lotan, R. Et al., J. Biol. Chem., 250, 8518-8523(1975)}, Glycine max 유래 렉틴 SBA(Pereira, M.E.A. et al., Crabohydr. Res., 37, 89-102(1974)}, Triticum aestivum 유래 렉틴 WGA{Peumans, W.J. et al., Planta, 154, 562-568(1982)}, Maackia amurensis 유래 렉틴 MAH{Kawaguchi, T. et al., J.Biol. Chem., 249, 2768-2792(1974)}, Galanthus nivalis 유래 렉틴 GHA{Van Damme, E.J.M. et al., FEBS lett., 215, 140-144(1987)}.

또한, 상기 육상 식물 유래 렉틴은 코스모 바이오 주식회사 등으로부터 구입하였다.

(방법)

상기 각종 렉틴과 닭 난황 항체(닭 IgY 항체)와의 결합성을 조사하였다. 간단하게는, 표면 플라즈몬 공명법(이하, 'SPR법'이라 한다)을 원리로 하는 Biacore 2000(BIACORE사)을 이용하고, 리간드로서 닭 난황 항체(닭 IgY 항체)를 센서 칩상에 고정하고, 아날라이트로 각 렉틴 용액을 이용하여 매뉴얼에 따라 측정하였다. SPR법에서는 생체 분자를 표식하지 않고, 생체 분자간의 특이적인 상호 작용을 미량 또한 단시간에 정량적으로 측정할 수 있다. 본 방법에서는 리간드를 센서 칩 표면상에 고정화하고, 이에 작용하는 물질(아날라이트)을 포함하는 용액을 첨가하면, 분자의 결합·해리에 의해 발생하는 미량의 질량 변화가 SPR 시그널의 변화로 검출된다. 질량 변화는 레조난스 유닛(RU)으로 나타내어지고, 1000RU는 공명에 의한 반 사 각도 0.1°의 변화에 상당하는데, 아날라이트가 리간드에 1ng/㎟ 결합한 것을 의미한다. 센서 칩 표면의 금박막상에는 덱스트란이 코팅되어 있는데, 주로 이 텍스트란 내에 도입된 칼복실기를 통해 리간드를 고정화한다.

또한, 아날라이트로서 실험에 제공한 렉틴은 가능한 서로 당 결합 특이성이 다른 것을 선택하고, 리간드로서 실험에 제공한 닭 난황 항체(닭 IgY 항체)는 닭 난황으로부터 Eggcellent Chiken IgY Purification Kit(Pierce Chem. Co. USA)를 이용하여 정제한 것을 사용하였다.

(결과)

상기 검토 결과, 조류(해조) 유래 렉틴인 ESA-2, Solnin B, BCL, Carnin, Hypnin A-1, BML-17 및 육상 식물 유래 렉틴인 Con A, UEA-I가 닭 난황 항체(닭 IgY 항체)와 결합한다는 것을 알았다. 이들 결합성을 나타내는 것은 Hypnin A-1과 UEA-I를 제외하고 모두 고 만노오스형 당쇄 결합성을 갖는 렉틴이었다.

[ 실시예 4 : 닭 난황 항체(닭 IgY 항체)와 렉틴과의 친화성 검토]

(테스트 렉틴)

조류(해조) 유래 렉틴 : ESA A-2, Solnin B, Carnin, Hypnin A-1, BML-17

육상식물 유래 렉틴 : Con A

(방법)

고 만노오스형 당쇄만을 갖는 타카아밀라아제(Taka-amylase)A{타카디아스타아제(누룩곰팡이 유래, Sankyo 제조)로부터 Con A 고정화 칼럼을 이용하는 어피니 티 크로마토그래피에 의해 정제된 것}, 복합형 당쇄만을 갖는 아시아로트랜스페린{트랜스페린(사람 유래, SIGMA 제조)으로부터 희산 처리물(탈시알화물)을 ODS 칼럼을 이용하는 역상계 HPLC에 의해 정제된 것}, 고 만노오스형 당쇄와 복합형 당쇄 양쪽을 갖는 소 티로글로불린(소 유래, SIGMA사 제조), 항체(닭 IgY 항체), 및 컨르롤로서 우혈청 알부민(BSA, SIGMA사 제조)을 각각 CM5 센서 칩(BIACORE 제조)상에 고정화하였다. 또한, 고정화 방법은 매뉴얼에 따라 수행하였다. 보다 구체적으로는, 타카아밀라아제A는 표면 티올 커플링법으로 고정화를 수행하고, 아시아로피투인, 소 티로글로불린, 항체 및 BSA는 아민 커플링법을 이용하여 고정화를 수행하였다. 또한, 고정화 양은 1000~1500RU의 범위가 되도록 매뉴얼 인젝션법으로 조제하였다. 또한, 상기 당단백질의 순도는 SDS-PAGE 또는 MALDI-TOF-MS로 확인하였다.

각종 당단백질과 각종 렉틴의 친화성은 SPR법으로 해석하였다. 동 해석에 앞서, 예비 실험으로 해석법을 검토하고, 비선형 최소 이승법에 의한 카이네틱스 해석이 적당하다고 판단하였다. 이에, 얻어진 센서 그램으로부터 대략의 K_D치를 산출하고, 0.1~10K_D[M]을 농도의 기준으로 2배 희석열로 5단계 이상의 아날라이트(각종 렉틴) 용액을 조제하였다. 분석 프로그램의 작성에는 매뉴얼에 따라 "Customaized Application"을 이용하고, 센서 칩 내의 4개의 플로우 셀 중 아무것도 고정화되지 않은 플로우 셀 1을 컨트롤로 하고, 당단백질을 고정화한 플로우 셀로부터의 공제 기능(substraction function)을 사용하였다. 본 분석 프로그램하에서 아날라이트(각종 렉틴) 용액을 각각 센서 칩상에 유속 30㎕/min으로 3분간 흘려보낸 후, 버퍼 를 3분간 흘려보내 렉틴의 결합·해리량을 측정하였다. 또한, 아날라이트 첨가 개시 10초 전부터 첨가 종료후 10초 전까지의 RU의 첨가량을 결합량, 버퍼 첨가 개시 후 10초부터 첨가 종료 10초전까지의 RU 감소량을 해리량으로 하였다.

다음으로, 0.5MD-만노오스, 10mM glycine-HCl(pH4.0), 50mM HCl 및 10mM NaOH를 이용하여 센서 칩을 세정 재생하였다. 얻어진 센서그램에 대하여, 결합상과 해리상을 동시에 커브 피팅시켜 결합 속도 정수 Ka, 해리 속도 정수 Kd, 친화 정수 K_A, 및 해리 정수 K_D를 산출하였다.

(결과)

닭 난황 항체와 각종 렉틴과의 친화 정수를 [표1]에 나타내었다. [표1]에 결합 속도 정수 Ka(M^-1s^-1), 해리 속도 정수 Kd(s^-1), 친화 정수 K_A(M^-1), 및 해리 정수 K_D(M)를 나타내었다. 또한, 친화 속도는 그 값이 커질수록 친화성이 높은(결합력이 강한) 것을 의미한다.

[표1]의 결과에서, 시험한 모든 렉틴이 닭 난황 항체(친화 정수 K_A=10⁷~10⁸M^-1), 및 소 티로글로불린(친화 정수 K_A=10⁷~10⁸M^-1)과 높은 친화성을 나타내었다. 한편, Carnin(친화 정수 K_A=10⁸M^-1)과 Con A(친화 정수 K_A=10⁶M^-1)는 아시아로트랜스페린에 대해서도 높은 친화성을 나타내었다. 또한, HypninA-1을 제외한 모든 테스트 렉틴은 타카아밀라아제A(친화 정수 K_A=10⁷~10⁸M^-1)에 대하여 높은 친화성을 나타내었다.

이상의 결과에서, 닭 난황 항체하고만 특이적으로 결합하는 렉틴을 찾아내지는 못하였다. 그러나, 해조 렉틴 4종(ESA-2, Solnin B, BML-17, Carnin)과 닭 난황 항체와의 결합은 고 만노오스형 당쇄와의 결합을 통해 이루어진다는 것이 판명되었다. 또한, 닭 난황 항체와의 친화성은 BML-17, ESA-2, Hypnin A-1, Carnin, Con A의 순으로 높았다.

[ 실시예 5 : 각종 렉틴과 소 티로글로불린과의 용해성 검토]

(방법)

닭 난황 항체와 마찬가지로, 고 만노오스형 당쇄와 복합형 당쇄를 갖는 소 티로글로불린 고정화 칩을 이용하여, 동 칩에 결합된 렉틴의 용해성을 검토하였다. 또한, 티로글로불린의 고정화에 있어서, 특이적 결합 및 용리를 확인하기 쉽도록 CM5 센서 칩상에 최대한 고정화(12,095RU)하였다. HBS-EP(평형화) 버퍼(BIACORE사 제조) 중의 각 100㎍/㎖ 농도의 아날라이트(렉틴) 용액을 유속 5㎕/min으로 결합량이 평형에 달할 때까지 흘려보냈다. 이후, HBS-EP 버퍼로 세정하고, 해리가 평형에 도달한 후, 동 버퍼 중에 0.5M D-만노오스를 50㎕ 주입하였다. 센서그램을 바탕으로, 아날라이트(렉틴) 용액을 50㎕(5㎍) 주입한 시점에서의 결합량(RU)을 측정하였다. 다음으로, 버퍼 세정 및 50㎕의 0.5M D-만노오스 용액에서의 용출후의 아날라 이트(렉틴)의 잔존 결합량(RU)을 측정하였다. 잔존 결합량을 최대 결합량에 대한 비율(%)로 나타내었다.

(결과)

도 9에 고정화 티로글로불린과 각종 렉틴의 상호 작용의 센서그램을, 도 3에 결합, 세정 및 0.5M D-만노오스에서의 용리후의 아날라이트(렉틴)의 잔존 결합량(%)을 나타내었다. 도 3은 소 티로글로불린 고정화 칩에 각종 렉틴을 결합시켰을 때의 칩과 결합하고 있는 렉틴량을 100%로 한 경우에 있어서, HBS-EP 버퍼로 해리시킨후의 칩과 결합하고 있는 렉틴량의 상대치, 및 0.5M D-만노오스로 용리시킨후의 렉틴량의 상대치를 나타내고 있다.

이 결과에서, BML-17과 Carnin이 D-만노오스에서 특이적 또한 정량적으로 용리된다는 것을 알았다. 한편, ESA-2, Solnin B, Hypnin A-1은 D-만노오스 및 다른 용리액(결과는 나타내지 않음)에서는 용리되지 않고, Con A는 D-만노오스에서 일부 용리되었다.

이상의 결과에서, BML-17과 Carnin이 닭 항체의 정제용 리간드로서 이용 가능하다는 것을 알았다.

[ 실시예 6 : BML -17 칼럼, Carnin 칼럼 및 Con A 칼럼을 이용한 닭 난황 항체의 정제]

(방법)

BML-17, Carnin, Con A를 각각 HiTrap NHS-activated HP Column{1㎖볼륨 겔, (Amersham Bioscience Corp 제조)}에 고정화하였다. 고정화 방법은 동 HiTrap 칼럼에 첨부된 매뉴얼에 따라 수행하였다. 또한, BML-17 및 Con A의 경우에는 각각 저해 단당인 D-만노오스 및 메틸-α-D-만노시드를 종농도 0.2M가 되도록 리간드 용액에 가하여 활성 사이트를 블록한 상태에서 고정화하였다. 평형화 버퍼{(0.15M NaCl 및 0.02% NaN₃을 포함하는 0.05M 트리스-염산 버퍼(pH7.5)}로 충분히 세정한 이후의 각 칼럼의 렉틴 고정화량은 400㎍(BML-17), 570㎍(Carnin), 270㎍(Con A)이었다. 또한, HiTrap IgY Purification HP Column(Amersham Bioscience Corp 제조, 5㎖볼륨 겔, 이하 'IgY 정제용 칼럼'이라 한다)을 비교 대조로 이용하였다.

또한, 이하 각종 렉틴을 고정화한 칼럼은 각각 'BML-17 칼럼', 'Carnin 칼럼', 'Con A 칼럼'이라 칭한다.

(결과)

도 4에 각종 렉틴을 고정화한 칼럼(BML-17 칼럼, Carnin 칼럼, Con A 칼럼) 및 IgY 정제용 칼럼에 닭 난황 항체를 통과시키고, D-만노오스 또는 용출 버퍼로 용리한 경우의 단백질 거동을 UV280㎚ 흡수(도면 중 'A₂₈₀'으로 나타냄. 이하 동일)로 모니터한 결과를 나타내었다. 도 4(a)는 BML-17 칼럼의 결과를 나타내고, 도 4(b)는 Carnin의 결과를 나타내고, 도 4(c)는 Con A 칼럼의 결과를 나타내고, 도 4(d)는 IgY 정제용 칼럼의 결과를 나타낸 것이다.

닭 난황 항체를 상기 4종류의 칼럼에 제공한 결과, 모든 칼럼에 동 항체가 결합하였다. 또한, 20mM, 200mM, 500mM의 D-만노오스에서 용리를 수행한 결과, BML-17 칼럼 및 Carnin 칼럼은 D-만노오스에서 닭 난황 항체를 특이적으로 용리시킬 수 있다는 것을 알았다{도 4(a), (b) 참조}. 또한, 후술할 도 5에 도시된 바와 같이, 닭 난황 항체의 회수율 관점에서, BML-17 칼럼이 가장 유효하였다.

한편, Con A 칼럼에서는 200mM 메틸-α-D-만노시드에서 용리가 보여졌으나{도 4(c) 참조}, 티올 친화성을 어피니티 원리로 하는 시판품의 IgY 정제용 칼럼에서의 정제 효율은 현저히 낮았다{도 4(d) 및 후술할 도 5 참조}.

[ 실시예 7 : BML -17 칼럼, Carnin 칼럼 및 Con A 칼럼을 이용한 하이브리도 마 배양 상청으로부터의 닭 모노크로날 항체의 정제]

(방법)

상기 BML-17 칼럼, Carnin 칼럼, Con A 칼럼, IgY 정제용 칼럼 및 Con A Sepharose 4B Lab Packs 칼럼(Amersham Bioscience Crop 제조, 이하 '시판 Con A 칼럼'이라 한다)(5㎖볼륨 겔, 고정화 Con A 양 10~16㎎/㎖)을 이용하여 하이브리도마 배양 상청으로부터 닭 모노크로날 항체의 정제를 시도하였다.

보다 구체적으로는, 하이브리도마 배양 상청의 5㎖(시판 Con A 칼럼의 경우에는 2.5㎖)를 각 칼럼에 직접 첨가하고, 칼럼을 1M NaCl로 충분히 세정후, 렉틴을 고정화한 칼럼의 경우에는 500mM D-만노오스 또는 500mM 메틸α-D-만노시드로, IgY 정제용 칼럼의 경우에는 매뉴얼 지정 용출 버퍼로 용출하고, 각 용출액을 SDS-PAGE{4~20% 그라디언트 겔(e-파겔, ATTO 제조)}에 제공하였다. 밴드 검출은 CBB 염색 및 웨스턴 브롯법으로 수행하였다. 또한, 용출액의 활성 닭 모노크로날 항체의 정량은 샌드위치 ELISA법을 이용하여 수행하였다. 또한, 웨스턴 브로팅에는 서양 고추냉이 페록시다제(HRP) 표식 염소 항닭 IgG 항체(코스모 바이오사 제조), 발색에는 코니카 이무노스테인(Konica immunostain)-HRP(생화학공업 제조)를 이용하였다.

하이브리도마는 닭 B 세포주 유래 MUH1과 DNP-KLH 면역 닭 지라 세포와의 융합에 의해 얻어진 항 DNP 항체 생산 B4 Cell로, 이것을 10% FBS 이스코브 배지중에서 38.5℃로 5% CO₂ 하에서 4~5일 배양한 배양액의 원심 상청을 상기 시험에 제공하였다. 본 하이브리도마는 본 발명자 등이 제작하였다.

또한, 샌드위치 ELISA법은 마이크로 플레이트를 이용하여 수행하였다. 50㎕의 DNP-BSA 용액(10㎍/㎖)을 플레이트 내의 각 웰에 첨가하고, 4℃에서 16시간 정치하여 동 항원을 고상화하였다. 각 웰을 0.2% 스킴 밀크 함유 PBS로 브로킹하고, 0.5% Tween20을 포함하는 PBS로 세정한 후, 0.1% 스킴 밀크를 포함하는 PBS로 조정한 검액 50㎕를 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 1시간 정치하였다. 이 플레이트를 세정한 후, 0.1% 스킴 밀크를 포함하는 PBS로 조제한 HRP 표식 염소 항닭 IgG 항체 용액(1㎍/㎖) 50㎕를 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 1시간 정치하였다. 이 플레이트를 충분히 세정한 후, 각 웰에 100㎕의 발색액(코니카 이무노스테인)을 가하고, 실온에서 10분 정치하였다. 각 웰의 415㎚의 흡광도를 마이크로 플레이트 리더(BIO-RAD Nodel 50)로 측정하였다. 또한, 표준 검량선은 닭 항DNP-KLH 모노크로날 항체 샘플을 동일한 측정에 제공하여 작성하였다.

(결과)

도 5에 각종 렉틴을 고정화한 칼럼(BML-17 칼럼, Carnin 칼럼, Con A 칼럼, Con A-HiTrap 칼럼) 및 IgY 정제용 칼럼에 하이브리도마 배양 상청을 통과시키고, 500mM D-만노오스 또는 용출 버퍼로 용리한 경우의 단백질 거동을 UV280㎚의 흡수(도면 중 'A₂₈₀'으로 나타냄)로 모니터한 결과를 나타내었다. 도 5(a)는 BML-17 칼럼의 결과를 나타내고, 도 5(b)는 Carnin 칼럼의 결과를 나타내고, 도 5(c)는 Con A 칼럼의 결과를 나타내고, 도 5(d)는 시판 Con A 칼럼의 결과를 나타내고, 도 5(e)는 IgY 정제용 칼럼의 결과를 나타낸 것이다.

또한, 도 6에 용출액을 웨스턴 브롯{도 6(a) 및 SDS-PAGE(도 6(b))}으로 분석한 결과를 나타내었다. 레인 1 및 11은 분자량 마커를 나타내고, 레인 2 및 10은 닭 모노크로날 항체 샘플을 나타내고, 레인 3은 10% FBS 이스코브 배지를 나타내고, 레인 4는 하이브로도마 배양 상청을 나타내고, 레인 5는 BML-17 칼럼의 용출 획분을 나타내고, 레인 6은 Carnin 칼럼의 용출 획분을 나타내고, 레인 7은 Con A 칼럼의 용출 획분을 나타내고, 레인 8은 IgY 정제용 칼럼의 용출 획분을 나타내고, 레인 9는 시판 Con A 칼럼의 용출 획분을 나타낸 것이다.

도 5, 6에 따르면, BML-17 칼럼 및 Carnin 칼럼을 이용함으로써, 하이브리도마 배양 상청으로부터 원스텝으로 고순도의 닭 모노크로날 항체를 정제할 수 있다는 것을 알았다. 한편, 시판되고 있는 Con A-HiTrap 칼럼이나 IgY 정제용 칼럼에서의 정제 샘플은 다량의 협잡물을 포함하는 것이었다.

또한, [표6]에 각종 칼럼에 대한 하이브리도마 배양 상청으로부터의 활성형 닭 모노크로날 항체의 정제 효율을 나타내었다.

[표6]에서, 고정화 리간드량당 활성 닭 모노크로날 항체의 수율은 BML-17 칼럼이 가장 높고, 이어서 Carnin 칼럼이 높다는 것을 알았다.

이상의 결과에서, BML-17 칼럼 및 Carnin 칼럼을 이용함으로써, 종래와 같이 닭 모노크로날 항체를 하이브리도마 배양 상청으로부터 고전적인 단백질 정제법을 다단계 조합하여 정제할 필요 없이 극히 간단하게 정제할 수 있었다.

본 발명은 상술한 실시 형태에 한정되는 것이 아니라, 청구항에 나타낸 범위에서 여러 변경이 가능하다. 즉, 청구항에 나타낸 범위에서 적절히 변경된 기술적 수단을 조합하여 얻어지는 실시 형태에 대해서도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.

[각 실시예에 있어서의 표]

[표1]

[표2]

[표3]

[표4]

[표5]

[표6]

이상과 같이, 본 발명의 펩티드는 항체, 특히 닭 항체(폴리크로날 항체, 모노크로날 항체 등)의 정제에 이용 가능하다. 닭 항체를 비롯한 항체는 의료 분야에 있어서 유용하기 때문에, 본 발명은 의료 산업, 약품 산업, 검사약에 관한 산업 등 널리 이용 가능하다.

SEQUENCE LISTING <110> National University of Corporation Hiroshima University <120> Novel polypeptide, polynucleotide coding the polypeptide and use thereof <130> HU0615 <150> JP 2005-056717 <151> 2005-03-01 <160> 17 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 504 <212> DNA <213> Bryopsis maxima <400> 1 gtcatatacc aagaccccgt aacttcagat atgttcgcga agattccgat gccggggcac 60 cgtggaccgt ggtacgtctg ccactcgtcg ggtgactggt cgagaaacga gcctgttttc 120 ggccgttgtg ccctggatgc taagggcatg gtcgaggcgt acttccccta tggaggtaaa 180 gacatcaagt ggccttcacg ctggtccgca gtcttgacca ccggtgtgta ttggggaaag 240 tacaacgact ggaaacaagc ggattgcaat gggggtcaac aagtggtgga cggcggtaga 300 ggggccgtga cagtcaggat ggacggactc tcggagtgca agggctggac aacgggtaag 360 agcagtcata acgaggtctg gttcggatgt aacggaaagg aggtgggtag ctggctgtct 420 gatacccctg ccagcgacgt tttccctctg tgccaggagt atggagcggc agtaaaattg 480 gtccacatgg ggcgcgcttt caac 504 <210> 2 <211> 168 <212> PRT <213> Bryopsis maxima <400> 2 Val Ile Tyr Gln Asp Pro Val Thr Ser Asp Met Phe Ala Lys Ile Pro 1 5 10 15 Met Pro Gly His Arg Gly Pro Trp Tyr Val Cys His Ser Ser Gly Asp 20 25 30 Trp Ser Arg Asn Glu Pro Val Phe Gly Arg Cys Ala Leu Asp Ala Lys 35 40 45 Gly Met Val Glu Ala Tyr Phe Pro Tyr Gly Gly Lys Asp Ile Lys Trp 50 55 60 Pro Ser Arg Trp Ser Ala Val Leu Thr Thr Gly Val Tyr Trp Gly Lys 65 70 75 80 Tyr Asn Asp Trp Lys Gln Ala Asp Cys Asn Gly Gly Gln Gln Val Val 85 90 95 Asp Gly Gly Arg Gly Ala Val Thr Val Arg Met Asp Gly Leu Ser Glu 100 105 110 Cys Lys Gly Trp Thr Thr Gly Lys Ser Ser His Asn Glu Val Trp Phe 115 120 125 Gly Cys Asn Gly Lys Glu Val Gly Ser Trp Leu Ser Asp Thr Pro Ala 130 135 140 Ser Asp Val Phe Pro Leu Cys Gln Glu Tyr Gly Ala Ala Val Lys Leu 145 150 155 160 Val His Met Gly Arg Ala Phe Asn 165 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Bryopsis maxima <400> 3 Asp Met Phe Ala Lys Ile Pro Met Pro Gly His 1 5 10 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Bryopsis maxima <400> 4 Ala Lys Gly Met Val Glu Ala Tyr 1 5 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Bryopsis maxima <400> 5 Tyr Gln Asp Pro Val Thr Ser Asp Met Phe Glu 1 5 10 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 6 gacatgttcg cnaagatycc natgccnggn ca 32 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 7 gtacgcctcg accaccacgc ccttagcatc ca 32 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 8 ccaagacccc gtaacttcag atatgttcg 29 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 9 aaccctcact aaagggaaca aaagctgga 29 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 10 ttgtaatacg actcactata gggcga 26 <210> 11 <211> 576 <212> DNA <213> Bryopsis maxima <400> 11 gccgcacttg gtgatgcacg gccagttgtc aaccagatgg ccaacgtcac gacgatgatg 60 gttgaaaacg tcatatacca agaccccgta acttcagata tgttcgcgaa gattccgatg 120 ccggggcacc gtggaccgtg gtacgtctgc cactcgtcgg gtgactggtc gagaaacgag 180 cctgttttcg gccgttgtgc cctggatgct aagggcatgg tcgaggcgta cttcccctat 240 ggaggtaaag acatcaagtg gccttcacgc tggtccgcag tcttgaccac cggtgtgtat 300 tggggaaagt acaacgactg gaaacaagcg gattgcaatg ggggtcaaca agtggtggac 360 ggcggtagag gggccgtgac agtcaggatg gacggactct cggagtgcaa gggctggaca 420 acgggtaaga gcagtcataa cgaggtctgg ttcggatgta acggaaagga ggtgggtagc 480 tggctgtctg atacccctgc cagcgacgtt ttccctctgt gccaggagta tggagcggca 540 gtaaaattgg tccacatggg gcgcgctttc aactaa 576 <210> 12 <211> 191 <212> PRT <213> Bryopsis maxima <400> 12 Ala Ala Leu Gly Asp Ala Arg Pro Val Val Asn Gln Met Ala Asn Val 1 5 10 15 Thr Thr Met Met Val Glu Asn Val Ile Tyr Gln Asp Pro Val Thr Ser 20 25 30 Asp Met Phe Ala Lys Ile Pro Met Pro Gly His Arg Gly Pro Trp Tyr 35 40 45 Val Cys His Ser Ser Gly Asp Trp Ser Arg Asn Glu Pro Val Phe Gly 50 55 60 Arg Cys Ala Leu Asp Ala Lys Gly Met Val Glu Ala Tyr Phe Pro Tyr 65 70 75 80 Gly Gly Lys Asp Ile Lys Trp Pro Ser Arg Trp Ser Ala Val Leu Thr 85 90 95 Thr Gly Val Tyr Trp Gly Lys Tyr Asn Asp Trp Lys Gln Ala Asp Cys 100 105 110 Asn Gly Gly Gln Gln Val Val Asp Gly Gly Arg Gly Ala Val Thr Val 115 120 125 Arg Met Asp Gly Leu Ser Glu Cys Lys Gly Trp Thr Thr Gly Lys Ser 130 135 140 Ser His Asn Glu Val Trp Phe Gly Cys Asn Gly Lys Glu Val Gly Ser 145 150 155 160 Trp Leu Ser Asp Thr Pro Ala Ser Asp Val Phe Pro Leu Cys Gln Glu 165 170 175 Tyr Gly Ala Ala Val Lys Leu Val His Met Gly Arg Ala Phe Asn 180 185 190 <210> 13 <211> 28 <212> PRT <213> Bryopsis maxima <400> 13 Val Ile Tyr Gln Asp Pro Val Thr Ser Asp Met Phe Ala Lys Ile Pro 1 5 10 15 Met Pro Gly His Arg Gly Pro Trp Tyr Val Met His 20 25 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Bryopsis corticulans <400> 14 Ser Asp Leu Pro Thr Gly Asp Phe Phe Leu 1 5 10 <210> 15 <211> 23 <212> PRT <213> Bryopsis plumosa <220> Unknown <221> Xaa <222> (6) <400> 15 Ser Asp Leu Pro Thr Xaa Asp Phe Phe His Ile Pro Glu Gly Tyr Leu 1 5 10 15 Glu Ala Ser Asn Gly Gly Ala 20 <210> 16 <211> 31 <212> PRT <213> Bryopsis.sp <220> Unknown <221> Xaa <222> (2) ,(29) <400> 16 Pro Xaa Thr Ile Thr Val Phe Asn Ser Gly Gly Tyr Val Ile Lys Ser 1 5 10 15 Thr Phe Glu Tyr Phe Asp Asp Ala Thr Tyr Asp Ile Xaa Arg Arg 20 25 30 <210> 17 <211> 18 <212> PRT <213> Bryopsis.sp <220> Unknown <221> Xaa <222> (2) ,(17) <400> 17 Asp Xaa Val Trp Thr Val Glu Val Lys Gly Leu Gly Asp Arg Ser Ser 1 5 10 15 Xaa Pro

Claims (16)

1. 당쇄와 결합하는 폴리펩티드에 있어서,

   배열번호 2에 나타낸 아미노산 배열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
2. 제 1 항에 있어서,

   상기 당쇄가 고 만노오스형 당쇄인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
3. 삭제
4. 제 1 항 또는 제 2 항중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드를 코드하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
5. 제 4 항에 있어서,

   하기의 (a) 또는 (b)중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드:

   (a) 배열번호 1에 나타낸 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는

   (b) 이하의 (i) 혹은 (ii)중 어느 하나와 스트린전트(stringent)한 조건하에서 하이브리다이즈되는 폴리뉴클레오티드:

   (i) 배열번호 1에 나타낸 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 혹은

   (ii) 배열번호 1에 나타낸 염기 배열과 상보적인 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.
6. 제 4 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
7. 제 6 항에 기재된 벡터를 이용하는 것을 특징으로 하는 제 1 항에 기재된 폴리펩티드의 생산 방법.
8. 제 4 항에 기재된 폴리뉴클레오티드가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 형질전환체.
9. 제 8 항에 기재된 형질전환체를 이용하는 것을 특징으로 하는 제 1 항에 기재된 폴리펩티드의 생산 방법.
10. 제 4 항에 기재된 폴리뉴클레오티드가 기판상에 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 DNA칩.
11. 제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 폴리펩티드가 기판상에 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 프로테인칩.
12. 삭제
13. 삭제
14. 제 1 항에 기재된 폴리펩티드를 이용하는 것을 특징으로 하는 항체의 정제 방법.
15. 제 14 항에 있어서,

    상기 항체가 닭 항체인 것을 특징으로 하는 정제 방법.
16. 제 1 항에 기재된 폴리펩티드가 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 담체.

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