KR100891899B1 - 종양괴사인자 수용체 방출효소 활성에 영향을 주는 요인 - Google Patents

종양괴사인자 수용체 방출효소 활성에 영향을 주는 요인 Download PDF

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Abstract

시토킨 TNF의 생물학적 효과는 세포의 표면상에서 수용체에 결합함으로써 매개된다. 본 명세서는, TNF 수용체의 효소적 절단과 방출을 촉진하는 새로운 단백질과 폴리뉴클레오티드를 기술한다. TNF 수용체 쉐딩에 영향을 주는 부가적인 화합물들을 확인하는 방법이 또한 제공된다. 약제학적 조성물안의 활성성분으로서, 본 발명의 생성물은 TNF 신호전달을 증가시키거나 감소시켜 질병의 병리를 완화시킨다.
TNF, TNF 수용체, 시토킨, 신호전달, 수용체 쉐딩, 수용체 방출.

Description

종양괴사인자 수용체 방출효소 활성에 영향을 주는 요인{FACTORS AFFECTING TUMOR NECROSIS FACTOR RECEPTOR RELEASING ENZYME ACTIVITY}
관련 출원의 교차-참고문헌
본 출원은 1998년 5월 14일에 제출된 미국출원 09/081,385의 우선권 이익을 청구한다. 미국에서의 실행을 목적으로, 우선권 출원은 참고에 의하여 완전히 본원에 연합된다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 시토킨과 그것의 수용체를 통한 세포간의 신호전달 (signal transduction)의 분야에 관한 것이다. 보다 상세히는, 본 발명은 세포표면상에서 발견되는 TNF를 위한 수용체를 절단하고 방출하는 효소적 활성 및 결과적인 생물학적 효과에 관한 것이다. 본 발명의 어떤 구체예들은 그런 효소적 활성에 영향을 주고 질병 치료를 위한 의약에 포함될 수 있는 조성물에 관한 것이다.
시토킨은 세포간의 통신에 있어서 중심적인 역할을 한다. 자극에 반응하여 한 세포로부터의 시토킨의 분비는, 인접한 세포가 적절한 생물학적 반응-자극, 분화, 또는 아폽토시스와 같은-을 겪는 것을 시작하게 할 수 있다. 중요한 생물학적 사건이, 첫번째 세포로부터의 시토킨 방출에 영향을 줌에 의해서 뿐만 아니라, 후 속의 반응을 매개하는 두번째 세포상의 수용체로의 결합에 의해서도 영향을 받을 수 있다. 본 특허출원에서 기술된 발명은 종양괴사인자로부터의 신호전달에 영향을 주기 위한 새로운 화합물을 제공한다.
종양괴사인자(TNF 또는 TNF-α)로서 알려진 시토킨은 구조적으로 림프독소 (LT 또는 TNF-β)에 관련된다. 그것들은 약 40%의 아미노산 서열 상동성을 가진다(Old, Nature 330:602-603, 1987). 이 시토킨은 대식세포, 단구 및 자연살세포에 의하여 방출되고, 염증 및 면역 사건에서 역할을 한다. 이 두가지의 시토킨은 생체내 및 생체외 둘다에서 (i)혈관 혈전증 및 종양괴사; (ii)염증; (iii)대식세포와 호중구의 활성화; (iv)백혈구증가증; (v)아폽토시스; 및 (vi)쇼크를 포함하는 광범위한 효과들을 일으킨다. TNF는 다양한 형태의 암, 관절염, 건선, 내독소쇼크, 패혈증, 자가면역질환, 감염, 비만, 및 악액질을 포함하는 여러가지의 질병상태와 연관되어 왔다. TNF는 체중조절에 기여하는 세개의 요인들: 섭취, 소비 및 에너지의 저장에서 중요한 역할을 하는 것으로 보인다(Rothwell, Int. J. Obesity 17:S98-S101, 1993). 패혈병에 있어서, 증가된 내독소 농도는 TNF 수준을 올리는 것으로 보인다(Beutler et al. Science 229:869-871, 1985).
TNF 억제제로 환자를 치료함으로써 질병의 과정을 변경하려는 시도가 있어왔고 다양한 정도의 성공을 거두었다. 예를 들어, TNF 억제제 덱사나비올은 외상성 뇌손상에 따르는 TNF 매개된 효과들에 대항하여 방어를 제공하였다(Shohami et al. J. Neuroimmun, 72:169-77, 1997). 크론병에서의 어느정도의 개선은 항-TNF 항체로의 치료에 의하여 얻어졌다(Neurath et al., Eur. J. Immun. 27:1743-50, 1997).
인간의 TNF와 LT는 두개의 별개의 당단백질 원형질막 수용체(각각, 크기가 55kDa과 75kDa, p55 및 p75 TNF-R으로 알려짐)에 특이적으로 결합함으로써 그것들의 생물학적 활성들을 매개한다. 그 두개의 수용체는 세포외 도메인에서 28%의 아미노산 서열 상동성을 공유하는데, 이것은 네개의 반복하는 시스테인-풍부 영역들로 구성된다(Tartaglia and Goeddel, Immunol. Today 13:151-153, 1992). 그러나, 그 수용체들은 세포내 도메인에서 유의한 서열 상동성이 없고, 수용체 활성화에 대하여 상이한 세포내 반응을 매개한다. TNF와 LT의 상이한 활성에 일치하여, 대부분의 인간세포는 두 TNF 수용체 다의 낮은 수준을 발현한다: 세포당 약 2,000 내지 10,000개의 수용체(Brockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3127-3131, 1990).
림프양세포 및 비-림프양세포 둘다위에서의 TNF 수용체의 발현은, 지질다당류(LPS), 포르볼 미리스테이트 아세테이트(PMA; 단백질 키나제 C 활성제), 인터루킨-1(IL-1), 인터페론-감마(IFN-γ) 및 IL-2와 같은 많은 상이한 약제에 의하여 실험적으로 영향을 받을 수 있다(Gatanaga et al. Cell Immunol. 138:1-10, 1991; Yui et al. Placenta 15:819-835, 1994). 그것의 수용체에 결합된 인간 TNF의 복합체는 세포막으로부터 내부화된 다음, 그 수용체는 분해되거나 재활용되는 것으로 보여져 왔다(Armitage, Curr. Opin. Immunol. 6:407-413, 1994). TNF 수용체 활성은, 세포내부적으로 수용체에 결합하거나 리간드 결합부위에 결합하는 펩티드, 또는 수용체 쉐딩(shedding)에 영향을 주는 펩티드를 이용하여 조정될 수 있다. 예를 들어 특허공보 WO 95/31544, WO 95/33051, WO 96/01642, 및 EP 568 925를 참조하 라.
TNF 결합 단백질(TNF-BP)은, 열병 환자, 신부전 환자 및 암환자, 및 심지어 건강한 사람의 혈청과 뇨에서 상승된 수준으로 확인되어 왔다. 인간 뇌 및 난소 종양은 높은 혈청 수준의 TNF-BP를 초래했다. 이 분자들은 정제되고 특징분석되고 클로닝되었다(Gatanaga et al., Lymphokine Res. 9:225-229, 1990a; Gatanaga et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 87:8781-8784, 1990b). 인간의 TNF-BP는, p55 및 p 75 TNF 수용체의 N-말단 세포외 도메인에 각각 동일한 30kDa 및 40kDa 단백질로 구성된다(미국특허 제 5,395,760호; EP 418,014). 그러한 단백질은 내독소쇼크의 치료에 있어서의 사용을 위하여 제안되어 왔다(Mohler et al. J. Immunol. 151:1548-1561, 1993).
막 결합된 단백질을 닮은 분비된 단백질의 생산을 위하여 가능한 몇가지 메카니즘이 있다. 하나는 막투과 영역과 세포질 영역이 없는 양자택일적으로 스플라이싱되는 mRNA로부터의 번역을 수반한다. 또하나는 원상태의 막수용체의 단백분해적 절단과, 뒤이은 세포로부터의 절단된 수용체의 쉐딩을 수반한다. p55와 p75 TNF-R 의 가용성 형태는 mRNA 스플라이싱으로부터 생성되지 않는 것으로 보이는데, 왜냐하면 전 길이 수용체 mRNA만이 인간세포에서 생체외에서 검출되어 왔기 때문이다 (Gatanaga et al., 1991). 인간 p55 TNF-R에 대한 카르복시-말단 서열분석과 돌연변이 연구는 절단부위가 잔기 Asn 172와 Val 173사이에 존재할 수 있다는 것을 나타낸다(Gullberg et al. Eur. J. Cell. Biol. 58:307-312, 1992).
특이적인 메탈로프로테아제 억제제, TNF-α 프로테아제 억제제(TAPI)가 가용 성 p75와 p55 TNF-R의 쉐딩을 차단한다는 보고가 있다(Crowe et al. J. Exp. Med. 181:1205-1210, 1995; Mullberg et al. J. Immunol. 155:5198-5205, 1995). 세포막위의 프로-TNF를 프로세싱하여 TNF 리간드를 방출시키는 것은 매트릭스 메탈로프로테아제 유사효소에 의존하는 것으로 보인다(Gearing et al. Nature 370:555-557, 1994). 이것은, 발생 및 염증과 연관된 조직 개조와 수선에 있어서 주요한 역할을 하는 구조적으로 관련된 매트릭스-분해 효소들의 패밀리이다(Birkedal-Hansen et al. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 4:197-250, 1993). 이 효소들은 그것의 촉매적 도메인에 Zn2+를 가지고, Ca2+은 그것의 삼차구조를 유의하게 안정화시킨다.
유럽 특허출원 EP 657536A1에서, Wallach 등은, 그 효소에 의하여 절단되지 않지만 그것에 여전히 결합하는 돌연변이된 형태의 수용체를 발견함으로써 55,000kDa TNF 수용체를 절단하는 효소를 얻는 것이 가능하다는 것을 제안한다. 효소를 위한 유일한 제안된 공급원은 프로테아제 활성을 가지는 것으로 보이는 세포로부터의 막의 세제 추출물이다. 이 계획에 따라 효소를 얻는 것이 가능하다면, 그 효소는 아마 막 스패닝 영역(membrane spanning region)을 포함할 것이다. 이 특허출원은 실제로 얻어진 프로테아제를 기술하지 않는다.
본 연속물에서의 이전의 특허출원(국제특허공개 WO 9820140)에서, 세포표면으로부터 p55와 p75 TNF-R 둘다를 절단시키는 분리된 효소를 얻기 위한 방법이 기술된다. 편리한 공급원은 포르볼 미리스테이트 아세테이트(PMA)로 자극되어 온 세포의 배양배지이다. 이 효소활성에 TRRE(TNF 수용체 방출효소)라는 이름이 주어졌다. 다른 연구에서, TRRE는 PMA로 자극하자마자 즉시 방출되어, 그것이 비활성 형태로 전합성되어 있어서 자극되자마자 활성형태로 신속하게 전환된다는 것을 나타냈다. TNF-R의 직접적인 절단을 위한 증거는, 쉐딩이 30분이내에 최대 쉐딩을 하면서 매우 빨리(~5분) 시작된다는 것이다. TRRE는 TNF-R에 특이적이고, IL-1 수용체, CD30 ICAM-1 또는 CD11b를 절단하지 않는다. TRRE 활성은 Ca++ 또는 Zn++을 첨가함으로써 증강되고 EDTA와 페난트롤린에 의하여 억제된다.
TNF는 다양한 병리학적 질병에 연관되기 때문에, 수용체 쉐딩이 조정될 수 있도록 허용할 다양한 요인들을 얻음으로써 질병부위에서 TNF로부터의 신호전달을 조절하는 것이 바람직하다.
발명의 개요
본 명세서는, 세포표면으로부터의 TNF 수용체의 효소적 절단과 방출을 촉진하는 새로운 화합물을 제공한다. 수용체 방출을 증강하는 능력을 시험하는 분석에서 스크리닝을 반복한 후에, 9개의 새로운 DNA 클론이 선택되었다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열과 그것에 의하여 암호화되는 단백질은, 유익한 방식으로 TNF 신호전달을 조정하기 위하여 사용될 수 있는 진단 보조 및 치료화합물로서 잠재력을 가진다.
본 발명의 한 구체예는 다음의 성질들을 가진 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드이다: a) 이 서열은 Jurkat T 세포에서 mRNA 수준에서 발현되고; b) TNF-수용체를 발현하는 COS-1 세포가 그 서열을 발현하도록 유전학적으로 형질전환될 때, 이 세포는 그 수용체를 절단하고 방출하기 위한 효소적 활성을 증가시킨다. 폴리뉴클레오티드 서열이 Jurkat 세포에서 발현되면, 그것은 ATCC(접수번호 TIB-152)를 이용하여 기탁된 Jurkat 세포 발현라이브러리에서 발견될 수 있다. 이 폴리뉴클레오티드는 다른 셀라인으로부터 얻어질 수 있거나 재조합 기술에 의하여 생산될 수 있다는 것이 인식된다.
뉴클레오티드 서열이 SEQ. ID NOS:1-10중 어느 것에 들어있는 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 또한, 상기 뉴클레오티드 서열내의 적어도 30개의 그리고 바람직하게는 더 많은 연속적인 뉴클레오티드, 또는 유의한 수준으로, 바람직하게는 90%이상의 수준으로 상기 서열에 상동성인 적어도 50개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드가 구체화된다. 또한 TRRE 조정인자의 발현을 억제하는 안티센스 및 리보자임 폴리뉴클레오티드가 포함된다.
본 발명의 또하나의 구체예는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드이다. 비-한정적인 실예는 SEQ. ID NOS:147-158에서 보여지는 서열들이다. 단편과 융합단백질이 본 발명에 포함되고, 바람직하게는 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의하여 암호화되는 적어도 10개의 연속적인 잔기, 또는 유의한 수준, 바람직하게는 적어도 80%로 상동성인 적어도 15개의 연속적인 아미노산을 포함한다. 바람직한 폴리펩티드는, 세포표면, 특히 TNF 수용체를 발현하도록 유전학적으로 형질전환된 COS-1 세포로부터 TNF 수용체의 절단과 방출을 촉진한다. 이 폴리펩티드는 막 스패닝영역을 가지거나 가지지 않을 수도 있으며, 세포로부터의 분비를 수반하는 과정에 의하여 임의로 생산될 수 있다. 원하는 활성을 가진 종 상동체(species homologs) 및 부가적인 유익한 성질을 가진 인공 돌연변이체가 포함된다.
본 발명의 또하나의 구체예는 본 발명의 폴리펩티드에 특이적인 항체이다. TRRE 조정인자 단백질에 결합하지만, 비교가능한 양으로 인간의 조직 샘플에서 발견되는 다른 물질들에는 결합하지 않는 항체가 바람직하다.
본 발명의 또하나의 구체예는, 상응하는 TRRE 조정인자의 존재 또는 부재를 검출하기 위하여 본발명의 폴리뉴클레오티드 또는 항체를 이용하여 세포 또는 조직 샘플내에서 변경된 TRRE 활성을 측정하는 분석방법이다. 이 분석방법은, 비정상적인 TNF 수준이나 TNF 신호전달에 관련한 임상 상태의 진단 또는 평가를 위하여 임의로 사용될 수 있다.
본 발명의 또하나의 구체예는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 또는 항체와 세포를 접촉시키는 것으로 이루어지는, 시토킨(TNF를 포함하지만, 그것에 한정되지는 않음)으로부터 세포안으로의 신호전달을 증가시키거나 감소시키는 방법이다.
본 발명의 더이상의 구체예는 TRRE 활성을 조정하는 능력에 대하여 폴리뉴클레오티드를 스크리닝하는 방법이다. 이 방법은 TRRE와 TNF-수용체 둘다를 발현하는 세포를 제공하는 것; 스크리닝될 폴리뉴클레오티드를 이용하여 세포를 유전학적으로 변경하는 것; 세포를 클로닝하는 것; 및 원하는 활성을 가진 클론을 확인하는 것을 수반한다.
또한, 본 발명의 또하나의 구체예는 TRRE 활성에 영향을 주는 능력에 대하여 물질을 스크리닝하는 방법이다. 이것은 전형적으로, 시험물질의 존재 또는 부재하에서 TNF 수용체를 발현하는 세포를 본 발명의 TRRE 조정인자와 인큐베이션하는 것; 및 TNF 수용체의 쉐딩에 대한 영향을 측정하는 것을 수반한다.
본 발명의 생성물은 인체 또는 동물체의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서 사용될 수 있다. 이 의약은 심부전, 악액질, 염증, 내독소쇼크, 관절염, 다발성 경화증, 패혈증, 및 암과 같은 질병의 치료를 위한 임상적으로 효과적인 양을 포함한다. 이 조성물은, 임의적으로 환자의 상태에 적합한 다른 치료 형태와 조합하여, 그 질병을 가지거나 그 질병의 위험에 처한 것으로 의심되는 환자에게 투여하기 위하여 사용될 수 있다.
도 1은 플라스미드 pCDTR2의 도식적인 표시이다. 이 플라스미드는, TNF 수용체의 ~75kDa 형태인 p75 TNF-R을 발현한다. PCMV는 사이토메갈로바이러스를 나타내고; BGHpA는 소과의 성장호르몬 폴리아데닐화 신호를 나타낸다.
도 2는 그 수용체를 발현하도록 유전학적으로 변경된 COS-1 세포상에서 검출된 p75 TNF-R의 수준을 묘사하는 선이다. C75R이라 지명된 형질전환된 세포로부터의 결과(●,위로 급습하는 선)는 모(parental) COS-1 세포로부터의 결과(■,기저선)와 비교된다. 수용체 수는 Scatchard 분석(삽입도)에 의하여 계산되었다.
도 3은 생존 그래프인데, 패혈성 복막염을 유도하기 위하여 지질다당류(LPS)로 유발된 마우스에서 TRRE가 사망율을 감소시키는 것을 보여준다. (◆) LPS 단독; (■) LPS 더하기 대조표준완충액; (●) LPS 더하기 TRRE(2,000 U); (▲) LPS 더하 기 TRRE(4,000U).
도 4는 막대 그래프의 간색 재현인데, C75R 세포(TNF-수용체를 발현하도록 형질전환된 COS-1 세포)상에서 TRRE 활성에 대한 9개의 새로운 클론들의 효과를 보여준다. 아홉개 클론 각각은 TRRE 활성을 2배넘게 증가시킨다.
도 5는 생존 그래프인데, 새로이 발현된 4개가 LPS로 유발된 마우스를 구하는 능력을 보여준다. (◆) 식염수; (■) BSA; (△) Mey-3(100㎍); (X) Mey-3(10㎍); (*) Mey-5(10㎍); (●) Mey-8(10㎍).
TNF 전달경로에 연관되는 어떤 세포들은 TNF 수용체가 세포표면으로부터 쉐딩되도록하는 효소적 활성을 발현하는 것으로 발견되었다. TNF 수용체를 절단하고 방출하기 위한 효소적 활성에는 명칭 TRRE이 주어졌다. 포르볼 미리스테이트 아세테이트는 세포로부터 배양배지로의 TRRE의 방출을 유도한다. 모범적인 TRRE 단백질은 TNF-1 세포의 상청액으로부터 정제되었다(실시예 2). 이 프로테아제는 메탈로프로테아제 패밀리의 어떤 특질을 가지고, 활성화되자마자 세포로부터 신속하게 방출된다.
이 단백질의 본질을 설명하기 위하여, 기능적 클로닝을 수행하였다. Jurkat 세포는 TRRE의 좋은 공급원인 것으로서 선택되었다. Jurkat 라이브러리로부터 cDNA를 발현시키고, 세포표면으로부터 TNF 수용체를 방출하는 능력에 대하여 세포 상청액을 시험하였다. 발현 생성물의 클로닝과 시험을 여러 주기에 걸쳐 수행하였고, 분석에서 TRRE 활성이 두배 이상이 되는 9개의 클론을 얻었다(도 4). DNA 수준에서, 9개 클론 모두는 상이한 서열을 가졌다.
이 클론으로부터의 단백질 발현 생성물이 패혈증에 대한 지질다당류 동물모델에서 시험되어 왔다. 세개의 상이한 클론으로부터의 단백질이 치사량의 LPS로부터 성공적으로 동물을 구출했다(도 5). 이것은 TNF에 의하여 매개되는 병리학적 질병의 관리에 있어서 이 분자들의 중요한 역할을 지적한다.
발현 라이브러리로부터 얻어진 새로운 TRRE 촉진 클론들의 수는 놀랍다. 실시예 2에서 분리된 TRRE의 기질 특이성은 다른 시토킨 수용체 및 세포표면 단백질로부터 75kDa과 55kDa TNF 수용체를 구별한다. 세포들이 TNF 수용체를 위한 9개의 상이한 프로테아제들을 가질 수 있으리라 지레짐작으로 의심할 이유가 거의 없다. 이 클론중의 하나는 실시예 2에서 분리된 TRRE, 또는 관련 단백질을 암호화하는 것이 가능하다. 다른 클론중의 어떤 것은 동일한 부위에서, 또는 세포로부터 가용성 형태의 방출을 야기하는 또다른 부위에서 TNF 수용체를 절단하는 단백분해적 능력을 가지는 것이 가능하다. 클론들중 어떤 것은 그자체로는 단백분해적 활성을 가질 수 없지만, 2차적인 양식으로 TRRE 활성을 촉진하는데 역할을 한다는 것이 본 명세서의 가정이다.
이 가능성은 이루어진 관찰과 일치하는데, 분석에 사용된 세포에서 내생성 수준의 TRRE 활성이 있기 때문이다. 절단 분석은 C75 세포로부터의 TNF 수용체 방출을 모니터하는 것을 수반하는데, 이 세포는 p75 TNF-R을 발현하도록 유전학적으로 변경된 COS-1 세포이다. 표준 분석은, 형질전환된 세포를 TRRE를 함유한다고 믿어지는 체액과 접촉시킴으로써 수행되었다. 내생성 TRRE 활성의 수준은, 외생성 TRRE가 첨가되지 않은 때조차의 그 수용체의 자발적 방출의 속도로부터 분명하다(약 200 유니트). 따라서, TRRE 활성을 촉진하는 부속 단백질은 분석에서 측정된 활성을 증가시킬 것이다. 자이모겐 형태의 TRRE를 활성화하는 단백질, 다른 세포 표면 성분으로부터 TRRE를 해방시키는 단백질, 또는 세포내부로부터 TRRE의 분비를 자극하는 단백질을 포함하여, 많은 촉진의 메카니즘이 가능하다. 기술된 구체예들 대부분에서 본 발명의 생성물을 사용하기 위하여 이 메카니즘을 이해하는 것은 필수적이지 않다.
이 클론중의 몇몇은 TNF 수용체 절단을 촉진하기 위한 활성 뿐만 아니라 다른 표면 단백질에 영향을 주기 위한 활성을 가질 것으로 예상된다. 절단 서열 또는 부속 단백질이 상이한 수용체들사이에서 공유되는 정도까지, 어떤 클론들은 관련된 기질들의 패밀리를 위한 표현형 변화(수용체 방출과 같은)를 촉진할 것이다.
본 명세서는 TRRE 활성을 촉진하는 폴리펩티드, 그러한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 그러한 폴리펩티드에 결합하는 항체를 제공한다. TNF의 그것의 수용체로의 결합은 많은 생물학적인 효과들을 매개한다. TRRE에 의한 TNF-수용체의 절단은 TRRE에 의해 신호전달을 감소시킨다. TRRE 활성의 포텐시에이터 (potentiator)는 동일한 효과를 가진다. 그러므로, 본 발명의 생성물은, 시토킨 작용에 의하여 영향을 받는 질병 상태의 관리에 있어 상당히 중요한 시토킨에 의한 신호전달을 조정하기 위하여 이용될 수 있다. 본 발명의 생성물은 또한, 언제 신호전달이 비정상적인 TRRE 활성에 의하여 부적절하게 영향을 받고 있는가를 결정하기 위하여, 진단학적 방법에서 사용될 수 있다. 본 명세서에서 기술된 분석 시스템은, TRRE 활성에 영향을 주어 TNF로부터의 신호전달에 영향을 줄 수 있는 부가적인 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 명세서의 개요에 기초하고 실시예 절에서의 예시에 의하여 안내되어, 당업자는 본 발명의 수행에 있어 어떤 기술들을 사용할 것인가를 쉽게 알 것이다. 다음의 상세한 설명은 독자의 부가적인 편의를 위하여 제공된다.
정의 및 기초 기술
본 명세서에서 사용될 때, "TRRE 활성"은, TNF 수용체를 발현하는 세포의 표면으로부터 TNF 수용체를 절단하고 방출시키는 조성물의 능력을 말한다. 바람직한 분석은, 실시예 1에서 기술된 바와 같이, 트랜스펙션된 COS-1 세포로부터의 절단이다. 그러나, TRRE 활성은 55kDa 및 75kDa 크기의 TNF 수용체를 가지는 어떤 세포상에서든 측정될 수 있다. THP-1 세포의 PMA 유도로부터 얻어진 TRRE 효소의 다른 특질(실시예 2에서 예증됨)은 이 분석에서 측정된 TRRE 활성의 성질일 필요가 없다.
TRRE의 유니트 활성은, 자발적인 방출에 대한 보정후, 표준분석에서 세포표면으로부터 방출된 1pg의 가용성 p75 TNF-R로서 정의된다. TRRE 활성의 측정은 실시예 1에서 더 설명된다.
"TRRE 조정인자"는 세포의 표면상에서 TNF를 프로세싱하기 위한 TRRE 활성을 증가시키거나 감소시키는 성질을 가지는 화합물이다. TRRE 활성을 증가시키는 것들은 TRRE 촉진제라고 불릴 수 있고, TRRE 활성을 감소시키는 것은 TRRE 억제제라고 불릴 수 있다. TRRE 촉진제는 TNF-R을 위한 단백분해적 활성을 가지는 화합물, 및 TNF-R 프로테아제의 활성을 증대시키는 화합물을 포함한다. 실시예 5에서 기술된 9개의 폴리뉴클레오티드 클론들과 그것들의 단백질 생성물은 모범적인 TRRE 촉진제이다. TRRE 활성의 억제제는 아래에 기술된 스크리닝 분석을 이용하여 얻어질 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 어떤 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 또는 그것의 유사체를 말한다. 폴리뉴클레오티드는 어떤 3차원적 구조라도 가질 수 있고, 알려지거나 알려지지 않은 어떤 기능이라도 수행할 수 있다. 다음은 폴리뉴클레오티드의 비-한정적인 실예이다: 유전자 또는 유전자 단편, 엑손, 인트론, (mRNA), 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 핵산 프로브, 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는, 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체와 같은 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 존재한다면, 뉴클레오티드 구조에의 변형은 중합체의 조립 전 또는 후에 주어질 수 있다. 용어 폴리뉴클레오티드는 이중- 및 단일-스트랜드의 분자를 상호교환가능하게 말한다. 달리 특정되거나 요구되지 않으면, 폴리뉴클레오티드인 본원에 기술된 본 발명의 어떤 구체예라도 이중-스트랜드의 형태 및, 그 이중-스트랜드의 형태를 구성한다고 알려지거나 예견되는 두개의 상보적인 단일-스트랜드의 형태 각각을 둘다 포함한다.
"혼성화"는, 하나이상의 폴리뉴클레오티드가 반응하여 뉴클레오티드 잔기의 염기간의 수소결합을 통하여 안정화되는 복합체를 형성하는 반응을 말한다. 혼성화 반응은 상이한 "긴축(stringency)" 조건하에서 수행될 수 있다. 적절한 조건에는 온도, 이온세기, 및 포름아미드와 같은 반응혼합물안의 부가적인 용질의 존재가 포함된다. 증가하는 긴축 조건은 10X SSC(0.15M NaCl, 15mM 시트르산염 완충액)에서 30℃; 6X SSC에서 40℃; 6.X SSC에서 50℃; 6X SSC에서 60℃, 또는 0.5X SSC에서 약 40℃, 또는 50% 포름아미드를 포함하는 6.X. SSC에서 약 30℃이다. SDS와 단편으로 된 DNA의 공급원(연어 정자와 같은)도 전형적으로 또한 혼성화동안 존재한다. 보다 높은 긴축도는 안정한 혼성화 복합체가 형성되기 위하여 혼성화 요소들 사이에 더 높은 최소 상보성을 필요로 한다. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Second Edition(Sambrook, Fritsch & Maniatis, 1989)를 참조하라.
유사한 구조를 가진 퓨린 및 피리미딘 질소포함 염기가 왓슨-크릭 염기-쌍형성에 관하여 기능적으로 등가일 수 있고; 유사 질소포함 염기, 특히 우라실과 티민의 상호-치환, 또는 메틸화에 의한 것과 같은 질소포함 염기의 변형은 실체상의 치환을 구성하지 않는다는 것이 이해된다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 위한 서열 동일성의 백분율은 비교되고 있는 서열들을 정렬한 다음 각각의 정렬된 위치에서 공유된 잔기의 수를 셈으로써 계산된다. 삽입 또는 결실의 존재에 대하여 어떤 벌점도 주어지지 않지만, 이것들은 정렬되고 있는 서열중의 하나에서 분명히 증가된 수의 아미노산 잔기를 수용하기 위하여 요구되는 곳에서만 허용된다. 비교되고 있는 서열들중의 하나가 "연속적"인 것으로 나타날 때, 어떠한 갭도 비교동안 그 서열내에서 허용되지 않는다. 백분율 동일성은 비교 또는 참고 서열내의 잔기에 동일한 시험 서열내의 잔기에 관 하여 주어진다.
본원에서 사용될 때, 폴리뉴클레오티드의 "발현"은 RNA 전사체의 생산을 말한다. 단백질 또는 다른 효과기 화합물로의 후속의 번역이 또한 발생할 수 있지만, 특정되지 않으면 필요하지 않다.
"유전학적 변경"은, 유전학적 요소가 체세포분열 또는 감수분열에 의해서를 제외하고 세포안으로 도입되는 과정을 말한다. 이 요소는 세포에 비상동성일 수 있거나, 세포내에 이미 존재하는 요소의 부가적인 카피이거나 개선된 버전일 수 있다. 유전학적 변경은, 예를 들어, 일렉트로포레이션, 인산칼슘 침전과 같은 당업계에서 알려진 어떤 과정을 통해서 재조합 플라스미드 또는 다른 폴리뉴클레오티드로 세포를 형질도입시킴으로써 또는 폴리뉴클레오티드-리포솜 복합체와 접촉시킴으로써 실행될 수 있다. 유전학적 변경은 또한, 예를 들어, DNA 또는 RNA 바이러스 또는 바이러스 벡터를 이용한 형질도입이나 감염에 의하여도 실행될 수 있다. 유전학적 변경이 그 세포의 자손에 의하여 유전가능한 것이 바람직하지만, 이것은 특정되지 않으면 일반적으로 필요하지 않다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 어떤 길이의 아미노산의 중합체를 말한다. 이 중합체는 선형이거나 분지될 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비-아미노산에 의하여 가로막힐 수 있다. 이 용어는 또한 변형된 아미노산 중합체를 포함하는데, 예를 들어, 이황화결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 표지 성분과의 포합과 같은 어떤 다른 조작이다.
"융합 폴리펩티드"는 자연에서 발생하는 서열내의 상이한 위치에 있는 영역들을 포함하는 폴리펩티드이다. 이 영역들은 정상적으로 별개의 단백질내에 존재하고 융합 단백질내에서 함께 가져와지거나; 그것들은 정상적으로 동일한 단백질내에 존재하지만 융합 폴리펩티드내에서 새로운 배열로 배치되거나; 또는 그것들은 합성적으로 배열될 수 있다. 폴리펩티드의 "기능적으로 등가인 단편"은 아미노산의 첨가, 결실 또는 치환, 또는 그것들의 어떤 조합에 의하여 천연의 서열과 다르지만, 그것이 이용되는 상황에 적절한 단편의 기능적인 성질을 보존한다. 융합 펩티드 및 기능적으로 등가인 단편은 본 명세서에서 사용되는 폴리펩티드의 정의에 포함된다.
단백질의 접힘과 생물학적 기능은 아미노산 서열내에 삽입, 결실, 및 치환을 수용할 수 있다는 것이 이해된다. 어떤 아미노산 치환은 보다 쉽게 관용된다. 예를 들어, 유사 성질의 측쇄를 가진 또다른 아미노산에 의한, 소수성 측쇄, 방향족 측쇄, 극성 측쇄, 양전하 또는 음전하를 가진 측쇄, 또는 두개이하의 탄소원자를 포함하는 측쇄를 가진 아미노산의 치환은 그 두 서열의 본질적인 동일성을 교란하지 않고 발생할 수 있다. 상동성 영역을 결정하고 상동성의 정도를 채점하는 방법은 Altschul 등 Bull. Math. Bio. 48:603-616, 1986; 및 Henikoff 등 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919, 1992에서 기술된다. 폴리펩티드의 기능성을 보존하거나, 새롭고 유익한 성질(증강된 활성, 안정성, 또는 감소된 면역원성과 같은)을 부여하는 치환이 특히 바람직하다.
"항체"(복수형과 상호교환가능하게 사용됨)는, 면역글로불린 분자의 변이영역에 위치한 적어도 하나의 항원인식부위를 통하여 폴리펩티드와 같은 표적에 특이적 결합을 할 수 있는 면역글로불린 분자이다. 본원에서 사용될 때, 이 용어는 원상태의 항체뿐 아니라, 원하는 특이성의 적어도 하나의 항원조합부위를 포함하는 항체 등가물을 또한 포함한다. 이것들은 효소적으로 또는 재조합적으로 생산된 단편 항체, 융합 단백질, 인간화된 항체, 단일사슬 변이영역, 디아체(diabody), 및 항원-유도된 조립을 겪은 항체 사슬을 포함하지만, 여기에 한정되지는 않는다.
"분리된" 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체 또는 다른 물질은, 그 물질이나 유사한 물질이 자연적으로 발생하거나 처음 얻어지는 곳에서 또한 존재할 수 있는 다른 성분의 적어도 어느정도가 없는 그 물질의 제조를 말한다. 그러므로, 예를 들어, 분리된 물질은 정제기술을 이용하여 제조되어서 공급원 혼합물로부터 그것을 농축할 수 있다. 농축은, 용액부피당 중량과 같은 절대적 기초위에서 측정될 수 있거나, 공급원 혼합물에 존재하는 제2의 잠재적으로 방해하는 물질에 상대적으로 측정될 수 있다. 본 발명의 구체예의 농축이 증가할수록 더욱더 바람직하다. 그러므로, 예를 들어, 2-배 농축이 바람직하고, 10-배 농축이 더 바람직하고, 100-배 농축이 더 바람직하고, 1000-배 농축이 보다 더 바람직하다. 물질은 또한, 화학적 합성 또는 재조합 발현에 의한 것과 같은 인공적 조립의 과정에 의하여 분리된 상태로 제공될 수 있다.
"숙주세포"는 유전학적으로 변경되어 있거나, 외생성 폴리뉴클레오티드의 투여에 의하여 형질전환될 수 있는 세포이다.
용어 "임상 샘플"은, 환자로부터 얻어지고, 진단학적 시험과 같은 생체외 절차에서 유용한 다양한 샘플유형을 포함한다. 이 정의는 외과적인 제거, 병리 표본 또는 생검 표본으로서 얻어진 고체의 조직샘플, 임상환자로부터 얻어진 세포 또는 배양물로부터 얻어진 그것의 자손, 혈액, 혈청, 혈장, 척수액 및 뇨와 같은 액체샘플, 및 질병의 잠재적인 표시를 포함하는 그러한 샘플의 어떤 분획이나 추출물을 포함한다.
달리 표시되지 않으면, 본 발명의 실행은 분자생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 종래 기술을 당업계의 기술내에서 사용할 것이다. 그러한 기술은, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Second Edition(Sambrook, Fritsch & Maniatis, 1989), "Oligonucleotide Synthesis"(M. J. Gait, ed., 1984), "Animal Cell Cultures"(R. I. Freshney, ed., 1987); 연속물 "Methods in Enzymology"(Academic Press, Inc.); "Handbook of Experimental Immunology"(D. M. Weir & C. C. Blackwell, Eds.), "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells"(J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987), "Current Protocols in Molecular Biology"(F. M. Ausubel et al., eds., 1987); 및 "Current Protocols in Immunology" (J. E. Coligan et al., eds., 1991)과 같은 표준적인 문헌에서 설명된다. 독자는 또한, TRRE에 관한 이전의 특허출원, 국제특허출원 WO 98020140을 참고하기를 선택할 수 있다.
미국, 및 허용되는 다른 사법권내에서의 실행을 목적으로, 본 명세서에서 표시된 모든 특허, 특허출원, 기사 및 공개공보는 참고에 의하여 완전히 본원에 연합된다.
폴리뉴클레오티드
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 당업계에서 어떤 적당한 기술을 이용해서라도 제조될 수 있다. 본 명세서에서 제공된 자료를 이용하여, ~50염기쌍 미만의 서열이, 상업적 용역을 통하여 또는 트리에스테르 방법이나 포스파이트 방법과 같은 공지의 합성방법에 의하여, 화학적 합성에 의하여 편리하게 제조된다. 바람직한 방법은 모노뉴클레오시드 포스포르아미다이트 커플링 유니트를 이용하는 고체상 합성이다(Hirose et al., Tetra. Lett. 19:2449-2452, 1978; 미국특허 제4,415,732호).
안티센스 요법에서의 이용을 위하여, 폴리뉴클레오티드는, 보다 안정한 약제학적 제제를 생산하는 화학에 의하여 제조될 수 있다. 비-한정적인 실예에는, 티올-유도체화된 뉴클레오시드(미국특허 제5,578,718호), 및 변형된 골격을 가진 올리고뉴클레오티드(미국특허 제5,541,307호와 제5,378,825호)가 포함된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 또한, 원하는 서열을 가진 주형의 PCR 증폭에 의하여 얻어질 수 있다. 원하는 서열을 스패닝하는 올리고뉴클레오티드 프라이머는 주형으로 어닐링되고, DNA 중합효소에 의하여 신장된 다음, 보다 높은 온도에서 멜팅되어 주형과 신장된 올리고뉴클레오티드가 해리한다. 원하는 양의 증폭된 폴리뉴클레오티드가 얻어질 때까지 이 주기를 반복한다(미국특허 제4,683,195호와 제4,683,202호). 적당한 주형에는, TRRE 조정인자 암호화 서열을 가진 Jurkat T 세포 라이브러리 및 다른 인간 또는 동물 발현 라이브러리가 포함된다. Jurkat T 세포 라이브러리는 American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas VA 20110, U.S.A.(ATCC #TIB-152)로부터 이용가능하다. 돌연변이 및 다른 적응이 적당한 프라이머들을 고안함으로써 증폭하는 동안 수행될 수 있거나, 유전학적 스플라이싱에 의하여 후에 연합될 수 있다.
큰 폴리뉴클레오티드의 생산 스케일 양은 원하는 서열을 적당한 클로닝벡터안에 삽입하고 그 클론을 복제시킴으로써 가장 편리하게 얻어진다. 뉴클레오티드 클로닝을 위한 기술은 Sambrook, Fritsch & Maniatis(상기)에서 그리고 미국특허 제5,552,524호에서 주어진다. 모범적인 클로닝 및 발현 방법은 실시예 6에서 예시된다.
바람직한 폴리뉴클레오티드 서열은 본 명세서에서 예증된 서열중의 하나에 50%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 동일한데, 선호가 증가되는 순서대로이다. 모범적인 서열과 비교하여 동일하거나 상동성인 서열내의 연속적인 잔기들의 길이는, 선호가 증가되는 순서대로 약 15, 30, 50, 75, 100, 200 또는 500개 잔기일 수 있고 전체 클론의 길이까지이다. 보존적인 치환을 일으키고 암호화된 폴리펩티드의 기능을 보유하는(혼성화 성질 또는 암호화되는 것에 관하여) 뉴클레오티드 변화가 특히 바람직한 치환이다.
이것의 폴리뉴클레오티드는 세포 또는 조직샘플에서 변경된 TRRE 활성을 측정하기 위하여 사용될 수 있다. 이것은, 샘플내에 존재한다면, 그 폴리뉴클레오티드가 TRRE 활성의 조정인자를 암호화하는 핵산과 특이적으로 혼성화하도록 하는 조건하에서, 그 폴리뉴클레오티드와 샘플을 접촉시키는 단계와 단계 a)의 결과로서 혼성화되어진 폴리뉴클레오티드를 측정하는 단계를 수반한다. 이 시험의 특이성은 몇가지 방법중의 하나로 제공될 수 있다. 한 방법은 특이적인 프로브-충분히 길고 검출되고 있는 서열에 대하여 충분한 동일성이 있는 서열을 가진 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 사용을 수반하는데, 그것은 표적에 결합하고 샘플안에 존재할 수 있는 다른 핵산에는 결합하지 않는다. 프로브는 전형적으로 표지되어(직접적으로 또는 2차적인 시약을 통하여) 그후에 검출될 수 있다. 적당한 표지에는 32P와 33P, 화학발광 및 형광 시약이 포함된다. 혼성화 반응후에, 반응되지 않은 프로브는 세척되어 혼성화된 프로브의 양이 측정될 수 있다. 신호는 분지된 프로브를 이용하여 증폭될 수 있다(미국특허 제5,124,246호). 또다른 방법에서, 폴리뉴클레오티드는 PCR 반응을 위한 프라이머이다. 특이성은, 쌍형성된 프로브가 관심있는 서열을 증폭하는 능력에 의하여 제공된다. 적당한 수의 PCR 주기후에, 존재하는 증폭 생성물의 양은 샘플내에 원래 존재하는 표적서열의 양과 상호관련된다.
그러한 시험은 연구에서, 그리고 질병 상태의 진단 또는 평가 둘다에 있어서 유용하다. 예를 들어, TNF 활성은 종양세포를 제거하는데 있어서 역할을 하고(실시예 4), 암은 병에 걸린 조직에서 TRRE 활성을 활성화시킴으로써 이 제거과정을 모면할 수 있다. 그러므로, 어떤 조건하에서는, TRRE 조정인자의 높은 발현이 암의 진행과 상호관련될 수 있다. 진단학적 시험은 또한, 유전자요법이 TRRE 활성을 증가시키기 위하여 수행되는 때와 같이, 치료법을 모니터하는데 있어 유용하다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 또한, 아래에서 설명된 바와 같이 폴리펩티드의 생산 및 의약의 제조를 위하여 사용될 수 있다.
폴리펩티드
본 발명의 짧은 폴리펩티드는 고체-상 화학합성에 의하여 제조될 수 있다. 고체상 화학합성의 원리는 Dugas & Penney, Bioorganic Chemistry, Springer-Verlag NY pp 54-92 (1981) 및 미국특허 제4,493,795호에서 찾아질 수 있다. 자동화된 고체-상 펩티드 합성은 PE-Applied Biosystems 430A 펩티드 합성기(Applied Biosystems, Foster City CA)와 같은 장치를 이용하여 수행될 수 있다.
보다 긴 폴리펩티드는 발현 클로닝에 의하여 편리하게 얻어진다. 원하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 전사 및 번역을 위한 제어 요소에 작동가능하게 연결된 다음, 적당한 숙주세포안으로 트랜스펙션된다. 발현은 E. coli(ATCC 접수번호 31446 또는 27325)와 같은 원핵세포, 효모 Saccharomyces cerevisiae와 같은 진핵세포성 미생물, 또는 곤충이나 포유동물 세포와 같은 보다 고등의 진핵세포에서 실행될 수 있다. 많은 발현 시스템이 미국특허 제5,552,524호에서 기술된다. 발현 클로닝은 Lark Technologies, Houston TX와 같은 상업적 용역으로부터 이용가능하다. 곤충세포에서 본 발명의 4개의 모범적인 클론으로부터의 단백질의 생산은 실시예 6에서 예시된다. 단백질은, 친화성 크로마토그래피 및 HPLC와 같은 단백질화학에서 표준적인 방법에 의하여 생산하는 숙주세포로부터 정제된다. 발현 생성물은 임의로, 친화성 정제를 용이하게 하기 위하여 서열태그와 함께 생산되는데, 이 서열태그는 그후에 제거된다.
바람직한 서열은 본 명세서에서 예증된 서열중의 하나에 40%, 60%, 80%, 90%, 또는 100% 동일한데, 증가하는 선호의 순서대로이다. 천연의 인간 폴리뉴클레오티드와 비교하여 동일하거나 상동성인 서열의 길이는, 증가하는 선호의 순서대로 약 7, 10, 15, 20, 30, 50 또는 100개 잔기일 수 있고 전체 암호화 영역의 길이까지이다.
폴리펩티드는 TNF-R 절단 분석에서 TRRE를 조정하는 능력에 대하여 시험될 수 있다. 이 폴리펩티드는 수용체(바람직하게는 C75 세포와 같은 세포의 표면상에서 발현됨)와 접촉되고, 이 폴리펩티드가 수용체 절단 및 방출을 증가시키거나 감소시키는 능력이 측정된다. 본 발명의 모범적인 폴리펩티드에 의한 TNF-R의 절단은 실시예 7에서 예시된다.
본 발명의 폴리펩티드는 항체를 일으키기 위한 면역원으로서 사용될 수 있다. 큰 단백질은 항체들의 칵테일을 일으킬 것인 반면, 짧은 펩티드 단편은 원상태의 단백질의 작은 영역에 대하여 항체를 일으킬 것이다. 항체 클론은, 길이가 약 10개 아미노산인 짧은 중복되는 펩티드를 생산함으로써 단백질 결합부위를 위하여 매핑될 수 있다. 중복되는 펩티드는, 제조자의 지침에 따라 Genosys로부터의 SPOTSTM 키트를 이용하여, 표준적인 F-Moc 화학에 의하여 나일론막 지지체상에서 제조될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 또한, 아래에서 설명된 대로 TNF 신호전달에 영향을 주기 위하여 사용될 수 있다.
항체
폴리클로날 항체는 면역원 형태로 본 발명의 폴리펩티드를 척추동물에 주사함으로써 제조될 수 있다. 폴리펩티드의 면역원성은 KLH와 같은 담체에 연결함으로써, 또는 프로인트애주번트와 같은 애주번트와 조합함으로써 증강될 수 있다. 전형적으로, 초회항원자극 주사에 이어서 약 4주후에 추가항원주사를 하고, 항혈청을 한주후에 수확한다. 다른 항원들과 교차-반응하는 원하지 않는 활성이 존재한다면, 예를 들어, 고체상에 부착된 그 항원으로 만들어진 흡착제를 거쳐서 제조물을 통과시키고 결합되지 않은 분획을 수집함으로써 제거될 수 있다. 원한다면, 특이적인 항체 활성은, 단백질 A 크로마토그래피, 황산암모늄 침전, 이온교환 크로마토그래피, HPLC 및, 고체상에 커플링된 면역화 폴리펩티드를 이용한 면역친화성 크로마토그래피를 포함할 수 있는 기술들의 조합에 의하여 더 정제될 수 있다. 항체 단편 및 다른 유도체들은, 항체를 파파인이나 펩신과 같은 효소를 이용하여 절단하는 것과 같은 표준적인 면역화학적 방법에 의하여 제조될 수 있다.
모노클로날 항체의 생산은 Harrow & Lane (1988), 미국특허 제4,491,632호, 제4,472,500호 및 제4,444,887호 및 Methods in Enzymology 73B:3(1981)과 같은 표준적인 참고문헌에서 기술된다. 간단히 말해서, 포유동물을 면역화하고, 항체-생산 세포(보통, 비장세포)를 수확한다. 비-생산 골수종과의 융합, Epstein Barr Virus로의 트랜스펙션 또는 종양원 DNA로의 형질전환에 의하여 세포를 불멸화한다. 처리된 세포를 클로닝하고 배양하고 원하는 특이성의 항체를 생산하는 클론을 선택한다.
특이적인 항체 분자(최적으로는 단일-사슬 변이영역의 형태로)를 얻는 다른 방법은 면역적격 세포 또는 바이러스 입자의 라이브러리를 표적항원과 접촉시키는 것과 양성적으로 선택된 클론을 성장시키는 것을 수반한다. 면역적격 파지는 그것의 표면상에 면역글로불린 변이영역 절편을 발현하도록 구성될 수 있다. Marks et al., New Eng. J. Med. 335:730, 1996, 국제특허출원 WO 9413804, WO 9201047, WO 90 02809, 및 McGuiness et al., Nature Biotechnol. 14:1449, 1996을 참조하라.
본 발명의 항체는 TRRE 조정인자에 대한 면역분석에서 사용될 수 있다. 면역분석의 일반적인 기술은 "The Immunoassay Handbook", Stockton Press NY, 1994; 및 "Methods of Immunological Analysis", Weinheim: VCH Verlags gesellschaft mbH, 1993에서 찾아질 수 있다. 항체는, 존재할 수 있는 어떤 조정인자에라도 그 항체가 특이적으로 결합할 수 있지만 샘플내에 있을 법한 어떤 다른 단백질에도 특이적으로 결합하지 않을 조건하에서 시험 샘플과 조합된다. 형성된 복합체는 제자리에서(in situ)(미국특허 제4,208,479호와 제4,708,929호) 또는 반응되지 않은 시약으로부터 그것을 물리적으로 분리함으로써(미국특허 제3,646,346호) 측정될 수 있다. 분리 분석은 전형적으로 표지된 TRRE 시약(경합분석), 또는 표지된 항체(샌드위치분석)을 수반하여 그 복합체의 검출과 정량을 용이하게 한다. 적당한 표지는 125I와 같은 방사성동위원소, 또는 β-갈락토시다제와 같은 효소, 및 플루오레세인과 같은 형광표지이다. 본 발명의 항체는 또한 면역조직학에 의하여 고정된 조직 절편에서 TRRE 조정인자를 검출하는데 사용될 수 있다. 항체를 조직과 접촉시키고, 반응되지 않은 항체를 세척한 다음, 결합된 항체를 검출하는데 - 전형적으로 표지된 항-면역글로불린 시약을 이용한다. 면역조직학은 조정인자가 존재하는지 뿐만 아니라 그것이 조직내에서 어디에 위치하는지를 보여줄 것이다.
TRRE 조정인자의 검출은 연구목적상 및 임상적 사용상 관심을 끈다. 보다 일찍이 나타냈듯이, TRRE 조정인자의 높은 발현은 암의 진행과 상호관련될 수 있다. 진단학적 시험은 또한, 치료법의 과정에서 투여되는 TRRE 조정인자를 모니터하는데 유용하다.
본 발명의 항체는 또한, 의약의 제조를 위하여 사용될 수 있다. 치료상 잠재력을 가진 항체는, TRRE 조정인자의 제거를 촉진하거나 그것의 생리학적 활동을 차단함으로써 TRRE 활성에 영향을 주는 항체를 포함한다. 항체는, 다음의 절에서 기술된 분석에 따라 바람직한 활성에 대하여 스크리닝될 수 있다.
스크리닝 분석
본 발명은 TRRE를 조정하여 TNF 신호전달에 영향을 주는 생성물을 선택하고 개발하기 위한 많은 스크리닝 방법을 제공한다.
하나의 스크리닝 방법은 TRRE 활성을 조정하는 능력을 가진 폴리뉴클레오티드를 위한 것이다. 이 스크리닝을 하기 위하여, TRRE와 TNF 수용체를 둘다 발현하는 세포를 얻는다. 적당한 셀라인이, 기능적인 TRRE 활성의 수준을 발현하는 어떤 세포로부터라도 구성될 수 있다. 이 세포들은, 막-결합된 TNF-R을 방출하는 능력에 대하여 배양 상청액을 시험함으로써 확인될 수 있다. TRRE 발현의 수준은, 활성에 있어서의 증가가 검출될 수 있을 정도로 온건해야만 한다. 그리고나서, 세포는, 실시예 1에서 예시된 p55 또는 p75 TNF-R중의 어느 하나를 발현하도록 유전학적으로 변경될 수 있다. 모범은 C75R 라인: 75kDa 형태의 TNF-R를 발현하도록 유전학적으로 변경된 COS-1 세포이다. 세포로부터의 TNF-R의 방출은, 세포로의 표지된 TNF 리 간드의 잔여 결합을 시험함으로써, 또는 방출된 수용체에 대한 상청액의 면역분석에 의하여 측정될 수 있다(실시예 1).
스크리닝 분석은 TRRE와 TNF-R을 발현하는 세포를, 스크리닝될 폴리뉴클레오티드와 접촉시킴으로서 수행된다. 세포로부터의 TNF-R의 효소적 방출에 대한 이 폴리뉴클레오티드의 영향이 측정되고, 원하는 활성을 가진(TRRE 활성을 촉진하거나 억제하는) 폴리뉴클레오티드가 선택된다. 이 방법의 변이에서, TRRE 활성을 발현하지만 TNF-R은 발현하지 않는 세포(형질전환되지 않은 COS-1 세포와 같은)를 시험 폴리뉴클레오티드와 접촉시킨다. 그리고나서 배양배지를 수집하고, TNF-R을 발현하는 제2의 세포(C75 세포와 같은)를 사용하여 TRRE 활성에 대하여 분석하는데 사용한다.
이 유형의 스크리닝 분석은 TRRE 조정인자를 위한 암호화 서열을 포함한다고 믿어지는 발현 라이브러리로부터의 폴리뉴클레오티드의 선택에 유용하다. Jurkat 세포 발현 라이브러리(ATCC 접수번호 TIB-152)가 모범이다. 적당한 라이브러리가 구성될 수 있는 다른 세포는 특히 PMA 자극후에 높은 수준의 TRRE를 발현하는 것으로 알려진 세포인데, THP-1, U-937, HL-60, ME-180, MRC-5, Raji, K-562 및 정상적인 인간 단구와 같은 것들이다. 스크리닝은, 스크리닝을 위하여 사용되고 있는 선택된 셀라인안의 라이브러리로부터 DNA를 발현시키는 것을 수반한다. 원하는 활성을 가진 웰이 선택되고, 임의로 세포의 복제 또는 클로닝후에 DNA가 회수된다. 기능적인 스크리닝과 선택의 반복 주기는 TRRE 활성을 촉진하거나 억제하는 새로운 폴리뉴클레오티드 클론의 확인을 이끌어낼 수 있다. 이것은 아래 실시예 5에서 예시된다. 더이상의 실험들이, 선택된 폴리뉴클레오티드가 세포내에서 TRRE 활성을 조정하는지를 측정하기 위하여 그 폴리뉴클레오티드상에서, 또는 단백질 생성물의 활동을 통하여 수행될 수 있다. 긴 오픈 리딩프레임은 단백질 생성물을 위한 역할을 제안하고, 신호펩티드와 막스패닝 영역을 위한 아미노산 서열의 검사는 그 단백질이 세포로부터 분비되는지 또는 표면 막에서 발현되는지 여부를 결정하는 것을 도울 수 있다.
이 유형의 스크리닝은 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 더이상의 개발에 유용하다. 예를 들어, 기능적인 펩티드 단편, 융합 단백질, 및 다른 변이형을 암호화하는 발현 구조물이 개발될 수 있다. TRRE 조정 활성을 여전히 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열의 최소크기는, 그 서열의 일부를 제거한 다음 스크리닝 분석을 이용하여 활성이 여전히 존재하는지를 측정함으로써 결정될 수 있다. 돌연변이 및 연장된 서열도 또한 동일한 방법으로 시험될 수 있다.
이 유형의 스크리닝 분석은 또한, TRRE 조정인자를 암호화하는 mRNA를 이용하여 방해함으로써 TRRE 활성에 영향을 주는 화합물을 개발하는데 유용하다. 특히 관심이 있는 것은 리보자임 및 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 리보자임은 특이적 부위에서 RNA의 절단을 촉매하는 엔도리보뉴클레아제이다. 그것은 표적상의 절단부위에 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열 및, 절단에 영향을 주기 위하여 3차구조를 제공하는 부가적인 서열을 포함한다. 리보자임의 구성은 미국특허 제4,987,071호 및 제5,591,610호에서 기술된다. mRNA에 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 그 mRNA에 상보적인 짧은 서열을 포함한다(전형적으로 길이가 8-25개 염기). 안티센스 올리고뉴클레오티드를 구성하기 위한 바람직한 화학은 앞 절에서 개설되어 있다. 특이성은, 상보적인 서열 및 화학적 구조의 특질 둘다에 의하여 제공된다. 세포표면 수용체의 발현을 억제하는 안티센스 분자는 미국특허 제5,135,917호와 제5,789,573호에서 기술된다. 스크리닝은, TRRE 활성와 TNF-R을 발현하는 세포를 그 화합물과 접촉시키는 것과 수용체 방출에 대한 그 효과를 측정하는 것을 수반한다. TRRE 촉진제의 발현을 변경하는데 효과적인 리보자임과 안티센스 분자는 TNF-R 방출을 감소시킬 것이다. TRRE 억제제의 발현을 변경하는데 효과적인 리보자임과 안티센스 분자는 TNF-R 방출을 증가시킬 것이다.
본 명세서에서 기술된 또다른 스크리닝 방법은 폴리펩티드가 TRRE 활성을 조정하는 능력을 시험하기 위한 것이다(실시예 7). TNF-R과 온건한 수준의 TRRE 활성을 둘다 발현하는 세포를 시험 폴리펩티드와 접촉시키고, 수용체 방출의 속도를 자발적인 방출의 속도와 비교한다. 방출의 증가된 속도는 그 폴리펩티드가 TRRE 촉진제임을 나타내는 반면, 감소된 속도는 그 폴리펩티드가 TRRE 억제제임을 나타낸다. 이 분석은, 새로운 폴리펩티드의 활성을 시험하고 TRRE를 조정한다고 이미 알려진 폴리펩티드의 변이형을 개발하기 위하여 사용될 수 있다. TRRE 조정 활성을 여전히 암호화하는 폴리펩티드 서열의 최소크기는, 폴리펩티드의 더 작은 단편을 만든 다음 스크리닝 분석을 이용하여 활성이 여전히 존재하는지를 측정함으로써 결정될 수 있다. 돌연변이 및 연장된 서열은 동일한 방법으로 시험될 수 있다.
본 발명에서 구체화된 또하나의 스크리닝 방법은, 단백질 수준에서 TRRE 조정인자의 활동을 방해하는 물질을 스크리닝하기 위한 방법이다. 이 방법은 TNF 수 용체를 발현하는 세포(C75R 세포와 같은)를 TNF 촉진 활성을 가지는 본 발명의 폴리펩티드와 함께 인큐베이션하는 것을 수반한다. 이 분석에서 TRRE 조정인자를 공급하기 위한 두가지 선택이 있다. 한 선택에서, 폴리펩티드를 시험될 물질과 함께 시약으로서 세포의 배지에 첨가한다. 또하나의 선택에서, 세포는 높은 수준으로 TRRE 조정인자를 발현하도록 유전학적으로 변경되고, 분석은 시험물질이 세포와 접촉되는 것만을 필요로한다. 이 선택은 많은 시험 화합물들의 높은 처리량 스크리닝을 허용한다.
어느 방식으로든, 수용체 방출의 속도는 시험물질의 존재 및 부재하에서 비교되어 TRRE 활성을 증강시키거나 감소시키는 화합물을 확인한다. 수용체 쉐딩에 대한 그 물질의 활성이 첨가된 폴리펩티드의 부재하에서 시험되는 병행적 실험들이 수행되어야 한다(그 폴리펩티드를 발현하지 않는 세포를 이용하여). 이것은 시험물질의 활성이 첨가되고 있는 TRRE 촉진제에 대한 영향을 통하여 발생하는지 또는 어떤 다른 메카니즘을 통하여 발생하는지를 결정할 것이다.
이 유형의 스크리닝 분석은 TRRE 조정인자의 활성에 영향을 주는 항체를 확인하는데 유용하다. 항체는 이전의 절에서 기술된 대로 TRRE 조정인자에 대하여 일으켜진다. 만약 그 항체가 스크리닝 분석에서 TRRE 활성을 감소시킨 다면, 그것은 생체내에서 TRRE 활성을 낮추기 위한 치료상의 잠재력을 가진다. 이 분석을 이용한 모노클로날 항체의 스크리닝은 또한, 폴리펩티드내의 결합 또는 촉매 부위를 확인하는 것을 도울 수 있다.
이 유형의 스크리닝 분석은 또한, TRRE 조정인자에 대한 영향에 의하여 세포 상의 TNF 수용체의 수준에 영향을 주는 능력을 가진 작은 분자 화합물의 높은 처리량 스크리닝에 유용하다. 원하는 활성을 가지는 작은 분자 화합물은 종종 약제학적 조성물을 위하여 바람직한데, 왜냐하면 그것이 종종 생산하기에 더 안정하고 덜 고가이기 때문이다.
의약 및 그것의 사용
앞서서 기술된 바와 같이, 본 발명에서 구체화된 어떤 생성물의 효용은 시토킨(특히 TNF)으로부터의 신호전달에 영향을 준다는 것이다. TRRE 활성을 촉진하는 생성물은 세포의 표면상에서 TNF 수용체를 감소시키는 효과를 가지고, TNF로부터의 신호전달을 감소시킬 것이다. 반대로, TRRE 활성을 억제하는 생성물은 TNF 수용체의 절단을 막아서, 신호전달을 증가시킨다.
TNF 신호전달에 영향을 주는 능력은, TNF 신호하기가 병리에 기여하는 임상 상태의 관리에 있어서 상당한 관심을 끈다. 그러한 질병에는 다음의 것들이 포함된다:
ㆍ심부전. IL-1β 및 TNF는 염증과정을 영속시키고, 염증세포를 모집하고 활성화시키기 위한 중심적인 매개자인 것으로 믿어진다. 염증은 울혈성 심부전, 이식거부, 심근염, 패혈증, 및 화상쇼크에서 심기능을 저하시킨다.
ㆍ악액질. 암과 같은 만성 질병의 과정에서 발생하는 일반적인 체중감소와 소모. TNF는 식욕, 에너지 소비, 및 대사율에 영향을 주는 것으로 믿어진다.
ㆍ크론병. TNF에 의하여 매개되는 염증과정은, 림프부종과 림프구 침윤의 결과 생기는 장벽의 농후화를 이끌어낸다.
ㆍ내독소쇼크. E. coli와 같은 그람-음성 박테리아로부터 내독소의 방출에 의하여 유도되는 쇼크는 TNF-매개된 염증을 수반한다.
ㆍ관절염. TNF는 질병 발병기전에 수반된다고 믿어지는 산화질소 합성효소의 발현을 촉진한다.
관심있는 다른 질병은 다발성 경화성, 패혈증, 미생물 감염에 의하여 야기되는 염증, 및 유형 I 당뇨병과 같이 자가면역 원인론을 가지는 질병이다.
TRRE 활성을 촉진하는 본 발명의 폴리펩티드는 TNF 신호전달을 감소시키거나 정상화하는 목적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 울혈성 심부전 또는 크론병에 있어서, 그 폴리펩티드는 염증 후유증을 줄이기 위하여 규칙적인 간격으로 주어진다. 치료는 TNF 신호전달에 영향을 주거나(TNF에 대한 항체 또는 수용체 길항제와 같은) 다른 방법으로 염증의 정도를 줄이는 다른 약제와 임의로 조합된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 또한, 유전자 요법에 의하여 TRRE 활성을 촉진하기 위하여 사용될 수 있다. 암호화 서열은 인간세포내에서의 전사와 번역을 위한 제어 요소에 작동가능하게 연결된다. 그리고나서, 그것은 질병부위에 있는 세포에서 암호화 서열의 입장과 발현을 촉진할 형태로 제공된다. 국소주사에 적당한 형태에는, 드러난(naked) DNA, 양이온성 지질과 함께 패키지된 폴리뉴클레오티드, 및 바이러스 벡터(아데노바이러스 및 AAV 구조물과 같은)의 형태로의 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 당업자에게 알려진 유전자요법의 방법은 미국특허 제5,399,346호, 제5,827,703호, 및 제5,866,696호에서 개설된 것들을 포함할 것이다.
TNF 신호전달에 영향을 주는 능력은 또한, TNF가 질병을 해결하는데 있어서 유익한 역할을 한다고 생각되는 곳에서 관심을 끈다. 특히, TNF는 충실성 종양의 괴사에 있어 유익한 역할을 한다. 따라서, 본 발명의 생성물은 암환자에게 투여되어 TRRE 활성을 억제함으로써 TNF 신호전달을 증가시키고 유익한 효과를 개선할 수 있다.
TRRE 활성을 억제하는 본 발명의 구체예는 안티센스 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 오래-지속되는 억제 활성을 부여하는 방법은 안티센스 유전자요법을 투여하는 것이다. 세포내에서 RNA를 발현하고 차례로 표적 유전자의 전사를 감소시킬 유전학적 구조물이 고안된다(미국특허 제5,759,829호). 인간에서, 보다 빈번한 형태의 안티센스요법은 표적 mRNA - 이 경우에, TRRE 조정인자를 암호화하는 전사체의 절편에 상보적인 짧은 안정한 폴리뉴클레오티드 단편의 형태로 효과기 안티센스 분자를 직접 투여하는 것이다(미국특허 제5,135,917호 및 제5,789,573호). TRRE를 억제하는 본 발명의 또하나의 구체예는 앞선 절에서 기술된 대로 구성된 리보자임이다. mRNA 번역을 억제하는에 있어서 리보자임의 기능은 미국특허 제4,987,071호와 제5,591,610호에서 기술된다.
본 발명의 생성물이 본 명세서에서 기술된 생체내 분석에서 적당한 TRRE 조정활성을 가진다고 일단 밝혀지면, TNF 매개된 질병과정의 동물 모델에서의 그것의 유효를 또한 시험하는 것이 바람직하다. 실시예 3은 TRRE 활성의 촉진제를 시험하기 위하여 사용될 수 있는 패혈증을 위한 LPS 모델을 기술한다. 실시예 4는 종양 괴사모델을 기술하는데, 여기에서 TRRE 억제제는 괴사 활성을 증강시키는 능력에 대하여 시험될 수 있을 것이다. 당업자는 TNF 신호전달 또는 염증에 대한 영향을 시험하는데 적당한 다른 동물 모델에 관하여 알 것이다. 다른 예시는 Weyrich 등(J. Clin. Invest. 91:2620, 1993) 및 Garcia-Criado 등(J. Am. Coll. Surg. 181:327, 1995)의 심장허혈 재관류(reperfusion) 모델; Steinberg 등(J. Heart Lung Transplant. 13:306, 1994)의 폐 허혈 재관류 모델, 국제특허출원 WO 9635418의 폐염증 모델; Sharar 등(J. Immunol. 151:4982, 1993)의 박테리아 복막염 모델, Meenan 등(Scand. J. Gastroenterol. 31:786, 1996)의 대장염 모델, 및 von Herrath 등(J. Clin. Invest. 98:1324, 1996)의 당뇨병 모델이다. 패혈성 쇼크를 위한 모델은 Mack 등, J. Surg. Res. 69:399, 1997; 및 Seljelid 등, Scand. J. Immunol. 45:683-7에서 기술된다.
약제학적 제제에서 활성 성분으로서의 사용을 위하여, 본 발명의 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 항체는 일반적으로, 그것들이 제조되는 혼합물안에 존재하는 다른 반응성 또는 잠재적으로 면역원성인 구성성분으로부터 정제된다. 전형적으로, 각각의 활성성분은, 기능적인 분석, 크로마토그래피, 또는 SDS 폴리아크릴아미드겔 전기영동에 의하여 측정될 때 적어도 약 90% 동질성, 그리고 더욱 바람직하게는 95% 또는 99% 동질성으로 제공된다. 그리고나서, 활성성분은, Remington's Pharmaceutical Sciences 18th Edition (1990), E.W. Martin ed., Mack Publishing Co., PA에서 기술된 것과 같이, 약제학적 제제의 제조를 위하여 일반적으로 수용되는 절차에 따라 의약으로 조제된다. 의약의 조제에 있어서의 단계들은 부분적으로는 의도되는 사용과 투여의 양식에 의존하고, 멸균하는 것, 적절한 비-독성 및 비-방해 부형제 및 담체와의 혼합하는 것, 제형으로 나누는 것 및 송달장치에 넣는 것 을 포함할 수 있다. 의약은 전형적으로 그것의 의도된 사용에 관한 정보와 함께 패키지될 것이다.
투여의 양식은 치료되고 있는 질병의 본질에 의존할 것이다. 온건한 투여를 필요로 할 것으로 예상되고 잘 관류된 부위(심부전과 같은)에서의 질병을 위해서는, 전신성 투여가 수용될 수 있다. 예를 들어, 의약은 정맥내 투여, 근육내 주사, 또는 흡수를 위하여 혀밑으로 또는 코안으로 제제화될 수 있다. 활성성분을 국소적으로 투여하는 것이 가능한 경우에는, 이것이 보통 바람직하다. 국소 투여는 질병부위에서 활성성분의 농도를 증강시키고, 질병과정에 수반되지 않는 다른 조직상에 있는 TNF 수용체에 대한 효과를 최소화할 것이다. 질병부위에서 직접적으로 투여하는 것에 유용한 질병에는 암과 류마티스양관절염이 포함된다. 충실성 종양은 피부에 가까울 때 또는 내시경 절차에 의하여 도달될 수 있는 때는 직접 주사될 수 있다. 활성성분은 또한, 젤라틴성 매트릭스에 또는 Gliadel
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(Guilford Sciences)와 같은 적당한 막에 주입되어, 외과적 절제술동안 종양부위에 투여될 수도 있다. 직접 투여가 불가능한 경우, 투여는 질병부위로 이끄는 소동맥을 통하여 주어질 수 있다. 양자택일적으로, 약제학적 조성물은 질병부위에서 활성성분의 축적을 증강하기 위하여 제제화될 수 있다. 예를 들어, 활성성분은, 표적세포상의 세포표면 단백질을 결합할 수 있는 항체 또는 리간드를 드러내보이는 리포솜 또는 다른 매트릭스 구조안에 피막될 수 있다. 적당한 표적화 약제에는, 암항원에 대한 항체, 조직-특이적인 수용체를 위한 리간드(예를 들어, 폐 표적화를 위한 세로토닌)가 포함된다. TNF 신호전달을 감소시키는 조성물을 위하여, 적절한 표적화 분자는 TNF 리간드일 수 있는데, 표적 조직이 특별하게 높은 밀도의 TNF 수용체를 드러내보일 수 있을 것 같기 때문이다.
본 발명의 조성물의 효과적인 양은, TRRE 활성을 적어도 약 10%, 전형적으로는 적어도 약 25%, 보다 바람직하게는 약 50% 또는 75% 변경하는 양이다. TRRE 활성의 거의 완전한 제거(ablation)가 바람직한 경우, 바람직한 조성물은 TRRE 활성을 적어도 90% 감소시킨다. TRRE 활성의 증가가 바람직한 경우에, 바람직한 조성물은 적어도 2배 TRRE 활성을 증가시킨다. 활성 화합물의 최소 효과적인 양은 치료되고 있는 질병, 어떤 TRRE 조정인자가 사용을 위하여 선택되는지, 및 투여가 전신성일 것인지 또는 국소적일 것인지에 의존할 것이다. 전신성 투여를 위하여, 활성의 효과적인 양은 일반적으로, 효소 활성에서 약 100 내지 50,000 유니트-전형적으로는 약 10,000 유니트가 변화하도록 할 수 있는 TRRE 조정인자의 양일 것이다. 단백질, 핵산 또는 항체의 질량량은 그람당 유니트단위인 활성 화합물의 특이적인 활성에 기초하여, 알맞게 선택된다.
다음의 실시예들은 실행자에게 더이상의 안내로서 제공되고 어떤 방법으로든 본 발명을 한정하도록 의도되지 않는다.
실시예 1: TRRE 활성을 위한 분석 시스템
이 실시예는 세포표면 막에서 천연의 입체구조인 인간의 TNF-R에 대한 TRRE의 활성을 측정하는 분석 시스템을 예시한다.
막-연관된 TNF-R이, 생체내 TRRE를 위한 기질의 미세환경에 유사한 미세환경 을 가지기 때문에 기질로서 선택되었다. 막-연관된 TNF-R은 또한 보다 특이적인 활성을 요구하는데, 이것은 보다 덜-특이적인 프로테아제를 구별할 것이다. 상승된 수준의 p75 형태의 TNF-R을 발현하는 세포는, 75kDa 또는 55kDa 크기 중의 하나인 작은 TNF-R을 발현하는 원숭이 COS-1 세포안으로의 cDNA 트랜스펙션에 의하여 구성되었다.
이 세포들을 구성하는 절차는 다음과 같다: 인간의 p75 TNF-R의 cDNA는 인간의 단구 U-937 세포로부터 유도된 λgt10 cDNA 라이브러리로부터 클로닝되었다 (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA). 클로닝된 단편의 5' 및 3' 끝 둘다상의 처음 300bp를 서열분석하였고 인간의 p75 TNF-R의 보고된 cDNA 서열과 비교하였다. 클로닝된 서열은 보고된 p75 TNF-R 서열의 위치 58-2380을 차지하는 2.3kb 단편이었고, 이것은 위치 90에서 1475까지 전 길이의 p75 TNF-R-코딩서열을 포함한다. 그리고나서, 2.3kb p75 TNF-R cDNA는 pCDNA3 진핵세포 발현벡터의 다수의 클로닝 부위안으로 하위클로닝되었다. p75 TNF-R cDNA의 정위는 제한엔도뉴클레아제 매핑에 의하여 증명되었다.
도 1은 최종의 7.7kb 구조물, pCDTR2를 예시한다. 그것은 G418안에서 트랜스펙션된 세포의 선택을 위하여 네오마이신-저항성 유전자를 가지며, p75 TNF-R의 발현은 시토메갈로바이러스 프로모터에 의하여 조종된다. 그후, pCDTR2는 인산칼슘-DNA 침전법을 이용하여 원숭이 신장 COS-1 세포(ATCC CRL-1650)안으로 트랜스펙션되었다. G418 배지안에서 선택된 클론은 확인되고 하위배양되었다. 이 클론을 C75R이라 명명하였다.
C75R 세포상에서 p75 TNF-R 발현의 수준을 측정하기 위하여, 2 x 105 세포/웰을 24-웰 배양 플레이트안에 플레이팅하고 37℃에서 5% CO2안에서 12 내지 16시간동안 인큐베이션하였다. 그리고나서, 그것을, 100배-과잉의 표지되지 않은 인간의 TNF의 존재 또는 부재하에서 2-30ng 125I 인간의 재조합 TNF(클로라민 T 방법을 이용하여 방사성표지됨)와 함께 4℃에서 2시간동안 인큐베이션하였다. 빙냉 PBS로 세번 세척한 후, 세포를 0.1N NaOH로 융해하고 결합된 방사성활성을 Pharmacia Clinigamma 계수기(Uppsala, Sweden)안에서 측정하였다.
도 2는 얻어진 결과들을 보여준다. C75R은 방사성표지된 125I-TNF의 아주 높은 수준의 특이적 활성을 가지는 반면, 모 COS-1 세포는 그렇지 않았다. C75R상에서 발현된 TNF-R의 수는 Scatchard 분석에 의하여 세포당 60,000-70,000개 수용체인 것으로 측정되었다(도 2, 삽입도). 계산된 Kd 값은 5.6 x 10-10 M이었다. 이 Kd 값은 천연의 p75 TNF-R을 위하여 이전에 보고된 값에 가까이 일치되었다.
TRRE는 THP-1 세포(WO 9802140)의 PHA 자극에 의하여 얻어졌다. 지수기에서 성장하는 THP-1 세포(ATCC 45503)를 수집하고, 1% FCS가 첨가된 RPMI-1640의 1x106 세포/ml로 재현탁하고, 5% CO2에서 37℃로 30분동안 10-6M PMA와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 수집하고, 혈청-없는 배지로 한번 세척하여 PMA를 제거하고 1% FCS를 함유한 RPMI-1640의 동일한 부피에 재현탁하였다. 5% CO2에서 37℃로 2시간 인큐베 이션한 후에, 세포 현탁액을 수집하고, 원심분리하고, 세포-없는 상청액을 TRRE의 공급원으로서 수집하였다.
COS-1 세포 구조물에서 막-결합된 TNF-R에 대한 TRRE의 효과를 측정하기 위하여, 다음의 실험을 수행하였다. C75R 세포를 2 x 105 세포/웰의 밀도로 24-웰 세포배양 플레이트안에 심고 5% CO2에서 37℃로 12 내지 16시간동안 인큐베이션하였다. 웰안의 배지를 흡인하고, 신선한 배지 단독 또는 TRRE 배지로 대체하고 37℃에서 30분동안 인큐베이션하였다. 그리고나서, 배지를 30ng/ml 125I-표지된 TNF를 포함하는 신선한 배지로 대체했다. 4℃에서의 2시간후에, 세포를 0.1N NaOH로 융해하고 결합된 방사성활성의 수준을 측정하였다. 125I-TNF에 의한 C75R의 특이적인 결합의 수준은 TRRE와의 인큐베이션후에 유의하게 감소하였다. 방사성활성 계수는, TRRE로 처리되지 않은 세포상에서의 10,567 cpm에 비교하여 TRRE로 인큐베이션된 세포상에서 1,393 cpm으로, 결합 수용능의 87%가 손실되었다.
TRRE에 의하여 C75R로부터 제거된 p75 TNF-R의 크기를 측정하기 위하여, 다음의 실험을 수행하였다. 15 x 106 C75R 세포를 150mm 세포배양 플레이트안에 심고, 5% CO2안에서 37℃로 12 내지 16시간동안 인큐베이션하였다. TRRE 배지를 150mm 플레이트안에서 30분동안 C75R 배지와 함께 인큐베이션하고, 결과적인 상청액을 수집하고 원심분리하였다. 농축된 샘플을 10% 아크릴아미드 SDS-PAGE에 적용하고 전기영동적으로 폴리비닐리덴 디플루오리드 막(Immobilon)에 옮겼다. 면역염색의 결과, 생물학적 체액안에서 발견되는 크기에 유사한 40kDa의 단일밴드가 생겼다. 그러므로, 트랜스펙션된 COS-1 세포는 천연의 TNF-R에 유사한 형태로 높은 수준의 인간의 p75 TNF-R을 발현하였다.
다음의 분석방법은 TRRE 활성의 일상적인 측정을 위하여 채택되었다. C75R 세포와 COS-1 세포를 2.5 x 105 세포/ml/웰의 밀도로 24-웰 배양플레이트안에 심고 5% CO2안에 37℃로 (12 내지 16시간동안) 밤새 인큐베이션하였다. 웰안에서 배지를 흡인한 다음, 300㎕의 TRRE 배지를, C75R과 COS-1 플레이트 둘다의 각각의 웰안에서 5% CO2안에 37℃로 30분동안 인큐베이션하였다(각각 아래에 언급된 A 및 C에 상응함). 동시에, 24-웰 플레이트안의 C75R 세포를 또한 300㎕의 신선한 배지 또는 완충액과 인큐베이션하였다. 상청액을 수집하고 원심분리한 다음, ELISA에 의하여 가용성 p75 TNF-R의 농도에 대하여 분석하였다.
방출된 TNF-R(WO 9802140)에 대한 ELISA 분석을 다음과 같이 수행하였다: 인간의 p75 TNF-R에 대한 폴리클로날 항체는 뉴질랜드 화이트 암컷 토끼의 면역화에 의하여 생성되었다(Yamamoto et al. Cell. Immunol. 38:403-416, 1978). 면역화된 토끼 혈청의 IgG 분획을 단백질 G(Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) 친화성 칼럼을 사용하여 정제하였다(Ey et al. (1978) Immunochemistry 15:429-436, 1978). 그리고나서, IgG 분획을 서양고추냉이 과산화효소(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)로 표지하였다(Tijssen and Kurstok, Anal. Biochem. 136:451-457, 1984). 이 분석의 처음 단계에서, 100㎕의 0.05M 탄산염 완충액(pH 9.6)중의 5㎍의 표지되지 않은 IgG를, 4℃에서 밤새 인큐베이션함으로써 96-웰 ELISA 미세플레이트 (Corning, Corning, NY)에 결합시켰다. 개개의 웰을 인산염 완충된 식염수(PBS)중의 0.2% Tween-20 300㎕로 세척했다. 100㎕의 샘플과 재조합 수용체 표준을 각각의 웰에 첨가하고 37℃에서 1 내지 2시간동안 인큐베이션하였다. 그리고나서 웰을 동일한 방법으로 세척하고, 100㎕의 서양고추냉이 과산화효소-표지된 IgG를 첨가하고 37℃에서 1시간동안 인큐베이션하였다. 웰을 한번더 세척하고, 기질 ABTS(Pierce, Rockford, IL)와 30% H2O2(Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ)를 이용하여 실온에서 20분(min)동안 색을 전개시켰다. 색 전개는 405nm에서 측정되었다.
C75R 세포가 TRRE 배지와 함께 인큐베이션될 때, 가용성 p75 TNF-R이 상청액으로 방출되고, 이것은 ELISA에 의하여 측정가능하다. 방출된 수용체의 양은 첨가된 TRRE의 양에 상응했다. 또한, 배지 단독으로만 인큐베이션된 C75R세포에서도 자발적인 TNF-R 방출의 수준이 있었다. 이것은 단백분해 효소의 내생성 공급원, 원숭이 기원의 인간 TRRE의 상동체에 기인하는 것으로 가정된다.
다음의 계산을 수행하였다. A = (TRRE 포함 샘플로 처리된 C75R 플레이트안의 가용성 p75 TNF-R의 양); 즉, C75R 플레이트안의 sTNF-R의 총량. B = (상응하는 샘플로서 동일한 시약을 포함하지만 외생성 TRRE가 없는 배지 또는 완충액만으로 처리된 C75R플레이트에서 자발적으로 방출된 가용성 p75 TNF-R의 양); 즉, C75R 세포로부터 sTNF-R의 자발적인 방출. C = (TRRE 샘플로 처리된 COS-1 플레이트안의 가용성 p75 TNF-R의 양 또는 THP-1에 의하여 방출된 가용성 p75 TNF-R의 배경수준); 즉, COS-1 플레이트에서 30분 인큐베이션동안 TRRE 샘플안에 옮겨진(이전-존재하는) sTNF-R의 분해된 값. 이것은 C75R에서 분해된 sTNF-R의 배경수준에 상응한다. 초기의 샘플안에 존재하는 TRRE 활성에 의하여만 생산되는 가용성 p75 TNF-R의 순방출은 다음과 같이 계산된다:(오직 TRRE만에 의한 가용성 p75 TNF-R의 순방출) = A - B - C.
TRRE의 유니트 활성은 다음과 같이 정의되었다: 이 분석과정에서 가용성 p75 TNF-R 순방출(A - B - C)의 1pg이 TRRE 활성의 1 유니트(U)이다.
이 분석을 이용하여, TRRE 활성에 의한 수용체 쉐딩의 시간과정이 다음의 실험에서 측정되었다. TRRE-배지를 변하는 길이의 시간동안 C75R 및 COS-1 세포와 인큐베이션하였다. 그리고나서, 상청액을 수집하고, ELISA에 의하여 가용성 p75 TNF-R의 수준에 대하여 분석하고, 순 TRRE 활성을 계산하였다. 검출가능한 수준의 가용성 수용체가 TRRE에 의하여 5분내에 방출되었고 30분까지 증가하였다. 더 긴 인큐베이션 시간은, 아마도 기질의 고갈때문에, TRRE의 수준이 30분후에는 상대적으로 일정하게 된다는 것을 보여주었다. 그러므로, 30분은 최적의 인큐베이션 시간인 것으로 측정되었다.
PMA 자극에 의한 TRRE 및 공지의 MMPs의 유도 패턴은 꽤 다르다. MMPs를 유도하기 위하여, 단구 U-937세포, 섬유육종 HT-1080 세포, 또는 복막 삼출물 대식세포(PEM)는 보통 LPS 또는 PMA로 1 내지 3일동안 자극되어야 한다. 한편, 이 길어진 유도와 비교할 때, TRRE는 PMA-자극후 30분에 이어 배양 상청액안에서 아주 신속하게 방출된다. TRRE와 sTNF-R이 생체외에서 복합체를 형성한다는 가정은, 25%의 TRRE 활성이 가용성 p75 TNF-R 친화성 칼럼으로부터 회수되는 실험에 의하여 확실하게 되었다. 이것은, 자유 TRRE가 그것의 촉매적 생성물, sTNF-R에 결합하는 능력을 가진다는 것을 의미한다. 친화성 칼럼에 결합하지 않는 남아있는 75%는 이미 sTNF-R에 결합되어 있을 수 있거나, 자유형태임에도 불구하고 sTNF-R에 결합하기에 충분한 친화성을 가질 수 없다.
실시예 2: THP-1 세포로부터 얻어진 TRRE의 특성화
THP-1 세포의 PHA 자극에 의하여 얻어진 TRRE는 배양배지로부터 부분적으로 정제되었다(WO 9802140). 먼저, 이 배지로부터의 단백질을 4℃에서 100% 포화된 황산암모늄 침전에 의하여 농축하였다. 침전물을 10,000 x g에서 30분동안 원심분리에 의하여 펠리팅하고, 펠렛 부피의 약 2배로 PBS에 재현탁하였다. 그리고나서 이용액을 10mM Tris-HCl, 60mM NaCl, pH 7.0에 대하여 4℃에서 투석하였다. 이 샘플을 50mM Tris-HCl, 60mM NaCl, pH 8.0으로 이전에 평형화된 음이온-교환 크로마토그래피, 디에틸아미노에틸(DEAE)-Sephadex A-25 칼럼(Pharmacia Biotech)(2.5 x 10cm)위에 로딩하였다. 그리고나서, TRRE를 60 내지 250mM NaCl, 50mM Tris-HCl, pH 8.0의 이온세기 선형구배를 이용하여 용출하였다. 각각의 분획을 280nm에서의 흡광도에 대하여 측정하였고 TRRE 활성에 대하여 분석하였다. 가장 높은 특이적인 활성(TRRE 유니트/A280의 가장 높은 값)을 가진 DEAE 분획을 모아서 이 실시예에서 기술된 TRRE의 특성조사에 사용하였다.
다음 실험에서, 효소의 기질 특이성은 면역조직화학적 기술을 이용하여 설명되었다. 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-포합된 항-CD54, FITC-포합된 염소 항-토끼 및 마우스 항체, 마우스 모노클로날 항-CD30, 항-CD11b 및 항-IL-1R (Serotec, Washington D.C.)을 사용하였다. 토끼 폴리클로날 항-p55 및 p75 TNF-R을 Yamamoto 등(1978) Cell Immunol. 38:403-416에 따라서 얻었다. THP-1 세포를, DEAE-Sephadex 칼럼으로부터 용출된 1,000 및/또는 5,000U/ml의 TRRE로 30분동안 처리한 다음, 1 x 105 세포/100㎕/튜브로 12 x 75mm 폴리스티렌 튜브(Fischer Scientific, Pittsburgh, PA)로 옮겼다. 그리고나서, 4℃에서 5분동안 350 x g로 원심분리함으로써 세포를 펠리팅하고, 10㎕의 FITC-포합된 항-CD54(따로 냉각 PBS/0.5% 나트륨에 희석됨)로 직접적으로, 마우스 모노클로날 항-CD11b, IL-1R 및 CD30의 처리후 FITC-포합된 항-마우스 항체로 간접적으로, 및 토끼 폴리클로날 항-p55 및 p75 TNF-R의 처리후 FITC-포합된 항-토끼 항체로 또한 간접적으로 염색하였다.
TRRE의 처리없이 각각의 항체로 염색된 THP-1 세포는 음성 대조표본으로 이용되었다. 튜브를 45분동안 4℃에서 인큐베이션하고, 15분마다 교반하고, PBS/2% FCS로 두번 세척하고, 다시 펠리팅한 다음, 200㎕의 1% 파라포름알데히드에 재현탁하였다. 이 표지된 THP-1 세포들을, 488nm의 여기를 가지는 25mW 아르곤 레이저로 장치된 형광 활성화 세포분류기(FACS)(Becton-Dickinson, San Jose, CA)를 이용하여 분석하였다. 형광신호는 전진 및 우각 광산란에 기초하여 게이트에서 콘트롤되어, 분석으로부터 죽은 세포와 집합체를 제거하였다. 게이트에서 콘트롤된 신호(104)는 585 BP 필터에서 검출되었고 Lysis II 소프트웨어를 이용하여 분석되었 다. 값은 양성 세포의 백분율로서 표현되었는데, 이 백분율은 TRRE로 처리된 염색된 THP-1 세포의 평균 채널형광강도(MFI)를 TRRE로 처리되지 않은 세포(음성 대조표준 세포)의 MFI로 나눔으로써 계산되었다.
TRRE 처리에 의한 생체외 TNF 세포융해 분석을 시험하기 위하여, Gatanaga 등(1990b)에 의하여 기술된 방법에 따라 L929 세포융해분석을 수행하였다. 간단히 말해서, L929 세포, 고착성 쥐과 섬유모세포 셀라인을 밤새 플레이팅해 두었다(96-웰 플레이트에서 70,000세포/0.1ml/웰). 단층으로 깔린 L929 세포를 100, 500 또는 2,500U/ml의 부분적으로-정제된 TRRE로 30분동안 전처리한 다음, 재조합 인간 TNF의 연속적인 희석에 1시간동안 노출시켰다. 10% FCS를 함유한 RPMI-1640으로 플레이트를 세척하여 TRRE와 TNF를 제거한 후에, 1㎍/ml 액티노마이신 D를 포함하는 10% FCS를 함유한 RPMI-1640안에서 5% CO2에서 18시간동안 세포를 인큐베이션하였다. 그리고나서, 배양 상청액을 흡인하고 50㎕의 1% 크리스탈 바이올렛 용액을 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 15분동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 수도물로 세척하고, 공기-건조한 후, 크리스탈 바이올렛으로 염색된 세포를 메탄올중의 100mM HCl 웰당 100㎕에 의하여 융해시켰다. 550nm에서의 흡광도를 EAR 400 AT 플레이트 판독기를 이용하여 측정하였다 (SLT-Labinstruments, Salzburg, Austria).
TRRE가 또한 ~55kDa 크기의 TNF-R을 절단하는지를 조사하기 위하여, 부분적으로-정제된 TRRE를, p55 및 p75 TNF-R 둘다의 낮은 수준(Scatchard 분석에 의하여 약 1,500개 수용체/세포)을 발현하는 THP-1 세포에 적용하였다. DEAE-Sephadex 칼럼으로부터의 TRRE 용출액을 1,000U/ml의 최종 TRRE 농도로 30분동안 THP-1 세포(5 x 106세포/ml)에 첨가하였다. 그 상청액안의 가용성 p55 및 p75 TNF-R의 농도는 가용성 p55 및 p75 TNF-R ELISA에 의하여 측정되었다. TRRE는 THP-1 세포상의 인간 p55 및 p75 TNF-R 둘다를 절단하는 것으로 밝혀졌고, 각각 2,382 및 1,662pg/ml의 가용성 p55 및 p75 TNF-R을 방출하였다.
그러므로, THP-1 세포의 PHA 자극에 의하여 얻어진 TRRE는 C75R상의 인간 p75 TNF-R, 및 THP-1 세포상의 인간 p55 및 p75 TNF-R 둘다를 효소적으로 절단하고 방출시킬 수 있다.
TRRE 활성의 부분적인 억제는 1,10-페난트롤린, EDTA 및 EGTA와 같은 킬레이트제에 의하여 얻어졌다(남아있는 % TRRE 활성이 2mM 농도에서 각각 41%, 67% 및 73%였다). 한편, PMSF, AEBSF 및 3,4-DCI와 같은 세린 프로테아제 억제제 및 TLCK와 TPCK와 같은 세린 및 시스테인 프로테아제 억제제는 TRRE의 억제에 효과가 없었다. TRRE가 Mn2+, Ca2+, Mg2+, 및 Co2+의 존재하에서 약간 활성화(남아있는 % TRRE 활성이 각각 157%, 151%, 127%, 및 123%였음)된 반면에, 부분적인 억제는 Zn2+와 Cu2+의 존재하에서 발생하였다(남아있는 % TRRE 활성이 각각 23%와 47%였음) (WO 9802140).
가장 활성있는 DEAE 분획(60mM 내지 250 mM NaCl)으로부터의 TRRE 분획은 더 정제될 수 있다. 한 방법에서(WO 9802140), 이 분획을 Centriprep-10 필터(10,000 MW 컷오프 막)(Amicon)를 이용하여 500㎕로 농축하였다. 이 농축된 샘플을 비-변성 천연조건하에서 6% PAGE에 적용하였다. 겔을 5mm 조각으로 수평으로 자르고 각각을 1ml PBS로 용출하였다. 그리고나서, 이 용출물을 TRRE 활성에 대한 분석(실시예 1)에 따라 시험하였다.
실시예 3: TRRE 활성을 패혈성 쇼크를 완화한다.
다음의 프로토콜을 사용하여, 패혈성 쇼크를 위한 모델에서 사망율을 막는데 있어서의 TRRE의 효과를 시험했다. 마우스를, 치사 또는 아치사 수준의 LPS로 주사한 다음, 대조표준 완충액 또는 TRRE로 주사하였다. 그리고나서, 말초혈의 샘플을 이따금 수집하여, TRRE가 혈류안에서 다른 시토킨의 TNF-유도된 생산을 차단하는지 여부를 확립하였다. 쇼크의 임상효과를 차단하는 TRRE의 능력에 대하여 동물을 평가한 다음, 안락사시켜 조직병리학적 방법에 의하여 조직을 검사하였다.
상세한 내용은 다음과 같다: 성숙한 Balb/c 마우스를 신체속박용구에 넣고, 인산염 완충 식염수(PBS)중의 10ng 내지 10mg의 LPS를 포함하는 0.1ml 용액을 꼬리 정맥을 통하여 정맥내로 주사하였다. 이 수준의 LPS는 이 스트레인의 마우스에서 온화한 수준에서 치사 수준까지 쇼크를 유도한다. 쇼크는 혈관 투과성, 체액 손실, 및 탈수에서의 변화로부터 생기고, 종종 기면상태, 둥글게 구부린, 움직임없는 자세, 헝클어진 털, 식사정지, 청색증 및, 심각한 경우에는 12 내지 24시간내 사망에 의하여 동반된다. 대조표준 마우스에는 PBS가 주사되었다. 상이한 양(2,000 또는 4,000U)의 정제된 인간 TRRE를, LPS 주사전 또는 후 한시간내에 0.1ml 부피로 IV 주사하였다. 혈청(0.1ml)을, LPS 주사후 30, 60 및 90분에 27게이지 바늘 및 1ml 주사기를 이용하여 IV로 꼬리정맥으로부터 수집하였다. 이 혈청을 헤파린화하고 -20℃에서 냉동 저장하였다. 다수의 실험으로부터의 샘플을, sTNF-R, TNF, IL-8 및 IL-6의 존재에 대하여 ELISA에 의하여 시험하였다. 쇼크의 임상효과에 대하여 동물을 다음 12시간에 걸쳐 모니터하였다. 처리후 3 내지 12시간의 기간에 선택된 동물을 안락사시키고 검시하고, 다양한 기관과 조직을 포르말린에 고정하고 파라핀에 포매하고 절편으로 자르고, 헤마톡살린-에오신(H 및 E)에 의하여 염색하였다. 조직 절편을 조직병리학적 및 면역병리학적 검사하였다.
도 3은 얻어진 결과들을 보여준다. (◆) LPS 단독; (■) LPS 더하기 대조표준완충액; (●) LPS 더하기 TRRE(2,000 U); (▲) LPS 더하기 TRRE (4,000U).
LPS 단독 또는 LPS와 대조표준완충액으로 주사된 마우스는 주사후 곧 죽었다. 시험동물의 50%가 8시간(LPS) 또는 9시간(LPS 더하기 대조표준완충액)후에 죽어 있었고, 동물의 100%는 15시간에 죽어있었다. 대조적으로, 실시예 1에서 기술된 대로 얻어진 TRRE로 처리된 동물은 훨씬 더 상태가 좋았다. LPS의 주사가 2,000U의 TRRE의 주사에 의하여 동반되었을 때, 사망은 연기되었고 사망율은 낮아졌다. 그 동물의 40%만이 24시간에 죽어있었다. 4,000U의 TRRE를 LPS와 함께 주사했을 때, 그 동물모두는 24시간에 생존하였다. 그러므로, TRRE은 시험동물에서 LPS에 의하여 유도되는 사망율을 상쇄할 수 있다.
실시예 4: TRRE 활성은 종양괴사 활성을 감소시킨다.
다음의 프로토콜에 따라, 종양이 생산되고 TNF가 그후에 주사된 시험동물에서 종양괴사에 대한 TRRE의 효과를 시험하였다.
0일(Day 0)에, 2 x 205 Meth A 종양세포의 피내주사에 의하여 15마리의 BALB/c 마우스의 복부벽위에 피부 Meth A 종양이 생산되었다. 7일(Day 7)에, 마우스를 각 5마리의 세군으로 나누고 다음과 같이 처리하였다.
ㆍ군 1: TNF(1㎍/마우스)로 정맥내 주사됨.
ㆍ군 2: TNF(1㎍/마우스)로 정맥내 주사되고, 실시예 1에서대로 얻어진 TRRE로 종양내로 주사됨(400유니트/마우스, TNF 주사후 6, 12시간).
ㆍ군 3: TNF(1㎍/마우스)로 정맥내 주사되고, 대조표준배지로 종양내로 주사됨(TNF 주사후 6, 12시간).
8일(Day 8)에, 종양괴사를 측정하여 다음의 결과를 얻었다: 군 1: 100%의 괴사(5/5); 군 2: 20%(1/5); 군 3: 80%(4/5). TRRE의 주사는 BALB/c 마우스안의 Meth A 종양에서 괴사를 유도하는 TNF의 능력을 크게 감소시켰다.
TRRE 활성의 첨가가 TNF의 유익한 괴사활성을 박리하기 때문에, 내생성 TRRE 활성을 차단하는 것은 TNF의 유익한 효과를 촉진할 것이다.
실시예 5: TRRE 활성에 영향을 주는 9개의 새로운 폴리뉴클레오티드 클론들
많은 세포들이, 특히 PMA 자극후에 높은 수준의 TRRE 활성을 발현하는 것으로 밝혀져 왔다. 이것들은 THP-1, U-937, HL-60, ME-180, MRC-5, Raji, K-562라 지명된 셀라인들을 포함한다. Jurkat 세포는 높은 TRRE 활성을 가진다(10-2 PMA에서 850 TRRE U/mL). 이 실험에서, Jurkat T 세포(ATCC #TIB-152)의 발현 라이브러리를 얻었고, TRRE 활성을 증대시키는 9개의 폴리뉴클레오티드 클론을 얻는데 사용하였 다.
이 라이브러리에서 발현 서열의 선택은, 반복된 주기의 COS-1 세포로의 트랜스펙션과 뒤이어 실시예 1에서와 같이 TNF 수용체를 절단하고 방출하는 활성의 존재에 대하여 분석하는 것에 의하여 수행되었다. 표준적인 기술들을 유전학적 조작에서 사용하였다. 간단히 말해서, 106 Jurkat 세포의 DNA를, 제조자의 지침에 따라 InVitrogen 플라스미드 추출키트를 이용하여 추출하였다. cDNA를 ZAP ExpressTM/EcoRI 벡터(cat. no. 938201, Stratagene, La Jolla CA)안에 삽입하였다. 라이브러리를 48군의 DNA로 나누고 CaCl 트랜스펙션법을 이용하여 COS-1 세포안으로 형질전환하였다. 세포가 성장하면, TRRE 분석을 수행하였고, 5개의 양성 군들을 선택하였다. 이 5군 각각으로부터 DNA를 얻었고, 군당 15개의 플레이트를 이용하여 E. coli안으로 트랜스펙션하였다. DNA를 이 세포들로부터 제조한 다음 COS-1 세포로 한번더 트랜스펙션하였다. 세포를 성장시키고, TRRE 활성을 다시 시험하였다. 두개의 양성의 군을 선택하고 E. coli안으로 트랜스펙션하여, 98개의 클로니를 얻었다. 이 콜로니중 96개로부터 DNA를 제조하고 COS-1 세포안으로 트랜스펙션하였다. TRRE 활성을 다시 수행하고, 9개의 클론이 분석에서 TRRE 활성을 실질적으로 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 이 클론은 2-8, 2-9, 2-14, 2-15, P2-2, P2-10, P2-13, P2-14, 및 P2-15로 명명되었다.
도 4는 이 9개의 클론이 표준적인 분석에서 C75 세포를 이용하여 시험되었을때 관찰되는 TRRE 활성을 보여주는 막대그래프이다(실시예 1).
그리고나서, 이 9개의 클론을 다음의 절차에 따라 서열분석하였다:
1. 변형된 알칼리 융해 절차를 이용하여 플라스미드 DNA를 제조하였다.
2. DyeDeoxy 종결반응(ABI)을 이용하여 DNA 서열분석을 수행하였다. 염기-특이적인 형광염료를 표지로서 이용하였다.
3. 서열분석 반응을, ABI 373A-S에 의하여 5.75% Long RangerTM 겔상에서 또는 ABI 377 자동화된 서열분석기에 의하여 5.0% Long RangerTM 겔상에서 분석하였다.
4. 후속의 자료분석을, SequencherTM 3.0 소프트웨어를 이용하여 수행하였다.
표준적인 프라이머 T7X, T3X, -40, -48 Reverse, 및 BK Reverse(BKR)를 서열분석 반응에 이용하였다. 각각의 클론을 위하여, 몇가지 부가적인 내부 서열분석 프라이머(아래에 열거됨)를 합성하였다.
NCBI BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) 서열분석(Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410)을 수행하여 다른 서열들이 이 서열들에 유의하게 유사한지를 측정하였다. 이 클론 및 상응하는 ORF(만약 있다면)의 DNA 서열 둘다를 데이터베이스내의 이용가능한 서열들에 비교하였다.
다음의 클론들이 얻어졌고 서열분석되었다:
Figure 112000023918557-pct00002
클론 2-9 (AIM2): 서열분석을 위하여 사용된 내부 프라이머는 SEQ. ID NOS:11-38에서 보여진다. AIM2의 서열이 SEQ. ID NO:1에서 제시된다. AIM2 서열의 상보적인 스트랜드는 SEQ. ID NO:147이다. AIM2 서열에의 가장 긴 오픈리딩프레임(ORF)는 길이가 474AA이고 SEQ. ID NO:148에서 나타난다.
클론 2-8 (AIM3): 길이 739와 233의 두개의 부분적인 서열이 얻어졌고 AIM3T3과 AIM3T7이라 명명되었다. 서열분석을 위하여 사용된 내부 프라이머는 SEQ. ID NOS:39-46에서 보여진다. AIM3T3과 AIM3T7의 서열은 각각 SEQ. ID NOs:2와 3에서 제시된다. BLAST 조사는 AIM3T3 서열이 마우스(M. musculus) 28S 리보솜 RNA(Hassouna et al. Nucleic Acids Res. 12:3563-3583, 1984) 및 M. musculus 45S 전-rRNA 유전자(접수번호 X82564)에 상동일 수 있다는 것을 드러냈다. AIM3T3 서열 의 상보적인 서열은, SEQ. ID NO:2의 nt 221로 시작하여 408bp에 걸쳐서 전자에 99% 유사성을 보여주었고, 동일한 스팬에 걸쳐서 후자에 97% 유사성을 보여주었다.
클론 2-14 (AIM4). 서열분석을 위하여 사용된 내부 프라이머는 SEQ. ID NOS:14-65에서 보여진다. AIM4의 서열은 SEQ. ID NO:4에서 제시된다. AIM4 서열의 상보적인 스트랜드는 SEQ. ID NO:149이다. AIM4 서열내의 가장 긴 ORF는 길이가 236AA이고 SEQ. ID NO:150에서 나타난다. AIM4는 인간 서열들 아르팹틴 2, SAICAR 합성효소에 상동성을 보이는 ADE2H1 mRNA, 폴리피리미딘 역(tract) 결합단백질(이종의 핵 리보핵단백질 I) mRNA, 폴리피리미딘 역 결합단백질을 위한 몇몇의 PTB 유전자, por1 단백질을 위한 mRNA에 대해 유의한 정렬을 갖는다. 인간의 아르팹틴 2는, 직접적으로 결합함으로써 RAC1과 상호작용하는 ADP-리보실화 인자의 추정적인 표적단백질이다. RAC1은 막 파동운동(ruffling)에 수반된다. 아르팹틴 2는 가능한 막투과 분절, 잠재적인 CK2 인산화부위, PKC 인산화부위 및 RGD 세포부착 서열을 가진다.
클론 2-15 (AIM5): 서열분석을 위하여 사용된 내부 프라이머는 SEQ. ID NO:66-80에서 보여진다. AIM5의 서열은 SEQ. ID NO:5에서 제시된다. BLAST 조사는 AIM5 서열이 인간의 초기화인자 5A(elF-5A) (Koettnitz et al. (1995) Gene 159: 283-284, 1995) 및 인간의 초기화인자 4D(elF 4D)(Smit-McBride et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:1578-1583, 1989)에 어느정도의 유사성을 보인다는 것을 드러냈다.
클론 P2-2 (AIM6): 서열분석을 위하여 이용된 내부 프라이머는 SEQ. ID NOS: 81-93에서 보여진다. AIM6의 서열은 SEQ. ID NO:6에서 제시된다. AIM6 서열내의 가장 긴 ORF는 길이가 1038AA이고 SEQ. ID NO:151에서 나타난다.
클론 P2-10 (AIM7): 서열분석을 위하여 이용된 내부 프라이머는 SEQ. ID NOS: 94-106에서 보여진다. AIM7의 서열은 SEQ. ID NO:7로서 제시된다. AIM7 서열내의 가장 긴 ORF는 길이가 849AA이고 SEQ. ID NO:152에서 나타난다. BLAST 조사는 이 클론이 인간의 인슐린-유사 성장인자 II 수용체(Morgan et al. Nature 329:301-307, 1987) 또는 인간의 양이온-독립성 만노스 6-인산 수용체 mRNA(Oshima et al. J. Biol. Chem. 263:2553-2562, 1988)에 관련될 수 있다는 것을 드러냈다. AIM7 서열은, SEQ. ID NO:7의 nt 12로 시작하여 2520 뉴클레오티드에 걸쳐서 두 서열다에 대충 99% 동일성을 보여주었고, 동일한 스팬에 걸쳐서 후자에 99% 유사성을 보여주었다.
클론 P2-13 (AIM8): 서열분석을 위해 사용된 내부 프라이머는 SEQ. ID NOS: 107-118에서 보여진다. AIM8의 서열이 SEQ. ID NO:8로서 제시된다. AIM8 서열내의 가장 긴 ORF는 길이가 852AA이고 SEQ. ID NO:153에서 나타난다.
클론 P2-14 (AIM9): 서열분석을 위하여 사용된 내부 프라이머는 SEQ. ID NOS:119-124에서 보여진다. AIM9의 서열은 SEQ. ID NO:9로서 제시된다. 가장 긴 ORF는 길이가 약 149개 아미노산이었다.
클론 P2-15 (AIM10): 서열분석을 위하여 사용된 내부 프라이머는 SEQ. ID NOS:125-146에서 보여진다. AIM10의 서열은 SEQ. ID NO:10으로서 제시된다. AIM10 서열내의 가장 긴 ORF는 길이가 693AA이고 SEQ. ID NO:154에서 나타난다. NCBI에서 의 비-여분의(redundant) 데이터베이스의 BLASTN 조사에서 서열 10은, 유전자좌 HSA7509(접수번호 AJ007509, NID g3319955)인 E1b-55kDa-연관된 단백질을 위한 인간의 mRNA와 정렬한다.
클로날 DNA는, 실시예 3과 4에서 상세히 기술된 것과 같이, TRRE 활성을 유도하고/하거나, 패혈성 쇼크를 상쇄하고/하거나 종양괴사에 영향을 주는 이 핵산의 능력을 시험하기 위하여 시험동물로 직접적으로 주사될 수 있다. 양자택일적으로, 단백질 또는 RNA는 유사한 시험을 위하여 클로날 DNA로부터 발생될 수 있다.
실시예 6: 새로이 얻어진 클론들의 발현
실시예 5는 세포표면 분석시스템에서 TRRE 활성을 증강시키는 9개의 새로운 클론들을 기술한다. 이 클론들은 pBK-CMB 파지미드 벡터에서 얻어졌다.
다음의 작업이 상업적 실험실 Lark Technologies, Houston, TX를 통하여 계약상 행해졌다. 이 클론들을 셔틀벡터로부터 제거하고 다음의 방법으로 발현벡터안으로 삽입하였다. 재조합 플라스미드(삽입체를 포함하는 pBK-CMV)를, 적절할 때 SpeI, XbaI, EcoRI 및 다른 것과 같은 적절한 제한효소(들)로 분해하였다. 바큘로바이러스 전달 벡터(pAcGHLT-A Baculovirus Transfer Vector, PharMingen, San Diego, CA, Cat. No. 21460P)를 또한, 셔틀벡터로부터 제거된 삽입체를 수용하기 위하여 다중 클로닝 부위내 또는 근처에서 적절한 제한효소(들)로 잘랐다.
하위클로닝되고 있는 관심있는 단편을 Low-Melting 아가로스 전기영동을 이용하여 분해로부터 분리하고, Lark SOP MB 020602를 따라 Qiaquick Gel Extraction Kit를 이용하여 겔로부터 정제했다. 필요하다면, 수용하는 벡터를 Lark SOP MB 090201에 따라 알칼리성 포스파타제로 처리했다. 단편을 벡터 pAcGHLT-A의 선택된 부위안으로 결찰하였다. 이 재조합 플라스미드를 E. coli XL1 Blue MRF' 세포안으로 형질전환하고, 형질전환된 박테리아를 암피실린(100㎍/ml)을 포함하는 LB 한천 플레이트상에서 선택하였다. 암피실린 저항성 콜로니를 집어내고 플라스미드 제조를 위하여 암피실린을 포함하는 LB 액체배지상에서 성장시켰다.
플라스미드 DNA를 Alkaline Minilysate Procedure(Lark SOP MB 010802)를 이용하여 제조하고 적절한 제한효소(들)로 분해했다. 선택된 하위클론이 올바른 크기인 것을 확인하였다. 하위클론을 다른 적절한 제한효소(들)로 분해하여, 적당한 크기(들)의 단편의 존재를 확실하게 함으로써 삽입체의 올바른 정위를 확인하였다. 하위클론을 암피실린(100㎍/ml)을 포함하는 100ml의 LB 액체배지안에서 성장시키고, 플라스미드 DNA를 Qiagen Midi Plasmid Preparation Kit(Lark SOP MB 011001)를 이용하여 제조하였다. DNA 농도를 260nm에서의 흡광도를 측정함으로써 측정하였고, 이 DNA 샘플은 제한분해에 의하여 올바른 하위클론으로부터 유래됨이 증명되었다.
그러므로, 이제 폴리히스티딘 태그, 단백질 키나제 A 부위 및 트롬빈 절단부위를 가진 GST 유전자에 융합된 관심있는 코딩서열을 가진 Mey3, Mey5, Mey6, Mey8을 위한 발현 구조물이 생산되었다. GST 유전자 및 이제 이 융합단백질은 폴리헤드린 프로모터하에 있다. PharMingen(San Diego, CA)은, 전달벡터(pAcGHLT)를 선형화된 바이러스 DNA와 함께 감수성있는 곤충 셀라인 S안으로 공동-삽입함으로써, 삽입체를 가진 벡터를 기능적인 바큘로바이러스 입자안으로 통합시켰다(PharMingen, San Diego, CA, BaculoGold 바이러스 DNA, Cat. No. 21100D). 기능적인 바이러스 입자를 곤충세포상에서 다시 성장시켜서 높은 역가의 원액을 생성하였다. 그리고나서, Tini 세포안에 세포의 큰 배양물을 감염시킴으로써 단백질 생산을 행하였다. 단백질 생산량이 최대에 이르고 바이러스가 세포를 죽이지 않을 때 이 세포를 수확하였다. 융합단백질을 글루타티온-아가로스 칼럼상에서 수집하고 세척하고 글루타티온으로 방출시켰다.
친화성 칼럼으로부터 수집된 단백질을 OD280을 측정함으로써 정량하였고 SDS-PAGE와, 표지된 항-GST와 함께 웨스턴 블롯팅을 이용하여 겔상에서 분석하여서 (PharMingen, San Diego, CA, mAbGST Cat. No. 21441A), 존재하는 모든 밴드들이 GST 부분을 포함한다는 것을 확인하였다.
10개 서열중 4개를 클로닝하고 바큘로바이러스 감염된 곤충세포안에서 발현시킨 다음, 정제하였다.
Figure 112000023918557-pct00003
겔은, 웨스턴 분석에서 항-GST 항체에 또한 양성인 보다 큰 단백질들에 부가하여 GST 단백질의 존재를 나타냈다. Mey3은 약 32kDa, 56kDa의 단백질, 약 60-70kDa의 밴드들 및 70kDa보다 큰 다른것의 존재를 반복적으로 보여주었다. Mey5는 약 34kDa, 38kDa, 58kDa, 약 60-70kDa 및 70kDa보다 큰 다른 것들로서 영동하는 단백질들을 일관되게 가졌다. Mey6은 약 34kDa, 56kDa, 58kDa의 단백질 밴드들, 및 약 60-70kDa의 밴드들을 가졌다. Mey8은 약 36kDa, 58kDa의 단백질 밴드들 및 약 60-70kDa의 밴드들을 가졌다. 표시된 밴드들 모두는 GST에 대하여 양성이었다. 이 밴드들은, 원하는 융합단백질 또는 성장이나 정제동안 발생된 분해/절단 생성물을 나타낼 수 있다.
실시예 7: TNF-R 절단활성에 미치는 효과에 대한 발현 생성물의 분석
다음의 방법을 사용하여 Mey 3, 5, 6 및 8의 TRRE 활성을 측정하였다. C75R 세포와 COS-1 세포를 2.5 x 105 세포/ml/웰의 밀도로 24-웰 배양플레이트에 심고, 5% CO2에서 37℃로 밤새(12 내지 16시간동안) 인큐베이션하였다. 웰안의 배지를 흡인한 다음, 1ug의 Mey 3, 5 및 8의 300㎕를 C75R과 COS-1 플레이트 둘다의 각각의 웰안에서 5% CO2에서 37℃로 30분동안 인큐베이션하였다(아래에서 언급된 A 및 C에 각각 상응). 동시에, 24-웰 플레이트안의 C75R 세포를 또한 300㎕의 신선한 배지 또는 완충액으로 인큐베이션하였다(아래 언급된 B에 상응). 상청액을 수집하고 원심분리한 다음, 실시예 1에서 기술된 바와 같이 ELISA에 의하여 가용성 p75 TNF-R의 농도에 대하여 분석하였다.
다음의 결과들이 얻어졌다:
Figure 112000023918557-pct00004
실시예 8: 패혈성 쇼크를 치료하는데 있어서 발현 생성물의 유효성
실시예 3에서 개설된 프로토콜을 사용하여, 패혈성 쇼크 모델에서 사망율을 막는데 있어서 새로운 클론들로부터의 발현 생성물의 효과를 시험하였다.
재조합 Mey 3, 5, 및 8의 상이한 양(10-100ug/마우스)을, 치사량의 LPS 주사 전 또는 후 1시간이내에 0.05ml 부피로 정맥내로 주사하였다. LPS 주사후 30, 60 및 90분에 27게이지 바늘과 1ml 주사기를 이용하여 혈청(0.1ml)을 꼬리정맥으로부터 수집하였다. 이 혈청을 헤파린화하고 -20℃에서 냉동저장하였다. 다수의 실험으로부터의 샘플을, 가용화된 TNR-R, TNR 리간드, IL-8 및 IL-6의 존재에 대하여 ELISA에 의하여 시험하였다. 쇼크의 임상효과에 대하여 동물을 다음의 12시간동안 모니터하였다. 선택된 동물을 처리후 3 내지 12시간에 안락사시키고, 검시하고 다양한 기관과 조직을 포르말린에 고정하고, 파라핀에 포매하고, 절편으로 자르고, 헤마톡살린-에오신(H 및 E)에 의하여 염색하였다. 조직절편에 조직병리학적 및 면역병리학적 검사를 하였다.
도 5는 얻어진 결과들을 보여준다. (◆) 식염수; (■) BSA; (△) Mey-3(100㎍); (X) Mey-3(10㎍); (*) Mey-5(10㎍); (●) Mey-8(10㎍).
LPS 단독 또는 LPS, 대조표준완충액이나 대조표준 단백질(BSA)로 주사된 마우스는 빨리 죽었다. 이 군안의 동물 모두는 24시간에 죽어있었다. 대조적으로, LPS의 주사가 10-100ug의 Mey 3, 5 및 8의 주사에 의하여 동반될 때, 사망은 연기되었고 사망율은 낮아졌다. Mey 3과 Mey 5로 처리되었던 동물은 어떤 것도 24시간에 죽어있지 않았다. Mey8로 처리되었던 동물의 66%만이 24시간에 죽어있었다. 그러므로, Mey 3, 5 및 8은 시험동물에서 LPS에 의하여 유도되는 사망율을 상쇄할 수 있었다.
<110> Gatanaga, T. Granger, G.A. <120> FACTORS AFFECTING TUMOR NECROSIS FACTOR RECEPTOR RELEASING ENZYME ACTIVITY <130> 1 <150> US 09/081,385 <151> 1998-05-14 <160> 154 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 4047 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 aagctttttg ctttccttcc ccgggaaagg ccggggccag agacccgcac tcggaccagg 60 cgggggctgc ggggccagag tgggctgggg agggctggga gggcgtctgg ggccggctcc 120 tccaggctgg gggccgccag ctccgggaag gcagtcctgg cctgcggatg gggccgcgcg 180 tggggcccgg cggggcggcc tcgggaggcg tccaggctgc gggagcggga ggagcggccg 240 tgcgggcgcc agcgccgtgg gtggaggtcg ccgtccctcc tgaggggcag ccagtgcgtt 300 tgggacccgg gagcagagcc cgcgcctccc cagcggcctc cccgggggtc tcaccgggtc 360 acccgagagc ggaggccccg gctccgcaga aacccggggc ggccgcgggg aagcagcgcc 420 ctcaggcgtc ggaggagccc ccagaaggac ctcgcgcctt cccgccgggc tccgaccgcc 480 tgggttcggt gcgggacggc ccaggccgcc aggaccccca agcgcagctc agtctgcggg 540 gcacgaccca gaggccagca gcagaggacg gggccggggc cgggagaggg cggggagggc 600 gctcctggga ggtcaaggcc agggctagac tttcagggtc atggcctggc ccctcatccc 660 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cttctagtta gtatagcgca aaaagcttct cgagagtact 1140 tctagagcgg ccgcgggccc atcgattttc cacccgggtg gggtacc 1187 <210> 10 <211> 3306 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 ccctcactaa agggaacaaa agctggagct cgcgcgcctg caggtcgaca ctagtggatc 60 gaaagttcgt tacgccaagc tcgaaattaa ctctgggctg acccataaac atttgtctga 120 tctaggatat agttgcgttt cttgcgggca gcaatctgga tgaggcggtt gaggcactgg 180 gtggcctgct ggatcaggac atcccagcgg ccagcatagt tccgctgccg gcgtaggccc 240 atcacccgca tcttatccat gatggcattg gtacccagga tgttgtactt cttggaaggg 300 ttggaggctg catgtttgat ggcccatgtg gtcttgccag cagcaggcag gcccaccatc 360 atcagaatct cacattctgc cttgctcttt ggtccaacgg tgccccggat acgctcacta 420 aggggaaggt gctggatgaa ggtaaacccc gggaggacag aacagtaggg ctctgctctc 480 tgtccgaagt tgaactccac tgcgcaattc ttcaccagga catgaggata gagggcctga 540 ccccccaagg cttccttctg gattcggaaa gcaatgccca tccactttcc attcttggta 600 aaagacagtt ccacgtcatt tccacattca aaatccgcaa agcagccaat caccggagag 660 ctctgcggtg ctaggagagc ggctgggccc gcagactggg gggaaagctc cgcagccgca 720 gtgggcccca ggatcaggcc ccgcgtggcc tggagaagcc cagtctgggc tggagcggga 780 gctggacagt gtggccttgc gttcgccccc gggagcgctg cgagtgtcgc ggcctcgggt 840 ggatttgctg agcaccaata cctcacggtt gccaacctgg ggttttagct cccttggttt 900 taatccccta ggggcgggtg ggggcacggg aggaaggatg ggccagctgg gtgcaatcct 960 gctgtaagcc agccattcct tgatttctta gaattaacta aacggtcgcg ccggaggccg 1020 cgggggccgg agcggagcag ccgcggctga ggttcccgag tcggccgctc ggggctgcgc 1080 tccgccgccg ggaccccggc ctctggccgc gccggctccg gcctccgggg gggccggggc 1140 cgccgggaca tggtgccagt cgcacccctt ccccgccgcc gctgagctcg ccggccgcgc 1200 ccgggctggg acgtccgagc gggaagatgt tttccgccct gaagaagctg gtggggtcgg 1260 accaggcccc gggccgggac aagaacatcc ccgccgggct gcagtccatg aaccaggcgt 1320 tgcagaggcg cttcgccaag ggggtgcagt acaacatgaa gatagtgatc cggggagaca 1380 ggaacacggg caagacagcg ctgtggcacc gcctgcaggg ccggccgttc gtggaggagt 1440 acatccccac acaggagatc caggtcacca gcatccactg gagctacaag accacggatg 1500 acatcgtgaa ggttgaagtc tgggatgtag tagacaaagg aaaatgcaaa aagcgaggcg 1560 acggcttaaa gatggagaac gacccccagg agncggagtc tgaaatggcc ctggatgctg 1620 agttcctgga cgtgtacaag aactgcaacg gggtggtcat gatgttcgac attaccaagc 1680 agtggacctt caattacatt ctccgggagc ttccaaaagt gcccacccac gtgccagtgt 1740 gcgtgctggg gaactaccgg gacatgggcg agcaccgagt catcctgccg gacgacgtgc 1800 gtgacttcat cgacaacctg gacagacctc caggttcctc ctacttccgc tatgctgagt 1860 cttccatgaa gaacagcttc ggcctaaagt accttcataa gttcttcaat atcccatttt 1920 tgcagcttca gagggagacg ctgttgcggc agctggagac gaaccagctg gacatggacg 1980 ccacgctgga ggagctgtcg gtgcagcagg agacggagga ccagaactac ggcatcttcc 2040 tggagatgat ggaggctcgc agccgtggcc atgcgtcccc actggcggcc aacgggcaga 2100 gcccatcccc gggctcccag tcaccagtcc tgcctgcacc cgctgtgtcc acggggagct 2160 ccagccccgg cacaccccag cccgccccac agctgcccct caatgctgcc ccaccatcct 2220 ctgtgccccc tgtaccaccc tcagaggccc tgcccccacc tgcgtgcccc tcagcccccg 2280 ccccacggcg cagcatcatc tctaggctgt ttgggacgtc acctgccacc gaggcagccc 2340 ctccacctcc agagccagtc ccggccgcac agggcccagc aacggtccag agtgtggagg 2400 actttgttcc tgacgaccgc ctggaccgca gcttcctgga agacacaacc cccgccaggg 2460 acgagaagaa ggtgggggcc aaggctgccc agcaggacag tgacagtgat ggggaggccc 2520 tgggcggcaa cccgatggtg gcagggttcc aggacgatgt ggacctcgaa gaccagccac 2580 gtgggagtcc cccgctgcct gcaggccccg tccccagtca agacatcact ctttcgagtg 2640 aggaggaagc agaagtggca gctcccacaa aaggccctgc cccagctccc cagcagtgct 2700 cagagccaga gaccaagtgg tcctccatac cagcttcgaa gccacggagg gggacagctc 2760 ccacgaggac cgcagcaccc ccctggccag gcggtgtctc tgttcgcaca ggtccggaga 2820 agcgcagcag caccaggccc cctgctgaga tggagccggg gaagggtgag caggcctcct 2880 cgtcggagag tgaccccgag ggacccattg ctgcacaaat gctgtccttc gtcatggatg 2940 accccgactt tgagagcgag ggatcagaca cacagcgcag ggcggatgac tttcccgtgc 3000 gagatgaccc ctccgatgtg actgacgagg atgagggccc tgccgagccg cccccacccc 3060 ccaagctccc tctccccgcc ttcagactga agaatgactc ggacctcttc gggctggggc 3120 tggaggaggc cggacccaag gagagcagtg aggaaggtaa ggagggcaaa accccctcta 3180 aggagaagaa aaaaaaaaca aaaagcttct cgagagtact tctagagcgg ccgcgggccc 3240 atcgattttc cacccgggtg gggtaccagg taagtgtacc caattcgccc tatagtgagt 3300 cgtatt 3306 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 11 tgcggggcca gagtgggctg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 12 gcagtcctgg cctgcggatg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 13 gtcgacagga gaattggttc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 14 gcctgggttc ggtgcgggac 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 15 tggtcgggtg tttgtgagtg 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 16 cctcttccgt ctcctcagtg 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 17 ggattgctag tctcacagac 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 18 ttaagggtgg ctgaagggac 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 19 accttccctc cctgtcacag 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 20 tggtcgggtg tttgtgagtg 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 21 acaccattcc agaaattcag 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 22 aaactgcagg tggctgagtc 20 <210> 23 <211> 20 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<400> 36 gttcccagag cttgtctgtg 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 37 gtttggcaga ctcatagttg 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 38 tagcagggag ccatgacctg 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 39 cttggcgcca gaagcgagag 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 40 cctctctctc tctctctctc 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 41 tccccgctga ttccgccaag 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 42 ctttttgaat tcggcacgag 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 43 cccctggtcc gcaccagttc 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 44 gagaagggtc ggggcggcag 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 45 aaatcacatc gcgtcaacac 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 46 taagagagtc atagttactc 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 47 gctctagaag tactctcgag 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 48 actctggcca tcaggagatc 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 49 caggcgttgt 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Primer <400> 76 ccagtgcctc tatgcatgtc 20 <210> 77 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 77 aggaagccca cgcacaccac 20 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 78 ccctttgttc cctgatcttc 20 <210> 79 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 79 cgctcgggat ccaggtcatc 20 <210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 80 tcgaggttca gagcgtagtg 20 <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 81 tcttggatct ctggcacctc 20 <210> 82 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 82 ccatcagagt gaaggaggag 20 <210> 83 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 83 ccatcttcca ctggtcagag 20 <210> 84 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 84 ctccttctct tggatctctg 20 <210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 85 ttacttcagc actgttagtc 20 <210> 86 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 86 agggaggtag ctcaaagctc 20 <210> 87 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 87 tgggtccaca gttcgcacag 20 <210> 88 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 88 caactctgtg atggctccag 20 <210> 89 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 89 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gctgcaggtc 20 <210> 103 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 103 gggtgtggtg cagatgagtc 20 <210> 104 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 104 atcacactct tatagctcag 20 <210> 105 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 105 gtgggaagct ttcctcagac 20 <210> 106 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 106 tgatgaacat gggcctggag 20 <210> 107 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 107 cattgtggat gtactaccac 20 <210> 108 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 108 tgtgttttgc aacctgagtg 20 <210> 109 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 109 atagtggcac cacttacgag 20 <210> 110 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 110 aattctgcaa cgtgatggcg 20 <210> 111 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 111 cacaagatgc ctcgtctgtg 20 <210> 112 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 112 aatccggaca aggtacagtc 20 <210> 113 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 113 gcacgagtgg cacaagcgtg 20 <210> 114 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 114 gcaagcgtgt ggtgtcagtg 20 <210> 115 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 115 tgtttgaaca ggctctggac 20 <210> 116 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 116 cggcatggca atgaggacac 20 <210> 117 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 117 aggacgagat ggacctccag 20 <210> 118 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 118 ccctctgtcc tctagcccac 20 <210> 119 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 119 tcttgagggg actgactctg 20 <210> 120 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 120 tgagtgagga ggcagatgtc 20 <210> 121 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 121 tggctttgaa gaaagagctg 20 <210> 122 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 122 gcaaaagacc aggctgactg 20 <210> 123 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 123 tgcagctcct tggtcttctc 20 <210> 124 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 124 gattcacagt cccaaggctc 20 <210> 125 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 125 atctggatga ggcggttgag 20 <210> 126 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 126 ggtcactctc cgacgaggag 20 <210> 127 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 127 ggatccaaag ttcgtctctg 20 <210> 128 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 128 cgctgtgtgt ctgatccctc 20 <210> 129 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 129 atgaaggtaa accccgggag 20 <210> 130 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 130 tggtctctgg ctctgagcac 20 <210> 131 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 131 gcctggagaa gcccagtctg 20 <210> 132 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 132 cacactctgg accgttgctg 20 <210> 133 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 133 aaagctccgc agccgcagtg 20 <210> 134 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 134 tcttccagga agctgcggtc 20 <210> 135 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 135 gatggtgggg cagcattgag 20 <210> 136 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 136 gtcaccagtg gtgcctgcag 20 <210> 137 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 137 acctcacggt tgccaacctg 20 <210> 138 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 138 cgcaacagcg tctccctctg 20 <210> 139 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 139 agtaccttca taagttcttc 20 <210> 140 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 140 tcccagactt caaccttcac 20 <210> 141 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 141 aaacatcttc ccggtcggac 20 <210> 142 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 142 gctgagcacc tttacctcac 20 <210> 143 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 143 gacgtccgtc cgggaagatg 20 <210> 144 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 144 acacaggaga tgcaggtcac 20 <210> 145 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 145 gagtcttcca tgaagaacag 20 <210> 146 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 146 gcagtgagga aggtaaggag 20 <210> 147 <211> 4047 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (378)..(1799) <400> 147 ggatccaaag gacgcccccg ccgacaggag aattggttcc cgggcccgcg gcgatgcccc 60 cccggtagct cgggcccgtg gtcgggtgtt tgtgagtgtt tctatgtggg agaaggagga 120 ggaggaggaa gaagaagcaa cgatttgtct tctcggctgg tctccccccg gctctacatg 180 ttccccgcac tgaggagacg gaagaggagc cgtagccgcc ccccctcccg gcccggatta 240 tagtctctcg ccacagcggc ctcggcctcc ccttggattc agacgccgat tcgcccagtg 300 tttgggaaat gggaagtaat gacagctggc acctgaacta agtactttta taggcaacac 360 cattccagaa attcagg atg aat ggg gat atg ccc cat gtc ccc att act 410 Met Asn Gly Asp Met Pro His Val Pro Ile Thr 1 5 10 act ctt gcg ggg att gct agt ctc aca gac ctc ctg aac cag ctg cct 458 Thr Leu Ala Gly Ile Ala Ser Leu Thr Asp Leu Leu Asn Gln Leu Pro 15 20 25 ctt cca tct cct tta cct gct aca act aca aag agc ctt ctc ttt aat 506 Leu Pro Ser Pro Leu Pro Ala Thr Thr Thr Lys Ser Leu Leu Phe Asn 30 35 40 gca cga ata gca gaa gag gtg aac tgc ctt ttg gct tgt agg gat gac 554 Ala Arg Ile Ala Glu Glu Val Asn Cys Leu Leu Ala Cys Arg Asp Asp 45 50 55 aat ttg gtt tca cag ctt gtc cat agc ctc aac cag gta tca aca gat 602 Asn Leu Val Ser Gln Leu Val His Ser Leu Asn Gln Val Ser Thr Asp 60 65 70 75 cac ata gag ttg aaa gat aac ctt ggc agt gat gac cca gaa ggt gac 650 His Ile Glu Leu Lys Asp Asn Leu Gly Ser Asp Asp Pro Glu Gly Asp 80 85 90 ata cca gtc ttg ttg cag gcc gtc ctg gca agg agt cct aat gtt ttc 698 Ile Pro Val Leu Leu Gln Ala Val Leu Ala Arg Ser Pro Asn Val Phe 95 100 105 agg gag aaa agc atg cag aac aga tat gta caa agt gga atg atg atg 746 Arg Glu Lys Ser Met Gln Asn Arg Tyr Val Gln Ser Gly Met Met Met 110 115 120 tct cag tat aaa ctt tct cag aat tcc atg cac agt agt cct gca tct 794 Ser Gln Tyr Lys Leu Ser Gln Asn Ser Met His Ser Ser Pro Ala Ser 125 130 135 tcc aat tat caa caa acc act atc tca cat agc ccc tcc agc cgg ttt 842 Ser Asn Tyr Gln Gln Thr Thr Ile Ser His Ser Pro Ser Ser Arg Phe 140 145 150 155 gtg cca cca cag aca agc tct ggg aac aga ttt atg cca cag caa aat 890 Val Pro Pro Gln Thr Ser Ser Gly Asn Arg Phe Met Pro Gln Gln Asn 160 165 170 agc cca gtg cct agt cca tac gcc cca caa agc cct gca gga tac atg 938 Ser Pro Val Pro Ser Pro Tyr Ala Pro Gln Ser Pro Ala Gly Tyr Met 175 180 185 cca tat tcc cat cct tca agt tac aca aca cat cca cag atg caa caa 986 Pro Tyr Ser His Pro Ser Ser Tyr Thr Thr His Pro Gln Met Gln Gln 190 195 200 gca tcg gta tca agt ccc att gtt gca ggt ggt ttg aga aac ata cat 1034 Ala Ser Val Ser Ser Pro Ile Val Ala Gly Gly Leu Arg Asn Ile His 205 210 215 gat aat aaa gtt tct ggt ccg ttg tct ggc aat tca gct aat cat cat 1082 Asp Asn Lys Val Ser Gly Pro Leu Ser Gly Asn Ser Ala Asn His His 220 225 230 235 gct gat aat cct aga cat ggt tca agt gag gac tac cta cac atg gtg 1130 Ala Asp Asn Pro Arg His Gly Ser Ser Glu Asp Tyr Leu His Met Val 240 245 250 cac agg cta agt agt gac gat gga gat tct tca aca atg agg aat gct 1178 His Arg Leu Ser Ser Asp Asp Gly Asp Ser Ser Thr Met Arg Asn Ala 255 260 265 gca tct ttt ccc ttg aga tct cca cag cca gta tgc tcc cct gct gga 1226 Ala Ser Phe Pro Leu Arg Ser Pro Gln Pro Val Cys Ser Pro Ala Gly 270 275 280 agt gaa gga act cct aaa ggc tca aga cca cct tta atc cta caa tct 1274 Ser Glu Gly Thr Pro Lys Gly Ser Arg Pro Pro Leu Ile Leu Gln Ser 285 290 295 cag tct cta cct tgt tca tca cct cga gat gtt cca cca gat atc ttg 1322 Gln Ser Leu Pro Cys Ser Ser Pro Arg Asp Val Pro Pro Asp Ile Leu 300 305 310 315 cta gat tct cca gaa aga aaa caa aag aag cag aag aaa atg aaa tta 1370 Leu Asp Ser Pro Glu Arg Lys Gln Lys Lys Gln Lys Lys Met Lys Leu 320 325 330 ggc aag gat gaa aaa gag cag agt gag aaa gcg gca atg tat gat ata 1418 Gly Lys Asp Glu Lys Glu Gln Ser Glu Lys Ala Ala Met Tyr Asp Ile 335 340 345 att agt tct cca tcc aag gac tct act aaa ctt aca tta aga ctt tct 1466 Ile Ser Ser Pro Ser Lys Asp Ser Thr Lys Leu Thr Leu Arg Leu Ser 350 355 360 cgt gta agg tct tca gac atg gac cag caa gag gat atg att tct ggt 1514 Arg Val Arg Ser Ser Asp Met Asp Gln Gln Glu Asp Met Ile Ser Gly 365 370 375 gtg gaa aat agc aat gtt tca gaa aat gat att cct ttt aat gtg cag 1562 Val Glu Asn Ser Asn Val Ser Glu Asn Asp Ile Pro Phe Asn Val Gln 380 385 390 395 tac cca gga cag act tca aaa aca ccc att act cca caa gat ata aac 1610 Tyr Pro Gly Gln Thr Ser Lys Thr Pro Ile Thr Pro Gln Asp Ile Asn 400 405 410 cgc cca cta aat gct gct caa tgt ttg tcg cag caa gaa caa aca gca 1658 Arg Pro Leu Asn Ala Ala Gln Cys Leu Ser Gln Gln Glu Gln Thr Ala 415 420 425 ttc ctt cca gca aat caa gtg cct gtt tta caa cag aac act tca gtt 1706 Phe Leu Pro Ala Asn Gln Val Pro Val Leu Gln Gln Asn Thr Ser Val 430 435 440 gct gca aaa caa ccc cag acc aat agt cac aaa acc ttg gtg cag cct 1754 Ala Ala Lys Gln Pro Gln Thr Asn Ser His Lys Thr Leu Val Gln Pro 445 450 455 gga aca ggc ata gag gtc tca gca gag ctg ccc aag gac aag acc t 1800 Gly Thr Gly Ile Glu Val Ser Ala Glu Leu Pro Lys Asp Lys Thr 460 465 470 aagatccagc agggaactat gtagtcaccc cgagaggccc agctctctcc gtgagctctg 1860 ggcctagggt gggggtggtt gttggttctg cgcgcactgt tccccctaca tgatgggtcc 1920 atcccagttg gcttctctca ctcgcttcct cctgtggaga agcctgtcca ggtgtcactg 1980 cctccaggaa gctgtctctg atttctccag ttgaacagtg agatttgcca cacctcacat 2040 gcatcgctct tgtccctgga attgtaacca taggttttcc tgtctcctgg aggacaagga 2100 tgagggcttt ccacttgagt ctccctggtg gagcccagct cctgacatac ctggtaaaag 2160 ttctcaagag aagaacatgg aggaggaatg tggataacaa ccctggctgc ctgtgtgttc 2220 caagctagga agatgtaatg tccccacaaa cggggtaaat ggcttgcctg cgtcacagct 2280 gtctcaagcc caggccctgg gcgccagccc aagcccaagg actaggtcca gagccacaca 2340 gcgccaggcc acatccgcct cacctgggac cctttgtggg gtacagtctc cggccccacc 2400 cagacctcct gaaggagaga ccccatggca aggactcagc cacctgcagt ttcataagcc 2460 cccagtgggt tcctaggcat gaagaccacc ggttagaggc tgaactggca ggaacctgtc 2520 tccagcccct tctcacccca gccgggccct gcctcagagg cagcacccag gacgtggcca 2580 tgacccgtgg actccactca atccctcttc tccaggagcc atgcaaagtg tcagccagcc 2640 aggcccctgg aaggcagtca tcacctctta aggcattgtg ggtgtcggtc ctgcaactgc 2700 caggtgcagc acacgacccg tgtccggtgt tcgatagcag ggagccatga cctggcaacg 2760 attccacgct caaaggggca cccggggggc cctgggtcgg ggcggatcag ctttccctgg 2820 gcacatctgc ctcattccag atctccaggg ctcatgtctg tgacagggag ggaaggctct 2880 gccctggcct tccgtcagct ctgccagtgc aggctgggca gcctgggctt tagagctggc 2940 ttctgcccac actttctccg tgaaaggaaa acaactatga gtctgccaaa cgcatctcag 3000 atgcgtttta aaaaattctg gtccccgctc tctgtcccat catccgcctc ggggacttcc 3060 tctctccgtg gttctcaccc catactctgt cactgccaca ttttcacctg ggcctggcct 3120 ttgtctccac ctgaaactcc tgaaaatctt gaaatggatt tctaggtcac tggggactcc 3180 ggcagcacat tcggcttcag aataaagggc gcccgcggtc ccccagcacc tccccaagcc 3240 acacccctag cttccctccc tatccctgca gcctgagggt cccttcagcc acccttaagt 3300 ccccacctgg gctcctgccc cgcccctggc tagcagcgcc ttctccaccg gggccccctc 3360 tgctcacaga gccccctcac ctccctgggg atgaggggcc aggccatgac cctgaaagtc 3420 tagccctggc cttgacctcc caggagcgcc ctccccgccc tctcccggcc ccggccccgt 3480 cctctgctgc tggcctctgg gtcgtgcccc gcagactgag ctgcgcttgg gggtcctggc 3540 ggcctgggcc gtcccgcacc gaacccaggc ggtcggagcc cggcgggaag gcgcgaggtc 3600 cttctggggg ctcctccgac gcctgagggc gctgcttccc cgcggccgcc ccgggtttct 3660 gcggagccgg ggcctccgct ctcgggtgac ccggtgagac ccccggggag gccgctgggg 3720 aggcgcgggc tctgctcccg ggtcccaaac gcactggctg cccctcagga gggacggcga 3780 cctccaccca cggcgctggc gcccgcacgg ccgctcctcc cgctcccgca gcctggacgc 3840 ctcccgaggc cgccccgccg ggccccacgc gcggccccat ccgcaggcca ggactgcctt 3900 cccggagctg gcggccccca gcctggagga gccggcccca gacgccctcc cagccctccc 3960 cagcccactc tggccccgca gcccccgcct ggtccgagtg cgggtctctg gccccggcct 4020 ttcccgggga aggaaagcaa aaagctt 4047 <210> 148 <211> 474 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 148 Met Asn Gly Asp Met Pro His Val Pro Ile Thr Thr Leu Ala Gly Ile 1 5 10 15 Ala Ser Leu Thr Asp Leu Leu Asn Gln Leu Pro Leu Pro Ser Pro Leu 20 25 30 Pro Ala Thr Thr Thr Lys Ser Leu Leu Phe Asn Ala Arg Ile Ala Glu 35 40 45 Glu Val Asn Cys Leu Leu Ala Cys Arg Asp Asp Asn Leu Val Ser Gln 50 55 60 Leu Val His Ser Leu Asn Gln Val Ser Thr Asp His Ile Glu Leu Lys 65 70 75 80 Asp Asn Leu Gly Ser Asp Asp Pro Glu Gly Asp Ile Pro Val Leu Leu 85 90 95 Gln Ala Val Leu Ala Arg Ser Pro Asn Val Phe Arg Glu Lys Ser Met 100 105 110 Gln Asn Arg Tyr Val Gln Ser Gly Met Met Met Ser Gln Tyr Lys Leu 115 120 125 Ser Gln Asn Ser Met His Ser Ser Pro Ala Ser Ser Asn Tyr Gln Gln 130 135 140 Thr Thr Ile Ser His Ser Pro Ser Ser Arg Phe Val Pro Pro Gln Thr 145 150 155 160 Ser Ser Gly Asn Arg Phe Met Pro Gln Gln Asn Ser Pro Val Pro Ser 165 170 175 Pro Tyr Ala Pro Gln Ser Pro Ala Gly Tyr Met Pro Tyr Ser His Pro 180 185 190 Ser Ser Tyr Thr Thr His Pro Gln Met Gln Gln Ala Ser Val Ser Ser 195 200 205 Pro Ile Val Ala Gly Gly Leu Arg Asn Ile His Asp Asn Lys Val Ser 210 215 220 Gly Pro Leu Ser Gly Asn Ser Ala Asn His His Ala Asp Asn Pro Arg 225 230 235 240 His Gly Ser Ser Glu Asp Tyr Leu His Met Val His Arg Leu Ser Ser 245 250 255 Asp Asp Gly Asp Ser Ser Thr Met Arg Asn Ala Ala Ser Phe Pro Leu 260 265 270 Arg Ser Pro Gln Pro Val Cys Ser Pro Ala Gly Ser Glu Gly Thr Pro 275 280 285 Lys Gly Ser Arg Pro Pro Leu Ile Leu Gln Ser Gln Ser Leu Pro Cys 290 295 300 Ser Ser Pro Arg Asp Val Pro Pro Asp Ile Leu Leu Asp Ser Pro Glu 305 310 315 320 Arg Lys Gln Lys Lys Gln Lys Lys Met Lys Leu Gly Lys Asp Glu Lys 325 330 335 Glu Gln Ser Glu Lys Ala Ala Met Tyr Asp Ile Ile Ser Ser Pro Ser 340 345 350 Lys Asp Ser Thr Lys Leu Thr Leu Arg Leu Ser Arg Val Arg Ser Ser 355 360 365 Asp Met Asp Gln Gln Glu Asp Met Ile Ser Gly Val Glu Asn Ser Asn 370 375 380 Val Ser Glu Asn Asp Ile Pro Phe Asn Val Gln Tyr Pro Gly Gln Thr 385 390 395 400 Ser Lys Thr Pro Ile Thr Pro Gln Asp Ile Asn Arg Pro Leu Asn Ala 405 410 415 Ala Gln Cys Leu Ser Gln Gln Glu Gln Thr Ala Phe Leu Pro Ala Asn 420 425 430 Gln Val Pro Val Leu Gln Gln Asn Thr Ser Val Ala Ala Lys Gln Pro 435 440 445 Gln Thr Asn Ser His Lys Thr Leu Val Gln Pro Gly Thr Gly Ile Glu 450 455 460 Val Ser Ala Glu Leu Pro Lys Asp Lys Thr 465 470 <210> 149 <211> 2998 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (26)..(799) <400> 149 aagctttttg aattcggcac gagat gct aca cag gct ata ttt gaa ata 49 Ala Thr Gln Ala Ile Phe Glu Ile 1 5 ctg gag aaa tcc tgg ttg ccc cag aat tgt aca ctg gtt gat atg aag 97 Leu Glu Lys Ser Trp Leu Pro Gln Asn Cys Thr Leu Val Asp Met Lys 10 15 20 att gaa ttt ggt gtt gat gta acc acc aaa gaa att gtt ctt gct gat 145 Ile Glu Phe Gly Val Asp Val Thr Thr Lys Glu Ile Val Leu Ala Asp 25 30 35 40 gtt att gac aat gat tcc tgg aga ctc tgg cca tca gga gat cga agc 193 Val Ile Asp Asn Asp Ser Trp Arg Leu Trp Pro Ser Gly Asp Arg Ser 45 50 55 caa cag aaa gac aaa cag tct tat cgg gac ctc aaa gaa gta act cct 241 Gln Gln Lys Asp Lys Gln Ser Tyr Arg Asp Leu Lys Glu Val Thr Pro 60 65 70 gaa ggg ctc caa atg gta aag aaa aac ttt gag tgg gtt gca gag aga 289 Glu Gly Leu Gln Met Val Lys Lys Asn Phe Glu Trp Val Ala Glu Arg 75 80 85 gta gag ttg ctt ttg aaa tca gaa agt cag tgc agg gtt gta gtg ttg 337 Val Glu Leu Leu Leu Lys Ser Glu Ser Gln Cys Arg Val Val Val Leu 90 95 100 atg ggc tct act tct gat ctt ggt cac tgt gaa aaa atc aag aag gcc 385 Met Gly Ser Thr Ser Asp Leu Gly His Cys Glu Lys Ile Lys Lys Ala 105 110 115 120 tgt gga aat ttt ggc att cca tgt gaa ctt cga gta aca tct gcg cat 433 Cys Gly Asn Phe Gly Ile Pro Cys Glu Leu Arg Val Thr Ser Ala His 125 130 135 aaa gga cca gat gaa act ctg agg att aaa gct gag tat gaa ggg gat 481 Lys Gly Pro Asp Glu Thr Leu Arg Ile Lys Ala Glu Tyr Glu Gly Asp 140 145 150 ggc att cct act gta ttt gtg gca gtg gca ggc aga agt aat ggt ttg 529 Gly Ile Pro Thr Val Phe Val Ala Val Ala Gly Arg Ser Asn Gly Leu 155 160 165 gga cca gtg atg tct ggg aac act gca tat cca gtt atc agc tgt cct 577 Gly Pro Val Met Ser Gly Asn Thr Ala Tyr Pro Val Ile Ser Cys Pro 170 175 180 ccc ctc aca cca gac tgg gga gtt cag gat gtg tgg tct tct ctt cga 625 Pro Leu Thr Pro Asp Trp Gly Val Gln Asp Val Trp Ser Ser Leu Arg 185 190 195 200 cta ccc agt ggt ctt ggc tgt tca acc gta ctt tct cca gaa gga tca 673 Leu Pro Ser Gly Leu Gly Cys Ser Thr Val Leu Ser Pro Glu Gly Ser 205 210 215 gct caa ttt gct gct cag ata ttt ggg tta agc aac cat ttg gta tgg 721 Ala Gln Phe Ala Ala Gln Ile Phe Gly Leu Ser Asn His Leu Val Trp 220 225 230 agc aaa ctg cga gca agc att ttg aac aca tgg att tcc ttg aag cag 769 Ser Lys Leu Arg Ala Ser Ile Leu Asn Thr Trp Ile Ser Leu Lys Gln 235 240 245 gct gac aag aaa atc aga gaa tgt aat tta t aagaaagaat gccattgaat 820 Ala Asp Lys Lys Ile Arg Glu Cys Asn Leu 250 255 tttttagggg aaaaactaca aatttctaat ttagctgaag gaaaatcaag caagatgaaa 880 aggtaatttt aaattagaga acacaaataa aatgtattag tgaataaatg gtgagggtag 940 gcctattcag atgcaaggcc agcaatgggg ctccccatta tccccacccc tttggtccca 1000 gtccccttct ctgcaatggg cacgcataga ggagagacaa agggtattag acgcaacatc 1060 attggcccag gggagtccga gaagagctgc cattggctga cagggcattt tcaggctctg 1120 tcattggtca gggagcacac cccagcctga agagtgatgc cattggccag ggagtggttt 1180 tgtcatagcc gttggctgtg aagtggaagg aaaagatctg ggaatgaagc cctgtggcca 1240 ggaagataga cagggcagca acttctgggc ctccaggccc tcttcccacc atagcaatgt 1300 gggcaaaact ggtgtcaggc cccagccaga aaaaggagcc caagccagag ggcaagtgac 1360 aaaggatgta ccatgtccaa tctcccacac cctggggctg cccttcccaa tgtctttctt 1420 gatagccaag ttgggctggg agcagctcac tgctcctcta gccaggaggg tttctcagct 1480 cctggaggcc gcagcttgat gttgaactgc tgcagggtct gctccagctg tttctggttc 1540 ccagcaaagt aggcggacac agcattgtgg aagagcagca gctgcttgtg catcaccttg 1600 atcttgtttt cttccaggaa cttgagcttg atggccacat ctccccgcag cttctcatac 1660 ttgtcccgat gggcctggaa agtggcctgg gcactctcaa gtcgaccacg tgtccctgca 1720 tcccgggggc ctagactcag ctcctctaag tctgttcggt aggcatcata ttccagcctg 1780 gcagcctcat actgtttcac agtcatgagc gtgtcttcca tggtcttggt gaccaatgtg 1840 ttgatgctag agacaaagaa gttcacggct cctagcagcg tttccccatt cttgcatagt 1900 agtttctgtg tctctgcatt gtagccaaat 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cggcacagtg ttgaagatca tcaccttcac 2800 caagaacaac cagttccagg ccctgctgca gtatgcggac cccgtgagcg cccagcacgc 2860 caagctgtcg ctggacgggc agaacatcta caacgcctgc tgcacgctgc gcatcgactt 2920 ttccaagctc accagcctca acgtcaagta caacaatgac aagagccgtg actacctcgt 2980 gccgaattct ttggatcc 2998 <210> 150 <211> 258 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 150 Ala Thr Gln Ala Ile Phe Glu Ile Leu Glu Lys Ser Trp Leu Pro Gln 1 5 10 15 Asn Cys Thr Leu Val Asp Met Lys Ile Glu Phe Gly Val Asp Val Thr 20 25 30 Thr Lys Glu Ile Val Leu Ala Asp Val Ile Asp Asn Asp Ser Trp Arg 35 40 45 Leu Trp Pro Ser Gly Asp Arg Ser Gln Gln Lys Asp Lys Gln Ser Tyr 50 55 60 Arg Asp Leu Lys Glu Val Thr Pro Glu Gly Leu Gln Met Val Lys Lys 65 70 75 80 Asn Phe Glu Trp Val Ala Glu Arg Val Glu Leu Leu Leu Lys Ser Glu 85 90 95 Ser Gln Cys Arg Val Val Val Leu Met Gly Ser Thr Ser Asp Leu Gly 100 105 110 His Cys Glu Lys Ile Lys Lys Ala Cys Gly Asn Phe Gly Ile Pro Cys 115 120 125 Glu Leu Arg Val Thr Ser Ala His Lys Gly Pro Asp Glu Thr Leu Arg 130 135 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Leu 225 230 235 240 Arg Gln Leu Glu Thr Asn Gln Leu Asp Met Asp Ala Thr Leu Glu Glu 245 250 255 Leu Ser Val Gln Gln Glu Thr Glu Asp Gln Asn Tyr Gly Ile Phe Leu 260 265 270 Glu Met Met Glu Ala Arg Ser Arg Gly His Ala Ser Pro Leu Ala Ala 275 280 285 Asn Gly Gln Ser Pro Ser Pro Gly Ser Gln Ser Pro Val Leu Pro Ala 290 295 300 Pro Ala Val Ser Thr Gly Ser Ser Ser Pro Gly Thr Pro Gln Pro Ala 305 310 315 320 Pro Gln Leu Pro Leu Asn Ala Ala Pro Pro Ser Ser Val Pro Pro Val 325 330 335 Pro Pro Ser Glu Ala Leu Pro Pro Pro Ala Cys Pro Ser Ala Pro Ala 340 345 350 Pro Arg Arg Ser Ile Ile Ser Arg Leu Phe Gly Thr Ser Pro Ala Thr 355 360 365 Glu Ala Ala Pro Pro Pro Pro Glu Pro Val Pro Ala Ala Gln Gly Pro 370 375 380 Ala Thr Val Gln Ser Val Glu Asp Phe Val Pro Asp Asp Arg Leu Asp 385 390 395 400 Arg Ser Phe Leu Glu Asp Thr Thr Pro Ala Arg Asp Glu Lys Lys Val 405 410 415 Gly Ala Lys Ala Ala Gln Gln Asp Ser Asp Ser Asp Gly Glu Ala Leu 420 425 430 Gly Gly Asn Pro Met Val Ala Gly Phe Gln Asp Asp Val Asp Leu 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Lys 645 650 655 Lys Thr Lys Ser Phe Ser Arg Val Leu Leu Glu Arg Pro Arg Ala His 660 665 670 Arg Phe Ser Thr Arg Val Gly Tyr Gln Val Ser Val Pro Asn Ser Pro 675 680 685 Tyr Ser Glu Ser Tyr 690

Claims (36)

  1. 종양괴사인자 수용체(TNF-R) 방출 활성을 가지는 단백질을 암호화하는 핵산서열을 포함하며, 상기 핵산서열이 SEQ ID NO: 4, 6, 7 및 9로부터 선택되는, 폴리뉴클레오티드 발현 벡터.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 핵산서열이 SEQ ID NO: 9이고, 이 서열로부터 발현되는 종양괴사인자 수용체(TNF-R) 방출 활성을 가지는 단백질의 크기가 36kDa인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 발현 벡터.
  3. 제 2 항에 기재된 벡터를 발현시키는 단계를 포함하는, 종양괴사인자 수용체(TNF-R) 방출 활성을 가지는 단백질을 함유하는 조성물의 제조방법.
  4. 제 3 항에 기재된 방법에 의해 제조되는, 종양괴사인자 수용체(TNF-R) 방출 활성을 가지는 36kDa 크기의 단백질을 함유하는 조성물.
  5. 하기의 단계를 포함하는 의약 제조방법:
    a) 제 2 항에 기재된 벡터를 발현하여, 종양괴사인자 수용체(TNF-R) 방출 활성을 가지는 36kDa 크기의 단백질을 생산하는 단계;
    b) 상기 생산된 단백질을 정제하는 단계; 및
    c) 상기 정제된 단백질과 약제학적으로 허용되는 부형제를 주사투여용으로 혼합하는 단계.
  6. 제 5 항에 기재된 방법에 의해 제조되는, 염증질환 치료용 의약.
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Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050191661A1 (en) * 1996-11-06 2005-09-01 Tetsuya Gatanaga Treatment of inflammatory disease by cleaving TNF receptors
US6930084B1 (en) 1996-11-06 2005-08-16 The Regents Of The University Of California Treating arthritis with TNF receptor releasing enzyme
US6593456B1 (en) * 1996-11-06 2003-07-15 The Regents Of The University Of California Tumor necrosis factor receptor releasing enzyme
KR100533531B1 (ko) 1996-11-06 2005-12-06 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 분리된 종양괴사인자 수용체 방출효소, 그 효소로 이루어지는 조성물 및 그것의 사용방법
AU2001245371A1 (en) * 2000-02-28 2001-09-12 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Regulators of type-1 tumor necrosis factor receptor and other cytokine receptor shedding
JP4265402B2 (ja) * 2001-09-25 2009-05-20 ソニー株式会社 ｐ３００ヒストンアセチル化酵素インヒビターを含む転写阻害用組成物及び該ｐ３００ヒストンアセチル化酵素インヒビターを阻害し得る阻害物質のスクリーニング方法
CN1671843B (zh) 2002-07-25 2010-07-14 索尼株式会社 参与转录调控的因子
US20090204076A1 (en) * 2003-02-03 2009-08-13 Barry Peter Liversidge Medical Injector
CN100375750C (zh) * 2003-05-15 2008-03-19 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 抑制人肿瘤坏死因子活性的寡聚核苷酸
US7738952B2 (en) * 2003-06-09 2010-06-15 Palo Alto Investors Treatment of conditions through modulation of the autonomic nervous system
EP1699478A2 (en) * 2003-09-23 2006-09-13 Meyer Pharmaceuticals, LLC Treating inflammation using a biological agent that causes cells to release cytokine receptors
WO2005087947A2 (en) * 2004-03-09 2005-09-22 Meyer Pharmaceuticals Llc Bioengineered proteolytic enzymes with enhanced specificity for cytokine receptors
GB0414054D0 (en) * 2004-06-23 2004-07-28 Owen Mumford Ltd Improvements relating to automatic injection devices
ITRM20050064A1 (it) * 2005-02-16 2006-08-17 Univ Siena Peptide poliepitopico derivato dalla timidilato sintetasi avente attivita' immunologica e antitumorale e composizioni farmaceutiche relative.
JP2009504192A (ja) * 2005-08-19 2009-02-05 サイリーン ファーマシューティカルズ インコーポレーティッド ヒトリボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）およびリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）核酸ならびにそれらの使用
WO2007120638A2 (en) * 2006-04-12 2007-10-25 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for modulating glycosylation
TWI527603B (zh) 2006-06-30 2016-04-01 艾伯維生物技術有限責任公司 自動注射裝置
US8524444B2 (en) * 2007-06-15 2013-09-03 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for detections and modulating O-glycosylation
MX2011011541A (es) 2009-04-29 2012-02-28 Abbott Biotech Ltd Dispositivo de inyeccion automatico.
JP2012528858A (ja) 2009-06-01 2012-11-15 プレジデント アンド フェロウズ オブ ハーバード カレッジ Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ転移酵素阻害剤およびその使用
GB0915877D0 (en) * 2009-09-10 2009-10-14 E Therapeutics Plc Cancer cell apoptosis
NZ600069A (en) 2009-12-15 2015-02-27 Abbvie Biotechnology Ltd Improved firing button for automatic injection device
EP2667918B1 (en) 2011-01-24 2017-03-01 AbbVie Biotechnology Ltd Automatic injection devices having overmolded gripping surfaces

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0657536A1 (en) * 1993-10-12 1995-06-14 Yeda Research And Development Co. Ltd. Proteases capable of shedding the soluble TNF-receptor and TNF-R derived peptides and antibodies against the proteases inhibiting the shedding

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4340586A (en) * 1977-02-18 1982-07-20 Adam Bekierkunst Pharmaceutical preparation for treating disorders of the skin
US5192537A (en) * 1984-03-30 1993-03-09 Cellcor Inc. Method of treating renal cell carcinoma using activated mononuclear cells, renal tumor antigen and cimetidine
US5643740A (en) * 1983-02-24 1997-07-01 Ronald J. Billing Monoclonal antibody specific for activated lymphocytes and monocytes
US5001061A (en) * 1983-06-22 1991-03-19 Lubrizol Genetics, Inc. nifD promoter of Bradyrhizobium
DE3343530A1 (de) * 1983-12-01 1985-06-13 Max Planck Gesellschaft Arzneimittel mit verbesserter penetration der gewebsmembran
ATE73345T1 (de) * 1984-10-19 1992-03-15 Chiron Corp Anregung zur heilung einer wunde mittels menschlichen hautwachstumsfaktors hergestellt durch rekombinant-dns.
US4761371A (en) 1985-02-12 1988-08-02 Genentech, Inc. Insulin receptor
US4695590A (en) * 1986-05-05 1987-09-22 California Health Technologies Method for retarding aging
US5002935A (en) * 1987-12-30 1991-03-26 University Of Florida Improvements in redox systems for brain-targeted drug delivery
US5017566A (en) * 1987-12-30 1991-05-21 University Of Florida Redox systems for brain-targeted drug delivery
US5140043A (en) * 1989-04-17 1992-08-18 Duke University Stable ascorbic acid compositions
US5130298A (en) * 1989-05-16 1992-07-14 Ethicon, Inc. Stabilized compositions containing epidermal growth factor
US6232446B1 (en) * 1989-05-18 2001-05-15 Yeda Research And Development Co. Ltd. TNF ligands
US5395760A (en) 1989-09-05 1995-03-07 Immunex Corporation DNA encoding tumor necrosis factor-α and -β receptors
US5270326A (en) * 1990-11-21 1993-12-14 University Of Florida Treatment for tissue ulceration
US5268384A (en) * 1990-11-21 1993-12-07 Galardy Richard E Inhibition of angiogenesis by synthetic matrix metalloprotease inhibitors
EP0534907B1 (en) * 1991-09-26 1998-08-05 Nippon Zoki Pharmaceutical Co., Ltd. The use of furanone derivatives for the prevention or treatment of autoimmune diseases
GB9214857D0 (en) * 1992-07-13 1992-08-26 Medical Res Council Human nucleic acid fragments and their use
CA2153480A1 (en) * 1993-11-12 1995-06-01 Kenichi Matsubara Gene signature
EP0693556B1 (en) * 1994-01-28 2004-10-06 Ajinomoto Co., Inc. Transglutaminase originating in japanese oyster
IL111125A0 (en) 1994-05-11 1994-12-29 Yeda Res & Dev Soluble oligomeric tnf/ngf super family ligand receptors and their use
US5741667A (en) 1994-05-27 1998-04-21 Genentech, Inc. Tumor necrosis factor receptor-associated factors
IL114418A0 (en) 1994-07-07 1995-10-31 Res Dev Foundation Tumor necrosis factor receptor-II associated protein kinase and methods for its use
FR2725213B1 (fr) 1994-10-04 1996-11-08 Rhone Poulenc Rorer Sa Vecteurs viraux et utilisation en therapie genique
EP2055712A1 (en) 1995-06-07 2009-05-06 Glaxo Group Limited Peptides and compounds that bind to a thrombopoietin receptor
US5968506A (en) * 1995-08-04 1999-10-19 Geron Corporation Purified telomerase
US6090605A (en) * 1996-03-11 2000-07-18 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Purified porcine kidney L-fucose kinase
US6068838A (en) * 1996-04-29 2000-05-30 Baxter Aktiengesellschaft Purified multimerase
US5834236A (en) * 1996-06-27 1998-11-10 The Salk Institute For Biological Studies AATT repeat transcription enhancer element
US5853977A (en) * 1996-07-12 1998-12-29 Schering Corporation Mammalian TNF-α convertases
US6022948A (en) * 1996-09-17 2000-02-08 Washington University Method of cell surface activation and inhibition
KR100533531B1 (ko) 1996-11-06 2005-12-06 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 분리된 종양괴사인자 수용체 방출효소, 그 효소로 이루어지는 조성물 및 그것의 사용방법
US6593456B1 (en) 1996-11-06 2003-07-15 The Regents Of The University Of California Tumor necrosis factor receptor releasing enzyme
CA2283379A1 (en) * 1997-03-05 1998-09-11 Michael G. Katze Novel screening methods to identify agents that selectively inhibit hepatitis c virus replication
US6911314B2 (en) * 1999-05-14 2005-06-28 The Regents Of The University Of California Screening for drugs that affect TNF receptor releasing enzyme

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0657536A1 (en) * 1993-10-12 1995-06-14 Yeda Research And Development Co. Ltd. Proteases capable of shedding the soluble TNF-receptor and TNF-R derived peptides and antibodies against the proteases inhibiting the shedding

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BBRC, Vol. 222, pp. 298-302*

Also Published As

Publication number Publication date
US20050090647A1 (en) 2005-04-28
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WO1999058559A2 (en) 1999-11-18
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TWI244501B (en) 2005-12-01
NZ507977A (en) 2004-04-30
US8101174B2 (en) 2012-01-24
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RU2279478C2 (ru) 2006-07-10

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