KR100883399B1

KR100883399B1 - Production methods of green tea extracts for preventing and curing skin diseases such as an acne and atopy

Info

Publication number: KR100883399B1
Application number: KR1020070069670A
Authority: KR
Inventors: 김경현; 이지혜; 심진선
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2007-07-11
Filing date: 2007-07-11
Publication date: 2009-02-11
Also published as: KR20090006385A; WO2009008569A1

Abstract

본 발명은 녹차 수용성 추출물의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로는 건조된 녹차 잎을 열수추출하는 단계, 상기 열수추출액을 원심분리 한 후 상등액을 에탄올로 침전시키는 단계, 상기 에탄올 침전물을 인산완충용액에 용해하고 핵산을 제거하는 단계, 및 상기 핵산이 제거된 에탄올 침전물을 차콜 컬럼(charcoal column)으로 여과하는 단계를 포함하는 하기 단계를 포함하는 여드름, 아토피 피부 질환 예방 및 치료용 녹차 수용성 추출물의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for preparing green tea water-soluble extract, specifically, the step of extracting hot water from dried green tea leaves, centrifuging the hot water extract and precipitating the supernatant with ethanol, the ethanol precipitates in a phosphate buffer solution. Method for preparing green tea soluble extract for acne, atopic skin disease prevention and treatment comprising the steps of dissolving and removing the nucleic acid, and filtering the ethanol precipitate from which the nucleic acid is removed to a charcoal column It is about.

본 발명에 따르면, 녹차(Camellia sinensis) 잎의 수용성 추출물은 유론산(uronic acid)의 함량이 높고, 황색 포도상 구균과 여드름 간균에 의한 적혈구 응집반응을 저해하는 활성이 높다. 따라서 여드름이나 아토피의 예방 및 치료에 사용될 수 있는 녹차 수용성 추출물을 산업적으로 유용하게 생산하기 위한 방법으로 본 발명의 제조방법을 이용할 경우 기존의 크로마토그래피를 이용한 방법보다 월등히 높은 수율을 얻을 수 있을 뿐만 아니라 공정 또한 간단하여 대량생산에 적합한 새로운 기술로서 사용될 수 있다.According to the present invention, the water-soluble extract of the leaves of Camellia sinensis has a high content of uronic acid and a high activity of inhibiting erythrocyte agglutination by staphylococcus aureus and acne bacilli. Therefore, as a method for industrially producing green tea soluble extract that can be used for the prevention and treatment of acne or atopy, the production method of the present invention can not only obtain a much higher yield than the conventional method using chromatography. The process is also simple and can be used as a new technology suitable for mass production.

녹차, 수용성 추출물, 유론산, 여드름, 아토피, 적혈구 응집반응, charcoal Green tea, water soluble extract, uronic acid, acne, atopy, erythrocyte agglutination, charcoal

Description

Preparation methods of green tea extracts for preventing and treating acne and atopic skin diseases {Production methods of green tea extracts for preventing and curing skin diseases such as an acne and atopy}

본 발명은 여드름, 아토피 피부 질환 예방 및 치료용 녹차 수용성 추출물의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 녹차 잎을 열수추출하여 에탄올로 침전시킨 후, charcoal column으로 여과하는 단계를 포함하는 녹차 수용성 추출물의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing green tea water-soluble extracts for preventing and treating acne and atopic skin diseases, and more specifically, after extracting the green tea leaves by hot water extraction and precipitating with ethanol, filtering the green tea water-soluble extracts by filtration with a charcoal column. It relates to a manufacturing method.

여드름(심상성 좌창; Acne vulgaris, pimples)은 청소년기부터 중년에 이르기까지 가장 흔한 피부질환 중 하나이며, 의학적으로 피부 속의 모낭(hair follicle)과 피부의 기름샘인 피지선(sebaceous gland)의 염증성 병변이다 (1). 증상의 특징으로는 좁쌀크기의 발진으로 내부에 피지(sebum)가 들어있고, 피부에 300만개 이상 되는 피지선에서 일어나며, 얼굴, 등, 앞가슴에 주로 발생한다 (2). 여드름은 흔하게 발생하는 피부 질환이기 때문에 증상이 가벼울 때는 일시적인 생리 현상으로 간주하기도 하지만, 여러 가지 세균의 감염으로 주위조직의 손상과 염증세포 침윤을 보이는 경우 염증이 심해서 화농이 생기고 흉터나 색소 침착 등을 남기기 쉽다. 피지선은 성호르몬, 특히 남성 호르몬인 안드로젠의 표적기관이기 때문에 사춘기에 성호르몬 분비가 왕성할 때 피지선이 성숙, 증식하고, 피지 분비가 증가하게 된다. 사춘기에 접어든 남녀 10명 중 약 8-9명은 여드름을 경험하는 것으로 알려져 있다 (3).Acne (acne vulgaris, pimples) is one of the most common skin diseases from adolescence to middle age, and is an inflammatory lesion of the sebaceous gland, which is medically the hair follicle in the skin and the oil glands of the skin. (One). The symptom is characterized by a narrow rice rash with sebum inside, which occurs in more than 3 million sebaceous glands on the skin, and occurs mainly on the face, back, and breast (2). Acne is a common skin disease, so when the symptoms are mild, it is considered as a temporary physiological phenomenon.However, when infections of various bacteria show damage to surrounding tissues and infiltration of inflammatory cells, inflammation can occur due to inflammation and scarring or pigmentation. Easy to leave Sebaceous glands are the target organs of sex hormones, especially the androgen, a male hormone, so when sexual hormones are active during puberty, the sebaceous glands mature and multiply, and sebum secretion increases. Of the 10 men and women who enter puberty, about 8-9 are known to have acne (3).

여드름의 내적 원인은 정신적, 신체적 스트레스에 따라 호르몬 변화 등 내분비 작용에 의한 피지 분비와 성분의 이상, 매일 1-2g의 과다한 피지의 분비에 따른 피지선 또는 모낭의 막힘을 들 수 있다. 스트레스로 인한 코티솔(cortisol)과 여성의 생리 기간 중의 프로제스테론(progesterone)이라는 호르몬과도 관계가 깊다 (4). 외적 원인으로는 피지의 증가로 피지선 안에 살고 있는 여드름 간균(Propionibacterium acnes)에 의한 자극인자가 모낭 상피벽을 자극하기 때문에, 상피내면의 각질이 두꺼워지고, 이 시기에 모낭의 이상각화로 인한 폐색이 일어나고 모낭 내로 산소유입이 감소한다. 이 현상은 여드름 발병 원인균인 혐기성 P. acnes에 있어서 매우 양호한 발육조건이 되어 여드름 병소에서 증식이 촉진된다 (5). 일반적으로 건강한 피부에는 여드름 간균, 포도상 구균 등 세균(bacteria)이 상재하고 있으며, 피부 1cm² 표면에 수십만 개에 달하는 여드름 간균이 상재해 있다.Internal causes of acne include sebaceous secretion and abnormalities of the components by endocrine effects such as hormonal changes depending on mental and physical stress, and sebaceous gland or hair follicle blockage due to excessive sebum secretion of 1-2g daily. Cortisol caused by stress and a hormone called progesterone during women's menstrual periods are also closely linked (4). External causes include increased sebum and stimulating factors caused by propionibacterium acnes living in sebaceous glands, which stimulate the hair follicle epithelial wall, resulting in thickening of keratin in the epithelium and obstruction of abnormal hair follicles at this time. Occurs and decreases oxygen inflow into hair follicles. This phenomenon is a very good development condition in anaerobic P. acnes , the causative agent of acne, and promotes the growth in acne lesions (5). In general, healthy skin contains bacteria such as acne bacillus and staphylococcus, and hundreds of thousands of acne bacillus are present on the surface of 1 cm ^{2 of} skin.

아토피성 피부염은 알레르기 질환이 있거나 가족력이 있는 사람의 얼굴이나 팔다리 접히는 부분에서 발병하는 만성 염증성 피부 질환이다 (6). 아토피성 피부염은 보통 급성기, 아급성기, 만성기로 구분해서 나타낸다. 급성기에는 발적(erythema)과 인설(scaling)이 현저하고 태선(lichenification)은 거의 나타나지 않는다. 하지만 만성기로 갈수록 발적은 사라지고 인설과 태선은 더욱 현저하게 나타난다. 표피박리(excoriation)는 모든 아토피성 피부염에 일반적으로 나타난다 (7). 아토피성 피부염은 보통 생후 3개월 정도에서 흔하게 발생하며, 소아와 취학 아동에서 높은 유병율을 보이며, 다른 알레르기성 질환과 같이 증가세를 보여주고 있다 (8-10). Atopic dermatitis is a chronic inflammatory skin disease that occurs in the folds of the face or limbs of people with allergies or family history (6). Atopic dermatitis is usually divided into acute, subacute, and chronic phases. In the acute phase erythema and scaling are prominent and lichenification rarely occurs. However, as the chronic phase disappears, the redness disappears and the tachycardia is more pronounced. Epidermal detachment is common in all atopic dermatitis (7). Atopic dermatitis usually occurs at around 3 months of age, has a high prevalence in children and school children, and increases like other allergic diseases (8-10).

아토피의 외적 요인은 방향제, 방부제, 용제 등 화학물질, 실내 먼지와 진드기, 곰팡이, 음식, 꽃가루, 애완견 등이 포함된다. 양털 같은 모직물에 대한 과민증도 아토피의 징후가 될 수 있다. 흡입된 항원은 아토피 피부염의 손상된 피부 보호막을 투과해서 접촉성 피부염의 원인이 된다. 음식에 의한 알레르기의 역할은 아직 논쟁의 대상이 되고 있지만 일반적으로 아이들에게 영향이 큰 것으로 알려져 있다. 아토피성 피부염은 다른 알레르기성 질환과 공존된 경우가 흔하다. 외적 요인으로는 혈청 IgE의 양이 증가하고, 세균, 바이러스, 진균에 감염되기 쉬운 면역 결핍과 관련이 있고, 생리학적으로 교감신경이나 부교감 신경 반응에 변화가 있다고 보고되고 있다 (11). 아토피 환자의 90%가 피부에 포도상 구균(Staphylococcus aureus)이 집적되어 번식하고 있으며, 많은 연구 결과들을 통해서 아토피 환자의 상피세포에 포도상 구균의 감염되어 있음이 알려져 있다. 그러나 이런 아토피 환자에게 상피세포에 포도상 구균의 감염 및 번식하는 기전은 명확하지 않다. 아토피성 질환 부모의 소아에서 아토피성 피부염의 빈도가 높아 유전적인 소인이 있는 것으로 추정되고, 아토피성 피부염을 가지고 있는 모체로부터 수유기간이 증가할수록 아토피성 피부염의 발생 빈도도 증가하는 것으로 알려지고 있다 (12).External factors of atopy include chemicals such as fragrances, preservatives and solvents, indoor dust and mites, mold, food, pollen and dogs. Hypersensitivity to woolen wool can also be a sign of atopy. Inhaled antigens penetrate the damaged skin barrier of atopic dermatitis and cause contact dermatitis. The role of food allergies is still controversial but is generally known to affect children. Atopic dermatitis often coexists with other allergic diseases. External factors include increased serum IgE levels, associated with immune deficiency susceptible to bacteria, viruses, and fungi, and physiological changes in sympathetic and parasympathetic responses (11). 90% of patients with atopy accumulate Staphylococcus aureus on the skin and multiply, and many studies show that epithelial cells of atopy are infected with staphylococcus. However, the mechanism of infection and propagation of Staphylococcus aureus in epithelial cells is not clear for these atopic patients. The prevalence of atopic dermatitis is high in children with atopic dermatitis, suggesting a genetic predisposition, and the incidence of atopic dermatitis increases with increasing lactation period from mothers with atopic dermatitis. 12).

P. acnes는 그람 양성균으로 spore를 형성하지 않으며, rod 형태의 혐기성 박테리아로서 여드름 간균으로 불리고 있다 (13). Corynebacterium과 형태학적으로 유사하며 non-toxigenic 하다. 제한적으로 호기성(microaerobic) 증식도 가능하며, 여드름을 유발하는 피부와 모낭의 대표적인 상재균(skin flora)이다. P. acnes의 유전체 염기 서열이 독일 Georg-August 대학과 Ulm 대학 공동으로 2004년에 규명되었다 (3, 14). 여드름 간균 P. acnes는 2,333개에 달하는 단백질 유전자가 발견되었으며, 이들 유전자 중에서도 지방산 분해, 피부세포 부착(adhesion), 모낭 증식에 관련된 유전자가 제시되었다. P. acnes가 피부 모낭세포에 결합하는 세포부착 작용에 의하여 질환을 야기하기 때문에, 인체 피부에 가장 많이 상재하는 균으로서 공생기작의 특징 연구에 큰 도움을 줄 것으로 기대된다. P. acnes are Gram-positive bacteria that do not form spores. They are rod-shaped anaerobic bacteria and are called acne bacilli (13). Morphologically similar to Corynebacterium and non-toxigenic. Limited aerobic (microaerobic) proliferation is possible, it is a typical skin flora of the skin and hair follicles that cause acne. The genome sequence of P. acnes was identified in 2004 jointly by Georg-August University and Ulm University in Germany (3, 14). Acne bacterium P. acnes has been found to have 2,333 protein genes, among which genes related to fatty acid degradation, skin cell adhesion (adhesion), and hair follicle proliferation have been suggested. Since P. acnes causes disease by cell adhesion to skin hair follicle cells, it is expected to be of great help in the study of the symbiotic mechanism as the most common bacterium in human skin.

P. acnes의 증식은 지방이 많은 부위, 모피지선(pilosebaceous gland)에 한정되어 있다. 호지성(lipophilic)인 특성으로 피지가 없이는 거의 발육할 수 없다. 따라서 P. acnes의 균수와 피지 분비량은 상관관계가 있으며, 피지가 많은 부위 즉 지루부위가 여드름의 호발인 동시에 이 부위는 P. acnes의 균수가 많은 부위이기도 하다 (14). P. acnes는 propionic acid를 생성하는 균으로서 lipase 효소를 세포 밖으로 배출하여 과다한 피지를 분해하고 생성되는 지방산이나 균 항원이 피부 모낭에 염증을 일으키고 손상을 입히게 되어 여드름의 형태(pustule)로 피부 표면에 형성되는 것이다.The proliferation of P. acnes is limited to the fatty areas, the pilosebaceous gland. It is lipophilic and can hardly develop without sebum. Therefore, the number of bacteria of P. acnes and the amount of sebum secretion are correlated, and the sebum-rich area, ie, seborrhea, is an acne-prone condition, and this area is also a site of P. acnes . P. acnes is a bacterium that produces propionic acid, which releases lipase enzymes out of cells to break down excess sebum, and the resulting fatty acids or fungal antigens inflame and damage skin hair follicles. It is formed.

황색 포도상 구균(Staphylococcus aureus)는 피부의 상처를 통해서 화농을 일으키며, 피부 표면의 부스럼, 종기 원인균이다. 아토피 피부염의 1차 요인일 뿐만 아니라 2차 요인으로서 피부 모공이 감염되거나, 땀샘이 막힌 상태에서 감염하거나 상처에 침입하여 발병하기도 한다 (7). 정상인은 10% 이내인 반면, 아토피 환자의 90%가 피부에 황색 포도상 구균이 발견되고 있다. 아토피 피부염이 발생하면 포도상 구균 감염이 합병되며, 포도상 구균이 내품는 독소(enterotoxin)는 아토피 피부염을 매우 악화시킨다. 또한 혈관 내에서는 초항원(superantigen)으로 인해 toxic shock syndrome이 일어나는데도 관여한다 (8). Staphylococcus aureus causes purulent wounds on the skin and is a cause of boils and boils on the surface of the skin. It is not only a primary cause of atopic dermatitis, but also a secondary cause of infections such as skin pores, clogged infections, or invasion of wounds (7). Within 10% of normal people, staphylococcus aureus is found in the skin in 90% of atopic patients. When atopic dermatitis develops, staphylococcal infections are combined, and enterotoxin, a staphylococcus aureus, exacerbates atopic dermatitis. It is also involved in the development of toxic shock syndrome due to superantigens in blood vessels (8).

일반적으로 여드름은 피부 진피 층에 존재하는 피지선 피지분비가 증가하여 모공이 막히거나, 여드름 원인균 P. acnes나 화농성 세균 S. aureus 등의 원인균에 의해 염증이 발생된다. 화장에 의해서 피지 배출이 잘 되지 않거나, 스트레스, 수면 부족 등에 의하여 부신피질 호르몬이 증가하면서 피지선을 자극하여 여드름이 발생하기도 한다. P. acnes가 생성하는 lipase 효소는 피지를 중성지방(트리글리셀리드)과 유리 지방산으로 가수 분해하고, 유리지방산은 모낭에 comedogenic한 작용을 하는 것으로 보인다. P. acnes의 균수는 미소면포(micro comedo), 폐쇄면포(closed comedo), 개방면포(opencomedo)의 순으로 많으며 미소면포내의 세균은 거의가 P. acnes이다. 피지선 내 서식하는 여드름의 원인균, 화농성 세균, 모낭충으로 인해 염증이 발생되어 모공이 막히거나, 유분이 많은 화장품 등으로 인해 각질이 두껍게 쌓이면서 모공이 막히게 되면 안에서는 피지가 만들어지고, 만들어진 피지가 밖으로 빠져나가지 못하고 피지선이 부풀어, 여드름이 발생하게 된다. P. acnes 균은 기름기가 많은 피지선에서 면포 안의 기름을 분해해 자극성 있는 유리 지방산으로 전환시키며, 면역 세포들이 몰려들어 염증을 일으켜 여드름을 발생하게 된다. 따라서 여드름 치료는 항생제나, benzoyl peroxide, 혹은 피지생성을 억제하는 vitamin A 제재 화합물 등이 이용되고 있다. In general, acne increases sebaceous glands secretion in the dermal layer of the skin, clogging pores, or inflammation caused by acne causing bacteria P. acnes or purulent bacteria S. aureus . Sebum is not well discharged by makeup, or corticosteroids increase due to stress, lack of sleep, and the acne is caused by stimulating sebaceous glands. The lipase enzyme produced by P. acnes hydrolyzes sebum into triglycerides and free fatty acids, and free fatty acids appear to have comedogenic effects on hair follicles. The number of bacteria of P. acnes is in order of micro comedo, closed comedo, and opencomedo, and most of bacteria in P. acnes are P. acnes . When acne in the sebaceous glands, purulent bacteria, and hair follicles causes inflammation, clogged pores, or keratin builds up due to oily cosmetics. If the sebaceous glands swell, acne will occur. P. acnes breaks down the oil in the scalp and converts it into irritating free fatty acids in the oily sebaceous glands, causing immune cells to flock to inflame and cause acne. Therefore, the treatment of acne, antibiotics, benzoyl peroxide, or vitamin A agent that inhibits sebum production is used.

아토피성 피부염의 원인과 병태생리에 관한 정확한 작용기전에 대해서는 아직 규명되지 않고 있다. 아토피성 피부염환자의 피부는 정상인의 피부에 비해 환부나 환부이외의 부위 모두에서 포도상 구균의 검출 빈도가 현저하게 높다. 정상적인 사람에게서 발견된 것에 비해 아토피성 피부염을 가지고 있는 환자에게서 분리된 포도상 구균이 항생제 메치실린(methicillin)내성 균주와 후시딘(fusidic acid) 내성 균주의 발생 비율도 현저히 높다. 또한 포도상 구균은 아토피의 급성 악화기에 주요 악화 원인이 된다. The exact mechanism of action on the cause and pathophysiology of atopic dermatitis has not been elucidated. The skin of patients with atopic dermatitis has a higher frequency of detection of staphylococci in both affected and non-infected areas than normal skin. Staphylococcus aureus isolates from patients with atopic dermatitis have significantly higher rates of antibiotic-methicillin-resistant and fusidic acid-resistant strains than those found in normal humans. Staphylococcus aureus is also a major cause of exacerbations during the acute exacerbation of atopy.

아토피성 피부염을 치료하는 전신요법의 제제는 항히스타민제, 항생제, 부신피질 호르몬제가 있다. 항히스타민제는 장기 연용시 효과가 갑자기 소실되는 경우가 흔하고, 경구용 부신피질 호르몬 제제는 외용제가 효과 없는 경우를 제외하고는 거의 사용하지 않는 것이 원칙이다. 아토피성 피부염으로 인한 2차 감염의 치료에는 외용 항생제만 사용하는 것보다 경구 치료를 병행하고, 항생제 등을 사용한다 (8, 11). Systemic therapies for treating atopic dermatitis include antihistamines, antibiotics, and corticosteroids. Antihistamines are often suddenly lost in long-term use, and oral corticosteroids are rarely used unless the external preparation is ineffective. In the treatment of secondary infections caused by atopic dermatitis, oral treatment is used in combination with antibiotics, rather than external antibiotics alone (8, 11).

이와 같이, 피부질환 병원균 특히 여드름과 아토피 치료와 보호를 목적으로 항생제가 주로 사용되고 있지만, 항생제 오용과 남용에 따라 많은 병원균이 항생제 에 대하여 내성을 갖고 있고, 항생제의 수명 또한 짧아지고 있다. 항생제 내성균의 출현과 병행하여 중요한 점은 항생제를 투여하였을 때의 피부 미생물의 발란스가 무너진다는 사실이다. 항생제를 대체하기 위한 노력이 필요하며, 국내에서 피부과에서 사용하고 있는 여드름과 아토피 치료용 항생제 남용에 따른 내성균은 향후 소아 및 사춘기 세대의 건강에 위협적인 인자가 될 수 있다.As described above, antibiotics are mainly used for the purpose of treating and protecting skin disease pathogens, particularly acne and atopic dermatitis, and many pathogens are resistant to antibiotics due to antibiotic misuse and abuse, and the lifetime of antibiotics is also shortened. Along with the emergence of antibiotic resistant bacteria, an important point is the fact that the balance of skin microorganisms when antibiotics are administered is compromised. Efforts to replace antibiotics are needed, and resistant bacteria caused by abuse of antibiotics used to treat acne and atopy, which are used in dermatology in Korea, may be a threat to the health of children and adolescents.

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 녹차 잎을 열수추출하여 에탄올로 침전시킨 후, charcoal column으로 여과하는 단계를 포함하는 제조방법을 사용할 경우, 여드름 간균, 포도상 구균의 인체피부 세포 부착에는 현저한 저해를 하면서 다른 피부상재균에는 저해효과가 없는 특이적 효과를 갖는 녹차 수용성 추출물을 보다 간단한 공정으로 높은 수율로 정제할 수 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.Accordingly, the present inventors have made a thorough research to overcome the problems of the prior art, when using the manufacturing method comprising the step of filtering the water on the charcoal column after the extraction of green tea leaves and precipitated with ethanol, acne bacilli, staphylococci It was confirmed that the green tea water-soluble extract having a specific effect of inhibiting the adhesion of human skin cells of the cocci and having no specific inhibitory effect to other dermatophytes can be purified in a higher yield by a simpler process, thus completing the present invention. .

따라서, 본 발명의 주된 목적은 여드름 간균, 포도상 구균의 인체피부 세포 부착에는 현저한 저해를 하면서 다른 피부상재균에는 저해효과가 없는 특이적 효과를 갖는 녹차 수용성 추출물을 고수율로 획득할 수 있는 제조방법을 제공하는 데 있다.Therefore, the main object of the present invention is a method of producing a green tea water-soluble extract having a specific effect in a high yield while having a significant inhibition on acne bacillus, Staphylococcus aureus adherence to human skin cells, but does not inhibit other dermatological bacteria To provide.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 여드름, 아토피 피부 질환 예방 및 치료용 녹차 수용성 추출물의 제조방법을 제공한다:According to an aspect of the present invention, the present invention provides a method for preparing green tea soluble extract for preventing and treating acne and atopic skin disease, comprising the following steps:

a) 건조된 녹차 잎을 열수추출하는 단계;a) hot water extracting the dried green tea leaves;

b) 상기 열수추출액을 원심분리 한 후 상등액을 에탄올로 침전시키는 단계;b) centrifuging the hot water extract and precipitating the supernatant with ethanol;

c) 상기 에탄올 침전물을 인산완충용액에 용해하고 핵산을 제거하는 단계; 및c) dissolving the ethanol precipitate in phosphate buffer solution and removing nucleic acid; And

d) 상기 핵산이 제거된 에탄올 침전물을 차콜 컬럼 (charcoal column)으로 여과하는 단계.d) filtering the ethanol precipitate from which the nucleic acid is removed by a charcoal column.

본 발명은 본 발명자의 등록특허 (제 10-0700912호)에서 그 효능이 알려져 있는 녹차(Camellia sinensis) 잎에서 추출된 산성다당류를 포함하는 녹차 수용성 추출물을 고수율로 얻을 수 있는 방법으로, 기존의 산성다당류의 추출은 이온 교환 크로마토그래피에서 얻어진 분획들 중 활성분획 만을 모아 다시 젤여과 크로마토그 래피를 수행하여 제조되기 때문에 그 수율이 매우 낮았다. 그러나 본 발명의 제조방법은 녹차 열수추출물을 시중에서 쉽게 구입이 용이한 활성탄 (activated charcoal)을 오픈 컬럼(open column)에 충진하여 여과시키기 때문에, 비교적 그 공정이 간단하고 경제성이 뛰어나 대량생산 공정에 적합하며 산업적으로 적용하는 데 있어서도 용이하다. 또한 본 발명의 실시예 2에서 나타난 바와 같이, 300배 이상 높은 수율로 녹차 수용성 추출물을 얻을 수 있음을 확인하였다.The present invention is a method for obtaining a green tea water-soluble extract containing an acidic polysaccharide extracted from the green tea ( Camellia sinensis ) leaves known in the registered patent (No. 10-0700912) of the present inventors, a high yield, The extraction of acidic polysaccharides was very low because the active fractions of the fractions obtained by ion exchange chromatography were collected and again subjected to gel filtration chromatography. However, the manufacturing method of the present invention is filled with activated charcoal (green charcoal), which is easy to purchase commercially available green tea hot water extract in an open column and filtered, so that the process is relatively simple and economical, and thus it is suitable for mass production. Suitable and easy to apply industrially. In addition, as shown in Example 2 of the present invention, it was confirmed that the green tea water-soluble extract can be obtained with a yield higher than 300 times.

본 발명에서는 녹차의 일반적인 섭취 및 추출방식에 따라 뜨거운 증류수로 추출한다. 이는 기존의 천연 생리 활성물질 추출을 주로 화장품 및 약품에 적용하기 어려운 유기용매를 이용하여 추출하는 방식과는 대조적으로, 인체 친화적이라고 할 수 있다. 녹차 수용성 추출물은 유론산 (uronic acid)의 함량이 높으며, P. acnes와 S. aureus의 인체 피부세포 인식을 저해하는데 매우 특이적 (specific)이다.In the present invention is extracted with hot distilled water according to the general intake and extraction method of green tea. This is in contrast to the conventional method of extracting natural bioactive substances using organic solvents, which are difficult to apply mainly to cosmetics and drugs, can be said to be human-friendly. Green tea soluble extract has a high content of uronic acid and is very specific for inhibiting human skin cell recognition of P. acnes and S. aureus .

기존의 녹차 잎 생리활성물질 추출은 유기용매 추출법에 의존하고 있는데, 이는 녹차 잎을 물에 끓여서 섭취하는 것과 대치되는 것이다. 본 발명에서 뜨거운 증류수 (90℃)에 의하여 추출되는 수용성 추출물은 유론산 함량이 20-30%에 달하며, P. acnes와 S. aureus에 의한 적혈구 응집반응과 섬유아세포 부착을 저해하는 최소 유효량은 높은 분자량에 근거하였을 때 낮은 농도 0.05-0.5 mg/ml로서 효과적인 저해활성을 보여주고 있다.Conventional green tea leaf bioactive material extraction relies on organic solvent extraction method, which is opposed to boiling green tea leaves in boiling water. In the present invention, the water-soluble extract extracted by hot distilled water (90 ° C) has a content of 20-30% in uronic acid, and the minimum effective amount that inhibits erythrocyte aggregation and fibroblast adhesion by P. acnes and S. aureus is high. Based on the molecular weight, the low concentration of 0.05-0.5 mg / ml shows effective inhibitory activity.

본 발명의 제조방법에서, 상기 d)단계에서 차콜 컬럼(charcoal column)은 입자상 활성탄소를 이용하여 카테킨을 제거하는 것을 특징으로 한다. 상기 차 콜(charcoal)은 분말형태의 활성탄도 사용이 가능하나, 본 발명의 실시예에서처럼 컬럼에 충진하여 사용되기 위해서는 입자상 활성탄이 바람직하다. 상기 카테킨은 녹차의 주요 활성물질로서 잘 알려진 화합물이다. 카테킨의 여러 활성이 알려져 있기 때문에, 본 발명에서는 상기 수용성 추출물에서 카테킨을 제거함으로써 본 발명의 녹차 수용성 추출물은 활성성분으로 카테킨이 아닌 유론산을 포함하며, 이러한 녹차 수용성 추출물이 병원균의 인체세포 부착 저해활성이 있음을 간접적으로 증명하였다.In the production method of the present invention, the char column in the step d) is characterized in that to remove catechin using the particulate activated carbon. The charcoal may be used in the form of powdered activated carbon, but granular activated carbon is preferable to be used in a column as in the embodiment of the present invention. The catechin is a well known compound as the main active substance of green tea. Since various activities of catechin are known, in the present invention, by removing the catechin from the water-soluble extract, the green tea water-soluble extract of the present invention contains uronic acid rather than catechin as an active ingredient, and the green tea water-soluble extract inhibits the adhesion of pathogens to human cells. Indirectly proved active.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 녹차 수용성 추출물을 유효성분으로 함유하는 여드름, 아토피 피부 질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.According to another aspect of the invention, the present invention provides a composition for the prevention and treatment of acne, atopic skin disease, containing the green tea water-soluble extract prepared by the above method as an active ingredient.

본 발명에서, 본 발명의 녹차 수용성 추출물이 여드름 간균 및 황색포도상 구균에 의한 적혈구 응집반응을 억제하며 피부 섬유아세포 부착에 대한 저해 효과가 탁월한 것을 확인하였다 (도 3과 4 참조). 또한 본 발명에서는 여드름과 아토피 발병 원인균의 인체 상피세포 결합을 저해하는 녹차 수용성 추출물을 분리하는 새로운 제조방법을 개발하였다.In the present invention, it was confirmed that the green tea water-soluble extract of the present invention inhibits hemagglutination by acne bacilli and Staphylococcus aureus and has an excellent inhibitory effect on skin fibroblast adhesion (see FIGS. 3 and 4). In addition, the present invention has developed a new method for separating green tea soluble extracts that inhibit human epithelial cell binding of acne and atopic diseases.

본 발명은 기존의 녹차 수용성 추출물의 제조방법에 비해서 산업적 응용 측면에서 많은 이점을 가지고 있다. 정제과정이 이온 및 젤 여과 크로마토그래피에 비해 단순하고 쉬우며, 시간적, 경제적 측면에서 우수하고 대량 생산(확보)이 용이하다. 또한 기존 방법과 달리 활성 탄소를 이용한 본 방법은 쉽고 간편한 방법으로 녹차추출물의 색소를 제거하고, 유론산을 다량 함유하는 활성 추출물을 얻을 수 있 다.The present invention has a number of advantages in terms of industrial applications compared to the production method of the conventional green tea water-soluble extract. The purification process is simpler and easier than ion and gel filtration chromatography, excellent in time and economics and easy to mass produce. In addition, unlike the existing method, the present method using activated carbon can remove the pigment of green tea extract in an easy and simple way, and obtain an active extract containing a large amount of uronic acid.

본 발명의 녹차 수용성 추출물이 상기와 같은 예방 및 치료용 조성물로 이용되기 위해서는 약제학적 분야에서 공지된 방법에 의해 제조될 수 있으며, 그 자체 또는 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 분말, 과립, 정제, 캡슐제 또는 주사제 등의 제형으로 제조되어 사용될 수 있다. 또한 이들은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다.Green tea water-soluble extract of the present invention can be prepared by a method known in the pharmaceutical field in order to be used as a composition for the prevention and treatment of the above, powdered by itself or mixed with a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, diluent, etc. It may be prepared and used in the form of granules, tablets, capsules or injections. They can also be administered orally or parenterally.

본 발명에 따른 녹차 수용성 추출물을 유효성분으로서 투여하는 투여량은 환자의 연령, 성별, 상태, 질병의 증상에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 바람직하게는 성인기준 1일 1-500mg의 녹차 수용성 추출물 및 그 분말로 투여될 수 있다.The dosage for administering the green tea soluble extract according to the present invention as an active ingredient may be appropriately selected according to the age, sex, condition and symptoms of the disease of the patient, preferably 1-500 mg of green tea soluble extract per day per adult and It may be administered in the powder.

일반적으로 땀과 피지를 섞어주는 역할을 하고 있는 피부 상재균은 이로운 상재균으로 피부에 도움을 주는 반면, 여드름 간균이나 포도상 구균 등 해로운 상재균이 너무 늘어나면 피부의 발란스가 무너지는 원인이 된다. 피부 상재균 Staphylococcus epidermidis는 건강한 사람에게는 사람 피부에 공생하는 비병원성인 그람 양성, coagulase-negative 균이다. 그러나 피부와는 달리 일반 외과 혹은 내과수술 후 환자의 수술부위가 감염되면 병원균으로 작용하기도 한다 (15, 16). 피부 박테리아는 제한된 종류의 그람 양성균으로 구성되어 있는데 반하여, 그람 음성균은 소수에 지나지 않다. 그람 음성균 중 Escherichia coli와 같은 대장균은 대변을 통하여 끊임없이 피부를 오염시키며, Acinetobacter는 피부에 서식하는 그람 음성균이다. 그람 음성균은 피부와 같이 건조한 조건에 잘 적응하는 그람 양성균과의 경쟁에서 생존하지 못한다. 항생제로 피부의 그람 양성균을 제거하면 그람 음성 균이 늘어나기 시작한다. 따라서 인체에 상재하는 이들 박테리아는 유익균과 무익균의 발란스를 유지하는 것이 무엇보다 중요하다. In general, the skin flora, which plays a role of mixing sweat and sebum, is beneficial to the skin as a beneficial flora, while too much harmful flora, such as acne bacilli and staphylococci, causes the balance of the skin to collapse. Staphylococcus epidermidis is a nonpathogenic gram-positive, coagulase-negative bacterium that coexists on human skin in healthy people. However, unlike skin, infection of a patient's surgical site after general surgery or internal surgery may act as a pathogen (15, 16). Skin bacteria are composed of a limited variety of Gram-positive bacteria, while Gram-negative bacteria are only a few. Among the Gram-negative bacteria, Escherichia coli , such as Escherichia coli , constantly pollutes the skin through feces. Acinetobacter is a Gram-negative bacterium that lives on the skin. Gram-negative bacteria do not survive competition with Gram-positive bacteria that adapt well to dry conditions such as skin. When antibiotics remove Gram-positive bacteria from your skin, they begin to grow. Therefore, it is important for these bacteria in the human body to maintain the balance between beneficial and unbeneficial bacteria.

인체세포의 인식 혹은 부착을 저해하는 탄수화물의 개발은 친환경적 신소재로서 비파괴적 기술이 적용되는 것으로 대표적인 예로 모유나 침을 들 수 있다. 모유나 침에는 생리 당배합체가 함유되어 있기 때문에, 인체에 병원균의 부착을 억제함으로써 피부기관에서 세정작용(cleansing mechanism)을 수행하게 된다. 본 발명은 P. acnes와 S. aureus의 피부 세포부착, 증식과 활동을 저해하면서 상재균이나 유익균은 선택적으로 저해하지 않는 생리활성 물질을 천연자원에서 탐색하여 분리하는 기존의 방법에서 수율이 낮다는 단점을 보완하기 위해, charcoal filtration 단계를 적용함으로써 병원균의 인체세포 부착 저해효과가 뛰어난 녹차 수용성 추출물을 고수율로 정제하는 방법을 개발하였다.The development of carbohydrates that inhibit the recognition or adhesion of human cells is an environmentally friendly new material that is applied to non-destructive technology, such as breast milk or saliva. Since breast milk or saliva contains physiological glycopolymers, it cleansing the skin organs by inhibiting the attachment of pathogens to the human body. The present invention has a low yield in the conventional method of screening and separating bioactive substances from natural resources, which inhibits the adhesion, proliferation and activity of P. acnes and S. aureus , but does not selectively inhibit the flora or beneficial bacteria. In order to make up for the shortcomings, the method of purifying green water-soluble extracts with excellent yields by inhibiting the adhesion of pathogens to human cells by applying the charcoal filtration step was developed.

본 발명에 사용된 효소 트립신(trypsin), 글루구론산(glucuronic acid), 갈락튜론산(galacturonic acid) 등은 시그마(Sigma, USA)에서, activated granular charcoal은 덕산과학에서 구입하였다.Enzymes trypsin, glucuronic acid, galacturonic acid, and the like used in the present invention were purchased from Sigma, USA, and activated granular charcoal was purchased from Duksan Science.

본 발명에 이용된 적혈구 응집 반응에 필요한 O형 적혈구는 고려대 의대에서 확보하였으며, 항응고제와 트립신 효소 처리를 한 다음 이용하였다. P. acnes (ATCC 11828)는 brain-heart infusion 배지에서 혐기적 조건으로 2일 이상 배양하였으며, S. aureus 및 S. epidermidis 박테리아는 고려대 의대 병원에서 분양 받아서 brain-heart infusion 배지에 호기적 조건으로 액체 배양하였다. 모든 균체는 6,000g에서 30분동안 원심 분리하여 사용하고 170 ℃ 액체 질소에 보관하였다.Type O erythrocytes required for erythrocyte agglutination reaction used in the present invention were obtained from Korea University Medical School, and used after treatment with anticoagulant and trypsin enzyme. P. acnes (ATCC 11828) was incubated in anaerobic conditions for more than 2 days in brain-heart infusion medium. S. aureus and S. epidermidis bacteria were obtained from Korea University Medical Center hospital and liquid in aerobic condition in brain-heart infusion medium. Incubated. All cells were centrifuged at 6,000 g for 30 minutes and stored in 170 ° C. liquid nitrogen.

본 발명에 이용된 대장균(BL21(DE3), BL21(DE3)/pLysS)은 Luria-Bertani (LB) agar 배지에서 항생제 처리없이 37 ℃에서 6시간 배양하였으며, 배양된 대장균은 원심분리후 -70 ℃에 보관하여 실험에 이용하였으며, L. acidophilus는 한국미생물보존센터에서 액체 배양액을 분양 받아 바로 액체질소에 stock 을 만들어 보관 후 사용 하였다. Escherichia coli (BL21 (DE3), BL21 (DE3) / pLysS) used in the present invention was incubated for 6 hours at 37 ℃ without antibiotic treatment in Luria-Bertani (LB) agar medium, the cultured E. coli was -70 ℃ after centrifugation L. acidophilus was used as a stock solution in liquid nitrogen immediately after receiving a liquid culture solution from Korea Microbiological Conservation Center.

본 발명에 이용된 동물 피부 섬유아세포(NIH3T3; ATCC CRL-1658, mouse embryo fibroblast epithelial cell line)는 ATCC(American Type Culture Collection)에서 구입하여 10% FBS와 1% 항생제가 첨가된 DMEM 배지로 5% CO₂ incubator에서 배양하여 실험에 사용하였다.Animal skin fibroblasts (NIH3T3; ATCC CRL-1658, mouse embryo fibroblast epithelial cell line) used in the present invention were purchased from the American Type Culture Collection (ATCC) and 5% in DMEM medium containing 10% FBS and 1% antibiotics. Cultured in a CO ₂ incubator was used for the experiment.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. Since these examples are only for illustrating the present invention, the scope of the present invention is not to be construed as being limited by these examples.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 피부질환 발병 원인균인 P. acnes와 S. aureus 균과 인체 세포 부착반응을 저해하는 녹차의 수용성 추출물을 분리하는 제조방법에 대한 발명을 이루었다. 특히 피부의 병원균/상재균 발란스가 중요한 의미를 갖고 있는 화장품 산업에 피부에서의 미생물 발란스라는 새로운 개념은 향후 인체 내 세균의 침입에 따른 감염을 예방 혹은 치료하는데 녹차 수용성 추출물 의 친환경적 우수성을 이용함으로써 넓은 시장성 확대가 가능하다고 판단된다. 천연자원인 녹차로부터 분리된 수용성 추출물은 천연소재로서 독성이 없으며, 부작용을 최소한으로 줄일 수 있으며, 농도에 따른 저해활성의 뛰어난 효과가 있으므로 화장품 및 의약 산업에 있어서 매우 뛰어난 발명인 것이다.As described above, according to the present invention, a method for separating the water-soluble extract of green tea, which inhibits human cell adhesion reactions with P. acnes and S. aureus bacteria, which are the causes of skin disease, has been achieved. In particular, the new concept of microbial balance in the skin is important in the cosmetics industry where the balance of pathogens and fungi on the skin is important. We believe the market will be able to expand. Water-soluble extracts isolated from green tea, which is a natural resource, have no toxicity as a natural material, can reduce side effects to a minimum, and have an excellent effect of inhibiting activity according to concentration, which is an excellent invention in the cosmetic and pharmaceutical industries.

실시예 1: 단백질 및 탄수화물과 카테킨 정량Example 1: Protein and Carbohydrate and Catechin Quantification

전체 탄수화물, 유론산 및 단백질의 양은 페놀-황산 방법, 카바졸(carbazole), 및 로우리(Lowry) 방법을 각각 포도당, 갈락튜론산(galacturonic acid), 소혈청 알부민을 표준으로 사용하여 결정하였다 (17, 18). 녹차잎 수용성 추출물의 카테킨(catechin) 함량은 상업적으로 판매되는 녹차 카테킨을 표준물질로 사용하여 바닐린(vanillin) spectroscopic method로 정량하였다 (19).Total carbohydrate, uronic acid and protein amounts were determined using glucose, galacturonic acid and bovine serum albumin as standard, respectively, using the phenol-sulfuric acid method, carbazole, and Lowry method (17 , 18). The catechin content of green tea leaf soluble extract was quantified by vanillin spectroscopic method using commercially available green tea catechin as a standard (19).

실시예 2: 녹차 잎 수용성 추출물의 분리Example 2: Isolation of Green Tea Leaf Water-Soluble Extract

제조방법은 건조된 녹차 잎을 50 mM 인산(phosphate) 완충용액 (pH 7.2) 또는 물로 90℃에서 3시간 열수추출 및 균질화 시킨 다음, 원심 분리하여 침전물을 제거하고 얻은 상등액 (CSI-1)을 70% 에탄올로 침전시켰다. 에탄올 침전물 (CSI-2)을 건조시킨 후, 이를 최소부피의 10 mM 인산 완충용액 (pH 7.5, 10mM MgCl₂, 1mM CaCl₂)에 녹여 Rnase 및 Dnase를 37 ℃에서 2시간 처리한 후 효소 활성을 중단시켰 다. 효소처리 한 반응액을 20,000g에서 원심분리한 후 상등액을 취하고 (CSI-3), 최종 70% 에탄올로 처리 한 후, 20,000g로 원심 분리하여 얻은 침전물을 조추출물로 하였다. 2.5x20cm 크기의 open charcoal column을 이용하여 상등액을 여과(filtration)하였다. 뜨거운 물을 이용하여 column을 씻어주고, 녹차 추출 상등액을 통과 시킨 후 여액을 받아, 다시 새로운 charcoal column에 통과시켜 색소가 제거된 시료를 농축, 동결건조 하였다 (CSI-4). 최종 분리단계는 도 1과 같다. 분리된 최종 수용성 추출물 CSI-4에서는 카테킨(catechin)이 검출되지 않았다. 또한 유론산 활성이 증가하면서 부착 저해활성이 높은 분획임을 확인하였다. 도 1은 녹차 잎으로부터 수용성 추출물의 분비 및 정제과정을 나타낸 모식도이다.In the preparation method, dried green tea leaves were extracted and homogenized with 50 mM phosphate buffer (pH 7.2) or water at 90 ° C. for 3 hours, and then centrifuged to remove precipitates. The supernatant (CSI-1) obtained was 70 Precipitated with% ethanol. After drying the ethanol precipitate (CSI-2), it was dissolved in a minimum volume of 10 mM phosphate buffer solution (pH 7.5, 10 mM MgCl ₂ , 1 mM CaCl ₂ ) and treated with Rnase and Dnase for 2 hours at 37 ° C. Stopped. The enzymatically treated reaction solution was centrifuged at 20,000 g, then the supernatant was taken (CSI-3), treated with final 70% ethanol, and centrifuged at 20,000 g to obtain a crude extract . The supernatant was filtered using an open charcoal column of 2.5 × 20 cm. The column was washed with hot water, passed through the green tea extract supernatant, received the filtrate, and passed through a new charcoal column to concentrate and freeze-dried the sample (CSI-4). The final separation step is shown in FIG. No catechin was detected in the isolated final aqueous extract CSI-4. In addition, it was confirmed that the fraction with high adhesion inhibitory activity as the euronic acid activity increased. Figure 1 is a schematic diagram showing the secretion and purification process of the water-soluble extract from the green tea leaves.

[표 1]. 녹차잎으로부터 분리된 수용성 추출물(CSI)의 특성TABLE 1 Characteristics of Water Soluble Extract (CSI) Isolated from Green Tea Leaves

^a정제수율은 녹차 잎 50g으로 측정하였다. ^a Purification yield was measured by 50g of green tea leaves.

표 1에 보는 바와 같이 CSI-4 수용성 추출물의 수율(yield)은 4%로 실제 활성분자인 산성다당류 CS-F2 (등록특허 제10-0700912호)의 수율(yield)(0.012%)에 비하여 300배 이상 높게 나타났다. 또한 추출물 중 CSI-4와 CS-F2의 유론산 농도는 는 큰 차이가 없어서 실제 유론산의 총량은 270배 정도 더 얻을 수 있는 효과를 나타내었다.As shown in Table 1, the yield of the CSI-4 water-soluble extract was 4%, compared to the yield (0.012%) of the yield of the actual active molecule acid polysaccharide CS-F2 (registered patent No. 10-0700912). It was more than twice as high. In addition, there was no significant difference in the concentrations of the uronic acids of CSI-4 and CS-F2 in the extract, and the total amount of the uronic acid was about 270 times higher.

실시예 3: 피부 병원균의 적혈구 및 섬유아 세포 부착 저해활성Example 3: Red blood cell and fibroblast adhesion inhibitory activity of skin pathogen

배양된 피부병원균 P. acnes와 S. aureus균을 인산 완충용액으로 묽게 만든 후 동량의 적혈구 용액과 혼합하여 실온에서 1-2시간 약하게 교반하여 반응시키거나 혹은 밤새도록 반응시켜, 이를 양성 적혈구 응집반응으로 하였다. 분리된 수용성 추출물을 이용하여 응집반응에 대한 저해활성을 위해서, 박테리아 용액과 추출물 용액을 각각 혼합하여 반응시킨 다음, 다시 적혈구 용액을 혼합하여 반응시킨 후 응집반응을 현미경을 이용하여 측정하였다. 비교군으로는 시판 카테킨을 사용하였다. P. acnes and S. aureus cultured in culture were diluted with phosphate buffer solution, mixed with the same amount of red blood cell solution and reacted with agitation for 1-2 hours at room temperature or overnight. It was made. For the inhibitory activity against the aggregation reaction using the separated aqueous extract, the bacterial solution and the extract solution were mixed and reacted, and then the red blood cell solution was mixed and reacted, and then the aggregation reaction was measured using a microscope. A commercial catechin was used as a comparative group.

P. acnes와 S. aureus에 의한 적혈구 응집반응을 저해하는 활성측정 결과, 녹차 잎에서 정제된 여러 분획 중에서도 CSI-4 분획은 각각 0.05 mg/ml, 0.1 mg/ml의 낮은 농도에서 저해 활성을 나타내었다 (도 2). 일반적으로 특이 단당류, 사이알릭산(N-acetylneuraminic acid), 글루구론산(glucuronic acid)은 5 mg/ml 이상의 농도, 즉 25 mM 이상 높은 농도에서 세포부착 저해활성을 보이고 있다. 따라서 본 발명의 대상인 녹차 수용성 추출물은 분자량 약 80 kDa에 근거하였을 때, 상대적으로 높은 활성을 가짐을 알 수 있다. 도 2는 녹차 수용성 추출물의 피부균에 대한 항부착 활성을 적혈구 응집반응으로 나타낸 현미경 사진이다. As a result of activity measurement that inhibited hemagglutination by P. acnes and S. aureus , CSI-4 fraction showed inhibitory activity at low concentrations of 0.05 mg / ml and 0.1 mg / ml, respectively. (Figure 2). In general, specific monosaccharides, sialic acid (N-acetylneuraminic acid), glucuronic acid (glucuronic acid) has been shown to inhibit cell adhesion at a concentration of 5 mg / ml or more, that is, 25 mM or more. Therefore, it can be seen that the green tea water-soluble extract of the present invention has a relatively high activity based on the molecular weight of about 80 kDa. Figure 2 is a micrograph showing the anti-adhesion activity of the green tea water-soluble extract against the skin bacteria in the hemagglutination.

또한, 피부 병원균의 동물 피부 섬유아세포(NIH3T3) 부착에 대한 녹차 수용성 추출물의 저해활성을 측정한 결과, 여드름 간균(P. acnes)과 황색포도상 구균(S. aureus)에 대해서 농도 (0.01-1.0 mg/ml)에 따라 저해하는 활성을 보였으며 (도 3), 여드름 간균 및 황색포도상 구균의 섬유아세포 부착은 각각 0.09 및 0.8 mg/ml의 농도에서 50% 저해하였다 (도 4 참조). 도 3은 피부 병원균의 동물 피부 섬유아세포 부착에 대한 녹차 수용성 추출물의 저해활성을 나타낸 것으로, 여드름 간균과 황색포도상 구균에 의한 항부착 활성을 농도(0.01-1.0 mg/ml)에 따라 저해하는 활성을 나타낸 것이다.In addition, as a result of measuring the inhibitory activity of green tea soluble extracts on the adhesion of skin pathogens to animal skin fibroblasts (NIH3T3), concentrations (0.01-1.0 mg) against acne bacilli ( P. acnes ) and Staphylococcus aureus ( S. aureus ) were measured. / ml) and fibroblast adhesion of acne bacilli and Staphylococcus aureus were inhibited by 50% at concentrations of 0.09 and 0.8 mg / ml, respectively (see Figure 4). Figure 3 shows the inhibitory activity of green tea water-soluble extracts against animal skin fibroblast adhesion of skin pathogens, inhibiting the anti-adhesion activity by acne bacilli and Staphylococcus aureus according to the concentration (0.01-1.0 mg / ml) It is shown.

실시예 4: 녹차 잎 수용성 추출물의 병원균 특이적인 부착 저해Example 4: Pathogen-Specific Adhesion Inhibition of Green Tea Leaf Water Soluble Extract

배양된 S. epidermidis, 대장균(E. coli), Lactobacillus, B. bifidus 균을 이용하여 적혈구 응집 반응을 실시 현미경을 이용하여 측정한 후 최소 저해 농도를 구하였다 (도 4). 피부 상재균인 S. epidermidis 균, L. acidophilus 균, 대장균의 경우에는 녹차 잎 수용성 추출물은 2.0 mg/ml의 고농도에서도 적혈구의 응집 저해 활성을 보이지 않았다 (도 4). Erythrocyte agglutination was performed using cultured S. epidermidis , E. coli , Lactobacillus , and B. bifidus bacteria, and the minimum inhibitory concentration was determined using a microscope (FIG. 4). In the case of the skin flora, S. epidermidis , L. acidophilus , and Escherichia coli, green tea leaf soluble extract did not show the inhibitory activity of erythrocyte aggregation at high concentrations of 2.0 mg / ml (FIG. 4).

따라서 본 발명 대상인 녹차 수용성추출물은 P. acnes와 S. aureus 균에 의하여 유도되는 혈구 응집반응에 대해서는 높은 저해작용을 보이는 반면, 피부상재균 S. epidermidis, 대장균, Lactobacillus 균 등에 의한 혈구 응집반응에는 아무런 저해효과를 보이지 않았고, 이는 동물 섬유아세포를 이용한 부착저해 실험에서도 같은 효과를 확인하였다. 따라서 녹차 잎이라는 고유 자생식물 자원으로부터 특 이 유론산 당의 함량이 높은 수용성 추출물을 고수율로 분리하여, P. acnes와 S. aureus 균에 의한 피부질환 원인 균에 의한 인체세포 결합을 저해하는 활성을 확인하였다. 도 4는 녹차 수용성 추출물의 피부 상재균 S. epidermidis, 대장균, 유익균인 L. acidophilus, B. bifidum 혈구 응집반응 저해활성을 나타낸 것으로, 여드름 간균(P. acnes)와 황색포도상 구균(S. aureus)에 특이적임을 나타낸다.Therefore, green tea water soluble extract of the present invention showed high inhibitory effect on hemagglutination reaction induced by P. acnes and S. aureus bacteria, whereas no hemagglutination reaction by S. epidermidis , Escherichia coli, Lactobacillus bacteria, etc. It did not show an inhibitory effect, which confirmed the same effect in the adhesion inhibition experiment using animal fibroblasts. Therefore, water-soluble extracts with a high content of uronic acid sugars are separated from the native native plant called green tea leaves in high yield, thereby inhibiting the binding of human cells by P. acnes and S. aureus bacteria. Confirmed. Figure 4 shows the inhibitory activity of the skin supernatant S. epidermidis , Escherichia coli, beneficial bacteria L. acidophilus , B. bifidum hemagglutination of green tea soluble extract, P. acnes and S. aureus It is specific to.

[참고문헌][references]

도 1은 녹차 잎으로부터 수용성 추출물의 분리 및 정제과정을 나타낸 모식도이다.1 is a schematic diagram showing the separation and purification of water-soluble extracts from green tea leaves.

도 2는 녹차 수용성 추출물의 피부균에 대한 항부착 활성을 적혈구 응집반응으로 나타낸 현미경 사진이다.Figure 2 is a micrograph showing the anti-adhesion activity of the green tea water-soluble extract against the skin bacteria in the hemagglutination.

도 3은 피부 병원균의 동물 피부 섬유아세포 부착에 대한 녹차 수용성 추출물의 저해활성을 나타낸 것이다.Figure 3 shows the inhibitory activity of green tea water soluble extracts against animal skin fibroblast adhesion of skin pathogens.

도 4는 녹차 수용성 추출물의 피부 상재균, 유익균에 대한 혈구 응집반응 저해활성을 나타낸 것이다.Figure 4 shows the hemagglutination inhibitory activity against skin flora, beneficial bacteria of green tea soluble extract.

Claims

Method for preparing green tea soluble extract for preventing and treating acne and atopic skin diseases comprising the following steps:

a) hot water extracting the dried green tea leaves;

b) centrifuging the hot water extract and precipitating the supernatant with ethanol;

c) dissolving the ethanol precipitate in a phosphate buffer solution and treating with ribonuclease (Rnase) and DNAase (Dnase), and then precipitating again with ethanol; And

d) filtering the ethanol precipitate over a charcoal column comprising particulate activated carbon.

delete

A composition for the prevention and treatment of acne and atopic skin diseases, comprising the green tea water-soluble extract prepared by the method of claim 1 as an active ingredient.