KR100885711B1 - 페록시좀 증식제를 선별할 수 있는 dna 칩 - Google Patents
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Abstract
The present invention relates to a DNA chip which comprises probes hybridizable to genes expressed when individuals are dosed with peroxisome proliferator, a process for preparing the DNA chip, a screening kit comprising the said DNA chip, and a method for screening of peroxisome proliferator by using the said kit. The DNA chip for screening of peroxisome proliferator comprises: a probe of 121 to 587 nucleotides hybridizable to a gene expressed when individuals are dosed with peroxisome proliferator; a linker consisting of oligo(dT)15, -(CH2)6- and amine residue in a sequential order, whose 5' end is bonded to the 3' end of the said oligo(dT)15; and, a solid substrate attached to aldehyde residue which is bonded to the amine residue of the linker via Schiff's base reaction. The screening kit of the invention can be readily used for the selection of peroxisome proliferators which show peroxisome proliferating activity to induce abnormal cellular responses, which makes possible its practical application in the safety test of various materials.
Description
본 발명은 페록시좀 증식제(peroxisome proliferator)를 선별할 수 있는 DNA 칩에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 페록시좀 증식제의 투여시 발현되는 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 유전자 탐침을 포함하는 DNA 칩, 전기 DNA 칩의 제조방법, 전기 DNA 칩을 포함하는 페록시좀 증식제 선별용 키트 및 전기 키트를 사용하여 페록시좀 증식제를 선별하는 방법에 관한 것이다.
페록시좀 증식활성을 나타내는 페록시좀 증식제는 체내에서 중성지방을 분해하는 대사를 촉진시키는 PPARs(peroxisome proliferator activated receptors)를 활성화시킬 뿐만 아니라, 체내에서 과량의 자유라디칼을 발생시켜서 비정상적인 세포반응을 유도하는 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. 페록시좀 증식제가 동물의 체내에 투여되면, 체내에서 과량의 자유라디칼이 발생되며, 발생된 과량의 자유라디칼을 제거하기 위하여, 세포내에 페록시좀이 이상증식하게 된다. 전기 이상증식된 페록시좀은 세포에 존재하는 자유라디칼의 대부분을 흡수하여 제거하는 역할을 수행하지만, 페록시좀을 통하여 모든 자유라디칼이 제거되는 것은 아니며, 소량의 자유라디칼은 세포내에 잔류하게 되는데, 이처럼 제거되지 않고 세포내에 잔류 하는 자유라디칼은, 비록 소량일지라도 세포내에서 비정상적인 산화반응을 수행할 수 있다. 이러한 이유로, 동물의 체내에 투여하고자 하는 물질이 페록시좀 증식활성을 나타내는지의 여부를 확인하는 것은, 안전성 측면에서 매우 중요하게 여겨지고 있다.
현재까지는, 동물의 체내에 투여하고자 하는 물질이 페록시좀 증식활성을 나타내는 지의 여부를 확인하기 위하여, 전기 물질을 실험동물에 투여하고, 전기 물질이 투여된 실험동물로부터 간조직을 적출하며, 적출된 간조직을 이용하여 광학현미경용 조직시료를 수득한 다음, 수득한 조직시료를 광학현미경으로 관찰하여, 전기 조직시료내에서 원래부터 존재하고 있는 페록시좀과 크기를 비교하여 이상증식된 페록시좀의 존재여부를 확인하는 방법이 사용되어 왔다. 그러나, 이러한 방법은 장시간이 소요되고, 페록시좀 증식제로서의 활성이 약한 물질인 경우, 정확한 확인이 어렵다는 단점이 있었다. 즉, 전기 물질이 투여된 동물에서 적출된 간조직을 이용하여 조직시료를 수득하는데 하루 이상의 기간이 소요된다는 단점과, 페록시좀 증식제로서의 활성이 약한 물질이 동물에 투여되는 경우, 상대적으로 적은 량의 자유라디칼이 발생되고, 비교적 소량의 자유라디칼을 제거하기 위하여, 페록시좀이 과다하게 증식되지 않을 수도 있는데, 이러한 경우에는 조직시료에 원래부터 존재하는 페록시좀의 크기와 패록시좀 증식제의 투여로 인하여 증식된 페록시좀의 크기가 명확하게 구별되지 않을 수도 있다는 단점이 지적되었다. 이러한 단점을 해결하기 위하여, 다양한 연구가 진행되고 있으나, 아직까지는 별다른 성과가 없는 실정이다.
따라서, 신속하고 정확하게 페록시좀 증식제로서의 활성을 나타내는 물질을 검색할 수 있는 방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.
발명의 요약
이에, 본 발명자들은 페록시좀 증식제로서의 활성을 나타내는 물질을 검색할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 페록시좀 증식제의 투여시 발현되는 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 유전자 탐침을 포함하는 DNA 칩 및 시료에서 채취한 RNA 로부터 합성된 cDNA 를 표지하기 위하여 형광표지된 데옥시 뉴클레오타이드를 포함하는 페록시좀 증식제 선별용 키트를 사용할 경우, 신속하고 정확하게 페록시좀 증식제를 선별할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 첫번째 목적은 페록시좀 증식제의 투여시 발현되는 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 유전자 탐침을 포함하는 페록시좀 증식제 선별용 DNA 칩을 제공하는 것이다.
본 발명의 두번째 목적은 전기 DNA 칩의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 세번째 목적은 전기 DNA 칩을 포함하는 페록시좀 증식제 선별용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 네번째 목적은 전기 분석키트를 이용하여 페록시좀 증식제를 선별하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 페록시좀 증식제 선별용 DNA 칩은 121 내지 587 개의 뉴클레오티드로 구성되고, 페록시좀 증식제에 의해 발현유도되는 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 유전자 탐침; 올리고 (dT)15, -(CH2)6- 및 아민(amine)기를 순차적으로 포함하고, 전기 유전자 탐침의 5' 말단이 올리고 (dT)15 의 3'말단부위에 연결된 링커; 및, 표면에 알데히드가 부착되고, 전기 링커의 아민기가 표면의 알데히드기와 시프염기(Schiff's base) 반응을 통해 연결된 고체기판을 포함한다: 이때, 유전자 탐침은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 하기의 서열번호 1 내지 12 의 유전자로부터 선택된 1 개 이상의 유전자를 탐침으로 사용함이 바람직하다.
전기 페록시좀 증식제 선별용 DNA 칩의 제조방법은 121 내지 587 개의 뉴클레오티드로 구성되고, 페록시좀 증식제에 의해 발현유도되는 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 유전자 탐침을 합성하는 공정; 올리고(dT)15, -(CH2)6- 및 아민(amine)기를 순차적으로 포함하는 링커를 합성하는 공정; 전기 합성된 유전자 탐침의 5' 말단을 전기 합성된 링커의 올리고 (dT)15 의 3'말단부위에 결합시키는 공정; 유전자 탐침이 결합된 링커를 알데히드가 부착된 고체기판의 표면에 시프염기(Schiff's base) 반응을 통해 결합시키는 공정; 및, 반응되지 않고 잔존하는 알데히드를 환원시키는 공정을 포함한다: 이때, 고체는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나 유리인 것이 바람직하고, 알데히드의 환원조건은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, NaBH4 등의 환원제를 사용함이 바람직하다.
한편, 본 발명의 페록시좀 증식제 선별용 DNA 칩을 이용하여, 페록시좀 증식제를 선별하기 위한 키트를 제작할 수 있다. 즉, 본 발명의 페록시좀 증식제 선별용 키트는 전기 페록시좀 증식제 선별용 DNA 칩 및 시료에서 채취한 RNA 로부터 합성된 cDNA 를 표지하기 위하여 형광표지된 데옥시 뉴클레오타이드를 포함한다: 이때, 형광표지된 데옥시 뉴클레오타이드는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 텍사스 레드(Texas Red) dATP, 시아닌 3(cyanine 3) dCTP, 시아닌 5(cyanine 5) dGTP 또는 플루오레세인-12(fluorescein-12) dUTP 를 사용함이 바람직하다.
상술한, 본 발명의 페록시좀 증식제 선별용 키트를 이용하여 페록시좀 증식제를 용이하게 선별할 수 있다. 즉, 실험동물에 페록시좀 증식제 후보물질을 투여하는 단계; 전기 후보물질이 투여된 실험동물로부터 RNA 를 채취하는 단계; 전기 키트에 포함된 형광표지된 데옥시 뉴클레오타이드를 이용하여 전기 채취된 RNA 로부터 형광표지된 cDNA 를 합성하는 단계; 전기 합성된 cDNA 를 전기 키트에 포함된 페록시좀 증식제 선별용 DNA 칩에 적용하여 혼성화시키는 단계; 및, 전기 혼성화된 DNA 칩을 세척하고, 스캐너를 이용하여 DNA 칩에 혼성화된 탐침부위를 검사하는 단계를 통하여, 투여된 후보물질이 페록시좀 증식제로서의 활성을 나타내는지 확인함으로써, 페록시좀 증식제를 선별할 수 있다.
본 발명의 페록시좀 증식제 선별용 키트는 체내에서 비정상적인 세포반응을 유도하는 페록시좀 증식제를 용이하게 선별할 수 있으므로, 여러가지 물질의 안전성 검사에 널리 활용될 수 있을 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 페록시좀 증식제의 투여시 발현되는 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 유전자 단편(EST, expressed sequence Tag)의 선별
6 주된 래트(Sprague-Dawley VAF+ albino)에 페록시좀 증식활성이 있는 것으로 알려진 고지혈증 치료제인 클로피브레이트(clofibrate)를 하루에 0.2㎎/kg 의 양으로 2 주동안 복강주사하여 투여한 실험군 1; 페록시좀 증식활성이 있는 것으로 알려진 고지혈증 치료제인 젬피브로질(gemfibrozil)을 하루에 0.2㎎/kg 의 양으로 2 주동안 복강주사하여 투여한 실험군 2; 페록시좀 증식활성이 없는 것으로 알려진 간질치료제인 페니토인(phenytoin)을 하루에 0.2㎎/kg 의 양으로 2 주동안 복강주사하여 투여한 실험군 3; 및, 약물이 투여되지 않은 대조군을 각각 준비하고, 각 대조군 및 실험군으로부터 간조직을 적출하였다.
RNA 추출키트(Micro-to-Midi Tatal RNA purification system, Life Technologies, Inc., USA)를 사용하여, 전기 적출된 각 간조직으로부터 mRNA 를 분리하였고, 역전사 키트(Platinum Biochip Reagent Kit, Genocheck, 한국) 및 시아닌 5(cyanine 5, Amersham, GB) dGTP 를 이용하여 전기 분리된 mRNA 로부터 형광표지된 cDNA 를 합성하였다.
한편, 다양한 EST 를 포함하는 클론라이브러리(Clone-Library, Reserch Genetics, USA)에서 각각의 유전자를 포함하는 플라스미드를 추출하고, 이를 PCR 방법으로 증폭시킨 다음, DNA 칩용 유리기판에 점적하여(spotting), 전기 증폭된 유전자를 포함하는 DNA 칩을 작제하였다.
전기 작제된 DNA 칩에 전기 합성된 형광표지된 cDNA 를 가하고, 혼성화반응을 12 시간동안 수행한 후, 혼성화반응이 종결된 DNA 칩을 평판스캐너(GenePix Scanner 4000A, Axon Inc., USA)으로 스캔하고, 스캔 결과를 이미지 분석시스템(GenePix Pro 4.0, Axon Instrument Inc., USA)으로 분석하여, 각 실험군에서 상대적으로 높은 정도의 형광반응을 나타내는 유전자를 선별하였다(참조: 표 1).
[표 1]
각 물질의 투여시 특이적으로 발현되는 유전자와 DNA 칩에 존재하는 유전자의 혼성화정도
상기 표 1 은 각 실험군의 cDNA 와 상대적으로 높은 혼성화 반응성을 나타내는 유전자를 선별한 것으로서, 각 실험군과 반응한 후, 시아닌 5(cyanine 5) dGTP 로부터 발생되는 상대적인 높은 형광정도를 나타내는 12 종의 EST(서열번호 1 내지 12) 및 그들의 상대적 형광정도를 나타내는 표이다. 이때, 상대적 형광정도의 기준으로는, 대조군의 cDNA 와 DNA 칩을 반응시키고, 시아닌 5(cyanine 5) dGTP 로부터 발생되는 형광정도(1.0)를 사용하였다.
상기 표 1에서 보듯이, 실험군 1 과 상대적으로 높은 혼성화를 수행하는 EST 는 서열번호 1 내지 11 이고, 실험군 2 와 상대적으로 높은 혼성화를 수행하는 EST 는 서열번호 12 이며, 실험군 3 은 상대적으로 낮은 혼성화 반응정도를 나타내었다. 특히, 페록시좀 증식활성이 있는 것으로 알려진 물질을 투여한 실험군 1 및 2 는 유사한 혼성화 패턴을 나타내었고, 페록시좀 증식활성이 없는 것으로 알려진 물질을 투여한 실험군 3 은 전기 실험군 1 및 2 와는 전혀 다른 혼성화 패턴을 나타내었으므로, 상기 선별된 12종의 EST를 사용할 경우, 페록시좀 증식활성이 있는 물질을 선별할 수 있을 것으로 예측되었다.
실시예 2: DNA 칩의 제조
탐침으로 사용할, 전기 실시예 1 애서 선별된 12 종의 EST 를 합성하고, 올리고 (dT)15, -(CH2)6- 및 아민(amine)기가 순차적으로 연결된 링커를 작제한 다음, 전기 합성된 EST 의 5' 말단을 링커의 티민부위에 연결시켰다.
이어, 전기 링커와 연결된 탐침을 완충용액(350mM sodium bicarbonate, pH 9.0)에 각각 50μ M 로 용해시키고, 알데히드가 부착된 슬라이드(silylated slide, CSS-100, CEL, USA)의 표면에 어레이어(MicroGrid II, BioRobotics, USA)를 이용하여 크기 150 ㎛, 간격 400 ㎛ 로 점적한 후, 시프염기 반응을 수행하였다. 이어, 0.2％(w/v) SDS 용액과 3 차 증류수를 이용하여 순차적으로 세척하고, NaBH4 용액(0.1g NaBH4, 30 ㎖ PBS, 10 ㎖ ethanol)에 15 분 동안 침지하여, 아민이 결합되지 않은 알데히드 잔기를 환원시킨 후, 3 차증류수로 세척하고 건조시켜서 DNA 칩을 제조하였다.
실시예 3: DNA 칩을 이용한 페록시좀 증식제의 선별
전기 실시예 2 에서 제조된 DNA 칩을 사용하여, 페록시좀 증식활성을 나타내는 화합물을 선별할 수 있는지 확인하였다.
즉, 페록시좀 증식활성을 나타내는 것으로 알려진 1-메틸-4-피페리딜-비스(p-클로로페녹시)아세테이트(1-methyl-4-piperidyl-bis(p-chlorophenoxy)acetate)를 하루에 0.05㎎/kg 의 양으로 2 주동안 복강주사하여 투여한 실험군 4; 페록시좀 증식활성을 나타내는 발암물질로 알려진 Wy-14,643(4-chloro-6-[(2,3-dimethylphenyl)amino]-2-pyrimidinyl)thioacetic acid, A.G.Scientific. Inc., USA)를 하루에 0.05㎎/kg 의 양으로 2 주동안 복강주사하여 투여한 실험군 5; 페록시좀 증식활성을 나타내고, 환경호르몬으로 알려진 디-(2-에틸헥실)프탈레이트(di-(2-ethylhexyl)phthalate)를 하루에 0.05㎎/kg 의 양으로 2 주동안 복강주사하여 투여한 실험군 6; 및, 페록시좀 증식활성을 나타내고, 간에서 수행되는 지방산의 산화반응 억제제로 알려진 2-히드록시-3-프로필-4-[6-(테트라졸-5-일)헥실옥실아세토페논(2-hydroxy-3-propyl-4-[6-(tetrazol-5-yl)hexyloxy]acetophenone)을 하루에 0.05㎎/kg 의 양으로 2 주동안 복강주사하여 투여한 실험군 7 을 각각 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1 과 동일한 방법을 이용하여, 각 실험군의 형광표지된 cDNA 를 합성하였다. 이어, 전기 실시예 2 에서 제조된 DNA 칩에 전기 합성된 각 실험군의 형광표지된 cDNA 를 적용하고, 혼성화 반응을 12 시간동안 수행한 후, 실시예 1 과 동일한 방법으로 혼성화반응이 종결된 DNA 칩을 스캔하고 그 결과를 분석하여, 각 실험군에서 발생한 형광의 상대적 정도를 측정함으로써, 전기 실험군의 cDNA 와 DNA 칩의 혼성화정도를 측정하였다(참조: 표 2).
[표 2]
각 물질의 투여시 특이적으로 발현되는 유전자와 DNA 칩의 혼성화 정도
상기 표 2 에서 보듯이, 실험군 4 내지 7 에서 수득한 cDNA 는 전기 DNA 칩에 구비된 각 탐침과 높은 혼성화정도를 나타내었으므로, 전기 실시예 1 에 개시된 실험군 1 및 2 와는 유사한 결과를 나타내고, 실험군 3 과는 상이한 결과를 나타냄을 알 수 있었다.
따라서, 본 발명의 DNA 칩을 이용하면, 페록시좀 증식활성을 나타내는 물질을 신속하고, 정확하게 선별할 수 있음을 확인하였다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 페록시좀 증식제의 투여시 발현되는 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 유전자 탐침을 포함하는 DNA 칩, 전기 DNA 칩의 제조방법, 전기 DNA 칩을 포함하는 페록시좀 증식제 선별용 키트 및 전기 키트를 사용하여 페록시좀 증식제를 선별하는 방법을 제공한다. 본 발명의 페록시좀 증식제 선별용 키트는 체내에서 비정상적인 세포반응을 유도하는 페록시좀 증식제를 용이하게 선별할 수 있으므로, 여러가지 물질의 안전성 검사에 널리 활용될 수 있을 것이다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> GENOCHECK CO., LTD.
SEOUL NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY FOUNDATION
ISTECH CO., LTD
SHIN-WON SCIENTIFIC CO., LTD
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aataaaagat tacaacagcc atagaatata atctataaag caaacattta atattgcact 180
ttgtttcgca aacattttgg attttacttt tcctaaatga aaaattagga attcaagata 240
gcttgaatac tagagcgcaa ctgtgaccct cagatgttat gtcaggaatt gaccaatatt 300
tagaatagtg taatgcctca aaagagtaaa gaaatactta atgggaaaaa taaaacttta 360
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agggtgtggg gagagctagg ctcctgatgt ctcctcggca ctggactgtg ggcctggtca 60
gtacacacgg gcttgtagag aaagtcagta tctcattaaa aaaagaagcg gcggcggcgg 120
cagcatcccg gctgtgcaga ccgcagcagt gcatgtgcct aagacaggcc gtaccgtcct 180
ctggaccagc acgctctgga cagcctgagc cagggcaggg tgctgcaaag agggggctgg 240
gcaggcttag gagaccacag ggaaccatac ctcaataggc ttctggcctt gcccagggtc 300
tggaccaaag ggaccccagg ccctgcctct gggtgaaccc gtcatacgtc cataaagtca 360
tcgtcctcgt ctgtctcact ctccaatgag gactcctggc tggatgtctc cagaacctcc 420
agggctggct ggcacaggct ctccttcctc acattggcgg ca 462
<210> 8
<211> 417
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 8
gtgaatcaat aaaacaaaag ctaaggacaa tgagctcaag ttatcgattc ttaagtttca 60
aaatagaaca gtaggaaagc tatgaaagtg ggggggtgga ctttggggtg tatgagcaat 120
aggaatctaa agcatcaaaa cacaggctaa gaaagtctag gacacaagga agactccagc 180
agctccctca gatgtctaat tccggtcatt tacttttcac tctaaaaagt atcttaaatt 240
tttaatattt attagttttt tgttttttca agacagggtc tcacatatag ctctgcctac 300
cccagaactc acaatgaagt ccaggctgac cttgaactca cagagaccct ctagcctctg 360
cctctgtcgt gctggaatta aaggcacatg caccactatg cccagcataa atattta 417
<210> 9
<211> 337
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 9
cacttactaa actaacatta tatgttttac aattttgaac aactttacaa gttactgtta 60
ttttcaattc tgagtagaaa ggtaaactcc aagcaagaca aagccaatag aggcttaagt 120
tcatcaccaa caagtttcaa caatttaccc caaatttact gttaaacagt acctggttga 180
agacacaagc tgcgccttaa ataagctgga gcgactctgg gatgttatga acttaacctt 240
gaaaggaaga aggtatagga acttctattt ggtttggatt gtaagaacag acaaattact 300
tacagaaact gaattacttc aatacacatg tgaagac 337
<210> 10
<211> 250
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 10
tatagtaaat acgtgtgttt tccaggatgc cacagaattt cattggaaaa caatgaaact 60
agattaacct gagacccccc ccttcccctt agaaaataag gactatagga ttagaccaca 120
agcagactag taaaggggat ggggttgtgg tacacctgat tttagccaga ctttcccaag 180
ctaaatccag ataaaactgc ttctgtatta gtaagttggg tgagtgtgta aaatctatca 240
ttcaaaaagt 250
<210> 11
<211> 393
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 11
agagcataga tgtggcaggg tctcagtccc tgcacagaaa tgagagatga acaaaaacga 60
gacacttcca cctggccaga gtctgggagg gcagggagga acacagacct ggacattcgt 120
aagaaaaata aaacctaaat caaacattca atcttgtacc caataaaggt ttgaacaggg 180
aactcagtca ccaccagttc ccaccctccc ctgccagcac tgaagaaaaa caaaagttca 240
acacacacta agggcttagg aggaaggggc attctcctgc cttcccccaa cccccaagaa 300
tgggctgggg aaaaaacggc tatatttccc caccccttac agtgtcaacc ctacacgagt 360
tctgaatgtg atccgtaaga atcagcagct caa 393
<210> 12
<211> 396
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 12
tgtgttctta gaaagcaaac ttaatggctt tcaaaccaaa tccttagagc cagtacatca 60
aaggcattgc ggtccacgta tgcaagggtg tgcatgtaga ggccagaggg caactttagg 120
agtcagtatt ctccttccac cctcggctcc agagtcgaat tcaggcctca tgagcaacaa 180
gcatgttcac ctcttgggcc attcaccagt cccaggatca agacttcttt gatgcttcta 240
tttcttccca caatgcagct tcaatttttg aagtgtcata ttctctcatc atatcaaact 300
caagccatgg cttgctccac ttctgggctt ctttcatttg ctcttcagtt aaagcaagat 360
caaatctgat ccctttaatg ttgaagttcg gacgtt 396
Claims (8)
- (ⅰ) 서열번호 1 내지 12로부터 선택되는 염기서열을 가지고, 페록시좀 증식제에 의해 발현유도되는 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 유전자 탐침;(ⅱ) 순차적으로 연결된 올리고 (dT)15, -(CH2)6- 및 아민(amine)기로 구성되고, 전기 유전자 탐침의 5' 말단이 올리고 상기 (dT)15의 3'말단부위에 연결된 링커; 및,(ⅲ) 표면에 알데히드가 결합되고, 전기 링커의 아민기가 표면의 알데히드기와 시프염기(Schiff's base) 반응을 통해 연결된 고체를 포함하는, 페록시좀 증식제 선별용 DNA 칩.
- 삭제
- (ⅰ) 서열번호 1 내지 12로부터 선택되는 염기서열을 가지고, 페록시좀 증식제에 의해 발현유도되는 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 유전자 탐침을 합성하는 공정;(ⅱ) 순차적으로 연결된 올리고 (dT)15, -(CH2)6- 및 아민(amine)기로 구성된 링커를 합성하는 공정;(ⅲ) 전기 합성된 유전자 탐침의 5' 말단을 전기 합성된 링커의 올리고 (dT)15의 3'말단부위에 결합시키는 공정;(ⅳ) 유전자 탐침이 결합된 링커의 아민기를 알데히드가 결합된 고체의 표면에 시프염기(Schiff's base) 반응을 통해 결합시키는 공정; 및,(ⅴ) 반응되지 않고 잔존하는 알데히드기를 환원시키는 공정을 포함하는, 페록시좀 증식제 선별용 DNA 칩의 제조방법.
- 삭제
- 제 1 항의 페록시좀 증식제 선별용 DNA 칩 및 시료에서 채취한 RNA 로부터 합성된 cDNA 를 표지하기 위하여 형광표지된 데옥시 뉴클레오타이드를 포함하는 페록시좀 증식제 선별용 키트.
- 제 5 항에 있어서,형광표지된 데옥시 뉴클레오타이드는 텍사스 레드(Texas Red) dATP, 시아닌 3(cyanine 3) dCTP, 시아닌 5(cyanine 5) dGTP 또는 플루오레세인-12(fluorescein- 12) dUTP 인 것을 특징으로 하는페록시좀 증식제 선별용 키트.
- (ⅰ) 인간을 제외한 포유동물인 실험동물에 페록시좀 증식제 후보물질을 투여하는 단계;(ⅱ) 전기 후보물질이 투여된 실험동물로부터 RNA를 채취하는 단계;(ⅲ) 제 5항에 개시된 키트에 포함된 형광표지된 데옥시 뉴클레오타이드를 이용하여 전기 채취된 RNA로부터 형광표지된 cDNA를 합성하는 단계;(ⅳ) 전기 합성된 cDNA를 전기 키트에 포함된 페록시좀 증식제 선별용 DNA 칩에 적용하여 혼성화시키는 단계; 및,(ⅴ) 전기 혼성화된 DNA 칩을 세척하고, 스캐너를 이용하여 DNA 칩에 혼성화된 탐침부위를 검사하는 단계를 포함하는, 제 5항에 개시된 키트를 이용하여 페록시좀 증식제를 선별하는 방법.
- 제 7항에 있어서,형광표지된 데옥시 뉴클레오타이드는 텍사스 레드(texas red) dATP, 시아닌 3(cyanine 3) dCTP, 시아닌 5(cyanine 5) dGTP 또는 플루오레세인-12(fluorescein-12) dUTP로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는제 5항에 개시된 키트를 이용하여 페록시좀 증식제를 선별하는 방법.
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