KR100930517B1

KR100930517B1 - 소의 임신 진단용 키트 및 이를 이용한 임신 진단방법

Info

Publication number: KR100930517B1
Application number: KR1020090059682A
Authority: KR
Inventors: 오홍근; 김용준; 김옥진; 유강렬; 김진호; 정세희
Original assignee: (주)휴벳
Priority date: 2009-07-01
Filing date: 2009-07-01
Publication date: 2009-12-09

Abstract

본 발명은 소의 임신 진단용 키트 및 이를 이용한 임신 진단방법에 관한 것이다.

본 발명의 소의 임신 진단용 키트는, 일정 길이를 갖는 다공성 박막형 스트립부재와, 프로게스테론-소혈청알부민 결합체 또는 프로게스테론-키홀 림펫 헤모시아닌 결합체 중 선택된 1종을 코팅함으로써 형성되며, 여기에 프로게스테론이 함유된 소분변추출액과 항 프로게스테론-콜로이드 금입자 결합체가 결합된 결합액과 반응하여 발색하는 검사선과, 항 마우스 면역글로불린지를 코팅함으로써 형성되며, 상기 결합액과 반응하여 발색하여 검사선의 발색정도를 대조할 수 있도록 한 대조선과, 상기 대조선과 인접하는 스트립부재의 타단 표면에 일체화되게 적층되어, 스트립부재의 일단으로부터 함침되는 상기 결합액을 타단으로 이동할 수 있게 흡수하도록 한 흡수지를 포함하여 구성된다.

본 발명에 의해, 소의 분변을 이용하여 검사할 수 있어 소에게 스트레스를 주지 않으면서 간단한 조작으로 즉석에서 정확하게 검사할 수 있는 소의 임신 진단용 키트 및 이를 이용한 임신 진단 방법이 제공된다.

소, 임신, 진단, 키트

Description

소의 임신 진단용 키트 및 이를 이용한 임신 진단방법{KIT FOR DIAGNOSING PREGNANCY OF CATTLE AND METHOD FOR DIAGNOSING PREGNANCY USING THE SAME}

본 발명은 소의 임신 진단용 키트 및 이를 이용한 임신 진단방법에 관한 것으로, 특히 즉석에서 명확하게 임신여부를 검사할 수 있음과 아울러 소의 분변을 이용함으로써 소에게 스트레스를 주지 않으면서 간단하게 임신여부를 판단할 수 있는 소의 임신 진단용 키트 및 이를 이용한 임신 진단방법에 관한 것이다.

산업동물인 소와 돼지사육에서는 대부분이 새끼 생산을 통해 농가의 소득이 이루어지고 있는 실정이다.

특히, 소의 번식에서는 수태를 시키는 것도 중요하지만, 수정을 시킨 소의 임신여부를 조기에 진단하는 것도 매우 중요하다.

이는 조기 임신여부진단을 통해 비수태 동물을 조기에 별도 관리할 수 있어 공태기간을 줄일 수 있어 농가의 원가 절감이 가능하기 때문이다.

이에, 1990 년대 이전까지는 한우 또는 젖소의 임신 여부를 진단하기 위해 수정 또는 교배시킨 후, 50 내지 60 일 경과한 상태에서 수의사가 직접 직장검사로 임신여부를 판단하였다.

그러나, 상기와 같은 방법은 직장을 통해 임신여부를 진단하는 것이므로, 숙련된 인공 수정사나 수의사가 필요함과 아울러 임신여부 감정시 난소 및 태아에 가해지는 손상에 의해 조기 태아사의 부작용이 발생될 가능성이 있으며, 대부분의 검사대상인 임신우가 스트레스를 받게 된다.

또한, 상기의 방법은 수정 후 50 내지 60 일이 경과하여야만 확실한 임신 여부를 판단할 수 있기 때문에, 만약 이때에 임신이 되지 않은 것으로 평가되면, 60일 이후 발정 징후를 확인하여 다시 수정 절차를 거쳐야 하는 번거로움이 있었다.

이에, 1990 년대 이후부터는 한우 또는 젖소의 수정 적기, 조기임신 및 번식장애를 감정할 수 있는 초음파진단기를 이용한 임신 진단법 등이 개발되었는데 이는 주로 현장에서 비전문가가 사용할 목적으로 개발된 것이긴 하나, 고가의 장비를 구입해야 하는 점, 숙련된 진단기술이 필요한 점, 직장을 통한 임신진단으로 임신우에게 스트레스를 주는 단점이 있었다.

이에 최근에는 아래와 같이 임신 진단용 키트가 개발되었는데 특히, 혈액 내의 프로게스테론(progesterone) 농도로 임신 여부를 진단하는 것이 개발되었다.

특허공개공보 제10-2001-0018289호(임신진단키트)에는, 혈액속에 존재하는 프로게스테론의 농도와 박막에 고정화한 프로게스테론-소혈청 알부민과 항체로서 항 프로게스테론 금 결합체를 반응시켜 혈액 내의 프로게스테론 농도와 반비례하여 발색되도록 발명한 한우의 임신 진단 키트에 관한 것이 공개되어 있다.

또한, 특허공개공보 제10-2001-00178630호(비임신 진단 키트 및 이를 이용한 동물의 비임신 진단방법)에는 혈청 또는 탈지우유에 존재하는 프로게스테론과 프로 게스테론-소혈청알부민 결합체의 프로게스테론이 항 프로게스테론 면역글로불린지-금 결합체와 반응하여 발색정도의 강약을 비교하여 비임신여부를 판정하도록 한 비임신 진단키트에 관한 것이 공개되어 있다.

그러나, 상기 발명들은 프로게스테론의 농도를 측정하기 위해서는, 검사 대상의 혈액이나 우유를 채취하여야 하는 번거로움이 있으며 특히, 한우의 경우 젖소와는 달리 우유를 쉽게 채취할 수가 없어 프로게스테론을 검사 대상으로부터 채취하기 어려운 문제점이 있으며, 여전히 소에게 스트레스를 주는 문제점이 해소되지 못하였다.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하기 위해, 소에게 스트레스를 주지 않으면서 단기간 내에 현장에서 누구나 손쉽게 임신여부를 판단할 수 있도록 소의 분변을 통해 소의 임신여부를 진단하는 방법을 제공하는게 목적이 있다.

또한, 소의 분변을 이용함으로써 유즙배출이 있지 않은 상태인 최초 임신이 된 초임 젖소 및 유즙배출이 없거나 약한 한우에 대해서도 임신여부 진단이 가능함과 동시에 소의 임신여부를 별도의 장비없이 간단한 조작으로 즉석에서 정확하게 검사할 수 있는 소의 임신 진단용 키트를 제공하는데 그 목적이 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 소의 임신 진단용 키트는 일정 길이를 갖는 다공성 박막형 스트립부재와, 프로게스테론-소혈청알부민 결합체(progesterone-BSA conjugate) 또는 프로게스테론-키홀 림펫 헤모시아닌 결합체(progesterone-KLH conjugate) 중 선택된 1종을 상기 스트립부재의 일표면에 일단과 인접하게 코팅함으로써 형성되며, 스트립부재의 일단으로부터 함침되어 타단으로 이동하는 프로게스테론이 함유된 소분변추출액과 항 프로게스테론-콜로이드 금입자 결합체가 결합된 결합액과 반응하여 발색하는 검사선과, 항 마우스 면역글로불린지(anti-mouse IgG)를 상기 스트립부재의 일표면에 타단과 인접하게 코팅함으로써 형성되며, 상기 결합액과 반응하여 발색하여 검사선의 발색정도를 대조할 수 있도록 한 대조선과, 상기 대조선과 인접하는 스트립부재의 타단 표면에 일체화 되게 적층되어, 스트립부재의 일단으로부터 함침되는 상기 결합액을 타단으로 이동할 수 있게 흡수하도록 한 흡수지를 포함하여 구성된다.

또, 상기 스트립부재의 일단 표면에는 외부로부터 투입되는 프로게스테론이 함유된 소분변추출액을 함침하여 스트립부재의 일단으로 이동시키기 위한 시료패드가 적층되고, 시료패드와 스트립부재의 사이에는 항 프로게스테론-콜로이드 금입자 결합체를 함유하여 그 항 프로게스테론-콜로이드 금입자 결합체를 소분변추출액과 결합시켜 스트립부재의 일단으로부터 타단으로 이동하는 상기 결합액을 만들도록 한 금결합체 패드가 더 적층되는 것이 특징이다.

또한, 상기 스트립부재는 니트로셀룰로스 멤브레인으로 이루어진 것이 특징이다.

상기 소의 임신 진단용 키트를 이용하여 소의 임신을 진단하는 방법으로는 검사대상인 소로부터 채취한 분변을 메탄올로 추출하여 프로게스테론이 함유된 소분변추출액을 제조하는 단계와, 상기 소분변추출액을 스트립부재의 일단에 적층된 시료패드에 함침시켜 스트립부재의 타단 표면에 적층된 흡수지로 인해 스트립부재의 타단으로 이동시키되, 상기 시료패드와 스트립부재 사이에 적층된 금결합체 패드를 경유시켜 금결합체 패드에 함유되어 있는 항 프로게스테론-콜로이드 금입자 결합체와 결합한 결합액이 스트립부재의 타단으로 이동시키는 단계와, 상기 결합액이 스트립부재의 타단으로 이동되면서 프로게스테론-소혈청알부민 결합체(progesterone-BSA conjugate) 또는 프로게스테론-키홀 림펫 헤모시아닌 결합체(progesterone-KLH conjugate) 중 선택된 1종으로 코팅된 검사선과 반응함으로 인한 발색정도를 확인하는 단계와, 상기 검사선을 통과한 결합액이 스트립부재의 타단으로 계속 이동되면서 항 마우스 면역글로불린지(anti-mouse IgG)으로 코팅된 대조선과 반응하여 대조선이 검사선보다 진하게 발색되면 임신임을 확인하는 단계를 포함하여 구성된다.

이때, 상기 소분변추출액은 메탄올 1 ㎖당 소의 분변을 0.5 ~ 1 g 넣고 0.5 ~ 2 분동안 혼합한 후, 여과시켜 제조되는 것이 특징이다..

또, 상기 항 마우스 면역글로블린은 토끼 유래 항 마우스 면역글로불린지(goat anti-mouse IgG)인 것이 특징이다.

본 발명에 의해, 한우 또는 젖소의 임신여부를 별도의 장비없이 간단한 조작으로 즉석에서 정확하게 검사할 수 있는 소의 임신 진단용 키트가 제공된다.

또한, 소의 분변으로 검사함으로써 소에게 스트레스를 주지 않으면서 간단하게 임신여부를 판단할 수 있는 소의 임신진단 방법이 제공된다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부한 도면을 참조하여 상세히 설명하면 다음과 같다.

도면을 참조하여 본 발명의 소의 임신 진단용 키트를 설명한다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 소의 임신 진단용 키트를 나타낸 도면, 도 2는 도 1의 임신 진단용 키트에서 임신상태를 나타낸 도면, 도 3은 도 2의 검사선에서 일어나는 반응을 나타낸 도면, 도 4는 도 1의 임신 진단용 키트에서 비임신 상태를 나타낸 도면, 도 5는 도 4의 검사선에서 일어나는 반응을 나타낸 도면이다.

본 발명의 임신 진단용 키트는 소에게 스트레스를 주지않기 위해 진단시료로 소의 분변을 이용하도록 구성됨과 동시에 소의 발정주기(19 ~ 22일)때 프로게스테론 농도는 50 ng/g 이하이며, 그 후 점차 증가하다가, 발정일 후 19 일째 비임신상태일 경우에는 프로게스테론의 농도가 다시 50 ng/g 이하로 낮아지게 되며, 임신상태가 되면 프로게스테론의 농도가 낮아지지않는 점을 이용하여 짧은기간에 임신여부를 용이하게 판정할 수 있도록 구성된다.

즉, 도시된 바와 같이 본 발명의 일실시예의 임신 진단용 키트는 다공이 형성된 박막형 스트립부재(10)로 이루어지며, 상기 스트립부재(10)의 일단에는 시료패드(20)가 적층되고, 상기 스트립부재와 시료패드 사이에 금결합체 패드(30)가 적층되며, 스트립부재의 타단에는 흡수지(40)가 일체화되게 적층되어 있다.

상기 다공성 박막형 스트립부재(10)는, 검사대상인 소의 분변을 추출한 추출액(50)이 흡수되어 이동될 수 있는 재질인 니트로셀룰로스 멤브레인으로 이루어진 것이 바람직하다.

시료패드(20)도 상기와 같이 소의 분변을 추출한 추출액이 흡수되어 금결합체패드(30)로 이동될 수 있도록 니트로셀룰로스 멤브레인으로 이루어지는 것이 좋다.

금결합체 패드(30)는 항 프로게스테론- 콜로이드 금입자 결합체가 함유되어 있는 것으로써, 상기와 같이 시료패드(20)에서 흡수되어 이동되는 소분변추출액과 항 프로게스테론- 콜로이드 금입자 결합체가 결합되어 형성된 결합액이 스트립부 재(10)의 타단으로 이동될 수 있도록 니트로셀룰로스 멤브레인으로 이루어지는 것이 좋다.

이때, 상기 항 프로게스테론-콜로이드 금입자 결합체는 비이온성 계면활성제를 함유한 인산 생리식염 완충액을 일정량 첨가하여 용해하여 용액으로 제조하여 사용되는 것이 바람직하며, 필요에 따라 통상적으로 사용 가능한 안정제를 포함 할 수 있으며, 이때 사용되는 안정제로는 비한정적으로 수혈청 알부민, 수크로오스(sucrose)등을 예시할 수 있으며, 이와 같은 안정제의 사용량은 사용되는 안정제의 종류에 따라 상이하지만 일반적으로 진단 시약 총량을 기준으로 1 내지 5 중량 %를 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 소분변 추출액(50)과 항 프로게스테론-콜로이드 금입자 결합체가 결합하여 형성된 결합액이 스트립부재(10)의 내부로 점차적으로 흡수될 때, 모세관 현상에 의해 상기 결합액을 하기 검사선 및 대조선에 통과시키는 속도를 조절하기 위해 니트로셀룰로스 멤브레인의 다공직경은 8 ~ 12㎛로 이루어지는 것이 바람직하다.

상기와 같이 이동되는 결합액을 대상으로 소의 임신여부를 확인하기 위해, 상기 금결합체 패드(30)와 흡수지(40) 사이에 있는 스트립부재(10)의 일표면에는 검사선(11)과 대조선(13)이 코팅되어 있다.

설명하면, 검사선(11)은 금결합체 패드(30)의 일단과 일정간격을 두어 코팅되며, 바람직하게는 일단으로부터 8 ~ 10 mm 정도의 거리를 두고 일정영역으로 코팅되어 있는데, 이는 프로게스테론-소혈청알부민 결합체(progesterone-BSA conjugate) 또는 프로게스테론-키홀 림펫 헤모시아닌 결합체(progesterone-KLH conjugate) 중 선택된 1종으로 코팅되어 있으며, 이는 소의 분변속에 함유된 프로게스테론의 양을 상회하지 않도록 적정량(ex. 200 ~ 5ng/ml)이 코팅된다.

대조선(13)은 상기 검사선(11)과 일정간격을 두어 코팅되며, 바람직하게는 검사선으로부터 15 ~ 20 mm 정도의 거리를 두고 항 마우스 면역글로불린지(anti-mouse IgG)가 코팅된다.

이렇게 형성된 검사선(11)과 대조선(13)의 발색정도의 차이에 따라 임신여부를 확인할 수 있게 되는데, 대조선(13)보다 검사선(11)의 발색정도가 짙으면 비임신상태이고, 옅으면 임신상태이게 되는 것이다.

또한, 상기 대조선(13)을 이루는 항 마우스 면역글로불린지는 토끼에서 유래된 항 마우스 면역글로불린지인 것이 바람직하다.

상기 흡수지(40)는 스트립부재(10)를 통해 스트립부재의 일단에서 타단으로 이동할 수 있도록 도와주는 것으로서, 셀룰로스 페이퍼로 이루어지는 것이 바람직하다.

상기와 같이 이루어진 임신 진단용 키트에서 임신진단 시약으로 검사대상인 소의 분변을 메탄올로 추출하여 프로게스테론이 함유된 소분변 추출액을 제조하여 이용하게 된다.

상기와 같이 구성된 본 발명의 소의 임신 진단용 키트의 작용과 임신 진단방법에 대해서 설명하면 다음과 같다.

먼저, 임신우로부터 인공수정후 21일에 채취된 분변을 메탄올로 추출하여 추출액을 제조하게되는데 프로게스테론이 함유된 소분변추출액을 제조되게 된다.

이때, 소가 임신상태이면 프로게스테론(50b)의 농도가 50 ng/g 이상으로 높게 함유된 추출액이 제조되게 되는 것이고, 소가 비임신상태이면 프로게스테론(50b)의 농도가 50 ng/g 이하로 함유된 추출액이 제조되게 되는 것이다.

이렇게 형성된 상기 소분변 추출액(50)을 시료패드(20)에 떨어뜨리면 시료패드(20)를 거쳐 시료패드 일단에 적층된 항 프로게스테론- 콜로이드 금 결합체가 함유되어 있는 금결합체 패드(30)로 이동되는데, 이때, 소분변 추출액의 프로게스테론과 항 프로게스테론- 콜로이드 금 결합체가 결합되어 결합액이 생성되어 스트립부재(10)의 타단으로 이동하게 된다.

이때, 만약 소가 임신상태이면 소분변추출액의 프로게스테론(50)은 그 농도가 높아서 대부분의 항 프로게스테론-콜로이드 금 결합체와 결합된 결합액이 생성되게 되는 것이며, 비임신상태이면 소분변추출액의 프로게스테론(50)은 그 농도가 낮아서 상기 결합액은 항 프로게스테론-콜로이드 금 결합체와 결합된 양이 적은 결합액이 생성되게 되는 것이다.

그 후, 상기와 같이 결합된 결합액은 스트립부재(10)의 내부에 형성된 다공을 통해 스트립부재의 타단 표면에 적층된 흡수지(40)로 이동되게 된다.

이때, 상기 금결합체 패드(30)와 흡수지(40) 사이에 프로게스테론-소혈청알부민 결합체(progesterone-BSA conjugate) 또는 프로게스테론-키홀 림펫 헤모시아닌 결합체(progesterone-KLH conjugate) 중 선택된 1종으로 코팅된 검사선(11)과 항 마우스 면역글로불린지(anti-mouse IgG)이 코팅된 대조선(13)이 일정간격을 두고 고정되어 있어 이들의 발색정도에 따라 임신여부를 판단하게 되는 것이다.

즉, 도 2, 3에 나타나 있듯이 소의 임신상태에는 소분변추출액의 프로게스테론(50)의 농도가 높아 대부분의 항 프로게스테론-콜로이드 금 결합체와 결합되어 검사선(13)에 상기 결합액이 도달했을 때, 이 결합액에 함유되어 있는 항 프로게스테론-콜로이드 금 결합체는 더이상 검사선(13)에 고정된 프로게스테론과 결합할 수 없게되어, 발색이 약하게 나타나게 된다.

도 4, 5에 나타나 있듯이, 소의 비임신상태에는 소분변 추출액의 프로게스테론(50)의 농도가 낮아 대부분의 항 프로게스테론-콜로이드 금 결합체와 결합되지 않아 항 프로게스테론-콜로이드 금 결합체가 많이 남아 있는 상태로 검사선까지 이동되며, 이렇게 형성된 결합액에 함유되어 있는 항 프로게스테론-콜로이드 금 결합체는 검사선에 고정된 프로게스테론과 결합됨으로써 발색이 강하게 나타나게 되는 것이다.

즉, 소 분변 내에 존재하는 프로게스테론은 항 프로게스테론-콜로이드 금 결합체와 결합되며, 이들이 점차적으로 프로게스테론(11)이 고정된 위치에 도달하면, 검사 시료 내의 프로게스테론과 검사선에 고정된 프로게스테론-소혈청알부민 결합체(progesterone-BSA conjugate) 또는 프로게스테론-키홀 림펫 헤모시아닌 결합체(progesterone-KLH conjugate) 중 선택된 1종과 항 프로게스테론-콜로이드 금 결합체와 경쟁적으로 반응으로 결합하게 되므로, 분석 시료 속에 함유되어 있는 프로게스테론의 함량에 반비례하여 검사선의 선홍색 발색정도가 달라지게 되는 것이다.

따라서, 검사선(11)의 발색정도를 육안으로 파악하여 검체의 임신여부를 판별할 수 있다.

상기 검사선에 결합하지 않고 통과한 항 프로게스테론-콜로이드 금 결합체는 토끼유래 항-마우스 면역글로불린지가 고정된 대조선(13)으로 이동되어 대조선(13)에 코팅된 항-마우스 항체와 결합하여 발색하게 된다.

상기의 토끼유래 항-마우스 면역글로불린지 고정화 부위에서 검출되는 항 프로게스테론-콜로이드 금 결합체의 양은 분석 시료 내의 프로게스테론의 양에 정비례한다.

따라서, 사용자(축주)는 스트립부재 상 검사선과 대조선의 발색한 선홍색의 밴드 색상 또는 발색정도를 상대적으로 비교하여 소의 임신여부를 판단하게 되는데 이때 대조선과 비교하여 검사선의 발색정도가 낮으면 임신으로 판단되고, 대조선과 비교하여 검사선의 발색정도가 높으면 비임신으로 판단하게 되는 것이다.

이하, 본 발명의 소의 임신 진단용 키트를 이용하여 소의 임신을 진단하는 방법에 대하여 실시예 및 실험예를 통하여 상세히 설명하면 다음과 같다.

그러나, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

<실시예 1> 소의 임신 진단용 키트의 제조1

1. 대조선에 코팅할 항 마우스 면역글로불린지(Anti-mouse IgG) 생산

1) 항체 생산 및 정제

소의 프로게스테론(progesterone)을 면역원(sigma 구입)으로 하여 전통적인 융합세포 기술(hybridoma technology)에 의하여 융합세포(Hybridoma)를 확보한 후, 면역분석법(direct-ELISA)로 스크리닝(screening)하여 클론(clone) 선택한 다음 선택된 clone를 마우스의 복강 내에서 증식시켰다

더 구체적으로 예시하면,

(1) B 세포(B-cell) 확보

소의 프로게스테론을 항원으로 하여 마우스에 피하주사로 접종한 후 1주일 간격으로 재차 접종하여 1 주일 후 미정맥에서 채혈하여 분석용 검체로 사용하고, 항원과 반응성이 높은 검체를 선택하여 검체를 공급한 마우스의 비장(spleen)을 분쇄하여 융합(fusion)시 사용할 항 프로게스테론(anti-progesterone) 생성능이 있는 B 세포(B-cell)을 확보하였다.

(2) 융합 & 클로닝(fusion & cloning)

상기와 같이 확보된 B 세포와 골수종 세포(myeloma cells, SP2/0)를 적절히 혼합하고 PEG를 첨가하여 융합하였다.

이렇게 항체의 생성능이 확인된 융합세포(hybridoma)를 항원과의 반응성이 높은 것을 선택하여 클론(clone)을 확보하였다.

(3) 항체생산과 정제(Antibodies production 과 purification)

상기 클론(clone)의 배양은 배양플라스크(culture flask)를 이용한 in vitro 방법과 mouse를 이용한 in vivo방법을 이용하였다.

(4) 클론과 항체의 선택

상기 항체를 이용하여 항원과 높은 결합력이 인지되는 clone을 ELISA로 확인 한 후 보관하였다.

2) 항 마우스 면역글로불린지(Anti-mouse IgG) 생산

상기와 같이 정제된 mouse IgG를 면역원으로 하여 항체를 생산한 후 정제된 항체 1 mg/ml와 IFA(incomplete Freund's adjuvant) 1ml를 혼합하여 피하주사한 다음, 1주일 간격으로 4회 피하주사하여 5주째 경정맥에서 채혈하여 혈장을 취하고 분자분리법(affinity chromatography)을 이용하여 정제 후 실험에 사용하였다.

3) ELISA 키트의 공식화(Fomulation of a ELISA kit)

선택된 항체를 sandwich ELISA를 이용하여 접합(pairing)하여 후보 항체군을 선택한 후, 항체 중 하나는 마이크로웰플레이트(microwellplate)의 폴리스티렌(polystyrene)에 접합(binding)시키고, 다른 하나의 항체는 페록시다아제(peroxidase)와 결합(conjugation)하여 사용하였다.

2. 검사선에 코팅할 콜로이드 금입자 결합체 생산

1) 콜로이드 상태의 금입자 생산(Colloidal gold particle production)

금 클로라이드(gold chloride)를 증류수에 녹여 여과(pore size 0.45 ㎛)한 후, 여과액의 일정량을 취하여 증류수에 넣고 환원제(sodium citrate)용액을 첨가한 다음 금입자(gold particle)를 제조한 후 여과(pore size 0.45 ㎛)하여 냉장 보 관하였다.

2) 금-항체 결합체(Gold-antibody conjugate)의 제조

상기 콜로이드 상태의 금입자(Colloidal gold particle)를 마그네틱 스틸러(magnetic stirrer)를 이용한 교반상태에서 정제된 항체용액을 분주 결합한 후 남아있는 입자(particle)의 표면에는 10 % BSA(pH 9.0)를 첨가한 다음 반응(blocking)한 후, 반응액을 고속원심분리기(high-speed centrifuge, 7500 rpm, 30 분)을 이용하여 농축한 다음, 상등액을 버리고 남아있는 소량의 용액과 침전물을 완전히 혼합한 후 여과하여 냉장 보관하였다.

3. 키트형성시 사용될 맴브레인 선택(membrane casting technologies)

(1) 니트로셀룰로오스 멤브레인 취급 - 다공성 박막형 스트립부재(10)

(2) 샘플 패드(20) 취급

(3) 금결합 패드(30) 취급 - 안정제인 슈크로스(sucrose)를 전처리 한 후 상기 콜로이드 금입자 결합체에 보조제를 첨가한 용액이 함유됨.

(4) 흡수지(40) 취급

4. 키트제조

다공성 박막형 스트립부재(10)의 일단표면에 샘플패드(20)를 적층하고, 적층된 샘플패드(20)와 스트립부재(10) 사이에 금결합 패드(30) 적층하며, 스트리부재 의 타단표면에는 흡수지(40)를 적층해서 본 발명의 임신 진단용 키트를 조립하여 생성하였다.

상기와 같이 조립된 키트는 적당한 플라스틱 지지대에 넣어 밀봉하여 보관하고 실험에 사용하였다.

5. 검사대상 - 21 일령의 임신우와 비임신우의 대상으로 정하여 측정하였다.

6. 검사시료 - 상기 검사대상의 소의 분변을 이용하므로 분변의 전처리로써 분변 용기에 분변을 채집하여 검사시 까지 냉동상태로 유지하였다.

상기와 같이 보관해둔 분변 1 g에 100 % 메탄올 1 ㎖를 넣고 1 분정도 흔들어서 섞어(shaking, 25x100rpm 1 min in RT)준 뒤 1차 원심분리기로(centrifugation 7000 rpm, 15min) 걸러낸 후, 다시 2차 원심분리기(recentrifugation 12,000 rpm, 40min in E.P tube)로 걸러진 소분변추출액을 -20 ℃에서 보관해 두었다.

이렇게 생성된 소분변추출액을 키트에 사용할때 200 ㎕ 이상 떨어뜨려 발색정도를 확인하였다.

<실시예 2> 소의 임신 진단용 키트의 제조2

상기 실시예 1과 같은 방법으로 제조하되, 금-항체 결합체 제조시 10 % BSA(pH 9.0) 대신 10 % KLH(pH 9.0)를 사용하여 본 발명의 키트를 제조하였다.

<실험예 1> 추출액 종류에 따른 소분변 속 프로게스테론의 정량실험결과

1. 추출액의 종류

1) 100 % 메탄올(Buffer 1: Methyl alcohol, HAYMAN)

2) 100% 에탄올과 석유에테르(Buffer 2: ethanol & Petroleum ether, Wako 161-00805)

3) 0.05M 붕산(Buffer 3 : boric acid, bioshop, #BOR001)

4) 인산완충용액(Buffer 4 : PBS, Phosphate Buffered Saline)

2. 실험방법

상기 추출액의 종류별로 보관해둔 분변 1 g당 상기 추출액을 각각 1 ㎖씩 넣고 1 분정도 흔들어서 섞어(shaking, 25x100rpm 1 min in RT)준 뒤 1차 원심분리기로(centrifugation 7000 rpm, 15min) 걸러낸 후, 다시 2차 원심분리기(recentrifugation 12,000 rpm, 40min in E.P tube)로 걸러서 프로게스테론의 정량을 각각 측정하였다.

3. 실험결과

추출액 종류별 테스트(extraction buffer test)
	Buffer 1	Buffer 2	Buffer 3	Buffer 4
OD450	0.591	1.731	1.339	1.358
concentrate	18.2	1.3	3.3	3.3

상기의 표 1과 도 6에 나타나 있듯이, 소의 분변을 100% methanol을 이용하여 추출하는 방법이 다른 buffer에 비해 가장 효율적임을 알 수 있다.

<실험예 2> 토끼 항 프로게스테론 다클론성 항체(Rabbit anti-progesterone polyclonal Antibody) 생성확인

1. 항원준비

항원으로 소혈청알부민(BSA : bovine serum albumin), 소혈청알부민-프로게스테론 결합체(BSA-progesterone-3CMO conjugate), 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH : keyhole limpet hemocyanin), 키홀 림펫 헤모시아닌-프로게스테론 결합체(KLH-progesterone-3CMO conjugate), 프로게스테론(P-3CMO : Progesterone-3-O-carboxymethyloxime)를 각각 100 ng/well씩 사용하였다.

2. 실험방법

프로게스테론에 특이적인 다클론성 항체(polyclonal antibody)를 만들기 위해, BSA와 KLH에 프로게스테론(progesterone)을 각각 결합(conjugation) 하였다.

이것을 KLH/P (KLH-progesterone conjugate), BSA/P (BSA-progesterone conjugate), KLH/P, BSA/P 순으로 rabbit에 주사 하였다.

3. 실험결과

도 7에 나타나 있듯이, 상기 토끼(Rabbit)로 부터 얻은 항체(serum)를 이용하여 프로게스테론에 특이적인 항체가 형성 되었는지 ELISA assay를 통해 확인 한 결과 KLH/P와 BSA/P에 특이적인 항체가 형성 된 것을 확인 할 수 있었습니다.

<실험예 3> 마우스 항 프로게스테론 단일클론성 항체(Mouse anti-progesterone polyclonal Antibody) 생성확인

1. 실험방법

상기 실험예 2의 토끼(Rabbit)와 마찬가지로 프로게스테론(Progesterone)에 특이적인 다클론성 및 단일클론성 항체(polyclonal & monoclonal antibody)를 만들기 위해, BSA와 KLH에 프로게스테론(progesterone)을 각각 결합(conjugation)하고, 동일 순으로 주입(injection) 하였다.

2. 실험결과

도 8에 나타나 있듯이 마우스(Mouse)로 부터 얻은 혈청(serum)을 이용하여 프로게스테론(Progesterone)에 특이적인 항체가 형성 되었는지 ELISA assay를 통해 확인 한 결과 KLH/P와 BSA/P에 특이적인 항체가 형성된 것을 확인 할 수 있었습니다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 소의 임신 진단용 키트를 나타낸 도면.

도 2는 도 1의 임신 진단용 키트에서 임신상태를 나타낸 도면.

도 3은 도 2의 검사선에서 일어나는 반응을 나타낸 도면.

도 4는 도 1의 임신 진단용 키트에서 비임신상태를 나타낸 도면.

도 5는 도 4의 검사선에서 일어나는 반응을 나타낸 도면.

도 6은 소분변 속 프로게스테론의 정량실험결과를 나타낸 그래프.

도 7은 토끼로 부터 얻은 혈청을 이용하여 ELISA assay를 통해 프로게스테론에 형성되는 항체를 나타낸 그래프.

도 8은 마우스로 부터 얻은 혈청을 이용하여 ELISA assay를 통해 프로게스테론에 형성되는 항체를 나타낸 그래프.

<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>

10 : 스트립 부재

11 : 검사선 13 : 대조선

20 : 시료패드 30 : 금결합 패드

40 : 흡수지 50 : 소분변추출액

Claims

일정 길이를 갖는 다공성 박막형 스트립부재;

프로게스테론-소혈청알부민 결합체(progesterone-BSA conjugate) 또는 프로게스테론-키홀 림펫 헤모시아닌 결합체(progesterone-KLH conjugate) 중 선택된 1종을 상기 스트립부재의 일표면에 일단과 인접하게 코팅함으로써 형성되며, 스트립부재의 일단으로부터 함침되어 타단으로 이동하는 프로게스테론이 함유된 소분변추출액과 항 프로게스테론-콜로이드 금입자 결합체가 결합된 결합액과 반응하여 발색하는 검사선;

항 마우스 면역글로불린지(anti-mouse IgG)를 상기 스트립부재의 일표면에 타단과 인접하게 코팅함으로써 형성되며, 상기 결합액과 반응하여 발색하여 검사선의 발색정도를 대조할 수 있도록 한 대조선; 및

상기 대조선과 인접하는 스트립부재의 타단 표면에 일체화되게 적층되어, 스트립부재의 일단으로부터 함침되는 상기 결합액을 타단으로 이동할 수 있게 흡수하도록 한 흡수지;를 포함하여 구성되되,

상기 스트립부재의 일단 표면에는 외부로부터 투입되는 프로게스테론이 함유된 소분변추출액을 함침하여 스트립부재의 일단으로 이동시키기 위한 시료패드가 적층되고, 시료패드와 스트립부재의 사이에는 항 프로게스테론-콜로이드 금입자 결합체를 함유하여 그 항 프로게스테론-콜로이드 금입자 결합체를 소분변추출액과 결합시켜 스트립부재의 일단으로부터 타단으로 이동하는 상기 결합액을 만들도록 한 금결합체 패드가 더 적층됨을 특징으로 하는,

소의 임신 진단용 키트.
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제1항에 있어서,

상기 스트립부재는 니트로셀룰로스 멤브레인으로 이루어진 것을 특징으로 하는,

소의 임신 진단용 키트.
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