KR20050049893A - 돼지 유래의 신규한 성장특이유전자의 염기서열 - Google Patents
돼지 유래의 신규한 성장특이유전자의 염기서열 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20050049893A KR20050049893A KR1020030083652A KR20030083652A KR20050049893A KR 20050049893 A KR20050049893 A KR 20050049893A KR 1020030083652 A KR1020030083652 A KR 1020030083652A KR 20030083652 A KR20030083652 A KR 20030083652A KR 20050049893 A KR20050049893 A KR 20050049893A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- growth
- pigs
- dna
- minutes
- pig
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 47
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 title description 19
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 abstract description 23
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 6
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 abstract description 5
- 238000009395 breeding Methods 0.000 abstract description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 abstract description 3
- 235000021051 daily weight gain Nutrition 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 32
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 15
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 14
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 13
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical group O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical group [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101100532034 Drosophila melanogaster RTase gene Proteins 0.000 description 1
- 101150062179 II gene Proteins 0.000 description 1
- 101150098499 III gene Proteins 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 244000144980 herd Species 0.000 description 1
- 229940094991 herring sperm dna Drugs 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 238000012775 microarray technology Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012882 sequential analysis Methods 0.000 description 1
- FZHAPNGMFPVSLP-UHFFFAOYSA-N silanamine Chemical compound [SiH3]N FZHAPNGMFPVSLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 돼지 유래의 신규한 성장특이유전자에 관한 것으로, DNA 마이크로어레이 기술을 이용하여 돼지의 성장율을 증가시키는 데 관여하는 신규한 성장특이유전자를 제공하는 뛰어난 효과가 있다. 따라서, 본 발명 돼지의 성장특이유전자를 사료 등에 이용하여 돼지의 일당증체량을 증가시키거나 성장능력이 우수한 종돈개량에 응용할 수 있다.
Description
본 발명은 돼지 유래의 신규한 성장특이유전자에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 본 발명은 돼지의 근육 및 지방조직에서 특이적으로 발현되는 신규한 성장특이유전자의 염기서열에 관한 것이다.
분자생물학의 발전은 가축의 유전육종분야에도 막대한 영향을 미치게 되어 돼지의 유전자 연관지도(genetic linkage map)와 양적형질 지도(quantitative trait loci, QTL map) 작성에 있어서도 많은 발전을 가져왔다. 특히 경제형질과 연관된 QTL의 맵핑(mapping)이나 여러 형질에 영향을 미칠 것으로 추정되고 있는 후보유전자(candidate gene)들을 발견하여 양돈산업에도 직접적인 응용이 가능하게 되었다. 현재까지 돼지의 게놈 맵핑은 세계적으로 공식화된 PiGMaP(Internetional Pig Genome Mapping Project) consortium map (Archibald 등, 1995)과 USDA(United States Department of Agriculture) gene map(Rohrer 등, 1994) 등과 같은 협동 연구가들에 의해 마커와 유전자가 결합된 약 1,800개의 마커를 확보하여 돼지의 연관지도를 작성하고 있다(Archibald, 1994; Marklund 등, 1996; Rohrer 등, 1996). 또한 최근에는 QTL 스캔(scan)을 통해 경제적으로 중요한 형질에 대한 연관 DNA 마커를 확인하는 연구도 활발하게 진행되고 있다(Nielsen 등, 1996)
돼지의 유전자 지도의 작성은 양적형질과 연관된 특이적 마커를 식별하는데 있어 중요한 과정인데(Andersson 등, 1994; Archibald, 1994; Schook 등, 1994), 돼지의 6번 염색체상에 존재하는 마커와 경제적으로 중요한 성장형질 또는 도체형질간의 연관성에 근거하여 유전적 연관지도를 작성하게 되었다(Clamp 등, 1992; Louis 등, 1994; Chevaletn 등, 1996).
돼지의 개량목표의 대상이 되는 형질은 복당산자수, 육돈의 성장률, 사료효율, 등지방층과 관련된 도체율과 정육율의 증가이다. 일반적으로 일당증체량과 사료효율간의 유전상관계수는 매우 높아 돼지의 성장률을 개량하면 사료이용도 동시에 개량된다. 사료를 제한 급여시킬 때 일당증체량의 유전력은 0.14∼0.76으로서 평균 0.30이며, 이때 일당증체량과 사료효율간의 유전상관계수는 -1.07 ∼-0.93로서 평균 -1.0으로 보고하여 일당증체량과 사료효율 간에는 매우 높은 상관관계가 있다는 것을 알 수 있다. 그러므로 일당증체량은 비육돈의 증체능력을 나타내는 중요한 형질이 된다.
종래에는 돼지에 존재하는 유전적 차이를 시험하기 위해 노던 블랏팅, 디퍼렌셜 디스플레이, 유전자 발현의 순차적 분석 및 닷 블랏 분석과 같은 mRNA 수준에서 유전자 발현을 분석하는 몇몇 기술들이 사용되었지만, 이들 방법들은 다수의 발현 산물들을 동시에 분석하는데 있어서는 부적절한 단점을 가지고 있었다. 최근에는 이러한 단점들을 보완하기 위해 cDNA 마이크로어레이와 같은 신기술이 개발되었다. cDNA 마이크로어레이는 많은 생물들에서 유전자 발현을 연구함에 있어 가장 강력한 수단이 되고 있다. 이 기술은 폴리몰피즘 스크리닝과 유전체 DNA 클론의 맵핑 뿐만 아니라 수많은 유전자들의 동시 발현과 대규모의 유전자 발견에 적용되었다. 이미 알려져 있거나 혹은 미확인의 유전자들로부터 전사된 RNA을 정량적으로 분석하는 고도의 RNA 발현 분석 기술인 것이다.
상기로부터 본 발명자는 돼지의 특정 조직에서 성장에 관여하는 유전자의 발현 프로파일을 검색함에 있어 cDNA 마이크로어레이 기술을 도입하고 이로부터 밝혀진 특이유전자를 이용하여 성장능력이 우수한 종돈 개량에 응용하고자 하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 돼지의 근육과 지방 조직에서 분리한 총 RNA로부터 제작한 프로브를 집적한 기질에 돼지의 근육과 지방 조직에서 얻은 표적 DNA를 혼성화시켜 성장에 관여하는 특이유전자의 발현 프로파일을 검색하고자 한다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기에서 검색된 특이유전자를 시퀀싱하여 유전자의 염기서열을 제공하고자 한다.
본 발명의 상기 목적은 돼지의 근육과 지방 조직에서 분리한 총 RNA로부터 PCR을 통해 수천개의 ESTs를 얻고 이를 클로닝하여 염기서열을 데이터베이스에서 분석 및 검색하고, PCR를 통해 상기 ESTs를 증폭한 후 분리 정제하여 DNA 칩 어레이를 이용하여 대조군과 함께 슬라이드에 어레이한 다음, 성장특이유전자의 발현 프로파일을 검색하기 위해 돼지의 근육과 지방 조직에서 분리한 총 RNA로부터 표적 DNA를 제조하고, 상기 슬라이드(프로브 DNA)와 표적 DNA를 혼성화(hybridization)시킨 다음, 이를 스캐닝하고 이미지 파일을 분석하여 돼지의 성장에 관여하는 특이유전자의 발현양상을 조사한 후, 이를 시퀀싱하여 상기 유전자의 염기서열을 밝힘으로써 달성하였다.
이하, 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 돼지의 근육과 지방 조직에서 ESTs의 확보 및 염기서열 정보 확인단계; 상기 ESTs를 이용하여 프로브 DNA 제조단계; 돼지의 근육과 지방 조직에서 얻은 형광물질이 결합된 표적 DNA(ESTs)와 상기 프로브 DNA의 혼성화, 스캐닝 및 이미지 파일 분석단계; 돼지의 성장에 관여하는 특이유전자의 발현 프로파일 검색단계; 및 상기 유전자의 시퀀싱단계로 구성된다.
본 발명 돼지의 성장에 관여하는 신규한 특이유전자는 하기의 단계로부터 검색된다:
돼지의 근육과 지방조직에서 분리한 총 RNA로부터 PCR을 통해 4434개의 ESTs를 얻고,
DNA 칩 어레이를 이용하여 상기 ESTs를 효모대조군과 함께 슬라이드에 어레이하고,
돼지의 근육과 지방 조직에서 분리한 총 RNA로부터 시아닌 3-dCTP 또는 시아닌 5-dCTP이 결합된 표적 DNA를 제조하고,
상기 슬라이드(프로브 DNA)와 표적 DNA를 혼성화(hybridization)시키고 이를 스캐닝하고 이미지 파일을 분석하여 돼지의 성장에 관여하는 특이유전자의 발현양상을 조사하고,
상기 유전자를 시퀀싱하여 염기서열을 밝혀냄.
본 발명은 돼지의 성장에 관여하는 특이유전자인 서열목록 서열 1 내지 5에 기재된 신규한 성장인자 I, II, III, IV 및 V 의 염기서열을 제공한다.
이하, 본 발명의 구체적인 구성을 실시예를 통해 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1 : 돼지의 성장에 관여하는 특이유전자의 발현 프로파일의 검색
돼지의 성장에 관여하는 특이유전자의 발현 프로파일을 검색하기 위해, 가고시마 버크셔종의 근육과 지방 조직에 분리한 총 RNA로부터 프로브 DNA를 제작하고, 상기 조직의 총 RNA에 형광물질을 결합시켜 표적 DNA를 제작하여 이들을 혼성화시킨 다음 스캐닝하고 이미지 파일을 분석하여 돼지의 성장에 관여하는 특이유전자를 검색하고 이를 클로닝하여 염기서열을 밝혀내었다.
제조예 1: 프로브 DNA의 제조 및 어레이
우선, 슬라이드글라스에 부착하기 위해 PCR에 의해 증폭된 cDNA인 프로브 DNA를 제작하였다. 가고시마 버크셔종(체중이 30 kg 및 90 kg인 것을 선택함)의 등심부위의 근육 및 지방조직에서 RNA 분리 키트(독일 퀴아젠사)를 사용하여 메뉴얼에 따라 총 RNA를 분리하고 oligo(dT) column을 이용하여 mRNA를 분리하였다. 상기에서 분리한 mRNA 시료에 SP6, T3 정방향 프라이머, T7 역방향 프라이머(영국 아머샴 파마시아 바이오테크)를 사용하여 RT-PCR을 실시하고 cDNA를 합성하였다. 각 PCR 반응물의 총 부피는 100 ㎕로 하였다. 100 pM의 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 각각을 96-웰 PCR 플레이트(영국 제네틱스)에 옮겼다. 각 웰에는 2.5 mM dNTP, 10×PCR 버퍼, 25 mM MgCl2, 0.2 ㎍의 DNA 주형, 2.5 유닛의 Taq 폴리머라아제가 포함되게 하였다. PCR은 GeneAmp PCR 시스템 5700(캐나다 AB 어플라이드 바이오시스템)에서 다음의 조건 하에서 실시하였다: 94℃에서 30초, 58℃에서 45초, 72℃에서 1분으로 총 30 사이클.
증폭된 DNA의 크기는 아가로우즈 젤 전기영동에서 확인하였다. PCR 산물을 96-웰 플레이트에서 에탄올 침전을 실시한 후 건조시켜 -20℃에서 저장하였다.
상기에서 준비된 총 4434개의 cDNA(ESTs)를 클로닝하여 돼지가 가지고 있는 유전자의 염기서열을 분석하고, 이들의 정보는 NCBI를 통해 알아내었다. 정보를 가진 유전자들을 다시 PCR을 통해 분리정제한 다음, 총 4434개의 cDNA(ESTs)가 놓여질 자리와 배치도를 만든 후, 총 4434개의 cDNA(ESTs)와 300개의 효모 대조군을 1.7 cm2 면적에 배열하였다. 그 후, 마이크로그리드 II(바이오로보틱스)를 이용하여 CMT-GAPSTM 아미노실레인(aminosilane)이 코팅된 현미경용 슬라이드글라스(코닝사 제품)에 프로브 DNA를 점적하였다. 스플릿 핀을 이용하여 마이크로그리드 II(MicroGrid II)로 프로브 DNA를 프린트하였다. 그 후 핀 장치를 마이크로플레이트 내 웰에 접근시켜 상기 용액을 슬라이드글라스에 주입하였다(1~2 nL). 프로브 DNA를 프린팅한 후, 슬라이드를 건조시키고, 점적시킨 DNA와 슬라이드를 스트라타링커TM(미국 스트라타진)을 이용하여 90 mJ에서 UV-크로스링킹으로 결합시키고, 실온에서 2분 동안 0.2% SDS로 두 번 세척하고, 실온에서 2분 동안 3차 증류수로 한번 세척하였다. 세척 후, 슬라이드를 95℃ 수조에 2분 동안 침지시키고, 억제제(blocking solution, pH7.4의 인산염 완충액 300 mL에 1.0 g NaBH4를 녹인 용액과 무수 에탄올 100 mL를 혼합한 용액)를 첨가하여 15분 동안 차단하였다. 그 후, 상기 슬라이드를 실온에서 1분 동안 0.2% SDS로 3번 세척하고, 실온에서 2분 동안 3차 증류수로 한번 세척하고, 대기 중에서 건조시켰다.
제조예 2: 표적 DNA의 제조 및 혼성화(hybridization)
돼지 근육 및 지방 조직에서 성장에 관여하는 특이유전자를 검색하기 위한 표적 DNA를 제조하기 위해, 체중 30 kg과 90 kg의 가고시마 버크셔종(Kagoshima Berkshire)에서 등심부위(longissimus dorsi) 근육조직을 채취하였다. 지방 조직은 체중 30 kg의 가고시마 버크셔종에서 얻었다. 근육과 지방조직을 5~8 mm 길이로 자른 다음 액체질소로 냉동시켜 -70℃에서 보관하였다.
표적 DNA를 제조하기 위해 트리졸TM 키트(라이프 테크놀로지) 매뉴얼에 따라 0.2~1.0 g의 실험군과 대조군 조직에서 총 RNA를 분리하였다. 글래스-테프론 또는 폴리트론 균질기로 조직 50-100 mg 당 1 mL의 트리졸TM을 조직 시료에 넣고 파쇄하였다. 4℃에서 12,000 g으로 10분 동안 원심분리한 후 상등액을 1 mL씩 분취(aliquot)하였다. 여기에 200 ㎕의 클로로포름을 첨가하고 15초 동안 볼텍싱하고 15분 동안 얼음에 놓아 둔 후 4℃에서 12,000 g로 10분 동안 원심분리하였다. 동량의 클로로포름을 첨가하고 15초 동안 볼텍싱한 후 15분 동안 얼음에 놓아두었다. 이를 4℃에서 12,000 g로 10분 동안 원심분리한 후 상등액을 새 튜브로 옮기고 500 ㎕의 이소프로판올을 첨가하고 볼텍싱하고 얼음에 15분 동안 놓아두었다. 얼음을 냉각시키고 4℃에서 12,000 g 로 5분 동안 원심분리하고 상등액을 분리하고 여기에 75% 냉 에탄올 1 mL을 첨가한 후 4℃에서 12,000 g 로 5분 동안 원심분리하였다. 상등액을 취하여 클린벤취에서 30분 동안 얼음에서 건조시킨 다음 RNase가 제거된 물이나 DEPC 물 20㎕로 RNA를 녹였다. 총 DNA 농도를 40 ㎍/17 ㎕로 하여 전기영동을 준비하였다.
표준 펄스트 스트랜드 cDNA 합성법(standard first-strand cDNA)에 따라 표적 DNA를 얻었다. 간단히 말해, Schuler(1996)의 방법에 따라, 총 RNA 40 ㎍과 올리고 dT-18mer 프라이머(인비트로젠 라이프 테크놀로지)를 혼합하고 이를 65℃에서 10분 동안 가열한 후 4℃에서 5분 간 냉각하였다. 그 후, 1 ㎕의 25 mM dATP, dGTP 및 dTTP 혼합액, 1 ㎕의 1 mM dCTP(프로메가) 및 2 ㎕의 1 mM 시아닌 3-dCTP 혹은 2 ㎕의 1 mM 시아닌 5-dCTP, 20 units의 RNase 저해제(인비트로젠 라이프 테크놀로지), 100 units의 M-MLV RTase, 2 ㎕의 10×펄스트 스트랜드 완충액을 첨가한 후 피펫을 이용하여 혼합하였다. 반응혼합액을 38℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 에탄올 침전에 따라 미결합 상태의 뉴클레오티드를 제거하였다. 이때 사용한 물은 DEPC 처리된 살균수를 사용하였다.
상기에서 제조한 슬라이드에 혼성화 용액(5×SSC, 0.2% SDS, 1 mg/mL 청어 정자 DNA)으로 65℃에서 1시간 동안 미리 혼성화(prehybridization)시켰다. 시아닌 3(Cy-3)와 시아닌 5(Cy-5)로 표지된 표적 DNA는 20 ㎕의 혼성화 용액으로 재현탁하고 95℃에서 2분 동안 변성시켰다. 그 후, 슬라이드와 상기 용액을 65℃에서 밤새도록 혼성화시켰다. 상기 과정은 습윤 챔버에서 커버글라스(그레이스바이오랩)를 덮고 실시하였다.
혼성화 후, 슬라이드는 2×SSC, 0.1% SDS 혼합액으로 실온에서 5분 동안 댄싱 셰이커(Dancing shaker)에서 격렬하게 교반하면서 4번 세척하였다. 그 후, 상기 슬라이드를 0.2×SSC로 5분 동안 2번 세척하고, 0.1×SSC로 실온에서 5분 동안 세척하였다.
상기 슬라이드는 스캔어레이 5000(GSI 루모닉스 버젼 3.1)에서 50 ㎛의 픽셀 사이즈로 스캔하였다. 시아닌 3-dCTP로 표지된 표적 DNA는 565 nm에서 스캔하고, 시아닌 5-dCTP로 표지된 표적 DNA는 670 nm에서 스캔하였다. 2개의 형광강도는 시아닌 3-dCTP, 시아닌 5-dCTP로 표지된 스팟의 선 스캐닝에 따라 표준화하였다. 다시 상기 슬라이드를 스캔어레이 4000XL에서 10 ㎛의 픽셀 사이즈로 스캔하였다. 이로부터 얻은 TIFF 이미지 화일을 퀀트어레이 소프트웨어 버젼 2.1(Quantarray software version 2.1)에서 분석하고, 배경을 자동제거하였다. 각 스팟의 강도는 퀀트어레이에서 마이크로소프트 엑셀로 변환하였다.
그 결과, 하기 5개의 신규한 성장특이유전자를 밝혀내었다.
1. GF(growth factor)Ⅰgene: 서열목록 서열 1
2. GF(growth factor)Ⅱgene: 서열목록 서열 2
3. GF(growth factor)Ⅲ gene: 서열목록 서열 3
4. GF(growth factor)Ⅳgene: 서열목록 서열 4
5. GF(growth factor)Ⅴgene: 서열목록 서열 5
상기 결과로부터, 본 발명은 돼지의 근육 및 지방조직에서 성장에 관여하는 신규한 특이유전자의 염기서열을 밝혀냄으로써, 이들 특이유전자들을 이용하여 성장능력이 우수한 종돈을 개량하는데 사용가능하며, 상기 유전자들을 이용한 유전자 기능분석용 DNA 칩의 개발이 가능하며, 돼지 품종별 및 조직별 성장유전자의 발현 차이를 비교할 수 있고, 상기 유전자를 이용한 사료 등을 제조하여 돼지의 일당증체량을 증가시켜 농가의 소득 향상에 이바지할 수 있는 기반을 마련한 것이다.
상기 실시예를 통하여 살펴본 바와 같이, 본 발명은 돼지 유래의 신규한 성장특이유전자에 관한 것으로 DNA 마이크로어레이 기술을 이용항여 돼지의 성장율을 증가시키는 데 관여하는 신규한 성장특이유전자를 제공하는 뛰어난 효과가 있다. 따라서, 본 발명 돼지의 성장특이유전자를 사료 등에 이용하여 돼지의 일당증체량을 증가시키거나 성장능력이 우수한 종돈개량에 응용할 수 있으므로 양돈산업상 매우 유용한 발명인 것이다.
<110> KIM, Chulwook
Gyeongsangnam-do
<120> Novel growth related genes from swine
<160> 5
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 660
<212> DNA
<213> Kagoshima Berkshire
<400> 1
gagaccagca aatactatgt gaccatcatt gatgccccag gacacagaga cttcatcaaa 60
aacatgatta caggcacatc ccaggctgac tgtgctgtcc tgattgttgc tgctggtgtt 120
ggtgaatttg aagctggtat ctccaagaac gggcagaccc gcgagcatgc tcttctggct 180
tacaccctgg gtgtgaaaca gctgattgtt ggtgtcaaca aaatggattc caccgagcca 240
ccatacagtc agaagagata cgaggaaatc gttaaggaag tcagcaccta cattaagaaa 300
attggctaca accctgacac agtagcattt gtgccaattt ctggttggaa tggtgacaac 360
atgctggagc caagtgctaa tatgccttgg ttcaagggat ggaaagtcac ccgcaaagat 420
ggcagtgcca gtggcaccac gctgctggaa gctttggatt gtatcctacc accaactcgt 480
ccaactgaca agcctctgcg actgcccctc caggatgtct ataaaattgg aggcattggc 540
actgtccctg tgggccgagt ggagactggt gttctcaaac ctggcatggt ggttaccttt 600
gctccagtca atgtaacaac tgaagtcaag tctgttgaaa tgcaccatga agctttgagt 660
660
<210> 2
<211> 530
<212> DNA
<213> Kagoshima Berkshire
<400> 2
gctgactgat cgggagaatc agtctatctt aatcaccgga gaatccgggg caggaaagac 60
tgtgaacacg aagcgtgtca tccagtactt tgccacaatc gccgtcactg gggagaagaa 120
gaaggaggaa cctactcctg gcaaaatgca ggggactctg gaagatcaga tcatcagtgc 180
caaccccctg ctcgaggcct ttggcaacgc caagaccgtg aggaacgaca actcctctcg 240
ctttggtaaa ttcatcagga tccacttcgg taccactggg aagctggctt ctgctgacat 300
cgaaacatat cttctagaga agtctagagt cactttccag ctaaaggcag aaagaagcta 360
ccacattttt tatcagatca tgtctaacaa gaagccagag ctcattgaaa tgctcctgat 420
caccaccaac ccatatgact acgccttcgt cagtcaaggg gagatcactg tccccagcat 480
tgatgaccaa gaggagctga tggccacaga tagtgccatt gaaatcctgg 530
<210> 3
<211> 539
<212> DNA
<213> Kagoshima Berkshire
<400> 3
gttgttcctt taaatatgat gttgccacaa gctgcattgg agactcattg cagtaatatt 60
tccaatgtgc cacctacaag agagatactt caagtctttc ttactgatgt acacatgaag 120
gaagtaattc agcagttcat tgatgtcctg agtgtagcag tcaagaaacg tgtcttgtgt 180
ttacctaggg atgaaaacct gacagcaaat gaagttttga aaacgtgtga taggaaagca 240
aatgttgcaa tcctgttttc tgggggcatt gattccatgg ttattgcaac ccttgctgac 300
cgtcatattc ctttagatga accaattgat cttcttaatg tagctttcat agctgaagaa 360
aagaccatgc caactacctt taacagagaa gggaataaac agaaaaataa atgtgaaata 420
ccttcagaag aattctctaa agatgttgct gctgctgctg ctgacagtcc taataaacat 480
tcagtgtacc agatcgaatc acaggaaggg cgggactaaa ggaactacaa gctgttagc 539
<210> 4
<211> 419
<212> DNA
<213> Kagoshima Berkshire
<400> 4
catttatgag ggctacgcgc tgccgcacgc catcatgcgc ctggacctgg cgggccgcga 60
tctcaccgac tacctgatga agatcctcac tgagcgtggc tactccttct gaccacagct 120
gagcgcgaga tcgtgcgcga catcaaggag aagctgtgct acgtggccct ggacttcgag 180
aacgagatgg cgacggccgc ctcctcctcc tccctggaaa agagctacga gctgccagac 240
gggcaggtca tcaccatcgg caacgagcgc ttccgctgcc cggagacgct cttccagccc 300
tccttcatcg gtatggagtc ggcgggcatt cacgagacca cctacaacag catcatgaag 360
tgtgacatcg acatcaggaa ggacctgtat gccaacaacg tcatgtcggg gggcaccac 419
<210> 5
<211> 507
<212> DNA
<213> Kagoshima Berkshire
<400> 5
tatatagaac cgaatcacgt acactgggcc tgaccaagca gggccaaaac aaggcaacct 60
aggaggttat aaaataggta tacgcgcgct gacacataca tactcactac ccgaacgcgg 120
ggacaactag ggctccgcca taagccatcc tttcctggtc gtcgatgttg cgggctgcag 180
ttatagggct gccaaccgcc atacacacct taccagccac ttattaagtt acatccacga 240
gggctctgta ccacccctaa gcagtggcag tggtagccgc tgcccgctta ccctgcgcag 300
tgttggtgct agctccgtcc taagcttccc cgatagccgc cgctttttac acaccatcgg 360
cggactagac accgttggtt gcagcgtaag cgtctatggt agcagctgcg gcgaccgccg 420
tgtagccagc ttactacatg ttagtttcag caaccaccct gccaataccc gtgttcccta 480
ctccaactct gtcggtttca gccgcag 507
Claims (5)
- 서열목록 서열 1에 기재된 가고시마 버크셔(Kagoshima Berkshire) 유래의 성장특이유전자의 염기서열.
- 서열목록 서열 2에 기재된 가고시마 버크셔(Kagoshima Berkshire) 유래의 성장특이유전자의 염기서열.
- 서열목록 서열 3에 기재된 가고시마 버크셔(Kagoshima Berkshire) 유래의 성장특이유전자의 염기서열.
- 서열목록 서열 4에 기재된 가고시마 버크셔(Kagoshima Berkshire) 유래의 성장특이유전자의 염기서열.
- 서열목록 서열 5에 기재된 가고시마 버크셔(Kagoshima Berkshire) 유래의 성장특이유전자의 염기서열.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020030083652A KR20050049893A (ko) | 2003-11-24 | 2003-11-24 | 돼지 유래의 신규한 성장특이유전자의 염기서열 |
| US10/786,052 US20050113568A1 (en) | 2003-11-24 | 2004-02-26 | Novel growth related genes from swine |
| CNA2004100076609A CN1621409A (zh) | 2003-11-24 | 2004-02-27 | 来自猪的新的生长相关性基因 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020030083652A KR20050049893A (ko) | 2003-11-24 | 2003-11-24 | 돼지 유래의 신규한 성장특이유전자의 염기서열 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20050049893A true KR20050049893A (ko) | 2005-05-27 |
Family
ID=34588023
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020030083652A KR20050049893A (ko) | 2003-11-24 | 2003-11-24 | 돼지 유래의 신규한 성장특이유전자의 염기서열 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20050113568A1 (ko) |
| KR (1) | KR20050049893A (ko) |
| CN (1) | CN1621409A (ko) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20050049893A (ko) * | 2003-11-24 | 2005-05-27 | 경상남도 | 돼지 유래의 신규한 성장특이유전자의 염기서열 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20050049893A (ko) * | 2003-11-24 | 2005-05-27 | 경상남도 | 돼지 유래의 신규한 성장특이유전자의 염기서열 |
-
2003
- 2003-11-24 KR KR1020030083652A patent/KR20050049893A/ko not_active Application Discontinuation
-
2004
- 2004-02-26 US US10/786,052 patent/US20050113568A1/en not_active Abandoned
- 2004-02-27 CN CNA2004100076609A patent/CN1621409A/zh active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1621409A (zh) | 2005-06-01 |
| US20050113568A1 (en) | 2005-05-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6821724B1 (en) | Methods of genetic analysis using nucleic acid arrays | |
| KR101677517B1 (ko) | 돼지의 육질형질 수준 및 흑모색 판단용 snp 마커 및 이의 용도 | |
| US20020156263A1 (en) | Genes expressed in breast cancer | |
| US20030165924A1 (en) | Genes expressed in foam cell differentiation | |
| US20030065157A1 (en) | Genes expressed in lung cancer | |
| Franssen-van Hal et al. | Factors influencing cDNA microarray hybridization on silylated glass slides | |
| KR101861930B1 (ko) | 시식성 파리의 종 구별용 snp 마커 및 이의 용도 | |
| JP2004507206A (ja) | 診断上重要な組織特異的遺伝子 | |
| US20080145858A1 (en) | Detection and identification of toxicants by measurement of gene expression profile | |
| EP1920069A1 (en) | Differential expression gene profiles and applications in molecular staging of human gastric cancer | |
| CN108315435B (zh) | 与绵羊产羔数性状相关的snp分子标记及应用 | |
| US8138123B2 (en) | Gene expressing analysis tool | |
| US20050112602A1 (en) | cDNA chip for screening specific genes and analyzing their function in swine | |
| KR100578002B1 (ko) | 돼지의 성장특이유전자의 발현 프로파일의 검색 및 이를이용한 기능성 ｃＤＮＡ 칩 | |
| US20030119009A1 (en) | Genes regulated by MYCN activation | |
| KR20050049893A (ko) | 돼지 유래의 신규한 성장특이유전자의 염기서열 | |
| KR20050103657A (ko) | Ｋ―ｒａｓ 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이 및 이를이용하여 Ｋ―ｒａｓ 유전자의 돌연변이를 검사하는 방법 | |
| KR20050049891A (ko) | 돼지의 성장단계별 근육특이유전자의 발현 프로파일의검색 및 이를 이용한 기능성 ｃＤＮＡ 칩 | |
| KR20060119737A (ko) | 심혈관 질환 진단용 다중 ｓｎｐ, 그를 포함하는마이크로어레이 및 키트 및 그를 이용한 심혈관 질환 진단방법 | |
| KR20050049895A (ko) | 돼지의 지방특이유전자의 발현 프로파일의 검색 및 이를이용한 기능성 ｃＤＮＡ 칩 | |
| KR101985659B1 (ko) | 단일염기다형성 마커를 이용한 백우 품종 식별 방법 | |
| KR100974228B1 (ko) | 최기형성 및 부작용 유발 약물 검색용 바이오마커 및 이를이용한 최기형성 및 부작용 유발 약물 검색 방법 | |
| KR20060131972A (ko) | Ｄｎａ 어레이와 1 염기 다형의 검출 방법 | |
| KR101150707B1 (ko) | 다중유전자 증폭 기술을 이용한 자연살해세포수용체 유전형 동정 방법 | |
| CN112280869B (zh) | 一种利用基因芯片技术检测饲料中海洋哺乳类动物成分的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| J201 | Request for trial against refusal decision | ||
| J301 | Trial decision |
Free format text: TRIAL DECISION FOR APPEAL AGAINST DECISION TO DECLINE REFUSAL REQUESTED 20060227 Effective date: 20061228 |