KR100900360B1 - 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지 - Google Patents

탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지 Download PDF

Info

Publication number
KR100900360B1
KR100900360B1 KR1020077004238A KR20077004238A KR100900360B1 KR 100900360 B1 KR100900360 B1 KR 100900360B1 KR 1020077004238 A KR1020077004238 A KR 1020077004238A KR 20077004238 A KR20077004238 A KR 20077004238A KR 100900360 B1 KR100900360 B1 KR 100900360B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
chondrocytes
dedifferentiated
medium
redifferentiation
bmp
Prior art date
Application number
KR1020077004238A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20070047789A (ko
Inventor
가즈토 호시
유이치 데이
히로시 가와구치
고조 나카무라
쓰요시 다카토
Original Assignee
후지소프트 가부시키가이샤
가즈토 호시
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 후지소프트 가부시키가이샤, 가즈토 호시 filed Critical 후지소프트 가부시키가이샤
Publication of KR20070047789A publication Critical patent/KR20070047789A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100900360B1 publication Critical patent/KR100900360B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0655—Chondrocytes; Cartilage
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/105—Insulin-like growth factors [IGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/33—Insulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/395—Thyroid hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells

Abstract

본 발명은 시험관내에서 배양 중 등에 있어서 탈분화되어 연골 특성이 감약한 탈분화형 연골 세포를 원래의 연골 세포로 효율적이고도 용이하게 재분화시킬 수 있는, 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지 및 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 이를 위해, 탈분화되어 연골 특성이 감약한 탈분화형 연골 세포를 원래의 연골 세포로 재분화시키기 위해 사용되는 인슐린과 BMP-2 및 그의 유사체로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지, 및 상기 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지를 이용하여 탈분화형 연골 세포를 배양함으로써 상기 탈분화형 연골 세포를 원래의 연골 세포로 재분화시키는 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화 방법을 제공한다. 상기 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지는 추가로 T3을 포함하는 태양이 바람직하다.

Description

탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지{MEDIUM FOR THE REDIFFERENTIATION OF DEDIFFERENTIATED CHONDROCYTES INTO CHONDROCYTES}
본 발명은 시험관내(in vitro)에서 배양 중 등에 있어서 탈분화(脫分化)되어 연골 특성이 감약(減弱)한 탈분화형 연골 세포를 원래의 연골 세포로 재분화시키기 위한, 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지에 관한 것이다.
연골은 귀, 코, 기관, 관절, 디스크 등을 구성하고, 뼈와 더불어 몸의 형태 유지나 일상 생활 동작을 하는데 있어서 중요한 역할을 다하고 있다. 이러한 연골이 관절 연골 손상 등의 외상, 변형성 관절증 등의 가령성(加齡性) 질환, 관절 류마티즘 등의 염증성 질환, 종양 수술 후의 대형 질환, 선천 이상 등으로 장해를 받으면 보행 등의 생활 동작이 곤란하게 되거나, 몸의 외형을 유지할 수 없게 되는 등, 일상 생활에 현저한 장해를 초래하게 된다. 연골에 관한 이들 질환 등의 환자수는 많고, 상기 변형성 관절증의 발증자수는 연간 90만명이라고도 일컬어지고 있어, 이들 질환 등에 유효한 해결책이 요구되고 있다.
종래에 있어서는, 이들 질환 등에 대하여 인공 관절의 이용, 자기 연골의 이 식 등의 처치가 행하여져 왔지만, 내구성, 감염, 급여부(donor site) 곤란 등의 문제가 있기 때문에, 이러한 문제가 없는 해결책이 필요하여, 연골 재생 의료를 가능하게 하는 기술의 개발에 대한 기대가 높아지고 있다.
상기 연골 재생 의료에는 연골 세포의 효율적인 배양 기술의 확립이 필수이고, 연골 세포의 배양·증식 방법에 관해서는 다수 보고되어 있지만(특허문헌 1 및 2 참조), 연골 세포는 배양 중에 매우 높은 확률로 탈분화되어, 선유아세포상으로 변화되는데, 상기 연골 세포가 탈분화되어 선유아세포상의 탈분화형 연골 세포로 변화되어 버린 경우의 대응책·해결책으로서는 정수압을 이용하여 탈분화형 연골 세포를 재분화시키는 방법, 3차원 배양을 행하여 탈분화형 연골 세포로 재분화시키는 방법 등이 제안되어 있지만, 이들 방법의 경우 상기 탈분화형 연골 세포를 원래의 연골 세포로 효율적이고도 용이하게 재분화시킬 수 없는 것이 현상이다. 상기 연골 재생 의료를 실현하기 위해서는, 시험관내에서 배양 중 등에 있어서 탈분화되어 연골 특성이 감약한 탈분화형 연골 세포를 원래의 연골 세포로 효율적이고도 용이하게 재분화시킬 수 있는 기술의 제공이 요구되고 있다.
특허문헌 1: 일본 특허공표 제2003-534792호 공보
특허문헌 2: 일본 특허공표 제2004-502401호 공보
발명의 개시
본 발명은 종래에 있어서의 문제를 해결하고, 이하의 목적을 달성하는 것을 목적으로 한다. 즉, 본 발명은 코, 귀, 인후, 관절 등의 연골의 결손·손상 부위의 이식용 소재, 미용 정형 등의 미용용 소재 등의 효율적인 생산에 중요하고, 연 골 재생 의료의 발전에 공헌가능하고, 시험관내에서 배양 중 등에 있어서 탈분화되어 선유아세포상으로 변화되어 버린 탈분화형 연골 세포를 원래의 연골 세포로 효율적이고도 용이하게 재분화시킬 수 있는, 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지 및 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상술한 현상에 비추어, 본 발명의 발명자들이 예의 검토한 결과, 인슐린과 BMP-2를 병용했을 때에, 더욱 바람직하게는 T3을 병용했을 때에, 탈분화되어 연골 특성이 감약한 탈분화형 연골 세포를 원래의 연골 세포로 효율적이고도 용이하게 재분화시킬 수 있음을 발견했다. 본 발명은, 본 발명자들에 의한 상기 지견에 근거하는 것으로, 상기 과제를 해결하기 위한 수단은 이하와 같다. 즉,
<1> 탈분화되어 연골 특성이 감약한 탈분화형 연골 세포를 원래의 연골 세포로 재분화시키기 위해 사용되는 인슐린과 BMP-2 및 그의 유사체로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지이다.
<2> T3을 포함하는 상기 <1>에 기재된 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지이다.
<3> BMP-2의 유사체가 BMP-4인 상기 <1> 또는 <2>에 기재된 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지이다.
<4> 인슐린을 0.05 내지 500㎍/mL 포함하는 상기 <1> 내지 <3> 중 어느 하나에 기재된 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지이다.
<5> BMP-2 및 그의 유사체로부터 선택되는 1종 이상을 1ng/mL 내지 40㎍/mL 포함하는 상기 <1> 내지 <4> 중 어느 하나에 기재된 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지이다.
<6> T3을 10-9 내지 10-5M 포함하는 상기 <1> 내지 <5> 중 어느 하나에 기재된 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지이다.
<7> 선유아세포 성장 인자 2(FGF-2), 인슐린 유사 성장 인자류(IGF-1), 부갑상선 호르몬(PTH), 성장 호르몬(GH), 글루코코르티코이드, 바이타민 D, IL-1 수용체 길항제, 에스트로겐, 안드로겐, 형질 전환 성장 인자 α(TGFα), 형질 전환 성장 인자 β(TGFβ), 뼈형태 형성 단백류(BMP), 표피 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자류, 트랜스페린, 아셀레늄산, 리놀산, 알부민, 아스코르브산, 연골 모듈린류, 헤파린 결합 인자, α 선유아세포 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, 세포 분열 촉진 호르몬, 결합 조직 성장 인자, 간세포 성장 인자, 아라키돈산, 프로스타그란딘 A, 프로스타그란딘 B, 프로스타그란딘 E, 프로스타그란딘 F 및 히스타민으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 상기 <1> 내지 <6> 중 어느 하나에 기재된 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지이다.
<8> 재분화된 연골 세포가 유리 연골 세포 및 탄성 연골 세포로부터 선택되는 상기 <1> 내지 <7> 중 어느 하나에 기재된 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지이다.
<9> 재분화된 연골 세포가 평면 배양, 3차원 배양 및 펠렛 배양 중 어느 하나에 의 해 배양되는 상기 <1> 내지 <8> 중 어느 하나에 기재된 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지이다.
<10> 상기 <1> 내지 <9> 중 어느 하나에 기재된 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지를 이용하여, 탈분화되어 연골 특성이 감약한 탈분화형 연골 세포를 배양함으로써 상기 탈분화형 연골 세포를 원래의 연골 세포로 재분화시키는 것을 특징으로 하는 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화 방법이다.
<11> 배양이 3 내지 6주간 행해지는 상기 <10>에 기재된 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화 방법이다.
<12> 재분화된 연골 세포에 있어서의 II형 콜라겐 발현·생산량값 C와 탈분화형 연골 세포에 있어서의 II형 콜라겐 발현·생산량값 D의 비(C/D)가 1 이상인 상기 <10> 또는 <11>에 기재된 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화 방법이다.
<13> 탈분화형 연골 세포에 있어서의 I형 콜라겐 발현·생산량이 생체내의 연골 세포의 I형 콜라겐 발현·생산량 이상이고, 또한 II형 콜라겐 생산량이 생체내의 연골 세포의 II형 콜라겐 발현·생산량 이하이고, 또한 II형 콜라겐 발현·생산량이 탈분화형 연골 세포의 II형 콜라겐 발현·생산량 이상인 상기 <10> 내지 <12> 중 어느 하나에 기재된 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화 방법이다.
<14> 탈분화형 연골 세포에 있어서의 압박 강도, 파단 강도 및 영률이 재분화된 연골 세포에 있어서의 압박 강도, 파단 강도 및 영률보다도 큰 상기 <10> 내지 <13> 중 어느 하나에 기재된 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화 방법이다.
도 1은 좌측 도면이 배양 개시 직후의 연골 세포(PO)의 사진이고, 우측 도면이 배양 개시로부터 약 30일간 4회 계대한 연골 세포(P4)의 사진이다. 상측 도면이 배양 개시 직후의 연골 세포(P0)와 배양 개시로부터 약 30일간 4회 계대한 연골 세포(P4)에 있어서의 유전자의 발현상태를 나타내는 전기영동에 있어서의 밴드의 유무를 나타내는 사진이다.
도 2는 인슐린과 BMP-2와 T3을 포함하는 배지 및 인슐린과 BMP-2를 포함하는 배지를 이용하여 배양한 상기 탈분화형 연골 세포에 있어서의 I형 콜라겐의 발현량의 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 인슐린과 BMP-2와 T3을 포함하는 배지 및 인슐린과 BMP-2를 포함하는 배지를 이용하여 배양한 상기 탈분화형 연골 세포에 있어서의 II형 콜라겐의 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 인슐린과 BMP-2와 T3을 포함하는 배지 및 인슐린과 BMP-2를 포함하는 배지를 이용하여 배양한 상기 탈분화형 연골 세포에 있어서의 X형 콜라겐의 발현량의 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 인슐린과 BMP-2와 T3을 포함하는 실시예 2의 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지에 있어서의 상기 BMP-2의 함유량의 바람직한 범위를 비교 검토한 결과를 나타내는 데이터이다.
도 6은 인슐린과 BMP-2와 T3을 포함하는 실시예 2의 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지에 있어서의 상기 인슐린의 함유량의 바람직한 범위를 비교 검토한 결과를 나타내는 데이터이다.
도 7은 인슐린과 BMP-2와 T3을 포함하는 실시예 2의 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지에 있어서의 상기 T3의 함유량의 바람직한 범위를 비교 검토한 결과를 나타내는 데이터이다.
도 8은 배양한 탈분화형 연골 세포로의 재분화용 배지에 있어서의 인슐린, BMP-2, T3의 각 함유량이 각각 5㎍/mL, 20Ong/mL, 10-7M인 경우와, 상기 BMP-2를 BMP-4로 대체한 것 이외에는 같은 조성의 배지에 있어서의 I형 콜라겐의 유전자 발현량의 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 배양한 탈분화형 연골 세포로의 재분화용 배지에 있어서의 인슐린, BMP-2, T3의 각 함유량이 각각 5㎍/mL, 200ng/mL, 10-7M인 경우와, 상기 BMP-2를 BMP-4로 대체한 것 이외에는 같은 조성의 배지에 있어서의 II형 콜라겐의 유전자 발현량의 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10은 배양한 탈분화형 연골 세포로의 재분화용 배지에 있어서의 인슐린, BMP-2, T3의 각 함유량이 각각 5㎍/mL, 200ng/mL, 10-7M인 경우와, 상기 BMP-2를 BMP-4로 대체한 것 이외에는 같은 조성의 배지에 있어서의 X형 콜라겐의 유전자 발현량의 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11은 3차원 배양에 의한 3차원 배양물에 있어서의 기계적 성질로서의 압축 강도의 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 12는 3차원 배양에 의한 3차원 배양물의 사진 데이터이다.
도 13은 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지를 이용한 배양물을 누드 마우스의 피하에 2개월간 이식했을 때의 배양물의 기계적 성질로서 압축 강도를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 14는 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지를 이용한 배양물을 누드 마우스의 피하에 2개월간 이식했을 때의 배양물의 사진 데이터이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
(탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지 및 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화 방법)
본 발명의 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지는 시험관내에서 배양 중 등에 있어서 탈분화되어 연골 특성이 감약한 탈분화형 연골 세포를 원래의 연골 세포로 재분화시키기 위해 사용되는 인슐린과 BMP-2 및 그의 유사체로부터 선택되는 1종 이상을 포함하고, 더욱 바람직하게는 T3을 포함하고, 또한 필요에 따라 적절히 선택한 기타 성분을 포함한다.
본 발명의 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화 방법은 본 발명의 상기 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지를 이용하여, 시험관내에서 배양 중 등에 있어서 탈분화되어 연골 특성이 감약한 탈분화형 연골 세포를 배양함으로써 상기 탈분화형 연골 세포를 원래의 연골 세포로 재분화시키는 것을 포함하고, 필요에 따라 적절히 선택한 기타 처리 등을 포함한다.
이하, 본 발명의 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지와, 그것을 이용한 본 발명의 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화 방법에 관하여 설명한다.
상기 인슐린으로서는, 특별히 제한은 없고 목적에 따라 적절히 선택할 수 있고, 예컨대 시판품이라도 좋고, 적절히 합성한 것이라도 좋다.
상기 인슐린의 상기 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지에 있어서의 함유량으로서는, 특별히 제한은 없고 목적에 따라 적절히 선택할 수 있지만, 예컨대 0.05 내지 500㎍/mL인 것이 바람직하다.
상기 인슐린의 함유량이 0.05㎍/mL 미만이면 재분화가 유도되지 않는 경우가 있고, 500㎍/mL를 초과하면 재분화의 유도가 저해되는 경우가 있다.
상기 BMP-2는 뼈형성 단백(bone morphogenetic protein-2)을 의미한다. 상기 BMP-2로서는, 특별히 제한은 없고 목적에 따라 적절히 선택할 수 있고, 예컨대 시판품이라도 좋고, 적절히 합성한 것이라도 좋다.
상기 BMP-2의 유사체(아날로그)로서는, 특별히 제한은 없고 공지된 것 중에서 적절히 선택할 수 있고, 예컨대 BMP-4 등을 적합하게 들 수 있다.
상기 BMP-2 및 그의 유사체로부터 선택되는 1종 이상으로서는, 예컨대 상기 BMP-2와 상기 BMP-4를 병용할 수도 있고, 상기 BMP-2 또는 상기 BMP-4를 단독으로 사용할 수도 있지만, 상기 BMP-2를 단독으로 사용하는 것이 바람직하다.
상기 BMP-2 및 그의 유사체로부터 선택되는 1종 이상의 상기 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지에 있어서의 함유량으로서는, 특별히 제한은 없고 목적에 따라 적절히 선택할 수 있지만, 예컨대 1ng/mL 내지 40㎍/mL인 것이 바람직하다.
상기 BMP-2 및 그의 유사체로부터 선택되는 1종 이상의 함유량이 1ng/mL 미만이면 재분화가 유도되지 않는 경우가 있고, 40㎍/mL를 초과하면 재분화의 유도가 저해되는 경우가 있다.
상기 T3은 갑상선 호르몬(Triiodothyronine)을 의미한다. 상기 T3으로서는, 특별히 제한은 없고 목적에 따라 적절히 선택할 수 있고, 예컨대 시판품을 사용할 수도 있고, 적절히 합성한 것을 사용할 수도 있다.
상기 T3이 상기 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지에 함유되어 있으면, 상기 인슐린과 상기 BMP-2 및 그의 유사체로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 경우에 비해, 상기 탈분화형 연골 세포를 보다 효율적으로 재분화시킬 수 있을 뿐만 아니라, 또한 뼈로 될 때에 발현이 많이 보이는 X형 콜라겐의 발현을 효과적으로 억제시킬 수 있는 점에서 유리하다.
상기 T3의 상기 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지에 있어서의 함유량으로서는, 특별히 제한은 없고 목적에 따라 적절히 선택할 수 있지만, 예컨대 10-9 내지 10-5M인 것이 바람직하다.
상기 T3의 함유량이 10-9M 미만이면 재분화가 효율적으로 유도되지 않는 경우가 있고, 10-5M을 초과하면 재분화의 유도가 저해되는 경우가 있고, 상기 수치 범위내이면 상기 인슐린과 상기 BMP-2 및 그의 유사체로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 경우에 비해 상기 탈분화형 연골 세포를 보다 효율적으로 재분화시킬 수 있을 뿐만 아니라, 또한 상기 X형 콜라겐의 발현을 효과적으로 억제시킬 수 있다.
상기 기타 성분으로서는, 특별히 제한은 없고 목적에 따라 적절히 선택할 수 있고, 예컨대 상기 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화에 영향을 미칠 수 있는 것, 용매 등을 적합하게 들 수 있다.
상기 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화에 영향을 미칠 수 있는 것으로서는, 특별히 제한은 없고 목적에 따라 적절히 선택할 수 있고, 예컨대, 선유아세포 성장 인자 2(FGF-2), 인슐린 유사 성장 인자류(IGF-1), 부갑상선 호르몬(PTH), 성장 호르몬(GH), 글루코코르티코이드(덱사메타손 등), 바이타민 D, IL-1 수용체 길항제, 에스트로겐, 안드로겐(테스토스테론 등, 형질 전환 성장 인자 α(TGFα), 형질 전환 성장 인자 β(TGFβ), 뼈형태 형성 단백류(BMP), 표피 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자류, 트랜스페린, 아셀레늄산, 리놀산, 알부민, 아스코르브산, 연골 모듈린류, 헤파린 결합 인자, α 선유아세포 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, 세포 분열 촉진 호르몬, 결합 조직 성장 인자, 간세포 성장 인자, 아라키돈산, 프로스타그란딘 A, 프로스타그란딘 B, 프로스타그란딘 E, 프로스타그란딘 F 및 히스타민 등을 들 수 있다.
이들은 1종 단독으로 사용할 수도 있고, 2종 이상을 병용할 수도 있다.
상기 용매 등으로서는, 특별히 제한은 없고 목적에 따라 적절히 선택할 수 있고, 예컨대 물 등을 적합하게 들 수 있다.
상기 물로서는, 멸균수, 밀리포어 Q수 등을 들 수 있다.
상기 기타 성분의 상기 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지에 있어서의 함유량(합계량)으로서는, 특별히 제한은 없고 목적에 따라 적절히 선택할 수 있다.
본 발명의 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지에 의한 배양 대상인 상기 탈분화형 연골 세포는 연골 세포가 시험관내에서 배양 중 등에 있어서 탈분화되어 연골 특성이 감약한 세포이다.
본 발명에 있어서, 상기 연골 특성이란, 생체내에서의 상기 I형 콜라겐 및 상기 II형 콜라겐의 발현·생산량을 의미하고, 상기 연골 특성이 감약한이란, 상기 I형 콜라겐의 발현·생산량(A)과 상기 탈분화형 연골 세포로 탈분화되기 전의 상기 연골 세포(탈분화전 연골 세포)에 있어서의 상기 I형 콜라겐의 발현·생산량(B)의 비(A/B)가 1 이상인 것, 또는 상기 II형 콜라겐의 발현·생산량(c)과 상기 탈분화형 연골 세포로 탈분화되기 전의 상기 연골 세포(탈분화전 연골 세포)에 있어서의 상기 II형 콜라겐의 발현·생산량(D)의 비(C/D)가 1 이하인 것을 의미한다.
한편, 상기 탈분화전 연골 세포란, 상기 탈분화형 연골 세포가 유래되는 생체내의 연골 세포를 의미한다.
상기 연골 특성이 감약한 탈분화형 연골 세포인지, 또는 상기 탈분화전 연골 세포 또는 상기 탈분화형 연골 세포로부터 재분화된 연골 세포(재분화 연골 세포)인지에 관해서는 상기 I형 콜라겐 발현·생산량, 상기 II형 콜라겐 발현·생산량, 상기 X형 콜라겐의 발현·생산량, 압박 강도, 파단 강도, 영률, 평형 압박 계수 등에 따라서 판단할 수 있다.
즉, 상기 II형 콜라겐의 발현·생산량이 생체내의 연골 세포보다 적고, 상기 I형 콜라겐의 발현·생산량이 생체내의 연골 세포보다 많고, 압박 강도, 파단 강도, 영률, 평형 압박 계수 등이 생체내의 연골 조직보다 낮은 값으로 되는 세포는 상기 탈분화형 연골 세포일 가능성이 높고, 한편 상기 I형 콜라겐 발현·생산량이 적고, 상기 II형 콜라겐 발현·생산량이 많고, 압박 강도, 파단 강도, 영률, 평형 압박 계수 등이 자극전의 탈분화형 연골 세포에 비해 높은 값으로 되는 세포는 상기 재분화 연골 세포일 가능성이 높다고 판단할 수 있다.
여기서, 상기 연골 세포는 연골 기질을 생산하고, 톨루이딘 블루에 의한 염색에 대해서는 이염색성을 가져, 톨루이딘 블루 염색에 의한 식별이 가능하다.
상기 연골 세포에 있어서는, 일반적으로 I형 콜라겐의 발현·생산량이 적고, 뼈가 될 때에 발현이 많이 보이는 X형 콜라겐의 발현·생산량이 적고, II형 콜라겐의 발현·생산량이 많고, 또한 일반적으로 COL2A1 유전자, COL9A1 유전자, COL11A2 유전자, Aggrecan 유전자, Matrillin 3 유전자 및 Chondromodulin 1 유전자 중 적어도 하나가 상기 탈분화형 연골 세포보다도 고도로 발현하고 있다.
이 때문에, 상기 연골 세포에 있어서의 상기 I형 콜라겐 발현·생산량이 보이면 상기 연골 세포가 탈분화되어 선유아세포상의 탈분화형 연골 세포로의 변화가 생길 가능성이 있다. 한편, 상기 COL2A1 유전자, 상기 COL9A1 유전자, 상기 COL11A2 유전자, 상기 Aggrecan 유전자, 상기 Matrillin 3 유전자 및 상기 Chondromodulin 1 유전자는 상기 연골 세포에서 고도로 발현하는 유전자이고, 이들 유전자와 이들 유전자의 발현 결과로서의 II형 콜라겐 등의 단백질은 정상인 연골 세포의 마커로 될 수 있다. 한편, 이들 이외에, 프로테오글리칸 등도 정상인 연골 세포의 마커로 될 수 있다.
상기 연골 세포의 구체예로서는, 예컨대 관절 연골 세포(관절 연골 비하중부 유래의 연골 세포), 늑연골 세포(늑연골 유래의 연골 세포) 등의 유리 연골 세포, 이개 연골 세포(이개 연골 유래의 연골 세포) 등의 탄성 연골 세포 등을 들 수 있다.
이들은 통상 1종 단독으로 사용되지만, 2종 이상을 병용할 수도 있다.
상기 재분화 연골 세포는 상기 탈분화전 연골 세포와 마찬가지이고, 상기 재분화 연골 세포에 있어서는, 그의 상기 II형 콜라겐 발현·생산량값 C와 상기 탈분화형 연골 세포에 있어서의 상기 II형 콜라겐 발현·생산량값 D의 비(C/D)가 1을 초과하면 특별히 제한은 없지만, 10 이상이 바람직하고, 100 내지 1000이 보다 바람직하다.
상기 탈분화형 연골 세포의 상기 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지에 대한 접종 세포량으로서는, 특별히 제한은 없고 목적에 따라 적절히 선택할 수 있고, 예컨대 105 내지 109개/mL 정도가 바람직하고, 106 내지 108개/mL가 보다 바람직하다. 상기 탈분화형 연골 세포의 접종 세포량이 105개/mL 미만이면 세포가 저영양 상태가 될 가능이 있고, 109개/mL를 초과하면 세포가 저산소·저영양 상태가 될 가능성이 있다.
상기 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지에 접종하는 상기 탈분화형 연골 세포로서는, 특별히 제한은 없고 목적에 따라 적절히 선택할 수 있고, 예컨대 연골 세포의 시험관내에서의 배양 중에 탈분화되어 상기 탈분화형 연골 세포에 변화된 것, 상기 탈분화형 연골 세포로서 추출등한 것 등을 들 수 있지만, 전자의 것을 적합하게 들 수 있다.
상기 탈분화형 연골 세포의 상기 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지에서의 배양 조건으로서는, 특별히 제한은 없고 목적에 따라 적절히 선택할 수 있다.
상기 배양에 있어서의 배양 시간으로서는, 특별히 제한은 없고 목적에 따라 적절히 선택할 수 있지만, 예컨대 통상 1주간 이상이고, 3 내지 6주간이 바람직하다.
상기 배양 시간이 1주간 미만이면 재분화가 충분히 일어나지 않는 경우가 있다.
상기 배양에 있어서의 온도로서는, 특별히 제한은 없고 목적에 따라 적절히 선택할 수 있고, 예컨대 통상 32 내지 42℃이고, 34 내지 39℃가 바람직하다.
상기 배양 온도가 32℃ 미만이면 재분화 장해 또는 세포사(細胞死)를 일으키는 경우가 있다.
상기 배양에 있어서의 산소 분압으로서는, 특별히 제한은 없고 목적에 따라 적절히 선택할 수 있고, 통상 10 내지 30%이고, 15 내지 25%가 바람직하다.
상기 산소 분압이 10% 미만이면 재분화 장해 또는 세포사를 일으키는 경우가 있다.
상기 배양에 있어서의 pH값으로서는, 특별히 제한은 없고 목적에 따라 적절히 선택할 수 있고, 예컨대 통상 6 내지 8 정도이고, 6.5 내지 7.5가 바람직하다.
상기 pH값이 6 미만 또는 8을 초과하면 재분화 장해 또는 세포사를 일으키는 경우가 있다.
상기 배양의 형태로서는, 특별히 제한은 없고 목적에 따라 적절히 선택할 수 있고, 예컨대 평면 배양(단층 배양), 3차원 배양, 펠렛 배양 등을 들 수 있다.
이들은 1종 단독으로 채용할 수도 있고, 2종 이상을 병용할 수도 있다. 이들 중에서도 3차원 배양이 바람직하다.
상기 평면 배양(단층 배양)은, 예컨대 플레이트, 샬레 상에서 행하는 2차원적인 배양이다.
상기 3차원 배양은, 예컨대 콜라겐, 피브린, 히알론산 등에서 형성된 3차원 기재(발판 소재)의 상부 또는 내부에서 행하는 배양이다.
상기 3차원 배양에는, 예컨대 아테로콜라겐(가와켄 가부시키가이샤 제품) 등의 시판 재료를 이용하여 행할 수 있다.
상기 3차원 기재(발판 소재)로서는, 특별히 제한은 없고 목적에 따라 그의 소재, 성상, 형상, 구조, 크기 등에 관하여 적절히 선택할 수 있다.
상기 소재로서는, 예컨대 폴리-D-락타이드, 폴리-L-락타이드, 폴리-DL-락타이드, 폴리글라이콜산, 폴리락트산, 하이드록시아파타이트, 인산칼슘, 아테로콜라겐, 콜라겐, 피브린, 알지네이트, 한천, 젤라틴 등을 들 수 있다. 이들은 1종 단독으로 사용할 수도 있고, 2종 이상을 병용할 수도 있다. 이들 중에서도 아테로콜라겐 등을 적합하게 들 수 있다.
상기 성상으로서는, 예컨대 겔상 등을 적합하게 들 수 있다.
상기 형상으로서는, 예컨대 이식에 이용하는 이식용 소재, 미용용 소재 등의 형상에 따라 적절히 선택할 수 있다.
상기 구조로서는, 통상 다공질 구조, 메쉬 구조, 스폰지 구조 등을 적합하게 들 수 있다.
상기 펠렛 배양은 상기 평면 배양한 연골 세포를 박리하여 배양액 중에서 가볍게 원심하여 행하는 배양이다. 상기 펠렛 배양에 의하면 둥근 펠렛상의 배양 세포가 얻어진다. 상기 펠렛 배양은 배양 세포를 고밀도로 응집시킬 수 있다.
본 발명의 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지를 이용한 본 발명의 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화 방법에 의해 상기 탈분화형 연골 세포로부터 재분화시킨 상기 연골 세포(재분화 연골 세포)는, 코, 귀, 인후, 관절 등의 연골 결손·손상 부위의 이식용 소재, 미용 정형 등의 미용용 소재 등을 형성할 수 있다.
상기 재분화된 연골 세포(재분화 연골 세포)의 배양 내지 증식으로서는, 특별히 제한은 없고 목적에 따라 적절히 선택할 수 있고, 예컨대 상술한 평면 배양(단층 배양), 3차원 배양, 펠렛 배양 등을 들 수 있다.
이들은 단독으로 행하여도 좋고, 2 이상을 행하여도 좋지만 이들 중에서도 3차원 배양을 적합하게 들 수 있다.
상기 연골 세포는 연골 재생 의료 등을 목적으로 하여 시험관내에서 배양·증식시키면 비교적 용이하게 탈분화되어 선유아세포상의 탈분화형 연골 세포로 변화되어 버린다고 하는 문제가 있지만, 본 발명의 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지 또는 본 발명의 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화 방법에 의해, 상기 탈분화형 연골 세포를 효율적이고도 용이하게 상기 연골 세포로 재분화시킬 수 있다. 이 때문에, 본 발명에 의해 재분화시킨 연골 세포(재분화 연골 세포)를 추가로 배양하여 수득된 연골(연골 세포괴)은 연골 결손 부위 등으로 메움으로써 연골에 관한 각종 질환을 치료하는데 적합하게 사용할 수 있다. 본 발명은 상기 연골(연골 세포괴)로서 환자의 연골 세포를 배양하여 얻은 것을 이용하여, 이것을 상기 환자에게 되돌림으로써 이용할 수 있어, 연골 재생 의료 등에 있어서 적합하게 이용할 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예에 관하여 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 조금도 한정되지 않는다.
- 연골 세포의 탈분화에 의한 탈분화형 연골 세포로의 분화 -
5질량%의 FBS(fetal bovine serum) 중에 FGF-2(fibroblast growth factor-2)와, IGF-1(insulin-like growth factor-1), 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄산 등을 포함하는 연골 세포 증식 배지(캄브렉스(Cambrex)사 제품)를 샬레 중에 10mL 첨가하고, 상기 샬레내에서 연골 세포(인간 이개 연골 유래, 20만 세포)를 적의 계대하면서 30일간 평면 배양(단층 배양)했다. 한편, 상기 평면 배양(단층 배양)은 37℃, 30일간, pH 7, 산소 분압 20%의 조건으로 행했다.
도 1의 좌측 도면은 배양 개시 직후의 연골 세포(PO)의 사진이고, 도 1의 우측 도면은 배양 개시로부터 30일간 4회 계대한 연골 세포(P4)의 사진이다. 도 1의 상측 도면은 배양 개시 직후의 연골 세포(P0)와 배양 개시로부터 30일간 4회 계대한 연골 세포(P4)에 있어서의 I형 콜라겐, II형 콜라겐 및 GAPDH(글리세로알데하이드-6-인산 탈수소 효소)의 유전자 발현을 나타내는 전기 영동에 있어서의 밴드의 유무를 나타내는 사진이다.
이들 사진으로부터, 배양 개시 직후의 연골 세포(Po)에서는, II형 콜라겐이 발현하고 있고, I형 콜라겐은 발현하지 않고 있음을 알 수 있었다. 이것은 연골 세포(탈분화전 연골 세포)의 특징을 나타내는 것으로, 배양 개시 직후의 연골 세포(PO)는 탈분화하지 않고 있음이 확인되었다. 한편, 배양 개시로부터 약 30일간 4회 계대한 연골 세포(P4)에서는 II형 콜라겐의 발현량이 감소하고, I형 콜라겐이 발현하고 있었다. 이것은 탈분화형 연골 세포의 특징을 나타내는 것으로, 배양 개시로부터 약 30일간 4회 계대한 연골 세포(P4)는 탈분화하였음이 확인되었다.
- 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화 -
다음으로, 배양 개시로부터 약 30일간 4회 계대한 연골 세포(P4), 즉 탈분화형 연골 세포를 기초 배지 Dulbecco's Modified Eagle's Medium Nutrient Mixture F-12 HAM(DMEM/F12, 시그마 케미칼(Sigma Chemical)사 제품) 중에 인슐린(엠피 바이오메디칼스(MP Biomedicals)사 제품 insulin) 5㎍/mL 및 BMP-2(야마노우치제약사 제품 human recombinant bone morphogenetic protein-2) 200ng/mL를 포함하는 배 지(실시예 1의 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지), 및 이와 더불어 추가로 T3(이엠디 바이오사이언스(EMD Bioscience)사 제품 L-3,3',5'-Triiodothyronine) 10-7M을 포함하는 배지(실시예 2의 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지)를 각각 이용하여, 상기 탈분화형 연골 세포 20만 세포를 7일간 아테로콜라겐 3차원 포매 배양했다. 이 배양은 본 발명의 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화 방법에 해당한다.
이들 2개의 배지를 이용하여 배양한 상기 탈분화형 연골 세포에 있어서의 I형 콜라겐(Col-I), II형 콜라겐(Col-II) 및 X형 콜라겐(Col-X)의 발현량을 측정했다. 이들의 결과를 상기 탈분화형 연골 세포(대조, control)에 있어서의 I형 콜라겐의 발현량을 도 2에 나타내고, II형 콜라겐의 발현량을 도 3에 나타내고, X형 콜라겐의 발현량을 도 4에 각각 나타내었다. 한편, 도 2 내지 4에 있어서의 「BI」는 상기 BMP-2와 상기 인슐린을 포함하는 경우를 의미하고, 「BIT」는 상기 BMP-2와 상기 인슐린과 상기 T3을 포함하는 경우를 의미한다.
도 2 내지 4에 나타내는 결과로부터도 명백한 바와 같이, 인슐린과 BMP-2를 포함하는 실시예 1(BI)의 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지를 이용하여 상기 탈분화형 연골 세포를 배양한 경우에는, 상기 대조(컨트롤)의 탈분화형 연골 세포와 비교하여, 상기 탈분화형 연골 세포에 특징적으로 보이는 I형 콜라겐의 발현량이 감소하고, 상기 연골 세포에 특징적으로 보이는 II형 콜라겐의 발현이 증가하고, 연골이 뼈로 치환될 때에 발현이 보이는 X형 콜라겐의 발현량이 약간 증가하는 경향이 있었다. 인슐린과 BMP-2를 포함하는 실시예 1(BI)의 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지를 이용하여 상기 탈분화형 연골 세포를 배양한 경우의 II형 콜라겐 발현·생산량값 C와 상기 대조(컨트롤)의 탈분화형 연골 세포의 II형 콜라겐 발현·생산량값 D의 비(C/D)가 약 10이었다.
또한, 인슐린과 BMP-2와 T3을 포함하는 실시예 2(BIT)의 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지를 이용하여 상기 탈분화형 연골 세포를 배양한 경우에는, 상기 대조(컨트롤)의 탈분화형 연골 세포와 비교하여, 상기 탈분화형 연골 세포에 특징적으로 보이는 I형 콜라겐의 발현량이 대폭 감소하고, 상기 연골 세포에 특징적으로 보이는 II형 콜라겐의 발현량이 대폭 증가하고, 연골이 뼈로 치환될 때에 발현이 보이는 X형 콜라겐의 발현량은 감소 경향이 있었다. 인슐린과 BMP-2와 T3을 포함하는 실시예 2(BIT)의 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지를 이용하여 상기 탈분화형 연골 세포를 배양한 경우의 II형 콜라겐 발현·생산량값 C와 상기 대조(컨트롤)의 탈분화형 연골 세포의 II형 콜라겐 발현·생산량값 D의 비(C/D)가 20 이상이었다.
이들의 결과로부터, 탈분화되어 상기 탈분화형 연골 세포로 분화된 것을 상기 실시예 1 및 실시예 2에 따른 각 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지를 이용하여 배양함으로써 연골 세포로 재분화시킬 수 있음을 알았다. 또한, 실시예 2의 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지를 이용한 경우에는, 실시예 1의 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지를 이용한 경우에 비해, 상기 탈분화형 연골 세포를 효율적이고도 용이하게 상기 연골 세포로 재 분화시킬 수 있음을 알게 되었다.
- 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지에 있어서의 성분 배합량의 검토-
인슐린과 BMP-2와 T3을 포함하는 실시예 2의 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지에 있어서의 상기 인슐린, 상기 BMP-2 및 상기 T3의 각 함유량의 바람직한 범위를 이하 3종의 비교 검토에 의해 밝혔다.
즉, 우선, 인슐린 함유량을 5㎍/mL로 하고, T3 함유량을 10-7M으로 하고, BMP-2 함유량을 각각 400ng/mL, 200ng/mL, 100ng/mL로 변화시킨 바, 상기 BMP-2의 함유량이 200ng/mL인 경우가 가장 II형 콜라겐의 발현량이 많았다(도 5).
다음으로, 인슐린 함유량을 5㎍/mL로 하고, BMP-2 함유량을 200ng/mL로 하고, T3 함유량을 각각 10-6M, 10-7M, 10-8M으로 한 바, 상기 T3 함유량이 10-7M인 경우가 가장 II형 콜라겐의 발현량이 많았다(도 6).
다음으로, BMP-2 함유량을 200ng/nL로 하고, T3 함유량을 10-7M으로 하고, 인슐린 함유량을 각각 50㎍/mL, 5㎍/mL, 0.5㎍/mL로 한 바, 상기 인슐린의 함유량이 5㎍/mL인 경우가 가장 II형 콜라겐의 발현량이 많았다(도 7).
이상의 결과로부터, 실시예 2의 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지에 있어서의 인슐린, BMP-2, T3의 각 함유량이 각각 5㎍/mL, 200ng/mL, 10-7M인 경우가 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화능이 우수한 것으로 밝혀졌 다.
- 아날로그의 영향의 검토 -
다음으로, 본 발명의 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지에 있어서의 상기 BMP-2를 그의 아날로그인 BMP-4로 치환한 경우에 있어서의 상기 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화로의 영향을 아래와 같이 하여 조사했다. 즉, 실시예 1의 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지에 있어서의 인슐린, BMP-2의 각 함유량이 각각 5㎍/mL, 20Ong/mL인 경우와, 실시예 2의 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지에 있어서의 인슐린, BMP-2, T3의 각 함유량이 각각 5㎍/mL, 200ng/mL, 10-7M인 경우와, 상기 실시예 2의 배지에 있어서의 상기 BMP-2를 BMP-4로 대체한 것 이외에는 같은 조성의 배지를 이용하여, 상기와 마찬가지로 탈분화형 연골 세포의 배양을 했다. 배양한 상기 탈분화형 연골 세포에 있어서의 I형 콜라겐 발현량, II형 콜라겐 발현량 및 X형 콜라겐 발현량을 측정했다. 그 결과를 대조(컨트롤)인 탈분화형 연골 세포에 있어서의 I형 콜라겐 발현량을 도 8에 나타내고, II형 콜라겐 발현량을 도 9에 나타내고, X형 콜라겐 발현량을 도 10에 나타내었다. 한편, 도 8 내지 10에 있어서의 「BI」는 상기 BMP-2와 상기 인슐린을 포함하는 경우를 의미하고, 「BIT」는 상기 BMP-2와 상기 인슐린과 상기 T3을 포함하는 경우를 의미하고, 「BMP-4」는 상기 BMP-4와 상기 인슐린과 상기 T3을 포함하는 경우를 의미한다.
인슐린, BMP-4와 T3을 포함하는 배지를 이용하여 상기 탈분화형 연골 세포를 배양한 경우의 II형 콜라겐 발현·생산량값 C와 상기 대조(컨트롤)의 탈분화형 연골 세포의 II형 콜라겐 발현·생산량값 D의 비(C/D)가 20 이상이었다.
도 8 내지 10의 결과로부터도 명백한 바와 같이, 실시예 2의 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지에 있어서의 상기 BMP-2를 그의 아날로그인 BMP-4로 대체한 경우에 있어서도 실시예 2에 있어서의 경우와 대략 동등한 연골 세포로의 재분화능을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
- 재분화시킨 연골 세포의 배양물의 기계적 성질 -
다음으로, 배양 개시로부터 약 30일간 4회 계대한 연골 세포(P4), 즉 탈분화형 연골 세포로 분화된 것을 기초 배지 Dulbecco's Modified Eagle's Medium Nutrient Mixture F-12 HAM(DMEM/F12, 시그마 케미칼사 제품) 중에 인슐린(엠피 바이오메디칼사 제품 insulin) 5㎍/mL 및 BMP-2(야마노우치 제약사 제품 human recombinant bone morphogenetic protein-2) 200ng/mL를 포함하는 배지(실시예 1의 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지), 및 이와 더불어 추가로 T3(이엠디 바이오사이언스사 제품 L-3,3',5'-Triiodothyronine) 10-7M을 포함하는 배지(실시예 2의 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지)를 이용하여, 상기 탈분화형 연골 세포 20만 세포를 21일간 아테로콜라겐 3차원 포매 배양했다. 이 배양은 본 발명의 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화 방법에 해당한다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 이 3차원 배양에 의한 3차원 배양물에 있어서의 기계적 성질로서의 압축 강도(gr)(악심사 제품 비너스트롬에 의한 측정)는 인슐린, BMP-2 및 T3을 함유하지 않은 배지에서와 마찬가지로 배양한 대조(컨트롤)인 연골 세포의 배양물에 비해 증가 경향을 나타내었다(도 11 및 도 12 참조). 한편, 도 11 및 도 12에 있어서의 「BI」는 상기 BMP-2와 상기 인슐린을 포함하는 경우를 의미하고, 「BIT」는 상기 BMP-2와 상기 인슐린과 상기 T3을 포함하는 경우를 의미한다.
- 재분화시킨 연골 세포의 배양물의 기계적 성질 -
다음으로, 실시예 1의 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지 및 실시예 2의 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지를 이용하여, 상기 탈분화형 연골 세포 20만 세포를 21일간 아테로콜라겐 3차원 포매 배양하고, 상기 배양물을 2개월간 누드 마우스에 이식시킨 후, 이식한 상기 배양물의 압축 강도(gr)를 상기와 마찬가지로 측정했다.
도 13에 나타내는 바와 같이, 실시예 2의 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지를 이용한 배양물에 있어서는, 상기 압축 강도(gr)가 상기 대조(컨트롤)인 연골 세포의 배양물보다도 높은 결과가 되고, 생체내의 이개 연골(native cartilage)과 거의 동등한 압박 강도를 나타내었다(도 13 및 도 14 참조). 한편, 도 13 및 도 14에 있어서의 「BI」는 상기 BMP-2와 상기 인슐린을 포함하는 경우를 의미하고, 「BIT」는 상기 BMP-2와 상기 인슐린과 상기 T3을 포함하는 경우를 의미한다.
본 발명의 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지 및 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화 방법은, 시험관내에서 배양 중 등에 있어서 탈분화되어 연골 특성이 감약한 탈분화형 연골 세포를 효율적이고도 용이하게 연골 세포로 재분화시키고, 배양을 계속시키는데 적합하게 사용할 수 있다. 본 발명의 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지 및 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화 방법에 의해 탈분화형 연골 세포로부터 재분화되어 배양·증식된 연골 세포는 코, 귀, 인후, 관절 등의 연골 결손·손상 부위의 이식용 소재, 미용 정형 등의 미용용 소재 등에 적합하게 이용할 수 있어, 연골 재생 의료에 매우 유용하다.

Claims (11)

  1. 분화 성숙 후에 탈분화되어 연골 특성이 감약한 탈분화형 연골 세포를 원래의 연골 세포로 재분화시키기 위한 재분화용 배지로서,
    인슐린;
    BMP-2(bone morphogenetic protein-2) 및 BMP-4로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상; 및
    T3(Triiodothyronine)
    을 함유하고,
    X형 콜라겐의 발현을 억제하면서 상기 탈분화형 인간 연골 세포를 원래의 연골 세포로 재분화시키는 것을 특징으로 하는 재분화용 배지.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서,
    0.05 내지 500㎍/mL의 상기 인슐린을 함유하는 재분화용 배지.
  5. 제 1 항에 있어서,
    1ng/mL 내지 40㎍/mL의 상기 BMP-2 및 BMP-4로부터 선택되는 1종 이상을 함유하는 재분화용 배지.
  6. 제 1 항에 있어서,
    10-9 내지 10-5M의 T3을 함유하는 재분화용 배지.
  7. 제 1 항에 있어서,
    추가로, 선유아세포 성장 인자 2(FGF-2), 인슐린 유사 성장 인자류(IGF-1), 부갑상선 호르몬(PTH), 성장 호르몬(GH), 글루코코르티코이드, 바이타민 D, IL-1 수용체 길항제, 에스트로겐, 안드로겐, 형질 전환 성장 인자 α(TGFα), 형질 전환 성장 인자 β(TGFβ), 뼈형태 형성 단백류(BMP), 표피 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자류, 트랜스페린, 아셀레늄산, 리놀산, 알부민, 아스코르브산, 연골 모듈린류, 헤파린 결합 인자, α 선유아세포 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, 세포 분열 촉진 호르몬, 결합 조직 성장 인자, 간세포 성장 인자, 아라키돈산, 프로스타그란딘 A, 프로스타그란딘 B, 프로스타그란딘 E, 프로스타그란딘 F 및 히스타민으로부터 선택되는 1종 이상을 함유하는 재분화용 배지.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 재분화된 연골 세포가 유리 연골 세포 및 탄성 연골 세포로부터 선택되는 재분화용 배지.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 재분화된 연골 세포가 평면 배양, 3차원 배양 및 펠렛 배양 중 어느 하나로부터 배양되는 재분화용 배지.
  10. 분화 성숙 후에 탈분화되어 연골 특성이 감약한 탈분화형 연골 세포를 원래의 연골 세포로 재분화시키기 위한 재분화 방법으로서,
    제 1 항 또는 제 4 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 재분화용 배지를 이용하여 상기 탈분화형 연골 세포를 배양함으로써, X형 콜라겐의 발현을 억제하면서 상기 탈분화형 연골 세포를 원래의 연골 세포로 재분화시키는 것을 포함하여 이루어지는 재분화 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 배양이 3 내지 6주간 행해지는 재분화 방법.
KR1020077004238A 2004-08-24 2005-08-23 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지 KR100900360B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2004244114 2004-08-24
JPJP-P-2004-00244114 2004-08-24

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20070047789A KR20070047789A (ko) 2007-05-07
KR100900360B1 true KR100900360B1 (ko) 2009-06-02

Family

ID=35967474

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020077004238A KR100900360B1 (ko) 2004-08-24 2005-08-23 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20070134793A1 (ko)
EP (1) EP1792977A4 (ko)
JP (1) JP4469371B2 (ko)
KR (1) KR100900360B1 (ko)
CN (1) CN101014699B (ko)
BR (1) BRPI0514571A (ko)
RU (1) RU2355761C2 (ko)
WO (1) WO2006022263A1 (ko)
ZA (1) ZA200701555B (ko)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG184440A1 (en) * 2010-04-08 2012-11-29 Univ Edinburgh Chondrogenic progenitor cells, protocol for derivation of cells and uses thereof
KR101277970B1 (ko) * 2010-06-08 2013-06-27 경희대학교 산학협력단 연골질환 치료용 조성물, 인공연골 및 이들의 제조방법
JP5388233B2 (ja) * 2011-01-19 2014-01-15 富士ソフト株式会社 再生軟骨の軟骨特性を評価する方法
CN102399745A (zh) * 2011-11-22 2012-04-04 浙江大学 一种软骨干细胞分离培养方法
RU2494469C1 (ru) * 2012-04-02 2013-09-27 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Новосибирский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ФГБУ "ННИИТО" Минздравсоцразвития России) Способ коррекции дефекта межпозвонкового диска в эксперименте
CN104368043B (zh) * 2014-09-25 2016-02-24 浙江星月生物科技股份有限公司 一种胶原基质软骨修复膜、制备方法及应用
EP3423071A4 (en) * 2016-03-04 2019-12-04 Lacerta Technologies Inc. chondrocyte
US20200165568A1 (en) * 2017-06-21 2020-05-28 Mogrify Limited Cell reprogramming methods for producing chondrocytes
WO2020102715A1 (en) * 2018-11-16 2020-05-22 Rapa Therapeutics, Llc Method for t cell de-differentiation and resulting cells
WO2021254296A1 (zh) * 2020-06-14 2021-12-23 浙江大学 一种生物活性物质组合物、包含所述组合物的无血清培养基及其用途

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003064598A2 (en) * 2002-01-25 2003-08-07 Genzyme Corporation Serum-free media for chondrocytes and methods of use thereof

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4531135B2 (ja) * 1996-12-06 2010-08-25 オシリス セラピューティクス，インコーポレイテッド ヒト間葉幹細胞の改良された軟骨形成分化
DE69928678T2 (de) * 1998-09-18 2006-07-20 Massachusetts Institute Of Technology, Cambridge Verwendung von wachstumsfaktoren und hormonen zur vermehrung menschlicher chondrozyten und knorpelgewebeherstellung
DE20019809U1 (de) * 2000-05-31 2001-07-12 Fraunhofer Ges Forschung Knorpelersatz und Biomatrix zur Kultivierung von Zellen
AU2003226201A1 (en) * 2002-04-02 2003-10-20 William Marsh Rice University Redifferentiated cells for repairing cartilage defects

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003064598A2 (en) * 2002-01-25 2003-08-07 Genzyme Corporation Serum-free media for chondrocytes and methods of use thereof

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. Cell Biol. Vol.119, pp989-995.
J. Cell. Biochem. Vol.66, pp394-403.

Also Published As

Publication number Publication date
BRPI0514571A (pt) 2008-06-17
ZA200701555B (en) 2008-07-30
CN101014699B (zh) 2010-05-26
JPWO2006022263A1 (ja) 2008-05-08
EP1792977A4 (en) 2007-11-21
RU2007110826A (ru) 2008-10-10
JP4469371B2 (ja) 2010-05-26
KR20070047789A (ko) 2007-05-07
WO2006022263A1 (ja) 2006-03-02
RU2355761C2 (ru) 2009-05-20
EP1792977A1 (en) 2007-06-06
US20070134793A1 (en) 2007-06-14
CN101014699A (zh) 2007-08-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100900360B1 (ko) 탈분화형 연골 세포의 연골 세포로의 재분화용 배지
ES2251842T3 (es) Uso de factores de crecimiento y hormonas para expansion de celulas de mamiferos e ingenieria de tejidos.
EP1201749B1 (de) Verfahren zur Herstellung von Knorpelimplantaten mittels in vitro gezüchteter Chondrozyten
DE60028666T2 (de) Verwendung von Fettgewebe-abgeleiteten Stromalen Zellen zur Differenzierung in Chondrozyten und ihre Verwendung zur Reparatur von Knorpelgewebe
CN101490245B (zh) 无血清培养基及其在软骨细胞扩增中的用途
CN101802175B (zh) 人椎间盘组织
US20040082063A1 (en) Tissue-like organization of cells and macroscopic tissue-like constructs, generated by macromass culture of cells, and the method of macromass culture
JP3680067B2 (ja) 移植用軟骨細胞の製法
Koch et al. Tissue engineering with chondrocytes
KR20110097064A (ko) 무혈청 줄기 세포 배양 조성물, 이를 함유한 조직 재생용 조성물 및 이를 이용한 조직 재생 방법
KR100394430B1 (ko) 인간 혈청을 포함하는 인간 세포 배양용 배지 및 이를이용한 인간 세포의 배양 방법
AU2004317828B2 (en) Tissue-like organization of cells and macroscopic tissue-like constructs, generated by macromass culture of cells, and the method of macromass culture
CN104120105A (zh) 一种用于培养老龄人群软骨细胞的无血清培养基
CN105194731B (zh) 一种体外构建组织工程软骨用的凝胶状支架配方及制备方法
Greene et al. Septal cartilage tissue engineering: new horizons
WO2013138864A1 (en) Tissue scaffold
Kurokawa et al. Improvement of the maxillary bone growth suppression in the cleft palate operation with cultured dermal substitute: animal experiment and patient reports in preliminary clinical application
Xu et al. The role of adipose-derived stromal cells and hydroxypropylmethylcellulose in engineering cartilage tissue in vivo
US20220296649A1 (en) Method for preparing matrilin-3 pretreated stem cell speroids, and composition, derived therefrom, for preventing or treating cartilage diseases
Chen et al. The potential use of platelet-rich plasma to reconstruct the microtia chondrocyte in human auricular cartilage regeneration
Watson et al. Advancing the art of rhinoplasty with tissue engineering
Stark Tissue engineering: a biotechnologic challenge and chance for the future of operative medicine
Akbari Bioengineering Human Scaffold-free Cartilage Constructs Using Paediatric Auricular Tissue
Humphries et al. Research Space

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130410

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20140325

Year of fee payment: 6

LAPS Lapse due to unpaid annual fee