JPWO2006093088A1 - 新規ポリペプチドおよびそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びにそれらの利用 - Google Patents

Abstract

本発明の目的は糖鎖、特に抗体に結合している高マンノース型糖鎖、より好ましくはニワトリ型抗体に結合している糖鎖に結合するポリペプチドを発見すること、および当該ポリペプチドの代表的な利用例として、抗体（特にニワトリ型抗体）の精製方法、同精製手段を提供することにある。本発明にかかるポリペプチドＢＭＬ−１７は、オオハネモ（Ｂｒｙｏｐｓｉｓ ｍａｘｉｍａ）から単離された１６８アミノ酸からなる新規レクチンである。当該ＢＭＬ−１７を用いることによって、抗体（例えば、ニワトリ型抗体等）の精製を、簡便かつ高効率で行なうことができる。

Description

本発明は、糖鎖、特に高マンノース型糖鎖に結合する新規ポリペプチド、およびそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びにそれらの代表的利用に関するものである。

糖鎖と結合するタンパク質（ポリペプチド）としては、マンノース結合タンパク質、線維芽細胞増殖因子、上皮細胞増殖因子等の糖結合タンパク質、レクチン、レクチン様物質が知られている。上記レクチンは、特定の糖鎖構造に対して特異的に結合する性質を有するため、糖、糖鎖もしくは複合糖質を固定化したカラムを用いて精製することができる。レクチンの例としては、小麦胚芽レクチン、レンズマメレクチンなどが挙げられる。

小麦胚芽レクチンと糖鎖または糖ペプチドとの結合活性を調べたところ、小麦胚芽レクチンはＮ−グリコシド結合糖鎖のうちハイブリッド型糖鎖あるいはシアル酸を有する糖鎖または糖ペプチドとの結合性が高いことが示唆されている（非特許文献１、２参照）。また、小麦胚芽レクチンは、バイセクティングＮ−アセチルグルコサミンを有する糖鎖構造を有する糖ペプチドに対し、より強い結合活性を有することが示唆されている（非特許文献３参照）。

レンズマメレクチンは、単糖であるα−Ｄ−マンノース、α−Ｄ−グルコースを認識することが知られている（非特許文献４参照）。また、レンズマメレクチンが、Ｎ−グリコシド結合糖鎖のアスパラギンに最も近いＮ−アセチルグルコサミン残基に、Ｌ−フコースがα１，６−結合した糖鎖構造を有する糖ペプチドに対して、強い結合性を示すことが知られている（非特許文献５、６参照）。

ところで、抗体はそのＦｃ領域に特異な糖鎖構造を有していることが知られている。したがって、レクチンと糖鎖との結合を利用すれば抗体の精製に利用することが可能である。レクチンを用いて抗体（特にヒト抗体）を精製する方法としては、例えば特許文献１が知られている。

ニワトリは系統発生学的には哺乳類動物よりも下等であるが、哺乳類動物と同様に精緻な免疫システムを備えている動物である。特に哺乳類動物と系統発生学的に離れているため、多くの哺乳類動物で保存されているタンパク質に対して特異的抗体を作製するのに有用である。すなわちマウスやラットを用いて作製が困難なタンパク質（抗原）に対する特異的抗体が、ニワトリでは作製可能であるということである。例えば、ヒトの癌マーカーとなる抗原であるＮ−グリコリルノイラミン酸は、ヒトを除くほとんどの哺乳類動物に存在しているため、マウスやラット等では抗体を作製することはできないが、ニワトリをはじめとする鳥類ではＮ−グリコリルノイラミン酸が存在しないために抗体を作製することが可能である。また、クロイツフェルト・ヤコブ病や狂牛病の病原体となるプリオンタンパク質は、哺乳類動物間で９０％以上の相同性が有るため、哺乳類動物では抗体を作製することは困難であるが、哺乳類動物とニワトリ間の相同性は３０％台であるため、ニワトリにおいてその抗体の作製は可能である。事実、本発明者等は、細胞融合法によって上記Ｎ−グリコリルノイラミン酸、プリオンタンパク質に対するニワトリ型モノクローナル抗体の作製に成功している。またその他のニワトリ型抗体のメリットとしては、哺乳類動物型の抗体との交叉反応性が無いため、ニワトリ型モノクローナル抗体と哺乳類動物型モノクローナル抗体を用いることによって、非特異的反応のない高感度抗原検出系を確立することが可能なことである。

上記のように、ニワトリ型抗体（ニワトリが生産する抗体、ニワトリが生産する抗体と同じ構造を有する抗体）の有用性（検査用途、医療用途等）について注目されており、その効率的生産方法および精製方法の確立が求められている。ニワトリ型抗体の生産方法については、細胞融合法、ファージディスプレイ法等の技術により確立されつつある。しかし、その精製方法についてはいまだ確立されていないのが現状である。

ニワトリ型抗体は、哺乳類動物のＩｇＧ抗体の精製用リガンドとして用いられるプロテインＡおよびＧには結合しない。したがって、哺乳類動物の方法をそのまま適用することができない。

本発明者らは、ニワトリ型抗体の精製技術を開発すべく、まずマウスモノクローナル抗体を用いたアフィニティーカラムによるニワトリ型抗体の精製を試みた。しかし当該方法では、ニワトリ型抗体を精製することはできなかった。次に本発明者らは、ゲルろ過およびイオン交換カラムを用いてニワトリ型抗体の精製を行なった。その結果、電気泳動的に単一な抗体の精製に成功した。しかし当該方法は、多くのステップを要し、煩雑であること、回収率が著しく低いこと、精製した抗体の力価が低いこと等の問題点があった。

そこで本発明者らは、上記問題点を解決すべく、ニワトリ型抗体には高マンノース型糖鎖が結合していることを利用し、高マンノース型糖鎖と特異的に結合する植物由来レクチン（ユキノシタ由来レクチン、レンズマメ由来レクチン、およびＣｏｎＡ）を用いて、ニワトリ型抗体の精製を試みた。しかしユキノシタ由来レクチン、レンズマメ由来レクチンを用いた場合は、ニワトリ型抗体がレクチンに吸着するものの、当該抗体を溶出させることができなかった。またＣｏｎＡを用いた場合は、ニワトリ型抗体が吸着し、α−メチルグルコシドによって当該抗体を溶出することができた。しかし、電気泳動的に単一な抗体を得ることができなかった。このことは、ニワトリ型抗体に結合する糖鎖の特異的な構造に起因するものと考えられた。

ニワトリ型抗体（ニワトリ型モノクローナル抗体）の糖鎖構造については、ほとんど解析されていないのが現状である。最近、ニワトリ卵黄抗体（以下、「ＩｇＹ抗体」という）のＮ−アスパラギン結合型糖鎖（以下「Ｎ型糖鎖」という）には、１０数％のグルコースが存在するということが報告された（Ｏｈｔａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．，８，４００−４１３（１９９１））。哺乳類動物のＩｇＧ抗体のＮ型糖鎖にはグルコースが存在しないことから、ニワトリ型抗体の糖鎖構造が特異であるということが伺える。したがって、哺乳類動物の抗体を精製することが可能なレクチンをニワトリ型抗体の精製にそのまま流用することは、困難であるといえる。なお本発明者らの糖鎖解析によれば、ニワトリ型抗体には、高マンノース型糖鎖および複合型糖鎖が結合しており、糖鎖の非還元末端には複数個のグルコースが存在していること、特にニワトリ型ＩｇＹ抗体の糖鎖の非還元末端には１個のグルコースが存在するということが推察された。

本発明は上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は糖鎖、特に抗体に結合している高マンノース型糖鎖、より好ましくはニワトリ型抗体に結合している糖鎖に結合するポリペプチド（例えば、レクチン）を発見すること、および当該ポリペプチドの代表的な利用例として、抗体（特にニワトリ型抗体）の精製方法、同精製手段を提供することにある。さらには、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および当該ポリペプチドと結合する抗体、並びにそれらの利用方法を提供することを目的としている。
国際公開第０２／３０９５４号パンフレット（公開日：２００２年４月１８日） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１６，４４２６，１９７７ Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５４，４０００，１９７９ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０，５８９４，１９８１ Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６８，７６６８，１９９３ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４０，１１１，１９７５ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１１０，２８３，１９７５

本発明者らは上記課題を解決すべく、レクチン、特に藻類（海藻）由来レクチンに着目し、ニワトリ型抗体に特異的な非還元末端にグルコースを有する高マンノース型糖鎖と結合することが可能なレクチンの検索を行なった。その結果、本発明にかかるポリペプチドを発見するに至った。

すなわち本発明にかかるポリペプチドは、上記課題を解決すべく、糖鎖と結合するポリペプチドであって、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；または（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列、からなることを特徴としている。

また本発明にかかるポリペプチドは、上記課題を解決すべく、上記糖鎖が、高マンノース型糖鎖であってもよい。

また本発明にかかるポリペプチドは、上記課題を解決すべく、上記糖鎖が、非還元末端にグルコースが少なくとも１つ以上結合した糖鎖であってもよい。

一方、本発明にかかる抗体は、上記課題を解決すべく、上記本発明にかかるポリペプチドと結合することを特徴としている。

一方、本発明にかかるポリヌクレオチドは、上記課題を解決すべく、上記本発明にかかるポリペプチドをコードすることを特徴としている。

また、本発明にかかるポリヌクレオチドは、上記課題を解決すべく、下記の（ａ）または（ｂ）のいずれかであることを特徴とする上記のポリヌクレオチド：（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または（ｂ）以下の（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド：（ｉ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；もしくは（ｉｉ）配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるものであってもよい。

一方、本発明にかかるベクターは、上記課題を解決すべく、上記本発明にかかるポリヌクレオチドを含むことを特徴としている。

一方、本発明にかかるポリペプチドの生産方法は、上記課題を解決すべく、上記本発明にかかるベクターを用いることを特徴としている。

一方、本発明にかかる形質転換体は、上記課題を解決すべく、上記本発明にかかるポリヌクレオチドが導入されていることを特徴としている。

一方、本発明にかかるポリペプチドの生産方法は、上記課題を解決すべく、上記本発明にかかる形質転換体を用いることを特徴とする構成であってもよい。

一方、本発明にかかる検出器具は、上記課題を解決すべく、上記本発明にかかるポリヌクレオチドが基板上に固定化されていることを特徴としている。

また、本発明にかかる検出器具は、上記課題を解決すべく、上記本発明にかかるポリペプチドが基板上に固定化されている構成であってもよい。

また、本発明にかかる検出器具は、上記課題を解決すべく、上記本発明にかかる抗体が基板上に固定化されている構成であってもよい。

一方、ポリペプチドの精製方法は、上記課題を解決すべく、上記本発明にかかる抗体を用いることを特徴としている。

また本発明にかかる抗体の精製方法は、上記課題を解決すべく、上記本発明にかかるポリペプチドを用いることを特徴としている。また本発明にかかる抗体の精製方法は、上記課題を解決すべく、上記本発明にかかるポリペプチドに加え、さらにＣａｒｎｉｎを用いる方法であってもよい。また本発明にかかる抗体の精製方法は、上記課題を解決すべく、上記本発明にかかるポリペプチド、およびＣａｒｎｉｎのいずれか一方または両方を用いる方法であってもよい。

また本発明にかかる抗体の精製方法は、上記課題を解決すべく、上記抗体がニワトリ型抗体であることを特徴としている。

一方、本発明にかかる担体は、上記課題を解決すべく、上記本発明にかかるポリペプチドが固定化されていることを特徴としている。また本発明にかかる担体は、上記課題を解決すべく、上記本発明にかかるポリペプチドに加え、さらにＣａｒｎｉｎが固定化されていてもよい。また本発明にかかる担体は、上記課題を解決すべく、上記本発明にかかるポリペプチド、およびＣａｒｎｉｎのいずれか一方または両方を用いるものであってもよい。

本発明にかかるポリペプチドは、糖鎖、特に高マンノース型糖鎖に結合することが可能であるため、当該ポリペプチドを用いて各種抗体の精製を行なうことができる。さらに本発明にかかるポリペプチドは、ニワトリ型抗体に特異的な糖鎖、すなわち非還元末端に少なくとも１つ以上のグルコースが存在する高マンノース型糖鎖と結合することができるために、ニワトリ型抗体の精製に特に好適であり、精製を効率よく行なうことができるという効果を奏する。なお、公知のレクチンＣａｒｎｉｎについても同様に利用可能である。

本発明にかかるポリヌクレオチドは、上記本発明にかかるポリペプチドをコードしている。したがって、本発明にかかるポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを含むベクター、当該ポリヌクレオチドが導入された形質転換体を用いることによって、上記本発明にかかるポリペプチドを簡便かつ大量に調製することが可能となる。

また本発明にかかる抗体は、本発明にかかるポリペプチドと結合することができる。それゆえ当該抗体を例えば、担体に固定化しアフィニティークロマトグラフィーを行なうことによって、本発明にかかるポリペプチドを含む粗溶液から、当該ペプチドを効率良く精製することができるという効果を奏する。

本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、次の説明で明白になるであろう。

ニワトリ型抗体の糖鎖構造を示す図である。 ＢＭＬ−１７の全長ｃＤＮＡの塩基配列、およびその塩基配列から求めたアミノ酸配列を示す図である。 実施例５において、ウシチログロブリン固定化チップに対して各種レクチン（ＥＳＡ−２、Ｓｏｌｎｉｎ Ｂ、ＢＭＬ−１７、Ｃａｒｎｉｎ、Ｈｙｐｎｉｎ Ａ−１、Ｃｏｎ Ａ）の結合、解離、溶離を行なった結果を示すヒストグラムである。 実施例６に示す実験において、レクチンを固定化したカラム（ＢＭＬ−１７カラム）に、ニワトリ卵黄抗体を通塔し、Ｄ−マンノースで溶離した場合のタンパク質の挙動をＵＶ２８０ｎｍの吸収（Ａ_２８０）でモニターした結果を示す図である。 実施例６に示す実験において、レクチンを固定化したカラム（Ｃａｒｎｉｎカラム）に、ニワトリ卵黄抗体を通塔し、Ｄ−マンノースで溶離した場合のタンパク質の挙動をＵＶ２８０ｎｍの吸収（Ａ_２８０）でモニターした結果を示す図である。 実施例６に示す実験において、レクチンを固定化したカラム（Ｃｏｎ Ａカラム）に、ニワトリ卵黄抗体を通塔し、Ｄ−マンノースで溶離した場合のタンパク質の挙動をＵＶ２８０ｎｍの吸収（Ａ_２８０）でモニターした結果を示す図である。 実施例６に示す実験において、ＩｇＹ精製用カラム（市販品）に、ニワトリ卵黄抗体を通塔し、溶出バッファー（市販品）で溶離した場合のタンパク質の挙動をＵＶ２８０ｎｍの吸収（Ａ_２８０）でモニターした結果を示す図である。 実施例７に示す実験において、レクチンを固定化したカラム（ＢＭＬ−１７カラム）に、ハイブリドーマ培養上清を通塔し、５００ｍＭ Ｄ−マンノースで溶離した場合の、タンパク質の挙動をＵＶ２８０ｎｍの吸収（Ａ_２８０）でモニターした結果を示す図である。 実施例７に示す実験において、レクチンを固定化したカラム（Ｃａｒｎｉｎカラム）に、ハイブリドーマ培養上清を通塔し、５００ｍＭ Ｄ−マンノースで溶離した場合の、タンパク質の挙動をＵＶ２８０ｎｍの吸収（Ａ_２８０）でモニターした結果を示す図である。 実施例７に示す実験において、レクチンを固定化したカラム（Ｃｏｎ Ａカラム）に、ハイブリドーマ培養上清を通塔し、５００ｍＭ Ｄ−マンノースで溶離した場合の、タンパク質の挙動をＵＶ２８０ｎｍの吸収（Ａ_２８０）でモニターした結果を示す図である。 実施例７に示す実験において、レクチンを固定化したカラム（Ｃｏｎ Ａ−ＨｉＴｒａｐカラム）に、ハイブリドーマ培養上清を通塔し、５００ｍＭ Ｄ−マンノースで溶離した場合の、タンパク質の挙動をＵＶ２８０ｎｍの吸収（Ａ_２８０）でモニターした結果を示す図である。 実施例７に示す実験において、ＩｇＹ精製用カラム（市販品）に、ハイブリドーマ培養上清を通塔し、溶出バッファー（市販品）で溶離した場合の、タンパク質の挙動をＵＶ２８０ｎｍの吸収（Ａ_２８０）でモニターした結果を示す図である。 実施例７において、各種レクチンを固定化したカラム（ＢＭＬ−１７カラム、Ｃａｒｎｉｎカラム、Ｃｏｎ Ａカラム、Ｃｏｎ Ａ−ＨｉＴｒａｐカラム）およびＩｇＹ精製用カラムに、ハイブリドーマ培養上清を通塔し、５００ｍＭ Ｄ−マンノースまたは溶出バッファーで溶離した場合の溶出液を、ウエスタンブロットに供した結果を示す図である。 実施例７において、各種レクチンを固定化したカラム（ＢＭＬ−１７カラム、Ｃａｒｎｉｎカラム、Ｃｏｎ Ａカラム、Ｃｏｎ Ａ−ＨｉＴｒａｐカラム）およびＩｇＹ精製用カラムに、ハイブリドーマ培養上清を通塔し、５００ｍＭ Ｄ−マンノースまたは溶出バッファーで溶離した場合の溶出液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した結果を示す図である。 実施例１において、藻類（Ｂｒｙｏｐｓｉｓ ｍａｘｉｍａ）からの精製画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ゲル）に供した結果を示す図である。 ＢＭＬ−１７のＮ末端アミノ酸の配列および、これまでに単離されたハネモ属レクチン（ＢＣＬ、ＢＰＬ、Ｂｒｙ−１、Ｂｒｙ−２）のＮ末端アミノ酸の配列を示す図である。 固定化チログロブリンと各種レクチンの相互作用を示すセンサーグラムである。

本発明の実施の一形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明は、これに限定されるものではない。

本発明にかかるポリペプチド、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびこれらの利用について詳述する。

（１）ポリペプチド
本発明者らは、海藻（オオハネモ：Ｂｒｙｏｐｓｉｓ ｍａｘｉｍａ）から単離したポリペプチド（以下「ＢＭＬ−１７」という）が、糖鎖、特に高マンノース型糖鎖、さらには、ニワトリ型抗体に特異的な糖鎖（すなわち非還元末端にグルコースが少なくとも１つ以上結合した高マンノース型糖鎖）と結合すること、および当該ＢＭＬ−１７が、ニワトリ型抗体（ＩｇＹ抗体等）の精製に好適に利用が可能であるということを発見し、発明を完成するに至った。また従来公知の藻類（Ｃａｒｐｏｐｅｌｔｉｓ ｆｌａｂｅｌｌａｔａ＝Ｃ．ｐｒｏｒｉｆｅｒａ）由来レクチンであるＣａｒｎｉｎについても同様の効果があることを確認した。

本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。本発明にかかるポリペプチドはまた、天然供給源より単離されても、化学合成されてもよい。

用語「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、その天然の環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドおよびタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。

本発明にかかるポリペプチドは、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明にかかるポリペプチドは、グリコシル化され得るか、または非グリコシル化され得る。さらに、本発明にかかるポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。

本発明は、本発明にかかるポリペプチドを提供する。一実施形態において、本発明にかかるポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの変異体でありかつ本発明にかかるポリペプチドである。

変異体としては、欠失、挿入、逆転、反復、およびタイプ置換（例えば、親水性の残基の別の残基への置換、しかし通常は強く親水性の残基を強く疎水性の残基には置換しない）を含む変異体が挙げられる。特に、ポリペプチドにおける「中性」アミノ酸置換は、一般的にそのポリペプチドの活性にほとんど影響しない。

ポリペプチドのアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。

当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。さらに、本明細書中に記載される方法を用いれば、作製した変異体が所望の本発明にかかるか否かを容易に決定し得る。

好ましい変異体は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または添加を有する。好ましくは、サイレント置換、添加、および欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。これらは、本発明にかかるポリペプチド活性を変化させない。

代表的に保存性置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中での１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。

上記に詳細に示されるように、どのアミノ酸の変化が表現型的にサイレントでありそうか（すなわち、機能に対して有意に有害な効果を有しそうにないか）に関するさらなるガイダンスは、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）（本明細書中に参考として援用される）に見出され得る。

本実施形態にかかるポリペプチドは、糖鎖と結合するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列、
からなるポリペプチドであることが好ましい。

上記「１個もしくはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ポリペプチド作製法により置換、欠失、挿入、もしくは付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、最も好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されていることを意味する。このような変異ポリペプチドは、上述したように、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するポリペプチドに限定されるものではなく、天然に存在するポリペプチドを単離精製したものであってもよい。

なお、本発明にかかるポリペプチドは、アミノ酸がペプチド結合しているポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含む複合ポリペプチドであってもよい。本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド以外の構造」としては、糖鎖やイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。

また、本発明にかかるポリペプチドは、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。付加的なポリペプチドとしては、例えば、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ポリペプチドが挙げられる。

また、本発明にかかるポリペプチドは、後述する本発明にかかるポリヌクレオチド（本発明にかかるポリペプチドをコードする遺伝子）を宿主細胞に導入して、そのポリペプチドを細胞内発現させた状態であってもよいし、細胞、組織などから単離精製された場合であってもよい。また、本発明にかかるポリペプチドは、化学合成されたものであってもよい。

他の実施形態において、本発明にかかるポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で組換え発現され得る。例えば、本発明にかかるポリペプチドの付加的なアミノ酸、特に荷電性アミノ酸の領域が、宿主細胞内での、精製の間または引き続く操作および保存の間の安定性および持続性を改善するために、ポリペプチドのＮ末端に付加され得る。

本実施形態にかかるポリペプチドは、例えば、融合されたポリペプチドの精製を容易にするペプチドをコードする配列であるタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）にＮ末端またはＣ末端へ付加され得る。このような配列は、ポリペプチドの最終調製の前に除去され得る。本発明のこの局面の特定の好ましい実施態様において、タグアミノ酸配列は、ヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）において提供されるタグ）であり、他の中では、それらの多くは公的および／または商業的に入手可能である。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９）（本明細書中に参考として援用される）において記載されるように、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質由来のエピトープに対応する精製のために有用な別のペプチドであり、それは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４）（本明細書中に参考として援用される）によって記載されている。他のそのような融合タンパク質は、ＮまたはＣ末端にてＦｃに融合される本実施形態にかかるポリペプチドまたはそのフラグメントを含む。

別の実施形態において、本発明にかかるポリペプチドは、下記で詳述されるように組換え生成されても、化学合成されてもよい。

組換え生成は、当該分野において周知の方法を使用して行なうことができ、例えば、以下に詳述されるようなベクターおよび細胞を用いて行なうことができる。

合成ペプチドは、化学合成の公知の方法を使用して合成され得る。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎは、４週間未満で調製されそして特徴付けられたＨＡ１ポリペプチドセグメントの単一アミノ酸改変体を示す１０〜２０ｍｇの２４８の異なる１３残基ペプチドのような多数のペプチドの合成のための簡単な方法を記載している。Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５（１９８５）。この「Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＳＭＰＳ）」プロセスは、さらにＨｏｕｇｈｔｅｎら（１９８６）の米国特許第４，６３１，２１１号に記載される。この手順において、種々のペプチドの固相合成のための個々の樹脂は、別々の溶媒透過性パケットに含まれ、固相法に関連する多くの同一の反復工程の最適な使用を可能にする。完全なマニュアル手順は、５００〜１０００以上の合成が同時に行われるのを可能にする（Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、前出、５１３４）。これらの文献は、本明細書中に参考として援用される。

下記に詳細に記載するように、本発明にかかるポリペプチドは、抗体（特にニワトリ型抗体）の精製方法およびキットにおいて有用である。

本発明者らは、上記本発明にかかるポリペプチドが、糖鎖、特に高マンノース型糖鎖、さらには非還元末端にグルコースが少なくとも１つ以上結合した高マンノース型糖鎖と結合することを見出した。ここで「糖鎖」とは、直鎖または分岐したオリゴ糖または多糖を意味する。また上記糖鎖には、タンパク質との結合様式によって、アスパラギンと結合するＮ−グリコシド結合糖鎖（以下、「Ｎ型糖鎖」という）、およびセリン、スレオニンなどと結合するＯ−グリコシド結合糖鎖（以下、「Ｏ型糖鎖」という）に大別される。さらにＮ型糖鎖には高マンノース型糖鎖、複合型糖鎖、混成型糖鎖がある。本発明においては、上記糖鎖は全て含まれる。

なおオリゴ糖とは、単糖または単糖の置換誘導体が２〜１０個脱水結合して生じたものをいう。さらに多数の単糖が結合している糖質を多糖という。多糖は、構成糖の種類によって異なるが、ウロン酸やエステル硫酸を多く含む糖質を酸性多糖、中性糖のみのものを中性多糖という。多糖のうち、ムコ多糖とよばれる一群の多糖は、ほとんどがタンパク質と結合しており、プロテオグリカンという。単糖とは、糖鎖の構成単位となるもので、加水分解によってそれ以上簡単な分子にならない基本的物質である。

さらに単糖は、カルボキシル基などの酸性側鎖を有する酸性糖、ヒドロキシル基がアミノ基で置換されたアミノ糖、それ以外の中性糖の３つに大別される。生体内に存在する単糖としては、酸性糖はＮ−アセチルノイラミン酸やＮ−グリコリルノイラミン酸（以下、「Ｎｅｕ５Ｇｃ」という）などのシアル酸や、ウロン酸などがあり、アミノ糖としてはＮ−アセチルグルコサミン（以下、「ＧｌｃＮＡｃ」という）やＮ−アセチルガラクトサミンなどがあり、中性糖としてはグルコース、マンノース、ガラクトース、フコースなどがあげられる。

また抗体に結合する糖鎖としては、Ｎ型糖鎖の３つの型のいずれも包含する。Ｎ型糖鎖は全て、「トリマンノシルコア」と呼ばれる〔Ｍａｎ α１−６（Ｍａｎ α１−３）Ｍａｎ β１−４ＧｌｃＮＡｃ β１−４ＧｌｃＮＡｃ〕からなる共通母核構造を持っている。高マンノース型糖鎖とは、トリマンノシルコアに加え、分岐構造部分にα−マンノース残基のみを含む。この糖鎖には〔Ｍａｎ α１−６（Ｍａｎ α１−３）Ｍａｎ α１−６（Ｍａｎ α１−３）Ｍａｎ β１−４ＧｌｃＮＡｃ β１−４ＧｌｃＮＡｃ〕という七糖が共通の母核として含まれている。また混成型糖鎖は、複合型と高マンノース型の両方の特徴を併せ持っていることからそう呼ばれている。１つまたは２つのα−マンノシル基が、高マンノース型の場合と同様に、トリマンノシルコアのＭａｎ α１−６腕と結合し、複合型糖鎖の側鎖と同じものがコアのＭａｎ α１−３腕に結合している。トリマンノシルコアの還元末端に位置するＧｌｃＮＡｃのＣ−６位へのフコースの結合の有無、またβマンノシル残基のＣ−４位へのβ−ＧｌｃＮＡｃの結合（バィセクテイングＧｌｃＮＡｃと呼ばれる）の有無は、複合型や混成型糖鎖の構造の多様性に寄与している。３つのＮ−型糖鎖の間で、複合型が最も多様な構造を含んでいる。この多様性は、主に２つの要素で作り出され、トリマンノシルコアに１個から５個の側鎖がそれぞれ異なる結合位置で結合しており、一、二、三、四、または五本側鎖糖鎖を形成している。三本側鎖の複合型糖鎖には、〔ＧｌｃＮＡｃ β１−４（ＧｌｃＮＡｃ β１−２）Ｍａｎ α１−３〕あるいは〔ＧｌｃＮＡｃ β１−６（ＧｌｃＮＡｃ β１−２）Ｍａｎ α１−６〕のどちらかを含む２つの異性体が見つかっている。

なお上記トリマンノシルコアにおいて、アスパラギンと結合する糖鎖の末端、すなわちＧｌｃＮＡｃ側の末端を還元末端、その反対側、すなわちＭａｎ側の末端を非還元末端という。本発明者らの糖鎖解析によれば、ニワトリ型抗体（ニワトリ型ＩｇＹ抗体等）には、高マンノース型糖鎖および複合型糖鎖が結合しており、また高マンノース型糖鎖の非還元末端には少なくとも１個以上のグルコースが存在しているということが分かっている。特にニワトリ型ＩｇＹ抗体の高マンノース型糖鎖の非還元末端には１個のグルコースが存在するということが分かっている。図１にニワトリ型抗体の糖鎖構造を示す。図１左側にニワトリ型抗体に結合する高マンノース型糖鎖の構造を示し、同図右に複合型糖鎖の構造を示す。上述の通り、ニワトリ型抗体には非還元末端に１個のグルコースまたは２個のグルコースが存在している。特にニワトリ型ＩｇＹ抗体の糖鎖の非還元末端には、１個のグルコースが存在している。なお複合型糖鎖の結合については、免疫グロブリンのクラスを問わず共通である。

ポリペプチドが糖鎖と結合するか否かは、例えば標的となる糖鎖、または糖鎖が結合した抗体あるいは糖タンパク質等を固定化したカラムに、試験対象であるポリペプチドを通し、当該カラムにポリペプチドが結合したか否かをその通過液に含まれるポリペプチドの量、または特異的溶出剤でカラムから溶出したポリペプチドの量により評価することができる。また標的となる糖鎖が結合した抗体をメンブレン等に固定化し、ビオチン、フルオレセインイソチオシアネート、ペルオキシダーゼ等で標識したポリペプチドを用いて検出するウエスタンブロット法（法医学の実際と研究、３７，１５５，１９９４参照）、ドットブロット法（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０４（１），１９８，１９９２参照）を用いて評価することができる。また標的となる糖鎖、または糖鎖が結合した抗体あるいは糖タンパク質等を固定化したチップと、試験対象であるポリペプチドとの親和性を表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）を用いて測定すればよい。上記方法によれば、その親和性の有無のみならず、その強度まで測定できるために好ましい方法であるといえる。このとき得られる親和定数（Ｋ_Ａ）が、１０（Ｍ^−１）以上、より好ましくは１０^３（Ｍ^−１）以上、最も好ましくは１０^４（Ｍ^−１）以上であればポリペプチドと糖鎖とが結合していると判断できる。

なお本発明にかかるポリペプチドは、少なくとも、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含んでいればよいといえる。すなわち、配列番号２に示されるアミノ酸配列と特定の機能（例えば、タグ）を有する任意のアミノ酸配列とからなるポリペプチドも本発明に含まれることに留意すべきである。また、配列番号２に示されるアミノ酸配列および当該任意のアミノ酸配列は、それぞれの機能を阻害しないように適切なリンカーペプチドで連結されていてもよい。

つまり、本発明の目的は、本発明にかかるポリペプチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリペプチド作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得される本発明にかかるポリペプチドも本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。

（２）ポリヌクレオチド
本発明は、糖鎖と結合するポリペプチド（以下「本発明にかかるポリペプチド」という）をコードするポリヌクレオチドを提供する。本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。

本発明にかかるポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、またはそれは、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。

本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドが数個ないし数十個結合したものが意図され、「ポリヌクレオチド」と交換可能に使用される。オリゴヌクレオチドは、短いものはジヌクレオチド（二量体）、トリヌクレオチド（三量体）といわれ、長いものは３０マーまたは１００マーというように重合しているヌクレオチドの数で表される。オリゴヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチドのフラグメントとして生成されても、化合合成されてもよい。

本発明にかかるポリヌクレオチドのフラグメントは、少なくとも１２ｎｔ（ヌクレオチド）、好ましくは約１５ｎｔ、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、なおより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは少なくとも約４０ｎｔの長さのフラグメントが意図される。少なくとも２０ｎｔの長さのフラグメントによって、例えば、配列番号１に示される塩基配列からの２０以上の連続した塩基を含むフラグメントが意図される。本明細書を参照すれば配列番号１に示される塩基配列が提供されるので、当業者は、配列番号１に基づくＤＮＡフラグメントを容易に作製することができる。例えば、制限エンドヌクレアーゼ切断または超音波による剪断は、種々のサイズのフラグメントを作製するために容易に使用され得る。あるいは、このようなフラグメントは、合成的に作製され得る。適切なフラグメント（オリゴヌクレオチド）が、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（ＡＢＩ，８５０ Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｃｅｎｔｅｒ Ｄｒ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ ９４４０４）３９２型シンセサイザーなどによって合成される。

また本発明にかかるポリヌクレオチドは、その５’側または３’側で上述のタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドに融合され得る。

本発明はさらに、本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの変異体に関する。変異体は、天然の対立遺伝子変異体のように、天然に生じ得る。「対立遺伝子変異体」によって、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの交換可能な形態の１つが意図される。天然に存在しない変異体は、例えば当該分野で周知の変異誘発技術を用いて生成され得る。

このような変異体としては、本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換、または付加した変異体が挙げられる。変異体は、コードもしくは非コード領域、またはその両方において変異され得る。コード領域における変異は、保存的もしくは非保存的なアミノ酸欠失、置換、または付加を生成し得る。

本発明はさらに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは当該ポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、単離したポリヌクレオチドを提供する。

一実施形態において、本発明にかかるポリヌクレオチドは、本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり、かつ
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；または
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
のいずれかであることが好ましい。

他の実施形態において、本発明にかかるポリヌクレオチドは、本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、以下の（ａ）または（ｂ）：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）以下の（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；もしくは
（ｉｉ）配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、
のいずれかであることが好ましい。

なお、上記「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも９０％以上の同一性、好ましくは少なくとも９５％以上の同一性、最も好ましくは９７％の同一性が配列間に存在する時にのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。

上記ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法のような周知の方法で行なうことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。ハイブリダイゼーションの条件としては、従来公知の条件を好適に用いることができ、特に限定しないが、例えば、４２℃、６×ＳＳＰＥ、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ サケ精子ＤＮＡ、５×デンハルト液（ただし、１×ＳＳＰＥ；０．１８Ｍ 塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．７、１ｍＭ ＥＤＴＡ。５×デンハルト液；０．１％ 牛血清アルブミン、０．１％ フィコール、０．１％ ポリビニルピロリドン）が挙げられる。

本発明にかかるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡを包含する。またＤＮＡには例えばクローニングや化学合成技術またはそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。さらに、本発明にかかるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。

本発明にかかるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを取得する方法として、公知の技術により、本発明にかかるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングする方法が挙げられる。例えば、本発明におけるポリヌクレオチドの塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、本発明にかかるポリヌクレオチドの塩基配列またはその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列および／または長さのものを用いてもよい。

あるいは、本発明にかかるポリヌクレオチドを取得する方法として、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法を挙げることができる。例えば、本発明におけるポリヌクレオチドのｃＤＮＡのうち、５’側および３’側の配列（またはその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行ない、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明にかかるポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。

本発明にかかるポリヌクレオチドを取得するための供給源としては、特に限定されないが、所望のポリヌクレオチドを含む生物材料であることが好ましい。特に、本発明にかかるポリペプチドの起源であるオオハネモ（Ｂｒｙｏｐｓｉｓ ｍａｘｉｍａ）が好ましい。ただし、これに限定されるものではない。

なお本発明の目的は、本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および当該ポリヌクレオチドとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得される本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。

（３）抗体
本発明は、本発明にかかるポリペプチドと特異的に結合する抗体を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＹ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびこれらのＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、Ｆｃフラグメント）を意味し、例としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、抗イディオタイプ抗体およびヒト化抗体が挙げられるがこれらに限定されない。本発明にかかる抗体は、本発明にかかるポリペプチドを発現する生物材料を選択する際に有用であり得る。また本発明にかかるポリペプチドを含む粗溶液から、当該ペプチドを精製する際にも有用である。

「抗体」は、種々の公知の方法（例えば、ＨａｒＬｏｗら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）」、岩崎ら、「単クローン抗体 ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ、講談社（１９９１）」）に従えば作製することができる。

ペプチド抗体は、当該分野に周知の方法によって作製される。例えば、Ｃｈｏｗ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅ，Ｆ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４（１９８５）（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。一般には、動物は遊離ペプチドで免疫化され得る；しかし、抗ペプチド抗体力価はペプチドを高分子キャリア（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または破傷風トキソイド）にカップリングすることにより追加免疫され得る。例えば、システインを含有するペプチドは、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）のようなリンカーを使用してキャリアにカップリングされ得、一方、他のペプチドは、グルタルアルデヒドのようなより一般的な連結剤を使用してキャリアにカップリングされ得る。ウサギ、ラット、およびマウスのような動物は、遊離またはキャリア−カップリングペプチドのいずれかで、例えば、約１００μｇのペプチドまたはキャリアタンパク質およびＦｒｅｕｎｄのアジュバントを含むエマルジョンの腹腔内および／または皮内注射により免疫化される。いくつかの追加免疫注射が、例えば、固体表面に吸着された遊離ペプチドを使用してＥＬＩＳＡ法により検出され得る有用な力価の抗ペプチド抗体を提供するために、例えば、約２週間の間隔で必要とされ得る。免疫化動物からの血清における抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択により、例えば、当該分野で周知の方法による固体支持体上のペプチドへの吸着および選択された抗体の溶出により増加され得る。

本明細書中で使用される場合、用語「本発明にかかるポリペプチドと特異的に結合する抗体」は、本発明にかかるポリペプチド抗原に特異的に結合し得る完全な抗体分子および抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）_２フラグメント）を含むことを意味する。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）_２フラグメントは完全な抗体のＦｃ部分を欠いており、循環によってさらに迅速に除去され、そして完全な抗体の非特異的組織結合をほとんど有し得ない（Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６−３２５（１９８３）（本明細書中に参考として援用される））。従って、これらのフラグメントが好ましい。

さらに、本発明にかかるポリペプチドのペプチド抗原に結合し得るさらなる抗体が、抗イディオタイプ抗体の使用を通じて二工程手順で産生され得る。このような方法は、抗体それ自体が抗原であるという事実を使用し、従って、二次抗体に結合する抗体を得ることが可能である。この方法に従って、本発明にかかるポリペプチドと特異的に結合する抗体は、動物（好ましくは、マウス）を免疫するために使用される。次いで、このような動物の脾細胞はハイブリドーマ細胞を産生するために使用され、そしてハイブリドーマ細胞は、本発明にかかるポリペプチドと特異的に結合する抗体に結合する能力が本発明にかかるポリペプチド抗原によってブロックされ得る抗体を産生するクローンを同定するためにスクリーニングされる。このような抗体は、本発明にかかるポリペプチドと特異的に結合する抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、そしてさらなる本発明にかかるポリペプチドと特異的に結合する抗体の形成を誘導するために動物を免疫するために使用され得る。

ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）_２ならびに本発明にかかる抗体の他のフラグメントは、本明細書中で開示される方法に従って使用され得ることが、明らかである。このようなフラグメントは、代表的には、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生じる）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントを生じる）のような酵素を使用するタンパク質分解による切断によって産生される。あるいは、本発明にかかるポリペプチド結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術の適用または合成化学によって産生され得る。

このように、本発明にかかる抗体は、少なくとも、本発明にかかるポリペプチドを認識する抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）_２フラグメント）を備えていればよいといえる。すなわち、本発明にかかるポリペプチドを認識する抗体フラグメントと、異なる抗体分子のＦｃフラグメントとからなる免疫グロブリンも本発明に含まれることに留意すべきである。

つまり、本発明の目的は、本発明にかかるポリペプチドを認識する抗体を提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々の免疫グロブリンの種類（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＹ、ＩｇＧまたはＩｇＭ）、キメラ抗体作製方法、ペプチド抗原作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得される抗体も本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。

（４）本発明にかかるポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドの利用
（４−１）ベクター
本発明は、本発明にかかるポリペプチドを生成するために使用されるベクターを提供する。本発明にかかるベクターは、インビトロ翻訳に用いるベクターであっても組換え発現に用いるベクターであってもよい。

本発明にかかるベクターは、上述した本発明にかかるポリヌクレオチドを含むものであれば、特に限定されない。例えば、本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターなどが挙げられる。組換え発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。

ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明にかかるポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明にかかるポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。

発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択マーカーを含む。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、およびＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。

上記選択マーカーを用いれば、本発明にかかるポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認することができる。あるいは、本発明にかかるポリペプチドを融合ポリペプチドとして発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光ポリペプチドＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）をマーカーとして用い、本発明にかかるポリペプチドをＧＦＰ融合ポリペプチドとして発現させてもよい。

上記の宿主細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は当分野で周知である。

上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、例えば、本発明にかかるポリペプチドを昆虫で転移発現させる場合には、バキュロウイルスを用いた発現系を用いればよい。

このように、本発明にかかるベクターは、少なくとも、本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含めばよいといえる。すなわち、発現ベクター以外のベクターも、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。

つまり、本発明の目的は、本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々のベクター種および細胞種、ならびにベクター作製方法および細胞導入方法に存するのではない。したがって、上記以外のベクター種およびベクター作製方法を用いて取得したベクターも本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。

（４−２）形質転換体または細胞
本発明は、上述した本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入された形質転換体または細胞を提供する。ここで「形質転換体」とは、組織または器官だけでなく、生物個体を含むことを意味する。

形質転換体または細胞の作製方法（生産方法）は特に限定されるものではないが、例えば、上述した組換えベクターを宿主に導入して形質転換する方法を挙げることができる。また、形質転換の対象となる生物も特に限定されるものではなく、上記宿主細胞で例示した各種微生物、植物または動物を挙げることができる。

本発明にかかる形質転換体または細胞は、藻類もしくはその子孫、またはこれら由来の組織であることが好ましく、オオハネモ（Ｂｒｙｏｐｓｉｓ ｍａｘｉｍａ）であることが特に好ましい。

本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む形質転換体は、当該ポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、当該遺伝子が発現し得るように宿主細胞中に導入することにより得ることができる。

以下宿主細胞として植物を用いた場合を例にして説明する。なお本発明において使用する宿主細胞は植物に限定されるものではない。植物体の形質転換に用いられる組換え発現ベクターは、当該植物内で本発明にかかるポリヌクレオチドを発現させることが可能なベクターであれば特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、植物細胞内でポリヌクレオチドを構成的に発現させるプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター）を有するベクター、または外的な刺激によって誘導性に活性化されるプロモーターを有するベクターが挙げられる。

本発明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子など）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織など）または植物培養細胞、あるいは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどのいずれをも意味する。形質転換に用いられる植物としては、特に限定されず、単子葉植物綱または双子葉植物綱に属する植物のいずれでもよい。

植物への遺伝子の導入には、当業者に公知の形質転換方法（例えば、アグロバクテリウム法、遺伝子銃、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法など）が用いられる。例えば、アグロバクテリウムを介する方法と直接植物細胞に導入する方法が周知である。アグロバクテリウム法を用いる場合は、構築した植物用発現ベクターを適当なアグロバクテリウム（例えば、アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ））に導入し、この株をリーフディスク法（内宮博文著，植物遺伝子操作マニュアル，１９９０，２７−３１ｐｐ，講談社サイエンティフィック，東京）などに従って無菌培養葉片に感染させ、形質転換植物を得ることができる。また、Ｎａｇｅｌらの方法（Ｍｉｃｒｉｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、６７、３２５（１９９０））が用いられ得る。この方法は、まず、例えば発現ベクターをアグロバクテリウムに導入し、次いで、形質転換されたアグロバクテリウムをＰｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓ．Ｂ．Ｇｅｌｖｉｎら、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に記載の方法で植物細胞または植物組織に導入する方法である。ここで、「植物組織」とは、植物細胞の培養によって得られるカルスを含む。アグロバクテリウム法を用いて形質転換を行なう場合には、バイナリーベクター（ｐＢＩ１２１またはｐＰＺＰ２０２など）を使用することができる。

また、遺伝子を直接植物細胞または植物組織に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、遺伝子銃法が知られている。遺伝子銃を用いる場合は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい。このように調製した試料を遺伝子導入装置（例えばＰＤＳ−１０００（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）など）を用いて処理することができる。処理条件は植物または試料によって異なるが、通常は４５０〜２０００ｐｓｉ程度の圧力、４〜１２ｃｍ程度の距離で行なう。

遺伝子が導入された細胞または植物組織は、まずハイグロマイシン耐性などの薬剤耐性で選択され、次いで定法によって植物体に再生される。形質転換細胞から植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行なうことが可能である。

植物培養細胞を宿主として用いる場合は、形質転換は、組換えベクターを遺伝子銃、エレクトロポレーション法などで培養細胞に導入する。形質転換の結果得られるカルスやシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養または器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライドなど）の投与などによって植物体に再生させることができる。

遺伝子が植物に導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などによって行なうことができる。例えば、形質転換植物からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行なう。ＰＣＲは、前記プラスミドを調製するために使用した条件と同様の条件で行なうことができる。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動などを行ない、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ液などによって染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することによって、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素などによって標識したプライマーを用いてＰＣＲを行ない、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレートなどの固相に増幅産物を結合させ、蛍光または酵素反応などによって増幅産物を確認する方法も採用することができる。

本発明にかかるポリヌクレオチドがゲノム内に組み込まれた形質転換植物体がいったん得られれば、当該植物体の有性生殖または無性生殖によって子孫を得ることができる。また、当該植物体またはその子孫、あるいはこれらのクローンから、例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなどを得て、それらを基に当該植物体を量産することができる。したがって、本発明には、本発明にかかるポリヌクレオチドが発現可能に導入された植物体、もしくは、当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫、またはこれら由来の組織も含まれる。

このように、本発明にかかる形質転換体または細胞は、少なくとも、本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入されていればよいといえる。すなわち、組換え発現ベクター以外の手段によって生成された形質転換体または細胞も、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。

本発明の目的は、本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入されていることを特徴とする形質転換体または細胞を提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々のベクター種および導入方法に存するのではない。したがって、上記以外のベクター種および細胞種、ならびにベクター作製方法および細胞導入方法を用いて取得した形質転換体または細胞も本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。

（４−３）ポリペプチドの生産方法
本発明は、本発明にかかるポリペプチドを生産する方法を提供する。

一実施形態において、本発明にかかるポリペプチドの生産方法は、本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いることを特徴とする。

本実施形態の１つの局面において、本実施形態にかかるポリペプチドの生産方法は、上記ベクターを無細胞タンパク質合成系に用いることが好ましい。無細胞タンパク質合成系を用いる場合、種々の市販のキットを用いればよい。好ましくは、本実施形態にかかるポリペプチドの生産方法は、上記ベクターと無細胞タンパク質合成液とをインキュベートする工程を包含する。

本実施形態の他の局面において、本実施形態にかかるポリペプチドの生産方法は、組換え発現系を用いることが好ましい。組換え発現系を用いる場合、本発明にかかるポリヌクレオチドを組換え発現ベクターに組み込んだ後、公知の方法により発現可能な宿主に導入し、宿主内で翻訳されて得られる上記ポリペプチドを精製するという方法などを採用することができる。組換え発現ベクターは、プラスミドであってもなくてもよく、宿主に目的ポリヌクレオチドを導入することができればよい。好ましくは、本実施形態にかかるポリペプチドの生産方法は、上記ベクターを宿主に導入する工程を包含する。

このように宿主に外来ポリヌクレオチドを導入する場合、発現ベクターは、外来ポリヌクレオチドを発現するように宿主内で機能するプロモーターを組み込んであることが好ましい。組換え的に産生されたポリペプチドを精製する方法は、用いた宿主、ポリペプチドの性質によって異なるが、タグの利用等によって比較的容易に目的のポリペプチドを精製することが可能である。

本実施形態にかかるポリペプチドの生産方法は、本発明にかかるポリペプチドを含む細胞または組織の抽出液から当該ポリペプチドを精製する工程をさらに包含することが好ましい。ポリペプチドを精製する工程は、周知の方法（例えば、細胞または組織を破壊した後に遠心分離して可溶性画分を回収する方法）で細胞や組織から細胞抽出液を調製した後、この細胞抽出液から周知の方法（例えば、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー）によって精製する工程が好ましいが、これらに限定されない。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために用いられる。

別の実施形態において、本発明にかかるポリペプチドの生産方法は、本発明にかかるポリペプチドを天然に発現する細胞または組織から当該ポリペプチドを精製することを特徴とする。本実施形態にかかるポリペプチドの生産方法は、上述した抗体またはオリゴヌクレオチドを用いて本発明にかかるポリペプチドを天然に発現する細胞または組織を同定する工程を包含することが好ましい。また、本実施形態にかかるポリペプチドの生産方法は、上述したポリペプチドを精製する工程をさらに包含することが好ましい。

さらに他の実施形態において、本発明にかかるポリペプチドの生産方法は、本発明にかかるポリペプチドを化学合成することを特徴とする。当業者は、本明細書中に記載される本発明にかかるポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて周知の化学合成技術を適用すれば、本発明にかかるポリペプチドを化学合成できることを、容易に理解する。

以上のように、本発明にかかるポリペプチドを生産する方法によって取得されるポリペプチドは、天然に存在する変異ポリペプチドであっても、人為的に作製された変異ポリペプチドであってもよい。

変異ポリペプチドを作製する方法についても、特に限定されるものではない。例えば、部位特異的変異誘発法（例えば、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｇｅｎｅ １５２，２７１−２７５（１９９５）参照）、ＰＣＲ法を利用して塩基配列に点変異を導入し変異ポリペプチドを作製する方法、またはトランスポゾンの挿入による突然変異株作製法などの周知の変異ポリペプチド作製法を用いることによって、変異ポリペプチドを作製することができる。変異ポリペプチドの作製には市販のキットを利用してもよい。

このように、本発明にかかるポリペプチドの生産方法は、少なくとも、本発明にかかるポリペプチドのアミノ酸配列、または本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて公知慣用技術を用いればよいといえる。

つまり、本発明の目的は、本発明にかかるポリペプチドの生産方法を提供することにあるのであって、上述した種々の工程以外の工程を包含する生産方法も本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。

（４−４）検出器具
本発明は、種々の検出器具をも提供する。本発明にかかる検出器具は、本発明にかかるポリヌクレオチドもしくはフラグメントが基板上に固定化されたもの、または、本発明にかかるポリペプチドもしくは抗体が基板上に固定化されたものであり、種々の条件下において、本発明にかかるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現パターンの検出・測定などに利用することができる。

一実施形態において、本発明にかかる検出器具は、本発明にかかるポリヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドが基板上に固定化されていることを特徴とする。本実施形態の好ましい局面において、本実施形態にかかる検出器具は、いわゆるＤＮＡチップである。本明細書中で使用される場合、用語「ＤＮＡチップ」とは、合成したオリゴヌクレオチドを基板上に固定化した合成型ＤＮＡチップを意味するが、これに限定されず、ＰＣＲ産物などのｃＤＮＡを基板上に固定化した貼付け型ＤＮＡマイクロアレイもまた包含する。ＤＮＡチップとしては、例えば、本発明の遺伝子と特異的にハイブリダイズするプローブ（すなわち、本発明にかかるオリゴヌクレオチド）を基板（担体）上に固定化したＤＮＡチップが挙げられる。

プローブとして用いる配列は、ｃＤＮＡ配列の中から特徴的な配列を特定する公知の方法（例えば、ＳＡＧＥ法（Ｓｅｒｉａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ法）（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：１２６８，１９９７；Ｃｅｌｌ ８８：２４３，１９９７；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４８４，１９９５；Ｎａｔｕｒｅ ３８９：３００，１９９７；米国特許第５，６９５，９３７号）等が挙げられるがこれらに限定されない）によって決定することができる。

なお、ＤＮＡチップの製造には、公知の方法を採用すればよい。例えば、オリゴヌクレオチドとして、合成オリゴヌクレオチドを使用する場合には、フィトリオグラフィー技術と固相法ＤＮＡ合成技術との組み合わせにより、基板上でオリゴヌクレオチドを合成すればよい。一方、オリゴヌクレオチドとしてｃＤＮＡを用いる場合は、アレイ機を用いて基板上に張り付ければよい。

また、一般的なＤＮＡチップと同様、パーフェクトマッチプローブ（オリゴヌクレオチド）と、当該パーフェクトマッチプローブにおいて一塩基置換されたミスマッチプローブとを配置してポリヌクレオチドの検出精度をより向上させてもよい。さらに、異なるポリヌクレオチドを並行して検出するために、複数種のオリゴヌクレオチドを同一の基板上に固定化してＤＮＡチップを構成してもよい。

本実施形態にかかる検出器具に用いる基板の材質としては、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを安定して固定化することができるものであればよい。上記した基板以外には、例えば、ポリカーボネートやプラスティックなどの合成樹脂、ガラス等を挙げることができるが、これらに限定されない。基板の形態も特に限定されないが、例えば、板状、フィルム状等の基板を好適に用いることができる。本実施形態の好ましい局面において、本実施形態にかかる検出器具は、種々の生物またはその組織もしくは細胞から作製したｃＤＮＡライブラリーを標的サンプルとする検出に用いられる。

他の実施形態において、本発明にかかる検出器具は、本発明にかかるポリペプチドまたは抗体が基板上に固定化されていることを特徴とする。本実施形態の好ましい局面において、本実施形態にかかる検出器具は、いわゆるプロテインチップである。

本明細書中で使用される場合、用語「基板」は、目的物（例えば、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質）を担持することのできる物質が意図され、用語「支持体」と交換可能に使用される。好ましい基板（支持体）としては、ビーズ（例えば、ポリスチレンビーズ）、固相（例えば、ガラスチューブ、試薬ストリップ、ポリスチレン製のマイクロタイタープレートまたはアミノ基結合型のマイクロタイタープレート）などが挙げられるが、これらに限定されない。目的物をこれらの基板に固定化する方法は、当業者に周知であり、例えば、Ｎａｔｕｒｅ ３５７：５１９−５２０（１９９２）（本明細書中に参考として援用される）に記載される。

本実施形態にかかる検出器具に用いる基板の材質としては、ポリペプチドまたは抗体を安定して固定化することができるものであればよい。上記した基板以外には、例えば、ポリカーボネートやプラスティックなどの合成樹脂、ガラス等を挙げることができるが、これらに限定されない。基板の形態も特に限定されないが、例えば、板状、フィルム状等の基板を好適に用いることができる。

上記の方法以外のポリペプチドまたは抗体を基板上に固定化する方法としては、例えば、ニトロセルロース膜やＰＤＶＦ膜にポリペプチドや抗体をドットブロットの要領でスポットする物理吸着法、または、ポリペプチドや抗体の変性を軽減するために、スライドガラス上にポリアクリルアミドのパッドを接合して、これにポリペプチドや抗体をスポットする方法が挙げられる。さらに、ポリペプチドや抗体を基板表面に吸着させるだけでなく、強固に結合させるため、アルデヒド修飾ガラスを利用した方法（Ｇ．ＭａｃＢｅａｔｈ，Ｓ．Ｌ．Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８９，１７６０（２０００））を用いることもできる。また、基板上でのポリペプチドの配向を揃えて固定化する方法としては、オリゴヒスチジンタグを介して、ニッケル錯体で表面修飾した基板へ固定化する方法（Ｈ．Ｚｈｕ，Ｍ．Ｂｉｌｇｉｎ，Ｒ．Ｂａｎｇｈａｍ，Ｄ．Ｈａｌｌ，Ａ．Ｃａｓａｍａｙｏｒ，Ｐ．Ｂｅｒｔｏｎｅ，Ｎ．Ｌａｎ，Ｒ．Ｊａｎｓｅｎ，Ｓ．Ｂｉｄｌｉｎｇｍａｉｅｒ，Ｔ．Ｈｏｕｆｅｋ，Ｔ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｐ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｒ．Ａ．Ｄｅａｎ，Ｍ．Ｇｅｒｓｔｅｉｎ，Ｍ．Ｓｎｙｄｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３，２１０１（２００１））を用いることができる。

本実施形態の好ましい局面において、本実施形態にかかる検出器具は、種々の生物またはその組織もしくは細胞からの抽出液を標的サンプルとする検出に用いられる。

このように、本発明にかかる検出器具は、少なくとも、本発明にかかるポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、または本発明にかかるポリペプチドもしくは当該ポリペプチドと結合する抗体が支持体上に固定化されていればよいといえる。また、本発明にかかる検出器具は、本発明にかかるポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、または本発明にかかるポリペプチドもしくは当該ポリペプチドと結合する抗体が固定化されている基板を備えていればよいといえる。すなわち、これらの支持体（基板を含む）以外の構成部材を備える場合も、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。

つまり、本発明の目的は、本発明にかかるポリペプチドまたは本発明にかかるポリヌクレオチド、あるいは本発明にかかる抗体に結合するポリペプチドを検出する器具を提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々の支持体の種類、固定化方法に存するのではない。したがって、上記支持体以外の構成部材を包含する検出器具も本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。

（４−５）本発明にかかるポリペプチドを用いた抗体の精製
本発明で精製される抗体としては、動物に抗原を免疫することにより得られた抗血清、動物に抗原を免疫し免疫動物の脾臓細胞より作製したハイブリドーマ細胞が分泌するモノクローナル抗体、遺伝子組換え技術により作製された抗体、すなわち抗体遺伝子を挿入した抗体発現ベクターを宿主細胞へ導入することにより取得された抗体などいかなるものでもよい。また、抗体のＦｃ領域を融合させた融合タンパク質なども本発明では抗体として含まれる。なお精製される抗体としては、ニワトリ型抗体が好ましい。本発明にかかるポリペプチドは、ニワトリ抗体に結合する糖鎖との親和性が高いからである。なおニワトリ型抗体とは、抗原を免疫されたニワトリが生産する抗体（ＩｇＹ、ＩｇＥ等）、およびニワトリ以外の動物において生産されるニワトリ由来の抗体と同一構造を有する抗体をも含む。また上記抗体はモノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよい。その抗体については、「（３）抗体」の記載を適宜参照できる。

本発明にかかる抗体の精製方法は、例えば本発明にかかるポリペプチドを固定した担体を用いたクロマトグラフィーにより達成される。本発明にかかるポリペプチドが固定化される担体としては、アガロース、アクリル系合成樹脂のポリマー等があげられ、好ましくはアクリル酸エステルのポリマーがあげられる。そのほか市販のアフィニティー担体を適宜選択の上使用すればよい。例えば、ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰ ｃｏｌｕｍｎｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐ製）、ＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ Ｌａｂ Ｐａｃｋｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐ製）が利用可能である。また、高速液体クロマトグラフィー（以下、「ＨＰＬＣ」と表記する）システムを使用する場合は、一般に市販されているＨＰＬＣシステムであれば、いかなるものでもよい。例えば、ＬＣ−６Ａ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製）などがあげられる。固定化の方法については、担体に応じて適宜最適な方法を適用すればよい。

以下にＨＰＬＣシステムを使用した精製方法の一例を示す。溶離液は、１０〜１００（ｍｍｏｌ／ｌ）トリス−塩酸緩衝液、１０〜１００（ｍｍｏｌ／ｌ）リン酸緩衝液などを用いる。ｐＨは７〜８程度の間が好ましい。まず、１０〜１００（ｍｍｏｌ／ｌ）トリス−塩酸緩衝液、または１０〜１００（ｍｍｏｌ／ｌ）リン酸緩衝液などの初期緩衝液でカラムを充分に平衡化する。ＨＰＬＣシステムにより試料を通塔し、溶出糖を含む１０〜１００（ｍｍｏｌ／ｌ）トリス−塩酸緩衝液、または１０〜１００（ｍｍｏｌ／ｌ）リン酸緩衝液を用いて溶出させる。溶出に用いる糖は、適宜検討の上適用すればよいが、本発明にかかるポリペプチドを固定化した場合は、溶出に用いる糖として、０．０２〜０．５ｍｏｌ／ｌ Ｄ−マンノースや０．０２〜０．５ｍｏｌ／ｌ メチル−α−Ｄ−マンノシドを用いる。溶出はステップワイズ法、またはグラジエント法により溶出する。タンパク質（抗体）は、例えば紫外線吸収、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等）、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法などの方法により検出することができる。

なお、本発明にかかる抗体の精製方法は、本発明にかかるポリペプチドの代わりに、または本発明にかかるポリペプチドに加えて、従来公知のレクチンであるＣａｒｎｉｎを用いることによっても達成される。つまり本発明にかかる抗体の精製方法は、上記課題を解決すべく、上記本発明にかかるポリペプチドを用いる方法、上記本発明にかかるポリペプチドに加えさらにＣａｒｎｉｎを用いる方法、または、上記本発明にかかるポリペプチド、およびＣａｒｎｉｎのいずれか一方または両方を用いる方法であってもよい。

また本発明にかかる担体についても、同様に、上記本発明にかかるポリペプチドが固定化されているもの、上記本発明にかかるポリペプチドに加えさらにＣａｒｎｉｎが固定化されているもの、または、上記本発明にかかるポリペプチド、およびＣａｒｎｉｎのいずれか一方または両方を用いるものであってもよい。藻類（Ｃａｒｐｏｐｅｌｔｉｓ ｆｌａｂｅｌｌａｔａ＝Ｃ．ｐｒｏｒｉｆｅｒａ）由来Ｃａｒｎｉｎについては、『Ｈｏｒｉ，Ｋ．，Ｍａｔｓｕｄａ，Ｈ．，Ｍｉｙａｚａｗａ，Ｋ．ａｎｄ Ｉｔｏ，Ｋ．：Ａ ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｒｅｄ ａｌｇａ Ｃａｒｐｏｐｅｌｔｉｓ ｆｌａｂｅｌｌａｔａ．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６，１３３５−１３３８（１９８７）』に記載されており、本明細書中に参考として援用される。

本発明は、以下の実施例によってさらに詳細に説明されるが、これに限定されるべきではない。

［実施例１：藻類（Ｂｒｙｏｐｓｉｓ ｍａｘｉｍａ）からポリペプチド（ＢＭＬ−１７）の単離］
（抽出液の調製および硫安沈殿）
緑藻オオハネモ（Ｂｒｙｏｐｓｉｓ ｍａｘｉｍａ）の凍結乾燥粉末１２．２ｇに２００ｍｌの２０ｍＭＰＢＳＡ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ ｓｏｄｉｕｍ ａｚｉｄｅ；０．２％アジ化ナトリウム入り２０ｍＭ ＰＢＳ；ｐＨ７．０）を加え、４℃で一晩撹拌した後、遠心分離を行なって抽出液を得た。この操作を３回繰り返し、抽出液１〜３を得た。

上記抽出液に硫安粉末を２０％飽和となるように少しずつ撹拌しながら加え、この混合液を４℃で一晩静置した。これを遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，３０分間）して得られた沈殿を、ＰＢＳＡに溶解後、同溶媒に対し十分透析した。透析終了後、内液を遠心分離し、得られた上清を２０％飽和硫安塩析沈殿画分とした。一方、２０％飽和硫安塩析処理で得られた上清に、硫安粉末を６０％飽和となるように加え、同様に処理して、２０〜６０％飽和硫安塩析沈殿画分を得た。

（凝集活性の検討）
赤血球凝集活性は、マイクロタイター法を用いて測定した。生理食塩水にて調製した各精製画分溶液の２倍段階希釈液、各２５μｌをマイクロタイタープレート上に作製した。各希釈液に２％赤血球浮遊液２５μｌを加えて軽く撹拌し、室温で１．５時間静置後、凝集能を観察した。凝集能は肉眼で判定し、赤血球の５０％以上が凝集している場合を陽性とした。凝集活性は凝集素価（力価）、すなわち凝集活性を示す最大希釈液のタンパク質の濃度で示した。

本実施例においては、赤血球としてトリプシン処理ウサギ赤血球（ＴＲＢＣ）を用いた。なお、赤血球浮遊液の調製は次のように行なった。まず、実験室で飼育中のウサギの耳から血液２ｍｌを採取し、これを約５０ｍｌの生理食塩水で３回洗浄後、５０ｍｌの生理食塩水を加えて２％のウサギ赤血球浮遊液を調製した。これに１／１０容の０．５％トリプシン−生理食塩水を加え、３７℃で１．５時間静置した。このトリプシン処理赤血球を生理食塩水で３回洗浄後、４５ｍｌの生理食塩水を加え、トリプシン処理２％ウサギ赤血球浮遊液（ＴＲＢＣ）とした。

トリプシン処理ウサギ赤血球（ＴＲＢＣ）に対する凝集活性成分を検討したところ、上記抽出液１〜３に同凝集活性が検出された。抽出液１の総凝集活性（ＴＨＡ）、および可溶性タンパク質の含量は、抽出液２および３に比べて高い値を示したことから、凝集活性成分の多くは、抽出液１に回収されるということがわかった。またＴＨＡおよび可溶性タンパク質の多くが２０〜６０％飽和硫安塩析沈殿画分に回収されているということがわかった。

（ゲルろ過）
抽出液１の２０〜６０％飽和硫安塩析沈殿画分を、ゲルろ過カラム（東ソー社製、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ−５５カラム、４．４×９００ｃｍ、Ｖｔ＝１３６８ｍｌ）に供した。具体的には、同沈殿画分１６ｍｌを、２０ｍＭ ＰＢＳＡ（ｐＨ７．０）で平衡化したＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ−５５カラムに添加し、ＰＢＳＡを用いて流速６０ｍｌ／ｈで溶出した。溶出液は１５ｍｌ分取し、各フラクションのＵＶ２８０ｎｍおよび凝集活性を測定した。

（疎水クロマトグラフィー）
ゲルろ過で得られた凝集活性を有する画分１１０ｍｌを、０．８６Ｍ硫安を含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析を行ない、内液８０ｍｌを得た。得られた内液を、同緩衝液で平衡化したＴＳＫｇｅｌ Ｐｈｅｎｙｌ−５ＰＷカラム（７．５×７５ｍｍ）に注入し、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液，ｐＨ７．０（溶媒Ａ）と、０．８６Ｍ硫安を含む同緩衝液（溶媒Ｂ）の２液を用いる濃度勾配法により溶出した。濃度勾配［溶媒Ｂ１００％（２０分）、溶媒：Ｂ０％−溶媒Ａ１００％（２０−６０分）、溶媒Ａ１００％（６０−９０分）］は、グラジェントプログラマー（ＣＣＰコントローラー、東ソー社製）を用いて設定し、流速は０、５ｍｌ／分とした。溶出液は、ＵＶ２８０ｎｍをモニターするとともに、各ピークを分取し、凝集活性を測定した。

（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
上記疎水クロマトグラフィーで得られた凝集活性を有する画分（精製画分）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ゲル）に供した。

結果を図７に示した。同図中レーン１は分子量マーカー（各バンドは上から９４ｋＤａ、６７ｋＤａ、４３ｋＤａ、３０ｋＤａ、２０．１ｋＤａ、１４．４ｋＤａ）を示し、レーン２は非還元下（２−メルカプトエタノール処理なし）の精製画分を示し、レーン３は還元下（２−メルカプトエタノール処理あり）の精製画分を示し、同図中レーン４は分子量マーカー（各バンドは上から１６．９ｋＤａ、１４．４ｋＤａ、１０．７ｋＤａ、８．２ｋＤａ、６．２ｋＤａ、２．５ｋＤａ）を示している。なおタンパク染色はＣＢＢ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌｕｅ Ｒ−２５０）染色を行なった。

図７より精製画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて非還元下で比較分子量約１７ｋＤａの、還元下で１８ｋＤａの単一バンドを与えるものであった。また還元下、非還元下で分子量が異なることから、同精製画分内にジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）の存在が示唆された。上記精製過程により最終的に２．１ｍｇの精製画分が得られた。本発明者らは、当該精製画分を「ＢＭＬ−１７」と命名した。

（ＢＭＬ−１７の分子量の検討）
ＢＭＬ−１７、およびピリジルエチル化（ＰＥ）処理したＢＭＬ−１７の０．１ＴＦＡ−７０％アセトニトリル溶液（５００μｇ／ｍｌ）を、エレクトロンスプレイイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ、ＬＣＱ、Ｆｉｎｉｇａｎ）に供し分子量を測定した。

ＰＥ処理は、以下のようにした。ＢＭＬ−１７（２００μｇ）を、１００μｌの緩衝液（６Ｍグアニジン塩酸塩および１ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．２５Ｍ トリス−塩酸緩衝液、ｐＨ８．５）に溶解し、２００μｇのジチオスレイトールを添加して、容器内を窒素で置換し、２時間静置した。次に２μｌの４−ビニルピリジン（ナカライテスク製）を添加して、よく混合した。この混合溶液を暗所で一晩静置して十分に反応させた後、超純水に対して十分透析を行ない、塩および過剰の試薬を除去し、内液を「ピリジルエチル化（ＰＥ）処理したＢＭＬ−１７」とした。

ＢＭＬ−１７の比較分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から、非還元条件下では約１７ｋＤａ、還元条件下では１８ｋＤａと推定された。上記ＥＳＩ−ＭＳでの分子量測定値は１７，２９３Ｄａであった。また、ＰＥ処理したＢＭＬ−１７の分子量は、１７，９４５Ｄａであった。両者の分子量の差は６個のピリジルエチル基の分子量にほぼ相当することから、ＢＭＬ−１７は、システイン６残基を含むと推定された。

（ＢＭＬ−１７のアミノ酸組成分析）
ＢＭＬ−１７のアミノ酸組成分析は、ダブシル化法を用いて行なった。なおアミノ酸組成分析には、ＰＥ処理したＢＭＬ−１７を用いた。

上記アミノ酸組成分析の結果、ＢＭＬ−１７のアミノ酸組成は以下の通りであった。アスパラギンまたはアスパラギン酸（Ａｓｘ）が１１．８ｍｏｌ％、グルタミンまたはグルタミン酸（Ｇｌｘ）が６．８ｍｏｌ％、セリン（Ｓｅｒ）が９．６ｍｏｌ％、トレオニン（Ｔｈｒ）が６．０ｍｏｌ％、グリシン（Ｇｌｙ）が１１．４ｍｏｌ％、アラニン（Ａｌａ）が７．９ｍｏｌ％、プロリン（Ｐｒｏ）が３．４ｍｏｌ％、バリン（Ｖａｌ）が６．９ｍｏｌ％、アルギニン（Ａｒｇ）が３．９ｍｏｌ％、メチオニン（Ｍｅｔ）が２．７ｍｏｌ％、イソロイシン（Ｉｌｅ）が４．５ｍｏｌ％、ロイシン（Ｌｅｕ）が４．４ｍｏｌ％であり、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）が３．７ｍｏｌ％であり、リジン（Ｌｙｓ）が４．６ｍｏｌ％であり、ヒスチジン（Ｈｉｓ）が２．６ｍｏｌ％であり、チロシン（Ｔｙｒ）が４．９ｍｏｌ％であり、トリプトファン（Ｔｒｐ）が３．４ｍｏｌ％であった。なおシステイン（Ｃｙｓ）については分析を行なわなかった。

以上の結果からＢＭＬ−１７は、従来公知のレクチンと同様にグリシンおよび酸性アミノ酸を多く含むものであった。またセリンを多量に含むものであった。

（ＢＭＬ−１７のＮ末端アミノ酸分析）
ＢＭＬ−１７のＮ末端アミノ酸配列はエドマン法によるヒューレットパッカード社製の自動分析装置：プロテインシーケンサー（Ｇ１００５Ａ型）を用いて分析を行なった。なおＢＭＬ−１７の１００ｐｍｏｌ相当量を上記Ｎ末端アミノ酸分析に用いた。

図８にＢＭＬ−１７のＮ末端アミノ酸の配列（図中ＢＭＬと表記）および、これまでに単離されたハネモ属レクチン（ＢＣＬ、ＢＰＬ、Ｂｒｙ−１、Ｂｒｙ−２）のＮ末端アミノ酸の配列を示した。同図より、ＢＭＬ−１７は従来公知のハネモ属由来のレクチンとはＮ末端アミノ酸配列が全く異なる新規レクチンであるということが分かった。ＢＭＬ−１７のＮ末端アミノ酸の配列を配列番号１３に示し、ＢＣＬのＮ末端アミノ酸の配列を配列番号１４に示し、ＢＰＬのＮ末端アミノ酸の配列を配列番号１５に示し、Ｂｒｙ−１のＮ末端アミノ酸の配列を配列番号１６に示し、Ｂｒｙ−２のＮ末端アミノ酸の配列を配列番号１７に示した。

（ＢＭＬ−１７の温度安定性およびｐＨ安定性）
トリプシン処理ウサギ赤血球（ＴＲＢＣ）に対する凝集活性を指標として、ＢＭＬ−１７の温度安定性およびｐＨ安定性の検討を行なった。

ＢＭＬ−１７の凝集活性は６０℃以上、３０分間の熱処理によって低下したことから、耐熱性は低いということが分かった。また同活性はｐＨ４．０〜１１．０で安定であった。

（ＢＭＬ−１７の２価金属イオン要求性）
ＢＭＬ−１７の凝集活性は、ＥＤＴＡ処理後も変化しなかった。またＥＤＴＡ処理溶液の凝集活性は２価金属イオンを添加後も変化しなかったことからことから、ＢＭＬ−１７は凝集活性の発現に２価金属イオンを必要としないということが分かった。

（赤血球凝集阻害試験）
赤血球凝集阻害試験は以下のようにして行なった。まず生理食塩水にて調製した糖溶液の２倍段階希釈液、各２５μｌをマイクロタイタープレート上に作製した。なお、使用した糖類の原液の濃度は単糖および少糖の場合は１００ｍＭ、糖タンパク質の場合は２ｍｇ／ｍｌとした。これに凝集素価（力価）４に調整したＢＭＬ−１７溶液、各２５μｌを加えて軽く撹拌後、室温で１．５時間静置した。これに２５μｌのＴＲＢＣを加え、室温で２時間静置後、凝集阻害能を観察した。凝集阻止能の有無は肉眼で判定し、赤血球の約１００％が凝集していない場合を陽性とした。凝集阻害能（凝集阻害活性）は、最小阻害濃度すなわち凝集阻害能を示す最小濃度（ｍＭまたはｍｇ／ｍｌ）で表示した。

なお、本赤血球凝集阻害試験には、単糖類および少糖類としてＤ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ−キシロース、Ｌ−フコース、フルクトース、ラクトース、ラフィノースを用い、糖タンパク質としてムチン（牛顎下腺）および該アシアロ体、フェツエン（タイプＩＩＩ、子牛血清）および該アシアロ体、トランスフェリン（ヒト）および該アシアロ体、α１−酸性糖タンパク質（ヒト）および該アシアロ体、並びにイーストマンナンを用いた。

結果を表２に示す。ＢＭＬ−１７の凝集活性は、単糖類の中ではＤ−マンノースによって阻害された。二糖類では阻害されなかった。また、糖タンパク質のなかではトランスフェリン、フニツィン、ムチン、およびそれらのアシアロ体、並びにイーストマンナンにより阻害されることがわかった。糖タンパク質の阻止能はムチンを除きシアロ体よりもアシアロ体の方が強かった。また、イーストマンナンが最も強い阻害能を示した。以上の結果から、ＢＭＬ−１７はＮ−グリコシド型糖鎖の高マンノース型糖鎖に高い親和性を有するということが示唆された。

（糖鎖結合性試験）
供試糖鎖としてピリジルアミノ化糖鎖（以下、「ＰＡ化糖鎖」という）を４４種使用した。より具体的には、Ｎ−グリコシド型糖鎖の複合型１２種、高マンノース型１３種、混成型３種、共通コア構造１種および共通コア関連糖鎖１種、糖脂質系糖鎖８種、オリゴマンノース５種およびＰＡ−マンノースを用いた。上記供試糖を表３、４に示した。表３、４には各種供試糖の糖鎖構造と、その右側に各種糖鎖の番号（１〜４４）を付している。これは各種供試糖このうちＰＡ−オリゴマンノースを除き、他のＰＡ化糖鎖は市販品（タカラバイオ社製、Ａｊｉｎｏｋｉ社製）を用いた。ＰＡ−オリゴマンノースは、発明者らが合成したものを用いた。

当該糖鎖結合性試験は、遠心限外ろ過法を用いた。具体的には以下のようにした。５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で調製した５００ｎＭ ＢＭＬ−１７溶液９０μｌ（４５ｐｍｏｌ）と３００ｎＭ ＰＡ化糖鎖溶液１０μｌ（３ｐｍｏｌ）とを軽く混合後、室温で６０分間、保温した。この反応液を微量遠心限外ろ過器（ＮａｎｏＳｐｉｎＰｌｕｓ、分画分子量１０，０００、ＧｅｌｍａｎＳｃｉｅｎｃｅ）を用いて遠心ろ過（１０，０００ｇ、３０秒）し、ろ液の２０μｌをＨＰＬＣに供し、溶出するＰＡ化糖鎖量を測定して遊離糖鎖量とした。次に、５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）の９０μｌとＰＡ化糖鎖水溶液１０μｌを混合後、上記と同様の処理を行ない、その後のろ液の２０μｌをＨＰＬＣに供し、溶出するＰＡ化糖鎖量を測定して添加糖鎖量とした。結合糖鎖量は、添加糖鎖量から反応後の遊離糖鎖量を差し引いた値として算出した。ＢＭＬ−１７の糖鎖結合活性は、結合率、すなわち添加糖鎖量に対する結合糖鎖量の割合（Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ（％））で示した。なお、当該糖鎖結合性試験は各糖鎖につき２回ずつ行ない、糖鎖結合活性はその平均値とした。

結果を表５に示す。なお表５における「Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ」の欄の１〜４４は、表３、４の各種供試糖の番号に対応する。

表５からＢＭＬ−１７は、供試糖鎖中、Ｎ−グリコシド型糖鎖の高マンノース型糖鎖（番号１８〜２８）に対して、高い結合活性を有するということがわかった。高マンノース型糖鎖に対する結合活性は、非還元末端にα１−２マンノース（以下「α１−２Ｍａｎ」と表記）残基を最も多く有する糖鎖（番号２０）が最も高かったが、非還元末端のα１−２Ｍａｎ残基の有無に関わらず結合することがわかった。またＢＭＬ−１７は、Ｎ−グリコシド型糖鎖の共通コア構造（番号１３）およびＬ−Ｆｕｃ含有共通コア構造（番号１４）に結合するだけでなく、分岐糖鎖部分の遊離のマンノペンタサッカライド（番号３５）とも弱いながら結合した。しかし、共通コア構造や分岐糖鎖を構成する遊離のトリマンノース（３４）やマンノジサッカライド（３１〜３３）とは全く結合しなかった。さらに、番号１３の糖鎖（結合活性１９．８％）と番号３４の糖鎖（同０％）および番号１８の糖鎖（同３２．７％）、番号３５の糖鎖（同１４．２％）間での結合活性の比較から、ＢＭＬ−１７の高マンノース型糖鎖結合性に関して分岐糖鎖部分を認識するが、還元末端部分のＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ部分も同結合に補助的に寄与していることがわかった。さらに、ＢＭＬ−１７の高マンノース型糖鎖との結合には、共通コア構造のＭａｎα１−６アームにＭａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）残基が付加したもの（番号２８）が最小糖鎖構造として必要であることが、糖鎖番号２８（同１９．１％）と番号２９（同０％）および番号３０（同０％）との間の結合活性の比較から示唆された。なお、Ｎ−グリコシド型糖鎖の複合型糖鎖（番号１、５、６、１０）とも弱い結合活性を示した。これは、ＢＭＬ−１７が共通コア構造を弱いながら認識することに起因すると思われる。

これまでに明らかにされている海藻由来の高マンノース型糖鎖特異的レクチンは、いずれもマンノースを含む単糖、オリゴマンノース、高マンノース型糖鎖の共通コア構造とは結合しない。また、それらは高マンノース型糖鎖の分岐部分を認識部位とし、非還元末端にα１−２Ｍａｎ残基を持たないものに強い結合活性を示すもの、非還元末端にα１−２Ｍａｎ残基を持つものとのみ結合活性を示すものの２種類に分類されている。しかしＢＭＬ−１７は高マンノース型糖鎖結合特異性を持つが、コア構造およびオリゴマンノースにも弱い親和性を示し、非還元末端のα１−２Ｍａｎ残基の有無に関わらず結合することから、従来公知の高マンノース型糖鎖特異的レクチンとは異なる新規レクチンであるということがわかった。したがって、ＢＭＬ−１７は新規の糖鎖プローブとして応用価値が高いといえる。

なお興味深いことに、ゲルろ過における精製画分の凝集活性は、Ｄ−Ｍａｎおよびイーストマンナンでは全く阻止されず、同画分にはＣｏｎ Ａ結合性の糖タンパク質の存在が、ウエスタンブロッティングの結果により認められた。したがって、レクチンタンパク質は混在する高マンノース型糖鎖含有の糖タンパク質と会合し、疎水環境下でのみ解離する可能性も示唆された。

ところで、「レクチン」とは一般に、「動植物あるいは細菌で見出される免疫学的産物にあらざる糖結合性タンパク質で、結合価が２価以上で動植物細胞を凝集し、多糖類や複合糖質を沈降させ、その結合特異性は単糖やオリゴ糖を用いた凝集もしくは沈降阻害試験等で規定することができるもの」とされている。

［実施例２：ＢＭＬ−１７のｃＤＮＡのクローニング］
以下に示す操作を行なって、ｃＤＮＡライブラリーからＢＭＬ−１７のｃＤＮＡのクローニングを行なった。なお特に示さない限り、標準の条件にて操作を行なった。また各種キットを用いた場合においては、当該キットのマニュアルに記載された方法に準じて操作を行なった。

オオハネモ（Ｂｒｙｏｐｓｉｓ ｍａｘｉｍａ）の培養藻体から、ＡＧＰＣ法（Ａｃｉｄ Ｇｕａｎｉｄｉｕｍｕ−Ｐｈｅｎｏｌ−Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ ｍｅｔｈｏｄ）を利用して全ＲＮＡを抽出後、ＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ−ｄｔ３０ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ製）を用いてｍＲＮＡを精製した。

次にＲＴ−ＰＣＲを用いて２本鎖ｃＤＮＡを合成し、プラスミドベクターにｐＢＳＫ（＋）／Ｅ／Ｎ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）の導入した。当該プラスミドベクターをコンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂ）にＥｌｅｃｔｒｏＭａｘＤＨ１０Ｂ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ製）を用いて導入し、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。

次に、ＢＭＬ−１７のＮ末端領域のアミノ酸配列情報を基に縮重プライマーを設計した。ＢＭＬ−１７のＮ末端領域１０〜２０残基目のアミノ酸配列（ＤＭＦＡＫＩＰＭＰＧＨ：配列番号３）を基に縮重プライマーＳＰ１−１７を設計した。またＢＭＬ−１７のＮ末端領域４６〜５４残基目のアミノ酸配列（ＡＫＧＭＶＥＡＹ：配列番号４）を基に縮重プライマーＳＰ２−１７を設計した。またＢＭＬ−１７のＮ末端領域３〜１３残基目のアミノ酸配列（ＹＱＤＰＶＴＳＤＭＦＥ：配列番号５）を基に縮重プライマーＳＰ３−１７を設計した。

ＳＰ１−１７の塩基配列は、ＧＡＣＡＴＧＴＴＣＧＣＮＡＡＧＡＴＹＣＣＮＡＴＧＣＣＮＧＧＮＣＡ（配列番号６）である。

ＳＰ２−１７の塩基配列は、ＧＴＡＣＧＣＣＴＣＧＡＣＣＡＣＣＡＣＧＣＣＣＴＴＡＧＣＡＴＣＣＡ（配列番号７）である。

ＳＰ３−１７の塩基配列は、ＣＣＡＡＧＡＣＣＣＣＧＴＡＡＣＴＴＣＡＧＡＴＡＴＧＴＴＣＧ（配列番号８）である。

ＳＰ１−１７とベクターの塩基配列から設計したプライマーＡＰ２を用いて３’ＲＡＣＥを行ない、３’側の未知領域を決定した。

またＳＰ２−１７とベクターの塩基配列から設計したプライマーＡＰ３を用いて５’ＲＡＣＥを行ない、５’側の未知領域を決定した。

さらにＳＰ３−１７とＡＰ３を用いてｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行なった。

なおＡＰ２の塩基配列は、ＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＡＣＡＡＡＡＧＣＴＧＧＡ（配列番号９）である。

またＡＰ３の塩基配列は、ＴＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧＡ（配列番号１０）である。

得られたＰＣＲ産物を低融点アガロースにより精製後、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＲＯＭＥＧＡ製）を用いてサブクローニングを行ない、得られたクローンから精製プラスミドを回収して、ダイデオキシ法により塩基配列の決定を行なった。

ＢＭＬ−１７のｃＤＮＡの塩基配列、およびその塩基配列から求めたアミノ酸配列を図２に示す。クローニングされたＢＭＬ−１７のｃＤＮＡは、２３アミノ酸残基からなるシグナルペプチドの一部（図２中、四角で囲んだ部分）と、１６８アミノ酸残基からなるポリペプチドをコードしていることが分かった。なお上記クローニングされたｃＤＮＡの全塩基配列を配列番号１１に示し、その推定アミノ酸配列を配列番号１２に示す。またＢＭＬ−１７の塩基配列を配列番号１に示し、その推定アミノ酸配列を配列番号２に示した。

［実施例３：ニワトリ卵黄抗体（ニワトリ型ＩｇＹ抗体）と結合するレクチンの検索］
（供試レクチン）
藻類（海藻）由来レクチン：Ｅｕｃｈｅｕｍａ ｓｅｒｒａ由来レクチンＥＳＡ−２（Ｋａｗａｋｕｂｏ，Ａ．，Ｍａｋｉｎｏ，Ｈ．，Ｏｈｎｉｓｈｉ，Ｊ．，Ｈｉｒｏｈａｒａ，Ｈ．ａｎｄ Ｈｏｒｉ，Ｋ．：Ｔｈｅ ｍａｒｉｎｅ ｒｅｄ ａｌｇａ Ｅｕｃｈｅｕｍａ ｓｅｒｒａ Ｊ．Ａｇａｒｄｈ，ａ ｈｉｇｈ ｙｉｅｌｄｉｎｇ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｔｗｏ ｉｓｏｌｅｃｔｉｎｓ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｃｏｌ．，９，３３１−３３８（１９９７）参照）、Ｓｏｌｉｅｒｉａ ｒｏｂｕｓｔａ由来レクチンＳｏｌｎｉｎ Ｂ（Ｈｏｒｉ，Ｋ．，Ｉｋｅｇａｍｉ，Ｓ．，Ｍｉｙａｚａｗａ，Ｋ．ａｎｄ Ｉｔｏ，Ｋ．：Ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ ａｎｄ ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｉｓｏａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｒｅｄ ａｌｇａ Ｓｏｌｉｅｒｉａ ｒｏｂｕｓｔａ．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７，２０６３−２０６７（１９８８）参照。）、Ｂｏｏｄｌｅａ ｃｏａｃｔａ由来レクチンＢＣＬ（Ｈｏｒｉ，Ｋ．，Ｍｉｙａｚａｗａ，Ｋ．，ａｎｄ Ｉｔｏ，Ｋ．：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｓｏａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｓ ｆｒｏｍ ａ ｍａｒｉｎｅ ｇｒｅｅｎ ａｌｇａ Ｂｏｏｄｌｅａ ｃｏａｃｔａ（Ｄｉｃｋｉｅ）Ｍｕｒｒａｙ ｅｔ Ｄｅ Ｔｏｎｉ．Ｂｏｔ．Ｍａｒ．，２９，３２３−３２８（１９８６）参照。）、Ｃａｒｐｏｐｅｌｔｉｓ ｆｌａｂｅｌｌａｔａ由来レクチンＣａｒｎｉｎ（Ｈｏｒｉ，Ｋ．，Ｍａｔｓｕｄａ，Ｈ．，Ｍｉｙａｚａｗａ，Ｋ．ａｎｄ Ｉｔｏ，Ｋ．：Ａ ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｒｅｄ ａｌｇａ Ｃａｒｐｏｐｅｌｔｉｓ ｆｌａｂｅｌｌａｔａ．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６，１３３５−１３３８（１９８７）参照。）、Ｈｙｐｎｅａ ｊａｐｏｎｉｃａ由来レクチンＨｙｐｎｉｎ Ａ−１（Ｈｏｒｉ，Ｋ．，Ｍｉｙａｚａｗａ，Ｋ．，Ｆｕｓｅｔａｎｉ，Ｎ．，Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｋ．ａｎｄ Ｉｔｏ，Ｋ．：Ｈｙｐｎｉｎｓ，ｌｏｗ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｐｅｐｔｉｄｉｃ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｍａｒｉｎｅ ｒｅｄ ａｌｇａ，Ｈｙｐｎｅａ ｊａｐｏｎｉｃａ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，８７３，２２８−２３６（１９８６）；Ｈｏｒｉ，Ｋ．，Ｍａｔｓｕｂａｒａ，Ｋ．ａｎｄ Ｍｉｙａｚａｗａ，Ｋ．：Ｐｒｉｍａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｍａｒｉｎｅ ｒｅｄ ａｌｇａ，Ｈｙｐｎｅａ ｊａｐｏｎｉｃａ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２８，２２６−２３６（２０００）参照）、ＢＭＬ−１７、Ｂｒｙｏｐｓｉｓ ｐｌｕｍｏｓａ由来レクチンＢＰＬ−５４、Ｃｏｄｉｕｍ ｆｒａｇｉｌｅ由来レクチンＣＦＡ。

陸上植物由来レクチン：Ｃａｎａｖａｌｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ由来レクチンＣｏｎ Ａ（Ｅｄｅｌｍａｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，ＵＳＡ，６２，２５８０−２５８５（１９７２））、Ｕｌｅｘ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ由来レクチンＵＥＡ−Ｉ（Ｈｏｒｅｊｓｉ，Ｖ．ａｎｄ Ｋｏｃｏｕｒｅｋ，Ｊ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，３３６，３２９−３３７（１９７４））、Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ由来レクチンＰＮＡ（Ｌｏｔａｎ，Ｒ．Ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５０，８５１８−８５２３（１９７５））、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ由来レクチンＳＢＡ（Ｐｅｒｅｉｒａ，Ｍ．Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｒａｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，３７，８９−１０２（１９７４））、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ由来レクチンＷＧＡ（Ｐｅｕｍａｎｓ，Ｗ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔａ，１５４，５６２−５６８（１９８２））、Ｍａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ由来レクチンＭＡＨ（Ｋａｗａｇｕｃｈｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４９，２７６８−２７９２（１９７４））、Ｇａｌａｎｔｈｕｓ ｎｉｖａｌｉｓ由来レクチンＧＮＡ（Ｖａｎ Ｄａｍｍｅ，Ｅ．Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ ｌｅｔｔ．，２１５，１４０−１４４（１９８７））。

なお、上記陸上植物由来レクチンは、コスモバイオ株式会社等から購入した。

（方法）
上記各種レクチンとニワトリ卵黄抗体（ニワトリ型ＩｇＹ抗体）との結合性を調べた。簡単には、表面プラズモン共鳴法（以下、「ＳＰＲ法」という）を原理とするＢｉａｃｏｒｅ ２０００（ＢＩＡＣＯＲＥ社）を用いて、リガンドとしてニワトリ卵黄抗体（ニワトリ型ＩｇＹ抗体）をセンサーチップ上に固定し、アナライトとして各レクチン溶液を用い、マニュアルに従って測定した。ＳＰＲ法では、生体分子を標識することなく、生体分子間の特異的な相互作用を微量かつ短時間で定量的に測定できる。本法では、リガンドをセンサーチップ表面上に固定化し、これに作用する物質（アナライト）を含む溶液を添加すると、分子の結合・解離により生ずる微量の質量変化がＳＰＲシグナルの変化として検出される。質量変化はレゾナンスウユニット（ＲＵ）で表され、１０００ＲＵは共鳴による反射角度０．１°の変化に相当し、アナライトがリガンドに１ｎｇ／ｍｍ^２結合したことを意味する。センサーチップ表面の金薄膜上にはデキストランがコーティングされており、主としてこのデキストラン内に導入されたカルボキシル基を介してリガンドを固定化する。

なお、アナライトとして供試したレクチンは、可能なかぎり互いに糖結合特異性が異なるものを選択し、リガンドとして供試したニワトリ卵黄抗体（ニワトリ型ＩｇＹ抗体）は、ニワトリ卵黄よりＥｇｇｃｅｌｌｅｎｔ Ｃｈｉｃｋｅｎ ＩｇＹ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．ＵＳＡ）を用いて精製したものを使用した。

（結果）
上記検討の結果、藻類（海藻）由来レクチンであるＥＳＡ−２、Ｓｏｌｎｉｎ Ｂ、ＢＣＬ、Ｃａｒｎｉｎ、Ｈｙｐｎｉｎ Ａ−１、ＢＭＬ−１７、および陸上植物由来レクチンであるＣｏｎ Ａ、ＵＥＡ−Ｉがニワトリ卵黄抗体（ニワトリ型ＩｇＹ抗体）と結合するということが分かった。これら結合性を示したものは、Ｈｙｐｎｉｎ Ａ−１とＵＥＡ−Ｉを除き、すべて高マンノース型糖鎖結合性をもつレクチンであった。

［実施例４：ニワトリ卵黄抗体（ニワトリ型ＩｇＹ抗体）とレクチンとの親和性の検討］
（供試レクチン）
藻類（海藻）由来レクチン：ＥＳＡ−２、Ｓｏｌｎｉｎ Ｂ、Ｃａｒｎｉｎ、Ｈｙｐｎｉｎ Ａ−１、ＢＭＬ−１７
陸上植物由来レクチン：Ｃｏｎ Ａ
（方法）
高マンノース型糖鎖のみを有するタカアミラーゼＡ（タカジアスターゼ（コウジカビ由来、Ｓａｎｋｙｏ製）からＣｏｎ Ａ固定化カラムを用いるアフニティークロマトグラフィーにより精製したもの）、複合型糖鎖のみを有するアシアロトランスフェリン（トランスフェリン（ヒト由来、ＳＩＧＭＡ製）から希酸処理物（脱シアル化物）をＯＤＳカラムを用いる逆相系ＨＰＬＣにより精製したもの）、高マンノース型糖鎖と複合型糖鎖の両方を有するウシチログロブリン（ウシ由来、ＳＩＧＭＡ社製）、抗体（ニワトリ型ＩｇＹ抗体）、およびコントロールとして牛血清アルブミン（ＢＳＡ、ＳＩＧＭＡ社製）をそれぞれ、ＣＭ５センサーチップ（ＢＩＡＣＯＲＥ製）上に固定化した。なお固定化の方法は、マニュアルに従って行なった。より具体的にはタカアミラーゼＡは表面チオールカップリン法で固定化を行ない、アシアロフェツイン、ウシチログロブリン、抗体、およびＢＳＡはアミンカップリング法を用いて固定化を行なった。なお固定化量は、１０００〜１５００ＲＵの範囲になるようマニュアルインジェクション法で調整した。なお、上記糖タンパク質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで確認した。

各種糖タンパク質と各種レクチンとの親和性はＳＰＲ法で解析した。同解析に先立ち、予備実験で解析法を検討し、非線形最小二乗法によるカイネティクス解析が適当と判断した。そこで、得られたセンサーグラムからおおよそのＫ_Ｄ値を算出し、０．１〜１０Ｋ_Ｄ［Ｍ］を濃度の目安として、２倍希釈列で５段階以上のアナライト（各種レクチン）溶液を調製した。分析プログラムの作成には、マニュアルに従って“Ｃｕｓｔｏｍａｉｚｅｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ”を用い、センサーチップ内の４つのフローセルのうち、何も固定化していないフローセル１をコントロールとして、糖タンパク質を固定化したフローセルからの差し引き機能を使用した。本分析プログラム下で、アナライト（各種レクチン）溶液をそれぞれセンサーチップ上に流速３０μｌ／ｍｉｎで３分間流した後、バッファーを３分間流し、レクチンの結合・解離量を測定した。なお、アナライト添加開始１０秒前から添加終了後１０秒前までのＲＵの増加量を結合量、バッファー添加開始後１０秒から添加終了１０秒前までのＲＵ減少量を解離量とした。

次に、０．５Ｍ Ｄ−マンノース、１０ｍＭ ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ４．０）、５０ｍＭ ＨＣｌおよび１０ｍＭ ＮａＯＨを用いて、センサーチップを洗浄して再生した。得られたセンサーグラムについて、結合相と解離相を同時にカーブフィッティングさせ、結合速度定数Ｋａ、解離速度定数Ｋｄ、親和定数Ｋ_Ａ、および解離定数Ｋ_Ｄを算出した。

（結果）
ニワトリ卵黄抗体と各種レクチンとの親和定数を表１に示した。表１には、結合速度定数Ｋａ（Ｍ^−１ｓ^−１）、解離速度定数Ｋｄ（ｓ^−１）、親和定数Ｋ_Ａ（Ｍ^−１）、および解離定数Ｋ_Ｄ（Ｍ）を示した。なお親和定数は、その値が大きくなればなるほど、親和性が高い（結合力が強い）ことを意味する。

表１の結果より、試験した全てのレクチンがニワトリ卵黄抗体（親和定数Ｋ_Ａ＝１０^７〜１０^８Ｍ^−１）、およびウシチログロブリン（親和定数Ｋ_Ａ＝１０^７〜１０^８Ｍ^−１）と高い親和性を示した。一方、Ｃａｒｎｉｎ（親和定数Ｋ_Ａ＝１０^８Ｍ^−１）とＣｏｎ Ａ（親和定数Ｋ_Ａ＝１０^６Ｍ^−１）はアシアロトランスフェリンに対しても高い親和性を示した。また、ＨｙｐｎｉｎＡ−１を除く全ての供試レクチンはタカアミラーゼＡ（親和定数Ｋ_Ａ＝１０^７〜１０^８Ｍ^−１）に対して高い親和性を示した。

以上の結果より、ニワトリ卵黄抗体とのみ特異的に結合するレクチンを見いだすには至らなかった。しかし、海藻レクチン４種（ＥＳＡ−２、Ｓｏｌｎｉｎ Ｂ、ＢＭＬ−１７、Ｃａｒｎｉｎ）とニワトリ卵黄抗体との結合は、高マンノース型糖鎖との結合を介していることが判明した。なお、ニウトリ卵黄抗体との親和性は、ＢＭＬ−１７、ＥＳＡ−２、Ｈｙｐｎｉｎ Ａ−１、Ｃａｒｎｉｎ、Ｃｏｎ Ａの順で高かった。

［実施例５：各種レクチンとウシチログロブリンとの溶離性の検討］
（方法）
ニワトリ卵黄抗体と同様に、高マンノース型糖鎖と複合型糖鎖を有するウシチログロブリン固定化チップを用い、同チップに結合したレクチンの溶離性を検討した。なお、チログロブリンの固定化に際しては、特異的結合および溶離を確認しやすいようにＣＭ５センサーチップ上に最大限固定化（１２，０９５ＲＵ）した。ＨＢＳ−ＥＰ（平衡化）バッファー（ＢＩＡＣＯＲＥ社製）中、各１００μｇ／ｍｌ濃度のアナライト（レクチン）溶液を流速５μｌ／ｍｉｎで、結合量が平衡に達するまで流した。この後、ＨＢＳ−ＥＰバッファーで洗浄し、解離が平衡に達した後、同バッファー中０．５Ｍ Ｄ−マンノースを５０μｌ注入した。センサーグラムを基に、アナライト（レクチン）溶液を５０μｌ（５μｇ）注入した時点での結合量（ＲＵ）を測定した。次に、バッファー洗浄および５０μｌの０．５Ｍ Ｄ−マンノース溶液での溶出後のアナライト（レクチン）の残存結合量（ＲＵ）を測定した。残存結合量を最大結合量に対する割合（％）で表示した。

（結果）
図９に固定化チログロブリンと各種レクチンの相互作用のセンサーグラムを、図３に結合、洗浄および０．５Ｍ Ｄ−マンノースでの溶離後のアナライト（レクチン）の残存結合量（％）を示した。図３はウシチログロブリン固定化チップに、各種レクチンを結合させた時のチップと結合しているレクチン量を１００％とした場合において、ＨＢＳ−ＥＰバッファーで解離させた後のチップと結合しているレクチン量の相対値、および０．５Ｍ Ｄ−マンノースで溶離させた後のレクチン量の相対値を示している。

この結果より、ＢＭＬ−１７とＣａｒｎｉｎが、Ｄ−マンノースで特異的かつ定量的に溶離するということが分かった。一方、ＥＳＡ−２、Ｓｏｌｎｉｎ Ｂ、Ｈｙｐｎｉｎ Ａ−１はＤ−マンノースおよび他の溶離液（結果は示さず）では溶離せず、Ｃｏｎ Ａは、Ｄ−マンノースで一部溶離した。

以上の結果から、ＢＭＬ−１７とＣａｒｎｉｎがニワトリ型抗体の精製用リガンドとして利用可能であるということが分かった。

［実施例６：ＢＭＬ−１７カラム、ＣａｒｎｉｎカラムおよびＣｏｎ Ａカラムを用いたニワトリ卵黄抗体の精製］
（方法）
ＢＭＬ−１７、Ｃａｒｎｉｎ、Ｃｏｎ Ａを、それぞれＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰ Ｃｏｌｕｍｎ（１ｍｌ容ゲル、（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐ製）に固定化した。固定化の方法は、同ＨｉＴｒａｐカラムに添付のマニュアルに従って行なった。なお、ＢＭＬ−１７およびＣｏｎ Ａの場合は、それぞれ阻害単糖であるＤ−マンノースおよびメチル−α−Ｄ−マンノシドを終濃度０．２Ｍとなるようにリガンド溶液に加え、活性サイトをブロックした状態で固定化した。平衡化バッファー（０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび０．０２％ ＮａＮ_３を含む０．０５Ｍトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．５））で十分洗浄した後の各カラムのレクチン固定化量は、４００μｇ（ＢＭＬ−１７）、５７０μｇ（Ｃａｒｎｉｎ）、２７０μｇ（Ｃｏｎ Ａ）であった。また、ＨｉＴｒａｐ ＩｇＹ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＨＰ Ｃｏｌｕｍｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐ製、５ｍｌ容ゲル、以下「ＩｇＹ精製用カラム」という）を比較対照として用いた。

なお、以下各種レクチンを固定化したカラムを、それぞれ「ＢＭＬ−１７カラム」、「Ｃａｒｎｉｎカラム」、「Ｃｏｎ Ａカラム」と称する。

（結果）
図４に各種レクチンを固定化したカラム（ＢＭＬ−１７カラム、Ｃａｒｎｉｎカラム、Ｃｏｎ Ａカラム）およびＩｇＹ精製用カラムに、ニワトリ卵黄抗体を通塔し、Ｄ−マンノースまたは溶出バッファーで溶離した場合の、タンパク質の挙動をＵＶ２８０ｎｍの吸収（図中「Ａ_２８０」で示す。以下同じ。）でモニターした結果を示す。図４（ａ）はＢＭＬ−１７カラムの結果を示し、図４（ｂ）はＣａｒｎｉｎカラムの結果を示し、図４（ｃ）はＣｏｎ Ａカラムの結果を示し、図４（ｄ）はＩｇＹ精製用カラムの結果を示す。

ニワトリ卵黄抗体を上記４種類のカラムに供した結果、全てのカラムに同抗体が結合した。また２０ｍＭ、２００ｍＭ、５００ｍＭのＤ−マンノースで溶離を行なった結果、ＢＭＬ−１７カラムおよびＣａｒｎｉｎカラムは、Ｄ−マンノースでニワトリ卵黄抗体を特異的に溶離させることが可能であるということが分かった（図４（ａ）、（ｂ）参照）。なお、後出する図５に示すように、ニワトリ卵黄抗体の回収率の点から、ＢＭＬ−１７カラムが最も有効であった。

一方、Ｃｏｎ Ａカラムでは２００ｍＭ メチル−α−Ｄ−マンノシドで溶離がみられたが、（図４（ｃ）参照）、チオール親和性をアフィニティー原理とする市販品のＩｇＹ精製用カラムでの精製効率は、著しく低かった（図４（ｄ）、および後出する図５参照）。

［実施例７：ＢＭＬ−１７カラム、ＣａｒｎｉｎカラムおよびＣｏｎ Ａカラムを用いたハイブリドーマ培養上清からのニワトリモノクローナル抗体の精製］
（方法）
上記ＢＭＬ−１７カラム、Ｃａｒｎｉｎカラム、Ｃｏｎ Ａカラム、ＩｇＹ精製用カラムおよびＣｏｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ Ｌａｂ Ｐａｃｋｓカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐ製、以下「市販Ｃｏｎ Ａカラム」という）（５ｍｌ容ゲル、固定化Ｃｏｎ Ａ量１０〜１６ｍｇ／ｍｌ）を用いて、ハイブリドーマ培養上清からニワトリモノクローナル抗体の精製を試みた。

より具体的には、ハイブリドーマ培養上清の５ｍｌ（市販Ｃｏｎ Ａカラムの場合は２．５ｍｌ）を各カラムに直接添加し、カラムを１Ｍ ＮａＣｌで十分洗浄後、レクチンを固定化したカラムの場合は５００ｍＭ Ｄ−マンノースまたは５００ｍＭ メチル−α−Ｄ−マンノシド、ＩｇＹ精製用カラムの場合はマニュアル指定の溶出バッファーで溶出し、各溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜２０％ グラジエントゲル（ｅ−パジェル、ＡＴＴＯ製））に供した。バンド検出は、ＣＢＢ染色およびウエスタンブロット法で行なった。また溶出液の活性ニワトリ型モノクローナル抗体の定量は、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いて行なった。なお、ウエスタンブロッティングでは、西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗ニワトリＩｇＧ抗体（コスモバイオ社製）、発色にはコニカイムノステイン−ＨＲＰ（生化学工業製）を用いた。

ハイブリドーマは、ニワトリＢ細胞株由来のＭＵＨ１とＤＮＰ−ＫＬＨ免疫ニワトリ脾細胞との融合によって得られた抗ＤＮＰ抗体産生のＢ４Ｃｅｌｌで、これを１０％ ＦＢＳイスコブ培地中、３８．５℃で５％ ＣＯ_２下、４〜５日培養した培養液の遠心上清を上記試験に供した。本ハイブリドーマは本発明者等が作製した。

なおサンドイッチＥＬＩＳＡ法は、マイクロプレートを用いて行なった。５０μｌのＤＮＰ−ＢＳＡ溶液（１０μｇ／ｍｌ）をプレート内の各ウェルに添加し、４℃で１６時間静置して同抗原を固相化した。各ウェルを０．２％スキムミルク含有ＰＢＳでブロッキングし、０．５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄後、０．１％スキムミルクを含むＰＢＳで調製した検液５０μｌを各ウェルに添加し、３７℃で１時間静置した。このプレートを洗浄後、０．１％スキムミルクを含むＰＢＳで調製したＨＲＰ標識ヤギ抗ニワトリＩｇＧ抗体溶液（１μｇ／ｍｌ）５０μｌを各ウェルに添加し、３７℃で１時間静置した。このプレートを十分洗浄後、各ウェルに１００μｌの発色液（コニカイムノステイン）を加え、室温で１０分静置した。各ウェルの４１５ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ Ｎｏｄｅｌ ５５０）で測定した。なお、標準検量線は、ニワトリ型抗ＤＮＰ−ＫＬＨモノクローナル抗体標品を同様の測定に供して作成した。

（結果）
図５に各種レクチンを固定化したカラム（ＢＭＬ−１７カラム、Ｃａｒｎｉｎカラム、Ｃｏｎ Ａカラム、Ｃｏｎ Ａ−ＨｉＴｒａｐカラム）およびＩｇＹ精製用カラムに、ハイブリドーマ培養上清を通塔し、５００ｍＭ Ｄ−マンノースまたは溶出バッファーで溶離した場合の、タンパク質の挙動をＵＶ２８０ｎｍの吸収（図中「Ａ_２８０」で示す）でモニターした結果を示す。図５（ａ）はＢＭＬ−１７カラムの結果を示し、図５（ｂ）はＣａｒｎｉｎカラムの結果を示し、図５（ｃ）はＣｏｎ Ａカラムの結果を示し、図５（ｄ）は市販Ｃｏｎ Ａカラムの結果を示し、図５（ｅ）はＩｇＹ精製用カラムの結果を示す。

また図６に溶出液をウエスタンブロット（図６（ａ））およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図６（ｂ））で分析した結果を示した。レーン１および１１は分子量マーカーを示し、レーン２および１０はニワトリモノクローナル抗体標品を示し、レーン３は１０％ ＦＢＳイスコブ培地を示し、レーン４はハイブリドーマ培養上清を示し、レーン５はＢＭＬ−１７カラムの溶出画分を示し、レーン６はＣａｒｎｉｎカラムの溶出画分を示し、レーン７はＣｏｎ Ａカラムの溶出画分を示し、レーン８はＩｇＹ精製用カラムの溶出画分を示し、レーン９は市販Ｃｏｎ Ａカラムの溶出画分を示した。

図５、６によれば、ＢＭＬ−１７カラムおよびＣａｒｎｉｎカラムを用いることにより、ハイブリドーマ培養上清からワンステップで高純度のニワトリモノクローナル抗体を精製することができるということがわかった。一方、市販されているＣｏｎ Ａ−ＨｉＴｒａｐカラムやＩｇＹ精製用カラムでの精製標品は多量の夾雑物を含むものであった。

また表６に、各種カラムについて、ハイブリドーマ培養上清から活性型のニワトリ型モノクローナル抗体の精製効率を示した。

表６より、固定化リガンド量当たりの活性ニワトリ型モノクローナル抗体の収率はＢＭＬ−１７カラムが最も高く、次いでＣａｒｎｉｎカラムが高いことがわかった。

以上の結果より、ＢＭＬ−１７カラムおよびＣａｒｎｉｎカラムを用いることにより、従来のようにニワトリモノクローナル抗体をハイブリドーマ培養上清から古典的なタンパク質精製法を多段階組み合わせて精製する必要が無く、きわめて簡便に精製を行なうことができる。

本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。すなわち、請求項に示した範囲で適宜変更した技術的手段を組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

［各実施例における表］

以上のように、本発明のペプチドは抗体、特にニワトリ型抗体（ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等）の精製に利用が可能である。ニワトリ型抗体を始めとする抗体は医療分野において有用であるため、本発明は、医療産業、薬品産業、検査薬に関する産業等広く利用が可能である。

Claims (16)

1. 糖鎖と結合するポリペプチドであって、
   （ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；または
   （ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列、
   からなることを特徴とするポリペプチド。
2. 上記糖鎖が、高マンノース型糖鎖であることを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
3. 請求項１または２のいずれか１項に記載のポリペプチドと結合することを特徴とする抗体。
4. 請求項１または２のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
5. 下記の（ａ）または（ｂ）のいずれかであることを特徴とする請求項４に記載のポリヌクレオチド：
   （ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
   （ｂ）以下の（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド：
   （ｉ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；もしくは
   （ｉｉ）配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
6. 請求項４または５に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とするベクター。
7. 請求項６に記載のベクターを用いることを特徴とする請求項１に記載のポリペプチドの生産方法。
8. 請求項４または５に記載のポリヌクレオチドが導入されていることを特徴とする形質転換体。
9. 請求項８に記載の形質転換体を用いることを特徴とする請求項１に記載のポリペプチドの生産方法。
10. 請求項４または５に記載のポリヌクレオチドが基板上に固定化されていることを特徴とする検出器具。
11. 請求項１または２に記載のポリペプチドが基板上に固定化されていることを特徴とする検出器具。
12. 請求項３に記載の抗体が基板上に固定化されていることを特徴とする検出器具。
13. 請求項３に記載の抗体を用いることを特徴とする請求項１に記載のポリペプチドの精製方法。
14. 請求項１に記載のポリペプチドを用いることを特徴とする抗体の精製方法。
15. 上記抗体がニワトリ型抗体であることを特徴とする請求項１４に記載の精製方法。
16. 請求項１に記載のポリペプチドが固定化されていることを特徴とする担体。

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