KR20050049891A

KR20050049891A - 돼지의 성장단계별 근육특이유전자의 발현 프로파일의검색 및 이를 이용한 기능성 ｃＤＮＡ 칩

Info

Publication number: KR20050049891A
Application number: KR1020030083650A
Authority: KR
Inventors: 김철욱; 여정수; 이정규; 송영민; 조광근; 정기화; 김일석; 진상근; 박수현; 정지원; 이민정; 권은정; 조은석; 조확래; 신선민; 남희선; 홍연희; 홍성광; 강양수; 하영주
Original assignee: 경상남도; 김철욱
Priority date: 2003-11-24
Filing date: 2003-11-24
Publication date: 2005-05-27
Also published as: CN1621532A; US20050112600A1

Abstract

본 발명은 돼지의 성장단계별 근육특이유전자의 발현 프로파일의 검색 및 이를 이용한 기능성 cDNA 칩에 관한 것으로, 본 발명은 돼지의 근육과 지방 조직에서 성장단계에 따라 특이적으로 발현되는 근육특이유전자의 발현 프로파일을 제공하는 뛰어난 효과가 있다. 또한, 본 발명은 상기에서 검색된 근육특이유전자만을 집적하여 제조된 돼지의 육질 진단 및 특이유전자 검색용 기능성 cDNA 칩을 제공하는 뛰어난 효과가 있다. 따라서, 본 발명의 기능성 cDNA 칩은 돼지 품종별 육질의 평가 및 고육질의 돼지를 육성하는데 응용될 수 있다.

Description

돼지의 성장단계별 근육특이유전자의 발현 프로파일의 검색 및 이를 이용한 기능성 ｃＤＮＡ 칩{Screening expression profile of muscle specific genes expressed by growing stages in swine and functional cDNA chip prepared by using the same}

본 발명은 돼지의 성장단계별 근육특이유전자의 발현 프로파일의 검색 및 이를 이용한 기능성 cDNA 칩에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 돼지의 근육과 지방 조직에서 성장단계에 따라 특이적으로 발현되는 근육특이유전자의 발현 프로파일을 검색하고 이로부터 얻은 특이유전자만을 집적하여 제조된 돼지의 육질 진단 및 특이유전자 검색용 기능성 cDNA 칩에 관한 것이다.

재래 흑돼지는 등지방 두께가 두껍고 사료 효율과 성장률 및 생산율이 낮아 양돈 농가의 선호도가 낮았으나, 일반 개량종에 비해 단단한 지방 조직, 백색의 지방색, 좋은 질감, 풍부하고 담백한 육즙으로 우리 입맛에 맞는 풍미 때문에 최근 그 소비가 증가하고 있는 추세이다. 그러나 재래 돼지에 대한 유전적인 연구나 혈통 유지 관리, 육질 연관 유전자 분석에 대한 연구 결과는 아직까지 많이 미흡하다. 특히 육질에 관한 유전 형질은 육량에 관한 형질과는 달리 보다 많은 유전 형질에 대한 복합적인 결과로서 이에 대한 연구 결과는 많지 않다 (Cameron, 1993).

현재까지 알려져 있는 돼지에서 육질에 영향을 미치는 중요한 유전자로는 PSE (pale, soft, exudative) 돈육의 원인이 되는 ryanodine receptor gene (RYR) (Eikelenboom과 Minkema, 1974; Smith와 Bampton, 1977; Webb, 1981; Christian과 Mabry, 1989; Fujii 등, 1991), 산성육 (acid meat) 유전자 (Rendement Napole, Le Roy 등, 1990; Lundstrom 등, 1996)가 있다. 그 외에는 QTL (quantitative trait loci) 분석에 의한 육질 연관 염색체 구역이나 여러 가지 후보유전자 (candidate gene)가 알려져 있다. 7번 염색체에 존재하는 swine leucocyte antigen (SLA) 복합체 (Geffrotin 등, 1984)와 이 부근에 위치하는 micorsatellite marker S0064, S0066, S0102나 TNF 는 등지방 두께, 등심 단면적, 육질 형질, 웅취 (boar taint)와 연관성이 있는 것으로 알려져 있다 (Jung 등, 1989; Rothschild 등, 1995; Bidanel 등, 1996). 그리고 microsatellite marker S0001∼S0175 위치에서 등지방 두께와 복부 지방 함량과 연관된 QTL이 존재한다고 밝혀져 있고 (Andersson 등, 1994), 호르몬들의 조절인자로 알려진 뇌하수체 특이 전사 인자 (pituitary-specific transcription factor; PIT1) 유전자도 등지방 두께와 연관되어 있는 것으로 보고되었다 (Yu 등, 1995). 근내 지방 함량 (Intramuscula fat content; IMF)은 고기의 부드러움 (tenderness), 수분량 (juiciness), 그리고 맛에 크게 영향을 미치는 것으로 알려져 있다 (Devol 등, 1988; Cameron, 1990). 근내 지방 함량에 영향을 미치는 유전자로는 H-FAPB (heart-fatty acid binding protein)가 보고된 바 있고 (Gerbens 등, 1997), 6번 염색체에 존재하는 microsatellite SW1823∼S0003 (74∼79cM) 위치에서도 이와의 연관성이 연구되었다 (Grindflek 등, 2001).

이와 같이 4번, 6번, 7번 염색체에서 주로 육질 형질에 영향을 미치는 QTL이 많이 보고됨에 따라 (Clamp 등, 1992; Andersson 등, 1994; Renard 등, 1996; Rohrer와 Keele 1998a, 1998b; Wang 등, 1998; de Koning 등, 1999; Ovilo 등, 2000; Gerbens 등, 2000), 이 염색체들을 중심으로 한 육질 관련 마커 개발에 대한 연구가 많이 진행되고 있다.

지난 몇 년 동안, 돼지의 육질과 관련한 익명의 유전자 마커와 알려진 유전자로 구성된 유전자 지도를 개발하고자 하는 노력이 있어왔다. 종래에는 돼지에 존재하는 유전적 차이를 시험하기 위해 노던 블랏팅, 디퍼렌셜 디스플레이, 유전자 발현의 순차적 분석 및 닷 블랏 분석과 같은 mRNA 수준에서 유전자 발현을 분석하는 몇몇 기술들이 사용되었지만, 이들 방법들은 다수의 발현 산물들을 동시에 분석하는데 있어서는 부적절한 단점을 가지고 있었다. 최근에는 이러한 단점들을 보완하기 위해 cDNA 마이크로어레이와 같은 신기술이 개발되었다. cDNA 마이크로어레이는 많은 생물들에서 유전자 발현을 연구함에 있어 가장 강력한 수단이 되고 있다. 이 기술은 폴리몰피즘 스크리닝과 유전체 DNA 클론의 맵핑 뿐만 아니라 수많은 유전자들의 동시 발현과 대규모의 유전자 발견에 적용되었다. 이미 알려져 있거나 혹은 미확인의 유전자들로부터 전사된 RNA을 정량적으로 분석하는 고도의 RNA 발현 분석 기술인 것이다.

현재 사용되고 있는 DNA 칩 타입에는 데이타 베이스 정보를 기반으로 프라이머를 설계하여 cDNA 라이브러리에서 유전자를 모아 제작한 종합적 DNA 칩과 기존의 문헌 등을 근거로 관련 유전자를 모아 제작한 기능별 DNA 칩이 있다. 종합적 DNA 칩을 이용하여 해석하는 경우에는 관련없는 유전자의 작용으로 인한 해석의 어려움과 최종적으로 생물학적인 역할을 해석할 때 방대한 노력이 필요하고, 데이타 베이스를 근거로 하므로 신규유전자가 없을 수도 있고, 관계하는 유전자 일부의 누락 가능성 등의 어려움이 있다. 한편, 기능별 DNA 칩은 해석하기 쉽지만 기존의 문헌에 기재되지 않은 유전자나 기능이 알려져 있지 않은 유전자를 특정화 하려는 경우 다시 한번 유전자를 수집하여야 할 필요가 있다. 따라서, 효과적인 해석을 위해서는 칩상의 DNA 구성이 매우 중요하다.

이점에 착안하여 본 발명자는 돼지의 특정 조직에서 육질에 관여하는 유전자의 발현 프로파일을 검색함에 있어 cDNA 마이크로어레이 기술을 도입하고 이로부터 밝혀진 특이유전자만을 집적한 기능성 cDNA 칩을 제작하여 고육질의 종돈 개량 및 품종별, 조직별 육질 평가에 응용하고자 하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 돼지의 근육과 지방 조직에서 분리한 총 RNA로부터 제작한 프로브를 집적한 기질에 돼지의 근육과 지방 조직에서 얻은 표적 DNA를 혼성화시켜 근육의 성장단계에 따라 차별적으로 발현되는 특이유전자의 발현 프로파일을 검색하고자 한다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기에서 검색된 특이유전자만을 집적하여 제작한 돼지의 육질 진단 및 특이유전자 검색용 기능성 cDNA 칩을 제공하고자 한다.

본 발명의 상기 목적은 돼지의 근육과 지방 조직에서 분리한 총 RNA로부터 PCR을 통해 수천개의 ESTs를 얻고 이를 클로닝하여 염기서열을 데이터베이스에서 분석 및 검색하고, PCR를 통해 상기 ESTs를 증폭한 후 분리 정제하여 DNA 칩 어레이를 이용하여 대조군과 함께 슬라이드에 어레이한 다음, 근육특이유전자의 발현 프로파일을 검색하기 위해 돼지의 근육과 지방 조직에서 분리한 총 RNA로부터 표적 DNA를 제조하고, 상기 슬라이드(프로브 DNA)와 표적 DNA를 혼성화(hybridization)시킨 다음, 이를 스캐닝하고 이미지 파일을 분석하여 돼지의 성장단계에 따라 특이적으로 발현되는 근육특이유전자의 발현양상을 조사한 후, 돼지의 성장단계에 따른 근육특이유전자만을 집적한 기능성 cDNA 칩을 제작함으로써 달성하였다.

본 발명은 돼지의 근육과 지방 조직에서 ESTs의 확보 및 염기서열 정보 확인단계; 상기 ESTs를 이용하여 프로브 DNA 제조단계; 돼지의 근육과 지방 조직에서 얻은 형광물질이 결합된 표적 DNA(ESTs)와 상기 프로브 DNA의 혼성화, 스캐닝 및 이미지 파일 분석단계; 돼지의 성장단계에 따른 근육특이유전자의 발현 프로파일 검색; 및 상기의 근육특이유전자만을 집적한 기능성 cDNA 칩의 제작단계로 구성된다.

본 발명 돼지의 육질 진단 및 특이유전자 검색용 기능성 cDNA 칩은 하기의 단계로 제조됨을 특징으로 한다:

돼지의 근육과 지방조직에서 분리한 총 RNA로부터 PCR을 통해 4434개의 ESTs를 얻고,

DNA 칩 어레이를 이용하여 상기 ESTs를 효모대조군과 함께 슬라이드에 어레이하고,

돼지의 근육과 지방 조직에서 분리한 총 RNA로부터 시아닌 3-dCTP 또는 시아닌 5-dCTP이 결합된 표적 DNA를 제조하고,

상기 슬라이드(프로브 DNA)와 표적 DNA를 혼성화(hybridization)시키고 이를 스캐닝하고 이미지 파일을 분석하여 돼지의 성장단계에 따라 특이적으로 발현되는 근육특이유전자의 발현양상을 조사하고,

상기에서 검색된 돼지의 성장단계에 따른 근육특이유전자만을 집적한 기능성 cDNA 칩을 제작함.

본 발명 돼지의 육질 진단 및 특이유전자 검색용 기능성 cDNA 칩은 돼지의 근육 및 지방 조직에서 특이적으로 발현되는 근육특이유전자로 구성된 프로브 및 상기 프로브가 고정된 기질을 포함함을 특징으로 한다.

본 발명 돼지의 육질 진단 및 특이유전자 검색용 기능성 cDNA 칩의 DNA 마이크로어레이 상에 고착되는 프로브 DNA는 ESM-특이유전자와 ASM-특이유전자를 포함함을 특징으로 한다.

본 발명 돼지의 육질 진단 및 특이유전자 검색용 기능성 cDNA 칩의 DNA 마이크로어레이 상에 고착되는 돼지의 ESM-특이유전자는 액틴, 베타-미오신, 글리코겐 포스포릴라아제, 미오신 헤비 체인, 피루베이트 키나아제 및 트로포닌 C 코딩 유전자를 포함함을 특징으로 한다.

본 발명 돼지의 육질 진단 및 특이유전자 검색용 기능성 cDNA 칩의 DNA 마이크로어레이 상에 고착되는 돼지의 ASM-특이유전자는 1-알파 디네인 헤비 체인, 601446467F1, 피브로넥틴 전구체 및 MHC class I 코딩 유전자를 포함함을 특징으로 한다.

본 발명 기능성 cDNA 칩의 기질은 실리콘 웨이퍼, 유리, 폴리카보네이트, 멤브레인, 폴리스틸렌 또는 폴리우레탄과 같은 고분자 필름이 바람직하다. 본 발명 DNA 마이크로어레이는 통상의 DNA 마이크로어레이 제조방법으로 프로브를 기질에 고정시켜 제조할 수 있으며, 포토리소그래피방법, 압전인쇄방법, 마이크로 피펫팅, 스팟팅 등의 방법을 사용할 수 있으며, 본 발명은 스팟팅 방법을 사용하였다.

본 발명 돼지의 육질 진단 및 특이유전자 검색용 키트는 돼지의 성장단계에 따른 근육특이유전자가 집적된 기능성 cDNA 칩, Cy5-dCTP 또는 Cy3-dCTP과 결합시킨 검색 조직의 RNA에서 얻은 cDNA, 형광스캐닝시스템 및 컴퓨터분석시스템으로 이루어짐을 특징으로 한다.

이하, 본 발명의 구체적인 구성을 실시예를 통해 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1 : 돼지의 성장단계에 따른 근육특이유전자의 발현 프로파일의 검색

돼지의 성장단계에 따라 특이적으로 발현되는 근육특이유전자를 검색하기 위해, 가고시마 버크셔종의 근육과 지방 조직에 분리한 총 RNA로부터 프로브 DNA를 제작하고, 상기 조직의 총 RNA에 형광물질을 결합시켜 표적 DNA를 제작하여 이들을 혼성화 시킨 다음 스캐닝하고 이미지 파일을 분석하여 돼지의 성장단계에 따른 근육특이유전자의 발현 프로파일을 검색하였다.

제조예 1: 프로브 DNA의 제조 및 어레이

우선, 슬라이드글라스에 부착하기 위해 PCR에 의해 증폭된 cDNA인 프로브 DNA를 제작하였다. 가고시마 버크셔종(체중이 30 kg 및 90 kg인 것을 선택함)의 등심부위의 근육 및 지방조직에서 RNA 분리 키트(독일 퀴아젠사)를 사용하여 메뉴얼에 따라 총 RNA를 분리하고 oligo(dT) column을 이용하여 mRNA를 분리하였다. 상기 에서 분리한 mRNA 시료에 SP6, T3 정방향 프라이머, T7 역방향 프라이머(영국 아머샴 파마시아 바이오테크)를 사용하여 RT-PCR을 실시하고 cDNA를 합성하였다. 각 PCR 반응물의 총 부피는 100 ㎕로 하였다. 100 pM의 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 각각을 96-웰 PCR 플레이트(영국 제네틱스)에 옮겼다. 각 웰에는 2.5 mM dNTP, 10×PCR 버퍼, 25 mM MgCl₂, 0.2 ㎍의 DNA 주형, 2.5 유닛의 Taq 폴리머라아제가 포함되게 하였다. PCR은 GeneAmp PCR 시스템 5700(캐나다 AB 어플라이드 바이오시스템)에서 다음의 조건 하에서 실시하였다: 94℃에서 30초, 58℃에서 45초, 72℃에서 1분으로 총 30 사이클.

증폭된 DNA의 크기는 아가로우즈 젤 전기영동에서 확인하였다. PCR 산물을 96-웰 플레이트에서 에탄올 침전을 실시한 후 건조시켜 -20℃에서 저장하였다.

상기에서 준비된 총 4434개의 cDNA(ESTs)를 클로닝하여 돼지가 가지고 있는 유전자의 염기서열을 분석하고, 이들의 정보는 NCBI를 통해 알아내었다. 정보를 가진 유전자들을 다시 PCR을 통해 분리정제한 다음, 총 4434개의 cDNA(ESTs)가 놓여질 자리와 배치도를 만든 후, 총 4434개의 cDNA(ESTs)와 300개의 효모 대조군을 1.7 cm²면적에 배열하였다. 그 후, 마이크로그리드 II(바이오로보틱스)를 이용하여 CMT-GAPSTM 아미노실레인(aminosilane)이 코팅된 현미경용 슬라이드글라스(코닝사 제품)에 프로브 DNA를 점적하였다. 스플릿 핀을 이용하여 마이크로그리드 II(MicroGrid II)로 프로브 DNA를 프린트하였다. 그 후 핀 장치를 마이크로플레이트 내 웰에 접근시켜 상기 용액을 슬라이드글라스에 주입하였다(1~2 nL). 프로브 DNA를 프린팅한 후, 슬라이드를 건조시키고, 점적시킨 DNA와 슬라이드를 스트라타링커TM(미국 스트라타진)을 이용하여 90 mJ에서 UV-크로스링킹으로 결합시키고, 실온에서 2분 동안 0.2% SDS로 두 번 세척하고, 실온에서 2분 동안 3차 증류수로 한번 세척하였다. 세척 후, 슬라이드를 95℃ 수조에 2분 동안 침지시키고, 억제제(blocking solution, pH7.4의 인산염 완충액 300 mL에 1.0 g NaBH₄를 녹인 용액과 무수 에탄올 100 mL를 혼합한 용액)를 첨가하여 15분 동안 차단하였다. 그 후, 상기 슬라이드를 실온에서 1분 동안 0.2% SDS로 3번 세척하고, 실온에서 2분 동안 3차 증류수로 한번 세척하고, 대기 중에서 건조시켰다.

제조예 2: 표적 DNA의 제조 및 혼성화(hybridization)

돼지 근육 및 지방 조직에서 특이적으로 발현되는 근육특이유전자를 검색하기 위한 표적 DNA를 제조하기 위해, 체중 30 kg(ESM, early stage muscle)과 90 kg(ASM, adult stage muscle)의 가고시마 버크셔종(Kagoshima Berkshire)에서 등심부위(longissimus dorsi) 근육조직을 채취하였다. 지방 조직은 체중 30 kg(ESF, early stage fat)의 가고시마 버크셔종에서 얻었다. 근육과 지방조직을 5~8 mm 길이로 자른 다음 액체질소로 냉동시켜 -70℃에서 보관하였다.

표적 DNA를 제조하기 위해 트리졸^TM 키트(라이프 테크놀로지) 매뉴얼에 따라 0.2~1.0 g의 실험군과 대조군 조직에서 총 RNA를 분리하였다. 글래스-테프론 또는 폴리트론 균질기로 조직 50-100 mg 당 1 mL의 트리졸^TM을 조직 시료에 넣고 파쇄하였다. 4℃에서 12,000 g으로 10분 동안 원심분리한 후 상등액을 1 mL씩 분취(aliquot)하였다. 여기에 200 ㎕의 클로로포름을 첨가하고 15초 동안 볼텍싱하고 15분 동안 얼음에 놓아 둔 후 4℃에서 12,000 g로 10분 동안 원심분리하였다. 동량의 클로로포름을 첨가하고 15초 동안 볼텍싱한 후 15분 동안 얼음에 놓아두었다. 이를 4℃에서 12,000 g로 10분 동안 원심분리한 후 상등액을 새 튜브로 옮기고 500 ㎕의 이소프로판올을 첨가하고 볼텍싱하고 얼음에 15분 동안 놓아두었다. 얼음을 냉각시키고 4℃에서 12,000 g 로 5분 동안 원심분리하고 상등액을 분리하고 여기에 75% 냉 에탄올 1 mL을 첨가한 후 4℃에서 12,000 g 로 5분 동안 원심분리하였다. 상등액을 취하여 클린벤취에서 30분 동안 얼음에서 건조시킨 다음 RNase가 제거된 물이나 DEPC 물 20㎕로 RNA를 녹였다. 총 DNA 농도를 40 ㎍/17 ㎕로 하여 전기영동을 준비하였다.

표준 펄스트 스트랜드 cDNA 합성법(standard first-strand cDNA)에 따라 표적 DNA를 얻었다. 간단히 말해, Schuler(1996)의 방법에 따라, 총 RNA 40 ㎍과 올리고 dT-18mer 프라이머(인비트로젠 라이프 테크놀로지)를 혼합하고 이를 65℃에서 10분 동안 가열한 후 4℃에서 5분 간 냉각하였다. 그 후, 1 ㎕의 25 mM dATP, dGTP 및 dTTP 혼합액, 1 ㎕의 1 mM dCTP(프로메가) 및 2 ㎕의 1 mM 시아닌 3-dCTP 혹은 2 ㎕의 1 mM 시아닌 5-dCTP, 20 units의 RNase 저해제(인비트로젠 라이프 테크놀로지), 100 units의 M-MLV RTase, 2 ㎕의 10×펄스트 스트랜드 완충액을 첨가한 후 피펫을 이용하여 혼합하였다. 반응혼합액을 38℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 에탄올 침전에 따라 미결합 상태의 뉴클레오티드를 제거하였다. 이때 사용한 물은 DEPC 처리된 살균수를 사용하였다.

상기에서 제조한 슬라이드에 혼성화 용액(5×SSC, 0.2% SDS, 1 mg/mL 청어 정자 DNA)으로 65℃에서 1시간 동안 미리 혼성화(prehybridization)시켰다. 시아닌 3(Cy-3)와 시아닌 5(Cy-5)로 표지된 표적 DNA는 20 ㎕의 혼성화 용액으로 재현탁하고 95℃에서 2분 동안 변성시켰다. 그 후, 슬라이드와 상기 용액을 65℃에서 밤새도록 혼성화시켰다. 상기 과정은 습윤 챔버에서 커버글라스(그레이스바이오랩)를 덮고 실시하였다.

혼성화 후, 슬라이드는 2×SSC, 0.1% SDS 혼합액으로 실온에서 5분 동안 댄싱 셰이커(Dancing shaker)에서 격렬하게 교반하면서 4번 세척하였다. 그 후, 상기 슬라이드를 0.2×SSC로 5분 동안 2번 세척하고, 0.1×SSC로 실온에서 5분 동안 세척하였다.

상기 슬라이드는 스캔어레이 5000(GSI 루모닉스 버젼 3.1)에서 50 ㎛의 픽셀 사이즈로 스캔하였다. 시아닌 3-dCTP로 표지된 표적 DNA는 565 nm에서 스캔하고, 시아닌 5-dCTP로 표지된 표적 DNA는 670 nm에서 스캔하였다. 2개의 형광강도는 시아닌 3-dCTP, 시아닌 5-dCTP로 표지된 스팟의 선 스캐닝에 따라 표준화하였다. 다시 상기 슬라이드를 스캔어레이 4000XL에서 10 ㎛의 픽셀 사이즈로 스캔하였다. 이로부터 얻은 TIFF 이미지 화일을 퀀트어레이 소프트웨어 버젼 2.1(Quantarray software version 2.1)에서 분석하고, 배경을 자동제거하였다. 각 스팟의 강도는 퀀트어레이에서 마이크로소프트 엑셀로 변환하였다. 그 결과를 표 1과 2에 나타내었다.

미성숙기 근육(ESM, early stage muscle)의 전체적인 유전자 발현 패턴을 성숙기 근육(ASM, adult stage muscle)과 미성숙기 지방(ESF, early stage fat)의 것과 비교하였다. "ESM-특이" 및 "ASM-특이" 유전자는 표 1에 나타내었고, "ESF-특이" 유전자는 표 2에 나타내었다. 20개의 유전자가 ESM에서 보다는 ASM에서 5배 이상 높은 발현을 나타내었다. 또한, 18개의 유전자는 ESM에서 보다는 ESF에서 5 내지 10배 높은 발현을 나타내었다. 또한, ASM에서 보다는 ESM에서 5 내지 10배 높은 발현을 나타내었다.

예측되는 유전자군을 포함하여 ASM-특이 유전자, ESM-특이 유전자, ESF-특이 유전자 중 몇몇은 표 1과 2에 나타내었다.

ESM 과 ASM에서 달리 발현되는 유전자의 발현 비율

ESTs No.	Accession No.†	Description**	유전자발현 비율
			ESM(30)/ASM(90)
세포 구조 및 이동상
SM2149SM781SM635SM713SM106SM1068SM363SM768SMk77SM128SM902SM846SM653SMk340SM1605SM541SM715SM430SM758SM62SM949SM410SM1651SM1050SM491SM1573SMk55SMk338SMk168SM1732SM1691SM690SMk173SM141SMk51SM1043SMk19SMk50SMk57SM1535SM1063	CAB56598NP_033891BAB19361AAA51586P53506AAF20165B25819X52815NM_001100NP_033740BC001748P81287P04272U75316AAF99682NP_000079L47641Q9XSJ7CGHU1SCGHU2VO46392CAA28454XM_039583AAA30521NM_005529XM_044160NP_006462P79293AB025261NP_004678NP_000908NP_003109X66274CAA38179P18342P06469P02587Y00760AAA91854P02554P20152	1-alpha dynein heavy chain19 kDa-interacting protein 3-likeActinActinActinActinActinActinActin, alpha 1Actin, gamma 2Annexin A2Annexin VAnnexin ⅡBeta-myosin heavy chain mRNACalpain large polypeptide L2CollagenCollagenCollagen alpha 1Collagen alpha 1Collagen alpha 2Collagen alpha 2Collagen(alpha V)Discs, large(Drosophila) homolog 5FibronectinHeparan sulfate proteoglycan 2Lamin A/CMyosinMyosin heavy chainMyosin heavy chainMyotubularin related protein 4Procollagen-prolineSecreted protein, acidicTropomyosinTropomyosinTropomyosin alpha chainTropomyosin alpha chainTroponin CTroponin-CTroponin-CTubulin beta chainVimentin	-2.1+2.1+3.4+6.3+8.8+5.3+4.3+3.4+15.1+6.9-3.2-2.8-2.2+3.0+4.7-3.2-6.8-6.8-2.1-3.2-3.3-2.3-2.0-2.4-2.2+2.6+3.9+2.0+9.0+3.8-2.3-4.4+2.6+2.7+9.6+11.5+14.5+19.6+14.6+2.8-5.4

대사
SMk56SM995SMk344SM800SM51SMk151SM2070SMk120SMk147SM928SMk18SMk81SM295SMk346SM36SM887SM698SM723SMk79SMk135SM1033SMk347	AAA37210CAA59331NM_012839AAG53955T10974CAA06313P00339AJ275968X59418O79874AAG28185O19094AB006852M97664TVMVRRP11980S64635P52480U44751Z98820XM_018138X99312	Aldolase ACarbonate dehydrataseCytochrome CCytochrome c oxidase subunit ⅠCytochrome-c oxidaseFructose-1,6-bisphosphataseL-lactate dehydrogenase M chainLIM domains 1 proteinNADH dehydrogenaseNADH-ubiquinone oxidoreductase chain 1NADH4LOctanoyltransferase(COT)Phosphoarginine phosphatasePhosphoglucomutase isoform 2 mRNAProtein-tyrosine kinasePyruvate kinasePyruvate kinasePyruvate kinasePyruvate kinaseSarcolipinTyrosine phosphatase type IVAUDP glucose pyrophosphorylase	+5.5+3.2+3.4+3.0+3.8+7.1+12.7+8.6+2.4+5.3+2.1+3.2+2.6+5.5+4.3+8.5+9.7+7.3+5.2+3.0+2.9+3.0
유전자/단백질 발현
SM75SM1989SMk61SM968SMk91SM2083SM896SM1668SM1784SM1801SM997	U09823AAH05660NP_031959Y00104AAC48501NP_003083AAH01127AAH07512228176AAA3079951077272	Elongation factor 1 alphaElongation factor 1 alpha 1Enolase 3Repetitive dna sequence element RPE-1Reticulum proteinRibonucleoprotein polypeptide BRibosomal proteinRibosomal protein L18aRibosomal protein P0Transfer RNA-Trp synthetaseTranslation initiation factor eif1	-4.3-3.9+3.6-2.5+4.6+3.1+2.0+2.1+6.2+6.0+3.5

세포 신호전달/교환
SM464SM732SMk11SMk187	AJ002189AF304203XM_006515BC007462	Complete mitochondrial DNAMitochondrionPotassium channelSimilar to creatine kinase	+3.9+5.9-2.4+3.5
세포분열
SM1067	XP_007399	Protease, cystein, 1	+3.1
면역반응
SM154SMk1SM401	AF036005AAAG52886AJ251829	Interleukin-2 receptor alpha chainKel-like proteinMHC class I SLA genomic region	-2.5+6.4-3.0
EST
SM824SM1776SM1556	AK023385XM_050494XP_043678	cDNA flj13323 fisKIAA0182 proteinKIAA1096 protein	+2.5+3.6+4.9
미확인
SM1785SM2152SM1469SM908SM851SM1738SM1007SM1920SM1972SM1536SMk137SM1724SM1539SM1474SM1853SM1941SM379SM1911	AC015998BI327422BG938561AAG28205AAG28192CAA19420AAD31021BE421626XP_039195T08758XP_002275XP_016035AT001097BG384994BF198401BE925069AW328623BE872239	AC015998AR078G01iTHYEG01SCn26h08.x1COICOIDJ466P17.1.1(Laforin)Foocen-mHWM012cA.1Hypothetical proteinHypothetical proteinHypothetical proteinHypothetical proteinMandarina libraryMARC 1PIMARC 2PIGMR1-AN0039-290800-004-a01NIH_MGC_4NIH_MGC_65	+2.1-4.0-2.2+2.8+3.6+4.8+3.8+3.3+3.2+4.7+20.0-2.6-2.3+2.6+3.6+4.4+2.3-2.4

미확인
SM1676SM1914SM1650SM1064SM618SM1774SM1690SM1898SM96SM1922SM210	BG548727BG534187BI337009BAB28119BAB28422BAB30715BF864360F23148M17733AAH03026BAA91923	NIH_MGC_77NIH_MGC_77Peripheral Blood Cell cDNA libraryPutativePutativePutativeReinhardtii CC-1690Small intestine cDNA libraryThymosin beta-4 mRNAUnknownUnnamed protein product	+5.1-2.3+9.3+3.4+2.1+3.2+2.2-2.3-4.2+4.0-3.1
일치하지 않음
SM107SM278SM384SMk37SM717SM1598SMk6SMk68SM1100SMk70SMk80SMk112SM1639SMk148SM1665SM1665SMk95SMk133SMk152SM1897SMk138SM1902SMk342SMk181SM904SMk262SM9SM1964SMk335		No matchNo matchNo matchNo matchNo matchNo matchNo matchNo matchNo matchNo matchNo matchNo matchNo matchNo matchNo matchNo matchNo matchNo matchNo matchNo matchNo matchNo matchNo matchNo matchNo matchNo matchNo matchNo matchNo match	-2.4-2.2-2.3+7.7-3.0+4.5+3.8+5.0-2.6+3.9+17.7+3.5-4.0+3.8+3.8+13.0+2.7+2.4+6.4+3.4+10.3+2.1+6.7+11.0-3.4+3.9+2.4+2.6-3.9

†: 일치하는 Accession no.

**: 데이터베이스와 일치하는 정보

No match: 데이터베이스에서 일치하는 정보가 없음; 신규한 EST

ESM: early stage muscle(체중 30 kg), ASM: adult stage muscle(체중 90 kg)

SM: 돼지 근육

표 1에 나타난 바와 같이, ASM에서 발현되고, 표 1에서 동정되고 기능면에서 잘 알려져 있는 14개의 유전자들은 아직 정확하게 측정된 적이 없었다. 이들 유전자들로는 액틴 알파 1, 트로포미오신 알파 체인, 알돌라아제 A, 프룩토우즈-1,6-비스포스파타아제, NADH-유비퀴논 옥시도리덕타아제 체인 1, 포스포글루코뮤타아제 이소폼 1 mRNA, 피루베이트 키나아제, 미토콘드리온, 켈 유사 단백질이 있다(표 2). 마이크로필라멘트로 구성되어 있는 액틴 사이토스켈레톤는 진핵세포에서 세포 내외 운동 및 구조 지지 기능을 포함하여 다양한 역할들을 담당하고 있다. 액틴은 단량체(G-액틴) 또는 실모양(F-액틴)으로써 존재한다. F-액틴은 마이크로필라멘트의 주 성분이다. 다수의 단백질들이 마이크로필라멘트의 길이, 위치 및 변형을 조절하고 있다. 액틴 사이토스켈레톤은 자극에 대한 반응과 세포주기진행 시 재빨리 모양과 구조를 변형시키는 유동적 구조이다. 액틴 사이토스켈레톤의 구조는 고정되어 있지 않고 세포 환경에 반응하여 변한다. 트로포닌 복합체(troponin-I, -T 및 C)와 결합되어 있는 트로포미오신은 척추동물의 선근육의 수축 시 Ca²⁺ 의존적 조절에서 중추적인 역할을 담당하고 있다. 트로포미오신은 이량체로 된 알파 코일드 코일 구조를 갖는 단백질군과 가깝게 연결되어 있다. 포유동물의 PEP에서 ADP로의 트랜스포스포릴레이션(transphosphorylation) 을 촉매하는 피루베이트 키나아제는 주요 조절효소이며, 대사경로의 조절 특징들은 경로 작동 시 다른 조직에서 필요로 하는 다양한 대사적 요구에 밀접하게 관여하므로 본 발명자는 이를 조사 대상으로 삼았다.

또한, ESM에서 발현되고 표 1과 2에서 동정되고 기능이 잘 알려져 있는 5개의 유전자들은 아직 정확하게 측정된 적이 없었다. 이들 유전자들로는 콜라겐, 디스크/라지 호몰로그 5(초파리), 산성의 분비 단백질, 비멘틴이 있다. 콜라겐은 세포외 매트릭스의 주 성분이며, 적어도 18종의 이종 거대 단백질군으로 이루어져 있다. 이들은 배 발생과정과 다양한 형태분화과정 동안 세포분열, 증식, 이주 및 부착 시 관찰되며, 주변의 세포외 매트릭스의 세포상호작용에 의해 부분적으로 조절된다. 비멘틴 코딩 유전자(Vim)의 발현은 백혈구의대식세포로의 분화과정에서 일어나는 일련의 유전적 사건들을 거친 후 나타나는 말기 표지인자(terminal marker) 중 하나이다. 따라서, Vim의 전사조절메카니즘의 평가는 백혈구 분화에 관여하는 유전적 조절 경로를 이해하는데 중요한 단계일 것이다.

ESM 과 ESF 에서 달리 발현되는 유전자의 발현 비율

ESTs No.	Accession No.†	Description**	유전자발현 비율
			ESF(30)/ESM(30)
세포 구조 및 이동상
SM2149SM781SM1068SM635SM106SM768SM363SM713SMk77SM128SM1091SM902SM846SM653SMk340SM1807SM541SM715SM1023SM758SM62SM949SM410SM1121SM53SM1651SM1050SM381SM122SM1573SMk55SMk168SM1732SM690SM1043SMk173SMk19SMk57SMk50SM1535SM1063SM730	CAB56598NP_033891AAF20165BAB19361P53506X52815B25819AAA51586NM_001100NP_033740JC5971BC001748P81287P04272U75316AAF99682NP_000079L47641Q9XSJ7CGHU1SCGHU2VO46392CAA28454NM_000393NP_000384XM_039583AAA30521FNHUP07589XM_044160NP_006462AB025261NP_004678NP_003109P06469X66274P02587AAA91854Y00760P02554P20152CAA69019	1-alpha dynein heavy chain19 kDa-interacting protein 3-likeActinActinActinActinActinActinActin, alpha 1Actin, gamma 2Alpha-b crystallinAnnexin A2Annexin VAnnexin ⅡBeta-myosin heavy chain mRNACalpain large polypeptide L2CollagenCollagenCollagen alpha 1Collagen alpha 1Collagen alpha 2Collagen alpha 2Collagen(alpha V)Collagen, type V, alpha 2Collagen, type V, alpha 2Discs, large(Drosophila) homolog 5FibronectinFibronectin precursorFibronectin(FN)Lamin A/CMyosinMyosin heavy chainMyotubularin related protein 4Secreted protein, acidicTropomyosin alpha chainTropomysinTroponin CTroponin-CTroponin-CTubulin beta chainVimentinVimentin	-2.1+2.2+4.5+2.6+4.9+2.4+3.7+5.6+4.5+3.9+2.1-4.2-3.5-2.3+2.2+2.7-4.9-5.2-4.6-4.3-4.4-3.2-2.3-2.8-2.5-8.6-3.1-2.6-2.5+2.1+3.6+5.0+4.7-5.2+8.6+2.2+6.9+7.1+9.0+3.3-5.1-3.2

ESTs No.	Accession No.†	Description**	유전자발현 비율
ESTs No.	Accession No.†	Description**	ESF(30)/ESM(30)
대사
SMk344SM800SMk151SMk254SM2070SM928SMk81SM295SMk346SM36SM723SM698SM887SM1594SM1033	NM_012839AAG53955CAA06313231300P00339O79874O19094AB006852M97664TVMVRRP52480S64635P11980AAA62278XM_018138	Cytochrome CCytochrome c oxidase subunit ⅠFructose-1,6-bisphosphataseGlycogen Phosphorylase bL-lactate dehydrogenase M chainNADH-ubiquinone oxidoreductase chain 1Octanoyltransferase(COT)Phosphoarginine phosphatasePhosphoglucomutase isoform 2 mRNAProtein-tyrosine kinasePyruvate kinasePyruvate kinasePyruvate kinaseSuperoxide dismutaseTyrosine phosphatase type IVA	+2.4+2.9+4.2+2.6+10.6+3.2+3.9+2.3+3.3+2.6+7.5+6.6+6.3-3.2+2.2
유전자/단백질 발현
SM75SM1989SMk120SMk91SM2083SM21SM1784SM1820SM1801SM997	U09823AAH05660AJ275968AAC48501NP_003083NP_000994228176BC014277AAA3079951077272	Elongation factor 1 alphaElongation factor 1 alpha 1LIM domains 1 proteinReticulum proteinRibonucleoprotein polypeptide BRibosomalRibosomal protein P0Tissue inhibitor of metalloproteinase 3Transfer RNA-Trp synthetaseTranslation initiation factor eif1	-3.7-3.8+9.9+2.1+3.2+2.2+5.5-2.6+5.7+2.3
세포 신호전달/교환
SM464	AJ002189	Complete mitochondrial DNA	+2.7
면역반응
SMk1	AAG52886	Kel-like protein 23	+4.6
미확인
SM2152SMk3SM908SM1738SM1007SM1724SMk137SM1972SM787SM1474SM1676	BI327422AL13277AAG28205CAA19420AAD31021XP_016035XP_002275XP_039195AF192528BG384994BG548727	AR078G01iTHYEG01SChromosome 14 DNA sequenceCOIDJ466P17.1.1(Laforin)Foocen-mHypothetical proteinHypothetical proteinHypothetical proteinIntegrin beta-1 subunitMARC 1PINIH_MGC_77	-5.5+2.3+2.2+3.5+3.0-2.6+10.0+2.8+2.0+2.8+2.3

ESTs No.	Accession No.†	Description**	유전자발현 비율
			ESF(30)/ESM(30)
미확인
SM1650SM1774SM1064SM1690SM96SM1922	BI337009BAB30715BAB28119BF864360M17733AAH03026	Peripheral Blood Cell cDNA libraryPutativePutativeReinhardtii CC-1690Thymosin beta-4 mRNAUnknown	+7.3+5.1+3.0+2.5-3.9+4.7
일치하지 않음
SMk58SM717SMk6SMk68SMk80SMk112SM1639SMk148SM1665SMk95SMk152SM1897SMk138SM796SMk342SMk181SM904SMk262SM9SM1964SMk335		No matchNo matchNo matchNo matchNo matchNo matchNo matchNo matchNo matchNo matchNo matchNo matchNo matchNo matchNo matchNo matchNo matchNo matchNo matchNo matchNo match	+2.9-4.4+2.4+3.2+4.3+2.1-2.8+2.9+9.8+2.1+6.4+2.6+3.1-2.2+3.9+4.4-2.7+2.7+2.9+2.6+3.8

†: 일치하는 accession no.

**: 데이터베이스와 일치하는 정보

No match: 데이터베이스에서 일치하는 정보가 없음; 신규한 EST

ESM: early stage muscle(체중 30 kg), ESF: early stage fat(체중 30 kg)

SM: 돼지 근육

표 2에 나타난 바와 같이, 13개의 유전자들로는 ESF에서 발현되는 트로포닌-C, L-락테이트 디하이드로게나아제 M 체인, LIM 도메인 1 단백질, 피루베이트 키나아제, 리보좀 단백질 P0, 트랜스퍼 RNA-Trp 신타아제가 있다. M1형과 M2형 이소자임을 코딩하는 인간의 피루베이트 키나아제 M(PKM) 유전자를 포함하는 게놈 클론을 분리한 후 그들의 엑손 염기서열을 측정하였다. 상기 유전자는 대략 32 kb이며, 12개의 엑손과 11개의 인트론으로 구성되어 있다. 엑손 9와 10은 각각 M1과 M2형에 특이적인 염기서열을 포함하고 있으며, 이는 인간의 이소자임이 쥐의 유전자의 경우처럼 선택적 스플라이싱에 의해 동일한 유전자로부터 생산됨을 말하는 것이다. 4½LIM 도메인 단백질 1(FHL1)은 초기에는 4개의 LIM 도메인과 징크 핑거와 같은 GATA 1개를 갖는 풍부한 골격 근육 단백질로써 쓰였다. FHL1은 다양한 조직에서 뿐만 아니라 골격 근육에서 발현되는 것으로 보였다. 최근에, 선택적으로 삽입된 FHL1 mRNA가 C-말단이 잘린 단백질을 코딩하는 것으로 확인되었다. FHL1C는 새로이 확인된 시작 코돈에 의해 결과적으로 돼지의 골격 근육에서 16개의 아미노산으로 된 N-말단을 생산함이 알려지게 되었다. 상기 결과로부터 이들 유전자들은 육질과 관련된 후보 유전자로 평가하였다.

결과적으로, 발현율은 ESM vs ASM 및 ESM vs ESF에서 확인된 유전자들에 대해 2배 이상으로 측정되었다. cDNA 마이크로어레이 분석을 통해 유의하게 과다발현되는 총 128개의 유전자를 확인하였다. 액틴, 베타-미오신, 글리코겐 포스포릴라아제, 미오신 헤비 체인, 신규한 유전자들, 피루베이트 키나아제, 트로포닌 C는 ESM에서 특이적으로 발현되었다. 콜라겐, 피브로넥틴, 메탈로프로티나아제 3의 억제제, 인터그린 베타-1 서브유닛은 ESF에서 특이적으로 발현되었다. 1-알파 디네인 헤비 체인, 601446467F1, 가상 단백질, 피브로넥틴 전구체, MHC class I, 신규한 유전자들, 익명의 단백질 산물들은 ASM에서 특이적으로 발현되었다. 이들 유전자들은 육질과 관련된 후보 유전자들로 평가하였다. 또한, 본 발명자는 앞으로 보다 많은 유전자 기능을 연구함으로써 고육질의 돼지를 육성할 것이다.

실시예 2: 본 발명 돼지의 육질 진단 및 특이유전자 검색용 기능성 cDNA 칩의 제작

상기 실시예 1에서 검색된 돼지의 성장단계에 따른 근육특이유전자로 ESM-특이유전자인 액틴, 베타-미오신, 글리코겐 포스포릴라아제, 미오신 헤비 체인, 신규한 유전자들, 피루베이트 키나아제 및 트로포닌 C 코딩 유전자과 ASM-특이유전자인 1-알파 디네인 헤비 체인, 601446467F1, 피브로넥틴 전구체 및 MHC class I 코딩 유전자를 DNA 마이크로어레이 상에 고착시켜 제조예 1의 방법에 따라 돼지의 육질 진단 및 특이유전자 검색용 기능성 cDNA 칩을 제작하였다.

실시예 3: 본 발명 돼지의 육질 진단 및 특이유전자 검색용 키트의 제작

상기 실시예 2에서 제작된 기능성 cDNA 칩, Cy5-dCTP 또는 Cy3-dCTP과 결합시킨 검색 조직의 RNA에서 얻은 cDNA, 형광스캐닝시스템 및 컴퓨터분석시스템으로 이루어진 돼지의 육질 진단 및 특이유전자 검색용 키트를 제작하였다.

상기 실시예를 통하여 살펴본 바와 같이, 본 발명은 돼지의 성장단계별 근육특이유전자의 발현 프로파일의 검색 및 이를 이용한 기능성 cDNA 칩에 관한 것으로, 본 발명은 돼지의 근육과 지방 조직에서 성장단계에 따라 특이적으로 발현되는 근육특이유전자의 발현 프로파일을 제공하는 뛰어난 효과가 있다. 또한, 본 발명은 상기에서 검색된 근육특이유전자만을 집적하여 제조된 돼지의 육질 진단 및 특이유전자 검색용 기능성 cDNA 칩을 제공하는 뛰어난 효과가 있다. 따라서, 본 발명의 기능성 cDNA 칩을 이용하여 돼지 품종별 육질의 평가 및 고육질의 돼지를 육성하는데 응용될 수 있으므로 양돈산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

돼지의 근육 및 지방 조직에서 특이적으로 발현되는 근육특이유전자로 구성된 프로브 및 상기 프로브가 고정된 기질을 포함하는 돼지의 육질 진단 및 특이유전자 검색용 기능성 cDNA 칩.
제 1항에 있어서, 상기 프로브 DNA는 ESM-특이유전자와 ASM-특이유전자를 포함함을 특징으로 하는 돼지의 육질 진단 및 특이유전자 검색용 기능성 cDNA 칩.
제 2항에 있어서, 상기 ESM-특이유전자는 액틴, 베타-미오신, 글리코겐 포스포릴라아제, 미오신 헤비 체인, 피루베이트 키나아제 및 트로포닌 C 코딩 유전자를 포함함을 특징으로 하는 돼지의 육질 진단 및 특이유전자 검색용 기능성 cDNA 칩.
제 2항에 있어서, 상기 ASM-특이유전자는 1-알파 디네인 헤비 체인, 601446467F1, 피브로넥틴 전구체 및 MHC class I 코딩 유전자를 포함함을 특징으로 하는 돼지의 육질 진단 및 특이유전자 검색용 기능성 cDNA 칩.
제 1항 기재의 돼지의 성장단계에 따른 근육특이유전자가 집적된 기능성 cDNA 칩, Cy5-dCTP 또는 Cy3-dCTP과 결합시킨 검색 조직의 RNA에서 얻은 cDNA, 형광스캐닝시스템 및 컴퓨터분석시스템으로 이루어짐을 특징으로 하는 돼지의 육질 진단 및 특이유전자 검색용 키트.