KR100882762B1

KR100882762B1 - 혈관신생 마커로서 사용되는 폴리펩티드 및 이의 ｄｎａ

Info

Publication number: KR100882762B1
Application number: KR1020077022473A
Authority: KR
Inventors: 야스후미 사또; 히까루 소노다; 히데끼 오따
Original assignee: 시오노기세이야쿠가부시키가이샤; 야스후미 사또
Priority date: 2001-05-07
Filing date: 2002-04-26
Publication date: 2009-02-09
Also published as: US20080269129A1; CA2446327C; KR100817467B1; US7956036B2; JPWO2002090546A1; CA2446327A1; KR20060118619A; KR20040005950A; US20050158719A1; KR100781931B1; EP1391512A4; EP1391512A1; WO2002090546A1; KR20070106042A; US20110065641A1; JP4112374B2

Abstract

본 발명은 혈관신생, 혈관 질환, 염증 질환, 안내(眼內) 혈관신생 질환, 생식계 질환, 중추신경계 질환 및 암 마커;이의 검출 방법; 질환의 진단 키트; 및 질환의 치료용 약물을 제공할 의도이다. KIAA1036 은 난소암 및 직장암에서 과발현 및 제대 정맥 내피세포에서 발현을 보여주며, 상기 세포에서 DNA 합성, 세포 이동 및 루멘 형성을 저해하는 효과를 가진다. 상기 특성으로 인해, KIAA1036 은 혈관신생, 혈관 질환, 염증 질환, 안내(眼內) 혈관신생 질환, 생식계 질환, 중추신경계 질환 및 암에 대한 마커로서 유용하다. KIAA1036 은 또한 아고니스트, 길항제, DNA 합성 저해제, 세포 이동 저해제, 혈관신생 저해제 등을 스크리닝하는데 유용하다. 스크리닝에 의해 수득된 물질, KIAA1036 및 이의 항체는 전술한 질환의 치료제로서 유용하다.

KIAA1036, 혈관신생

Description

혈관신생 마커로서 사용되는 폴리펩티드 및 이의 ＤＮＡ {POLYPEPTIDE SERVING AS ANGIOGENIC MARKER AND DNA THEREOF}

본 발명은 혈관신생, 혈관 질환, 염증 질환, 안내(眼內) 혈관신생 질환, 생식계 질환, 중추신경계 질환 또는 암 마커로서 유용한 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 질환의 치료에 관한 것이다.

이중 어댑터(double adapter) 방법에 의해, 인간 게놈의 숏건 라이브러리를 구축하고, EST 클론인 AF055021 의 핵산 서열 (서열 번호 3)을 DNA 라이브러리를 이용하여 결정하였다 (ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, 236, 107-113 (1996)). 이어서, AF055021 의 전체 길이 cDNA 의 핵산 서열 (서열 번호 1)을 결정하고, KIAA1036 으로 명명하였다 (DNA Research, 6(3) 197-205 (1999)). KIAA1036 폴리펩티드 (서열 번호 2)는 365 개의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드이며, 기능은 아직 밝혀지지 않았다.

세포는 생체내에서 생존하기 위해 혈액으로부터 공급되는 산소 및 영양분을 필요로 하므로, 혈관신생은 급격히 증식하는 조직에서는 활발하다. 혈관신생은 조직의 생리학적 재생뿐만 아니라 병리학적 세포 증식에 동반되는 질환에 관계한 것으로 알려져 있다. 질환으로서, 혈관 질환, 염증 질환, 안내(眼內) 혈관신생 질환, 생식계 질환, 중추신경계 질환 및 암이 보고되었다 (Nature, 407, 249 (2000)). 혈관신생은 또한 악성 신생물 세포의 증식시 관찰되므로, 혈관 내피세포 성장 인자 (VEGF)로 처리된 인간 제대 정맥 내피세포 (HUVEC)는 암에 의해 야기된 혈관신생의 모델로서 보고되었다 (Cancer Research, 55, 5296-5301 (1995)).

전술한 다양한 질환에 관한 유전자 연구가 수행되었지만, 발병 기작은 완전히 밝혀지지 않았으며, 기작에 관한 미지의 유전자의 가능성이 존재한다. 이 상황에서, 전술한 질환의 발병에 관련된 신규 유전자의 확인 및 상기 유전자를 갖는 질환의 진단 절차가 요구된다.

발명의 개시

본 발명가는 KIAA1036 폴리펩티드의 발현은 난소암 및 직장암에서 증가한다는 것을 발견하고, 상기 펩티드가 암에 대한 마커로서 유용하다는 것을 확인하였다. 추가의 연구 결과로서, 이들은 KIAA1036 폴리펩티드가 혈관신생에 대한 신규 마커이며, 다양한 질환, 예컨대, 혈관신생과 관련된 혈관 질환, 염증 질환, 안내(眼內) 혈관신생 질환, 생식계 질환, 중추신경계 질환 또는 암의 마커 및 치료제로서 유용하다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 하기이다:

(1) 서열 번호 1 의 386 위치의 A 에서 1480 위치의 C 로 표시된 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편을 포함하는, 혈관신생, 혈관 질환, 염증 질환, 안내(眼內) 혈관신생 질환, 생식계 질환, 중추신경계 질환 또는 암에 대한 마커,

(2) 서열 번호 1의 1 위치의 C 에서 1480 위치의 C 로 표시된 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편을 포함하는, 혈관신생, 혈관 질환, 염증 질환, 안내(眼內) 혈관신생 질환, 생식계 질환, 중추신경계 질환 또는 암에 대한 마커,

(3) 서열 번호 1의 1 위치의 C 에서 1480 위치의 C 로 표시된 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편을 포함하는, (1)의 마커,

(4) 서열 번호 1의 1 위치의 C 에서 5481 위치의 C 로 표시된 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편을 포함하는, (1)의 마커,

(5) 서열 번호 2의 1 위치의 Met 에서 365 위치의 Val 로 표시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함하는, 혈관신생, 혈관 질환, 염증 질환, 안내(眼內) 혈관신생 질환, 생식계 질환, 중추신경계 질환 또는 암에 대한 마커,

(6) 하나 이상의 아미노산 잔기(들)이 서열 번호 2의 1 위치의 Met 에서 365 위치의 Val 로 표시된 아미노산 서열에서 결실, 치환 및 부가로부터 선택되는 돌연변이(들)을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함하는, 혈관신생, 혈관 질환, 염증 질환, 안내(眼內) 혈관신생 질환, 생식계 질환, 중추신경계 질환 또는 암에 대한 마커,

(7) 서열 번호 2의 1 위치의 Met 에서 365 위치의 Val 로 표시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함하는, (5) 의 마커,

(8) 인간 유래의 시료로부터 (1) 내지 (7) 중의 어느 하나의 마커의 검출 방법,

(9) 하기 공정을 포함하며, 서열 번호 1 의 386 위치의 A 에서 1480 위치의 C 로 표시된 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편을 이용하는, (1) 내지 (4) 중의 어느 하나의 마커의 검출 또는 분석 방법,

(a) 폴리뉴클레오티드 및 시료를 접촉시키는 공정, 및

(b) 폴리뉴클레오티드와 결합하는 폴리뉴클레오티드를 검출하는 공정,

(10) 하기 공정을 포함하며, 서열 번호 1의 386 위치의 A 에서 1480 위치의 C 로 표시된 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편을 이용하는, (1) 내지 (4) 중의 어느 하나의 마커의 검출 또는 분석 방법,

(a) cDNA 를 시료에서 제조하는 공정, 및

(b) cDNA 를 폴리뉴클레오티드 단편을 이용하여 증폭하고, 검출하는 공정,

(11) 하기 공정을 포함하며, 서열 번호 2의 1 위치의 Met 에서 365 위치의 Val 로 표시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 이의 단편을 인식하는 항체를 이용하는, (5) 내지 (7) 중의 어느 하나의 마커의 검출 또는 분석 방법,

(a) 항체 및 시료를 접촉시키는 공정, 및

(b) 항체와 폴리펩티드 사이의 결합을 검출하는 공정,

(12) (9) 내지 (11) 중의 어느 하나의 방법을 이용하는 것을 포함하는, (1) 내지 (7) 중의 어느 하나의 마커에 관련된 질환의 검출 방법,

(13) 질환이 혈관 질환, 염증 질환, 안내(眼內) 혈관신생 질환, 생식계 질환, 중추신경계 질환 또는 암인 (12) 의 검출 방법,

(14) (9) 내지 (11) 중의 어느 하나의 방법을 이용하는 것을 포함하는, (1) 내지 (7) 중의 어느 하나의 마커에 관련된 질환의 진단 키트,

(15) 질환이 혈관 질환, 염증 질환, 안내(眼內) 혈관신생 질환, 생식계 질환, 중추신경계 질환 또는 암인 (14) 의 진단 키트,

(16) 하기 공정을 포함하는, (5) 내지 (7) 중의 어느 하나의 마커의 결합 물질의 스크리닝 방법,

(a) (5) 내지 (7) 중의 어느 하나의 마커와 대상을 접촉시키는 공정, 및

(b) 마커와 대상 사이의 결합을 검출하는 공정,

(17) 서열 번호 2 로 표시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함하는, (16)의 결합 물질의 스크리닝 키트,

(18) 하기 공정을 포함하는, (5) 내지 (7) 중의 어느 하나의 마커와 마커의 결합 물질 사이의 결합을 조절하는 결합 활성 조절 물질의 스크리닝 방법,

(a) (5) 내지 (7) 중의 어느 하나의 마커와 마커의 결합 물질을 대상의 존재 또는 부재하에 접촉시키는 공정, 및

(b) 마커와 결합 물질의 결합 활성을 대상의 존재 또는 부재하에 비교하는 공정,

(19) 서열 번호 2 로 표시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함하는, (18)의 결합 활성 조절 물질의 스크리닝 키트,

(20) 하기 공정을 포함하는, (1) 내지 (7) 중의 어느 하나의 마커의 발현 조절 물질의 스크리닝 방법,

(a) (1) 내지 (7) 중의 어느 하나의 마커를 발현할 수 있는 세포와 대상을 접촉시키는 공정, 및

(b) 마커의 발현 수준의 변화를 (9) 내지 (11) 중의 어느 하나의 방법을 이용하여 검출하는 공정,

(21) (20)의 방법을 이용하는 것을 포함하는, (1) 내지 (7) 중의 어느 하나의 마커의 발현 조절 물질의 스크리닝 키트,

(22) 서열 번호 2의 1 위치의 Met 에서 365 위치의 Val 로 표시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함하는 DNA 합성 저해제,

(23) 서열 번호 2의 1 위치의 Met 에서 365 위치의 Val 로 표시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함하는 세포 이동 활성 저해제,

(24) (22)의 DNA 합성 저해제, (23)의 세포 이동 활성 저해제, 서열 번호 1로 표시된 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편, 서열 번호 1로 표시된 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편을 포함하는 인간 유전자 치료용 발현 벡터, 서열 번호 2 로 표시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 이의 단편 및 상기 폴리펩티드에 대한 항체로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 약학 조성물,

(25) 혈관 질환, 염증 질환, 안내(眼內) 혈관신생 질환, 생식계 질환, 중추신경계 질환 또는 암에 대한 치료제인 (24)의 약학 조성물,

(26) (24) 또는 (25)의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 혈관 질환, 염증 질환, 안내(眼內) 혈관신생 질환, 생식계 질환, 중추신경계 질환 또는 암의 치료 방법,

(27) (24) 또는 (25)의 약학 조성물을 제조하기 위한 서열 번호 1로 표시된 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 2 로 표시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 용도.

본 발명의 마커인 KIAA1036 폴리뉴클레오티드의 제조, 폴리펩티드의 제조, 재조합 벡터, 형질전환체, 이의 제조 방법, 항체, 폴리펩티드의 검출 방법, mRNA 의 검출 방법, 혈관신생, 혈관 질환, 염증 질환, 안내(眼內) 혈관신생 질환, 생식계 질환, 중추신경계 질환 또는 암의 검출 방법 및 진단 키트, 혈관 질환, 염증 질환, 안내(眼內) 혈관신생 질환, 생식계 질환, 중추신경계 질환 또는 암의 치료제 또는 치료 방법을 하기에 설명한다. 상기 기재에서, 지시가 없다면, 당해 분야에 주지된, 유전자 재조합 기술, 동물 세포, 곤충 세포, 효모 및 대장균에서 재조합 폴리펩티드의 생산 기술, 분자 생물학적 방법, 발현된 폴리펩티드의 분리 및 정제 방법, 분석 및 면역학적 방법을 채택한다.

본 발명의 마커는 "서열 번호 1의 386 위치의 A 에서 1480 위치의 C 로 표시된 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편" 및 KIAA1036 의 폴리뉴클레오티드 서열이다. 부가적으로, 본 발명의 마커는 "서열 번호 1의 1 위치의 C 에서 1480 위치의 C 로 표시된 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편" 및 "본 발명의 마커와 엄격한 조건하에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편"을 포함한다. 이후부터, 본 발명의 마커인 폴리뉴클레오티드를 폴리뉴클레오티드 A 로서 명명한다.

본 명세서에서, "혈관신생"은 신규 혈관이 기존의 혈관으로부터 생성되는 현 상을 의미한다. "혈관신생" 과 관련된 질환에는 "혈관 질환", "염증 질환", "안내(眼內) 혈관신생 질환", "생식계 질환", "중추신경계 질환" 또는 "암"이 포함된다.

"혈관 질환"에는 동맥경화, 고혈압, 협심증, 폐색성동맥경화증, 심근경색, 뇌경색, 당뇨병성 혈관장애 또는 혈관기형이 포함된다. "염증 질환"에는 간염, 폐렴, 사구체신염, 갑상선염, 골수염, 활막염, 골파괴, 연골파괴, 류마티스, 기관지 천식, 유육종증 (sarcoidosis), 크로우-푸카세 증후군 (Crow-Fukase syndrome), 판누스, 알레르기성 부종, 궤양, 복수증(hydroperitoneum), 복막경화 또는 조직 유착이 포함된다. "안내 혈관신생 질환"에는 당뇨병성 망막증, 망막정맥폐색증 또는 노화황반변성이 포함된다. "생식계 질환"에는 자궁기능부전, 태반기능부전, 난소기능과항진 또는 난포낭종이 포함된다. "중추신경계 질환" 에는 망막증, 뇌졸중, 혈관성치매 또는 알츠하이머 질환이 포함된다. "암" 에는 고형종, 혈관종, 혈관내피종, 육종, 육종 또는 조혈기종상과 같은 악성 신생물, 난소암 또는 대장암이 포함된다. 부가적으로, 상기 암의 전이를 포함한다.

"엄격한 조건하에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드"는 프로브로서 폴리뉴클레오티드 A 의 단편을 이용하여, 예컨대, 콜로니 혼성화, 플라크 혼성화, 또는 서던 블롯팅 혼성화를 이용하여 당 분야에서 일반적으로 공지된, 통상의 방법으로 수득가능한 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 상기 폴리뉴클레오티드의 예에는 콜로니 또는 플라크 유래의 폴리뉴클레오티드가 고정된 막을 이용하여 0.7 내지 1.0M NaCl 의 존재하에 65℃ 에서 혼성화 및 농도가 0.1 배 내지 2 배인 SSC (Saline Sodium Citrate; 150mM 염화나트륨, 15mM 시트르산 나트륨) 용액을 이용하여 65℃에서 막의 세정에 의해 수득된 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 혼성화는 또한 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제 2 판 (1989)(Cold Spring Harbor Laboratory Press)], [Current Protocols in Molecular Biology (1994)(Wiley-Interscience)], [DNA Cloning 1: Core Techniques, A practical Approach, 제 2 판 (1995)(Oxford University Press)]에 기재된 방법으로 수행될 수 있다. 바람직하게는, 단지 아데닌(a) 또는 티민(T)로 이루어지는 서열은 엄격한 조건하에 혼성화하는 서열로부터 제외된다. "폴리뉴클레오티드의 단편"에는 서열 번호 1의 염기 서열에서 5 개 이상의 연속적인 염기를 포함하는 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 예컨대, 5, 8, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 50, 100, 500 또는 1000 개의 염기를 포함하는 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 포함된다.

본 명세서에서, "혼성화하는 폴리뉴클레오티드"에는 상기 혼성화 조건하에 따른 폴리뉴클레오티드와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 상기 폴리뉴클레오티드의 예에는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 의 염기 서열과 적어도 60% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 상동성은 예컨대, Altshcul 등에 의해 개발 중인 알고리즘을 이용한 검색 프로그램 BLAST 를 이용함으로써 스코어로서 보여진다 (The Journal of Molecular Biology, 215, 403-410 (1990)).

본 발명의 마커에는 "서열 번호 2의 1 위치의 Met 에서 365 위치의 Val 로 표시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 이의 단편", 이의 염을 포함하는 KIAA1036 의 폴리펩티드 서열이 포함된다. "염" 에는 산 또는 염기와 생리적으로 허용가능한 염이 포함된다. 산과의 염이 특히 바람직하다. 염에는 예컨대, 무기산, 예컨대, 염산, 인산, 브롬화수소산 또는 황산과의 염, 또는 유기산, 예컨대, 아세트산, 포름산, 프로피온산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 타르타르산, 시트르산, 말산, 옥살산, 벤조산, 메탄술폰산 또는 벤젠술폰산과의 염이 포함된다. "폴리펩티드의 단편"에는 서열 번호 2의 아미노산 서열에서 5 개 이상의 연속적인 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드 서열, 예컨대, 5, 8, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 50, 또는 100 개의 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 포함된다.

본 발명의 마커에는 "서열 번호 2의 1 위치의 Met 에서 365 위치의 Val 로 표시된 아미노산 서열의 1 개 또는 수 개의 아미노산 잔기(들)에서 결실, 치환 및 부가로부터 선택되는 돌연변이를 갖는 폴리펩티드 또는 이의 단편"이 포함된다. 이후부터, 본 발명의 마커인 폴리펩티드를 폴리펩티드 B 라 명명한다.

"1 개 또는 수 개의 아미노산 잔기(들)"은 부위 특이적 변이유발법 등에 의해 결실, 치환 또는 부가할 수 있는 아미노산 잔기를 의미한다. 즉, 이는 50 개 이하, 바람직하게는 30 개 이하, 더욱 바람직하게는 20 개 이하, 더 더욱 바람직하게는 10 개 이하의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 잔기를 의미한다. 더욱이, 폴리펩티드 B 에는 결실, 치환 또는 부가 후에서 조차 혈관신생, 혈관 질환, 염증 질환, 안내 혈관신생 질환, 생식계 질환, 중추신경계 질환 또는 암에 대한 마 커로서 사용되는 폴리펩티드가 포함된다. 이는 예컨대, 아미노산 서열 2 와 적어도 60% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 폴리펩티드이다.

본 명세서에서, "마커" 에는 혈관신생 및 생물 시료 유래의 혈관신생과 관련된 모든 종류의 질환, 예컨대, 혈관 질환, 염증 질환, 안내 혈관신생 질환, 생식계 질환, 중추신경계 질환 또는 암을 검출하기 위해 사용되는 물질이 포함된다. 그리고, 이에는 폴리뉴클레오티드 A 및 폴리펩티드 B 가 포함된다. mRNA 또는 단백질은 질환의 발현이 증가 또는 감소하는 경우에 "마커"일 수 있다. 상기 마커의 예에는 서열 번호 2의 1 위치의 Met 에서 365 위치의 Val 로 표시된 아미노산 서열을 포함하는 KIAA1036 폴리펩티드, 서열 번호 1의 386 위치의 A 에서 1480 위치의 C 로 표시된 염기 서열을 갖는 KIAA1036 폴리뉴클레오티드, 이의 상보적인 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편이 포함된다.

본 명세서에서, 용어는 특별히 다르게 언급되지 않는다면, 당해 분야에서 통상의 의미로 사용된다. 본 명세서에서 특히 사용된 용어는 하기에 설명된다.

"항체"는 당해 분야에서 일반적인 항체를 의미하며, 모든 항체, 이의 단편, 유도체, 접합물 또는 변형된 항체를 포함한다. 폴리펩티드 B 또는 이의 단편을 인식하는 항체가 바람직하며, 상기 폴리펩티드를 특이적으로 인식하는 항체가 더욱 바람직하며, 폴리펩티드를 단일 특이적으로 인식하는 항체가 더 더욱 바람직하다. 상기 항체에는 다클론 항체 또는 단클론 항체가 포함된다.

본 발명의 마커의 "검출 또는 정량화"는 면역분석법 또는 분자생물학적 분석 법을 포함하는 임의의 적당한 방법에 의해 수행될 수 있다.

마커가 폴리펩티드 B 일 경우에, 상기 방법에는 예컨대, 면역분석법, 예컨대, ELISA (효소결합 면역흡수 분석법), RIA (방사성 면역분석법), 형광 항체 기술, 웨스턴 블롯 또는 면역 구조 염색법이 포함된다.

폴리펩티드 B 또는 이의 단편에 대한 항체를 사용함으로써, 혈관신생, 혈관 질환, 염증 질환, 안내 혈관신생 질환, 생식계 질환, 중추신경계 질환 또는 암을 검출하거나 정량화할 수 있다. 본 발명의 마커는 상기 질환에 대한 마커로서 사용될 수 있으므로, 상기 항체를 이용한 질환의 검출 또는 정량화 방법은 면역분석법 뿐만 아니라, 폴리펩티드의 검출 또는 정량화를 포함하는 임의의 적당한 방법에 의해 수행될 수 있다.

본 발명은 폴리펩티드 B 또는 이의 단편에 대한 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 혈관신생, 혈관 질환, 염증 질환, 안내 혈관신생 질환, 생식계 질환, 중추신경계 질환 또는 암의 진단 키트에 관한 것이다. 상기 키트에는 적어도 폴리펩티드 B 또는 이의 단편에 대한 항체 및 폴리펩티드 B 의 표준 시약이 포함된다. 폴리펩티드 B 는 혈관신생, 혈관 질환, 염증 질환, 안내 혈관신생 질환, 생식계 질환, 중추신경계 질환 또는 암에 대한 마커로서 사용될 수 있으므로, 이는 면역학적 뿐만 아니라 면역분석법에 의한 검출 또는 정량화의 전술한 방법으로 측정할 수 있다.

마커가 mRNA 와 같은 폴리뉴클레오티드인 경우에, 분석법에는 분자생물학적 분석법, 예컨대, 노던 블롯, 돗 블롯 또는 중합효소 연쇄반응 (PCR)이 포함된다.

mRNA 는 프로브 또는 프라이머로서 폴리뉴클레오티드 A 또는 이의 단편을 사용함으로써 검출되거나 정량화될 수 있다.

본 발명의 마커는 상기 질환의 마커일 수 있으므로, 프로브 또는 프라이머를 이용한 질환의 검출 또는 정량화 방법은 분자생물학적 분석법 뿐만 아니라 폴리뉴클레오티드의 검출 또는 정량화의 상기 방법을 포함한 적당한 방법에 의해 수행될 수 있다.

프로브 또는 프라이머에는 서열 번호 1 의 염기 서열에서 연속적인 염기를 포함하는 뉴클레오티드, 예컨대, 5, 8, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 또는 60 개의 염기를 포함하는 염기 서열이 포함된다. 이에는 동일한 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드의 서열에 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 이의 유도체가 포함된다. 이의 유도체에는 예컨대, 올리고뉴클레오티드내의 포스포디에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합 또는 N3'-P5' 으로 전환된 올리고뉴클레오티드, 리보오스 및 포스포디에스테르 결합이 펩티드 결합으로 전환된 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드내의 우라실이 C-5 프로피오닐 우라실 또는 C-5 티아졸 우라실로 치환된 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드내의 시토신이 페녹사진으로 변형된 올리고뉴클레오티드 또는 DNA 내의 리보오스가 2'-O-프로필 리보오스, 2'-메톡시에톡시 리보오스 등으로 치환된 올리고뉴클레오티드가 포함된다. 상기 폴리뉴클레오티드가 예컨대, 유전자 마커, PCR 용 프라이머 또는 혼성화용 프로브로서 유용하다.

본 발명은 폴리펩티드 B 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 부분 또는 전부 및 표준 시약으로서 폴리뉴클레오티드를 포함하는 혈관 질환, 염증 질환, 안내 혈관신생 질환, 생식계 질환, 중추신경계 질환 또는 암의 진단 키트에 관한 것이다. 이 키트에는 적어도 폴리뉴클레오티드 A 또는 이의 단편에 대한 프로브 또는 프라이머 및 폴리뉴클레오티드 A 의 표준 시약이 포함된다. 폴리뉴클레오티드 A 는 혈관신생, 혈관 질환, 염증 질환, 안내 혈관신생 질환, 생식계 질환, 중추신경계 질환 또는 암에 대한 마커로서 사용될 수 있으므로, 이는 분자생물학적으로 뿐만 아니라 분자생물학적 분석법에 의한 검출 또는 정량화의 상기 방법으로 측정될 수 있다.

DNA 의 전사 또는 mRNA 의 번역은 폴리뉴클레오티드 A 를 사용함으로써 저해될 수 있다. 폴리펩티드 B 의 DNA 의 전사 또는 mRNA 의 번역을 저해하는 방법은 폴리뉴클레오티드 A 의 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 A 또는 올리고뉴클레오티드와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드 A 의 염기 서열에서 연속적인 5 내지 60 개의 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드에 상보적인 서열을 갖는 유도체 올리고뉴클레오티드를 적당히 제조하고, 당해 분야에 공지된 안티센스 RNA/DNA 기술을 이용함으로써 제공될 수 있다.

본 발명은 본 발명의 마커의 "결합 물질의 스크리닝 방법"에 관한 것이다. "결합 물질"에는 본 발명의 마커에 결합하는 임의의 물질이 포함된다. 결합 물질에는 예컨대, 저분자량 물질, 폴리뉴클레오티드 또는 수용체 및 항체와 같은 폴리펩티드가 포함된다. "결합 물질의 스크리닝 방법"은 당해 기술 분야에 주 지된 기술을 적절히 이용함으로써 수행될 수 있다. 이에는 예컨대, 생물분석법 및 결합 분석법이 포함된다.

본 발명의 "결합 물질의 스크리닝 키트" 에는 적어도 본 발명의 마커가 포함된다. 결합 물질은 상기 키트를 이용한 생화학적 방법으로 스크리닝될 수 있다.

부가적으로 본 발명은 "결합 활성 조절 물질의 스크리닝 방법"에 관한 것이다. "결합 활성 조절"은 본 발명의 마커 및 결합 물질의 결합 활성이 증가되거나 감소되며, "결합 활성"이 Percent Maximum Binding (PMB)로 평가되는 것을 의미한다. "결합 활성 조절 물질" 에는 본 발명의 마커에 대한 결합 물질의 결합 활성을 증가시키거나 감소시키는 물질, 예컨대, 아고니스트(agonist) 또는 길항제가 포함된다. 상기 물질에는 예컨대, 저분자량 물질, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 포함된다. "결합 활성 조절 물질의 스크리닝 방법" 은 당해 분야에 주지된 기술을 적절히 이용함으로써 수행될 수 있다. 결합 활성 조절 물질은 본 발명의 스크리닝 방법으로 스크리닝할 수 있다. 방법은 예컨대, 생물분석법 및 결합 분석법이다.

본 발명의 "결합 활성 조절 물질의 스크리닝 키트" 에는 적어도 본 발명의 마커가 포함된다. 결합 활성 조절 물질은 본 발명의 키트를 이용한 생화학적 방법으로 스크리닝될 수 있다.

또한, 본 발명은 "발현 조절 물질의 스크리닝 방법"에 관한 것이다. 발현 수준은 표적 세포에서 발현되는 본 발명의 마커의 양을 의미한다. 발현 수 준은 폴리펩티드 B 에 대한 항체를 이용한 면역분석법, 예컨대, ELISA, RIA, 형광 하체 기술 또는 면역 구조 염색법 또는 폴리뉴클레오티드 A 의 mRNA 를 측정하는 분자생물학적 분석법, 예컨대, 노던 블롯 혼성화, 돗 블롯 또는 RT-PCR 을 포함하는 적당한 방법으로 평가될 수 있다. "발현 조절"은 상기 면역학적 또는 분자생물학적 분석법을 포함한 임의의 적당한 방법으로 평가된 단백질 또는 mRNA 내의 본 발명의 마커의 발현 수준이 증가되거나 감소되는 것을 의미한다. "발현 조절 물질"에는 상기 면역학적 또는 분자생물학적 분석법을 포함한 임의의 적당한 방법으로 평가될 수 있는, 단백질 또는 mRNA 수준에서 본 발명의 마커의 발현 수준을 증가시키거나 감소시키는 물질이 포함된다. 상기 물질에는 예컨대, 저분자량 물질, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 포함된다. "발현 조절 물질의 스크리닝 방법" 은 당해 분야에 주지된 기술을 적절히 이용함으로써 수행될 수 있다. 발현 조절 물질은 본 발명의 스크리닝 방법으로 스크리닝될 수 있다. 상기 방법에는 예컨대, 생물분석법 및 결합 분석법이 포함된다.

본 발명의 "발현 조절 물질의 스크리닝 키트" 에는 적어도 본 발명의 마커가 포함된다. 발현 조절 물질은 본 발명의 키트를 이용한 발현 조절 물질의 스크리닝 방법에 기초한 생화학적 방법으로 스크리닝될 수 있다.

폴리펩티드 B 는 혈관 내피세포 내의 DNA 합성 및 혈관 내피세포의 이동 활성을 저해하므로, 폴리뉴클레오티드 A, 상기 폴리뉴클레오티드의 상보적인 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 B 또는/및 상기 폴리펩티드에 대한 항체가 DNA 합성 저해제 또는/및 세포 이동 활성 저해제일 수 있다. 이어서, 본 발명은 DNA 합성 저 해제 및 세포 이동 활성 저해제를 제공한다.

본 발명의 "약학 조성물"에는 폴리펩티드 B, 상기 폴리펩디드에 대한 항체, 폴리뉴클레오티드 A, 상기 폴리뉴클레오티드의 상보적인 폴리뉴클레오티드, DNA 합성 저해제, 세포 이동 활성 저해제, 결합 물질, 결합 활성 조절 물질 및 발현 조절 물질로부터 선택된 하나 이상이 포함된다. 이는 특정 질환, 예컨대, 혈관 질환, 염증 질환, 안내(眼內) 혈관신생 질환, 생식계 질환, 중추신경계 질환 또는 암의 치료제로서 사용될 수 있다. 상기 물질에는 예컨대, 저분자량 물질, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 포함된다. 서열 번호 2의 1 위치의 Met 에서 365 위치의 Val 로 표시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 이의 단편이 바람직하다. 본 발명의 약학 조성물에는 "유전자 치료용 발현 벡터"가 포함된다. "유전자 치료용 발현 벡터" 에는 폴리뉴클레오티드 A 의 전부 또는 일부가 삽입된 발현 벡터 및 세포/조직내에 유전자를 도입함으로써 세포내에 정상 유전자를 삽입하고, 유전자의 결함을 수복/변형하고, 유전자의 발현을 조절하는 벡터가 포함된다. 벡터에는 복제능이 결여된 바이러스의 염기 서열의 일부 또는 전부가 치료 유전자로 대체되는 바이러스 벡터가 포함된다. 이어서, 본 발명은 상기 질환의 치료제 또는 치료 방법을 제공한다.

"치료 방법" 에는 상기 약학 조성물의 투여에 의해 혈관신생과 관련된 특정 질환, 예컨대, 혈관 질환, 염증 질환, 안내(眼內) 혈관신생 질환, 생식계 질환, 중추신경계 질환 또는 암의 치료 방법이 포함된다.

이후부터, 본 발명은 상세히 기재된다.

(1) KIAA1036 폴리펩티드의 제조

cDNA 라이브러리를 인간 뇌, 심장, 골격근, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 상기 조직의 인간 정상 세포, 인간 제대 정맥 내피세포 또는 인간 난소암 또는 인간 대장암으로부터 통상의 방법으로 제조한다.

cDNA 라이브러리를 제조하는 방법은 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제 2 판 (1989)(Cold Spring Harbor Laboratory Press)], [Current Protocols in Molecular Biology (1994)(Wiley-Interscience)], 또는 [DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, 제 2 판 (1995)(Oxford University Press)]에 기재된 방법 또는 시판되는 키트, 예컨대, cDNA 합성용 SuperScript Plasmid System 및 Plasmid Cloning (Invitrogen) 또는 ZAP-cDNA Synthesis Kits (STRATAGENE) 을 사용한 방법이다.

상기 방법으로 수득된 cDNA 는 예컨대, 서열 번호 2의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 이다. 상기 cDNA 의 예에는 서열 번호 1의 염기 서열을 포함하는 DNA 가 포함된다. 서열 번호 1의 DNA 를 포함하는 플라스미드는 예컨대, 하기 실시예에 기재된 플라스미드이다.

수득된 DNA 를 적당한 발현 벡터에 삽입하고, 발현 플라스미드를 구축한다. 발현 벡터를 적당한 숙주내로 도입한 후, 형질전환체를 수득할 수 있다. 발현 벡터는 cDNA 를 삽입하고, 동물 세포에서 발현하는 임의의 벡터이다. 벡터는 예컨대, pcDNA1.1, pcDNA1.1/Amp, pCDM8, pREP (Invitrogen), pHM6, pHB6 (Roche Diagonistics), pKK223-3, pGEX (Amersham Pharmacia Bioteque), pET-3, pET-11, pBluescriptII SK(+), pBluescriptII SK(-) (STRATAGENE), pUC19, pTrxFus (Invitrogen), pUC18, pSTV28 (TaKaRa), pMAL-c2X (New England Biolabs), pAGE107 (Cytotechnology, 3(2), 133-140 (1990); JP1991-22979), pAGE103 (The Journal of Biochemistry, 101(5), 1307-1310 (1987)), pAMo, pAMoA (The Journal of Biological Chemistry, 268(30), 22782-22787 (1993)), pAMoPRSA (JP1993-336963) 또는 pAS3-3 (JP1990-227075) 이다.

cDNA 인서트를 갖는 발현 벡터는 표적 cDNA 를 임의의 동물 세포 내로 도입하고, 형질전환된 세포를 수득한다. DNA 를 도입하는 임의의 방법이 숙주내로 발현 벡터를 도입하는 방법으로서 사용될 수 있다. 숙주가 동물 세포인 경우에, 이는 예컨대, 전기천공법 (Cytotechnology, 3(2), 133-140 (1990)), 칼슘 포스페이트법 (JP1990-227075) 또는 리포펙션법 (Proceedings of the National Academy of Science USA, 84, 7413 (1987); Virology, 52, 456 (1973))이다.

발현 벡터용 적당한 세포 또는 조직을 숙주로 사용할 수 있다. 이는 예컨대, 동물 세포이다. 숙주로서 동물 세포는 예컨대, Namalwa (Burkitt 림프종, ATCC:CRL-1432) 및 인간 유래의 확립된 세포인 서브라인 NamalwaKJM-1, HCT-15 (인간 대장암 세포, ATCC:CCL-225), 원숭이 유래의 확립된 세포인 COS-1 (아프리카 녹색 원숭이 신장세포 (SV40 형질전환된 세포), ATCC:CRL-1650) 및 COS-7 (아프리카 녹색 원숭이 신장세포 (SV40 형질전환된 세포), ATCC:CRL-1651) 또는 햄스터 유래의 확립된 세포인 CHO-K1 (차이니즈 햄스터 난소세포, ATCC:CCL-61) 및 HBT5637 (JP1987-299) 이다. Namalwa 세포, NamalwaKJM-1 세포 또는 HCT-15 세포가 바 람직하다.

본 발명의 형질전환체는 당해 분야에 일반적으로 공지된, 통상의 방법으로 배양한다. 이는 형질전환 숙주에 적합한 배지를 이용하여 수행될 수 있으며, 액체 배지가 액체 배지를 배양하는 배지로서 적합하다. 예컨대, MEM 배지 (Science, 130, 432(1959)), D-MEM 배지 (Virology, 8, 396 (1959)), RPMI 1640 배지 (The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)), YT 배지 또는 BEM 배지를 사용할 수 있다.

숙주로서 동물 세포를 이용하여 제조된 형질전환체를 배양할 경우에, 예컨대, 소 태아 혈청 (FCS)을 MEM 배지, D-MEM 배지 또는 PRIM 배지에 적당하게 첨가한 배지를 사용할 수 있다. 배지는 임의로 발현 벡터의 프로모터의 전사 활성을 증가시키기 위해 전사 활성을 증가시키는 물질을 포함할 수 있다. 예컨대, 이소프로필-1-티오-β-D-갈락토피라노신 (IPTG) 를 사용할 수 있다.

배지는 형질전환체를 키우기 위해 필요한 영양분, 예컨대, 글루코오스, 아미노산, 펩톤, 비타민, 호르몬 또는 혈청, 바람직하게는, FCS, 염화칼슘 또는 염화마그네슘을 포함한다. 임의의 조성을 갖는 이와 같은 배지가 사용될 수 있고, 시판되는 배지가 사용될 수 있다. 배양을 5% CO₂ 의 존재하에 25 내지 40℃에서 pH 6.0 내지 8.0 에서 유지한다.

수득된 형질전환 세포를 통상의 방법으로 배양한다. 예컨대, 이들은 하기 배양법으로 배양할 수 있다. 형질전환체가 동물 세포인 경우에, 세포를 배 양하는 배지의 예에는 통상 사용되는 RPMI1640 배지 (The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)), Eagle 의 MEM 배지 (Science, 122, 501(1952)), D-MEM 배지 (Virology, 8, 396 (1959)), 199 배지 (Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)) 또는 소 태아 혈청 (FCS)이 첨가된 배지가 포함된다.

배양을 1 내지 7 일 동안 5% CO₂ 의 존재하에 25 내지 40℃에서 pH 6 내지 8 에서 통상 수행한다. 항생제, 예컨대, 카나마이신, 페니실린 또는 스트렙토마이신은 임의로 배양 동안 첨가될 수 있다.

혈관신생 마커인 KIAA1036 을 코딩하는 DNA는 인간 뇌, 심장, 골격근, 비장, 신장, 간, 폐, 태반, 상기 조직의 인간 정상 세포, 인간 제대 정맥 내피세포 또는 인간 난소암 또는 인간 대장암으로부터 전술한 방법으로 수득될 수 있다.

아미노산 서열에 기초하여, KIAA1036 을 코딩하는 DNA 를 화학적 합성으로 제조할 수 있다. DNA 의 화학적 합성은 티오포스파이트 방법을 이용한 DNA 합성기 (Shimazu Corporation) 또는 포스포아미다이트 방법을 이용한 DNA 합성기 모델 392 (PerkinElmer, Inc.)을 이용하여 수행할 수 있다.

하기 올리고뉴클레오티드를 센스 프라이머 (서열 번호 4) 또는 안티센스 프라이머 (서열 번호 5)로 사용하고, 상기 DNA 의 상보적인 mRNA 를 발현하는 세포에서 mRNA 로부터 제조된 cDNA 를 주형으로서 사용한다. 표적 DNA 를 상기 조건하에 PCR 로 제조할 수 있다.

(2) KIAA1036 폴리펩티드의 제조

KIAA1036 은 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제 2 판 (1989)(Cold Spring Harbor Laboratory Press)] 또는 [Current Protocols in Molecular Biology (1994)(Wiley-Interscience)]에 기재된 방법으로 제조될 수 있다. 예컨대, KIAA1036 폴리뉴클레오티드가 하기 방법으로 숙주 세포에서 발현되도록 제조되고, KIAA1036 가 제조될 수 있다.

KIAA1036 폴리펩티드를 코딩하는 전체 길이 DNA 에 기초하여, 폴리펩티드를 코딩하는 일부를 포함하는 적당한 길이의 DNA 단편을 임의로 제조한다. 폴리펩티드를 코딩하는 염기 서열이 숙주에서 발현하기에 가장 적합하도록, 염기 치환된 DNA 를 제조한다. 이 DNA 는 폴리펩티드의 생산성을 증가시키는데 유용하다. DNA 단편 또는 전체 길이 DNA 를 적당한 발현 벡터의 프로모터의 하류에 삽입함으로써, 재조합 DNA (재조합 벡터)를 제조한다. 재조합 벡터에 의해 발현 벡터에 적응된 숙주 세포에서 제조하고, KIAA1036 폴리펩티드를 생산하는 형질전환체를 수득할 수 있다.

표적 유전자가 세포에서 발현된다면, 임의의 세포, 예컨대, 원핵세포, 효모, 동물 세포, 식물 세포 또는 곤충 세포를 숙주 세포로서 사용할 수 있다. 발현 벡터로서, 상기 숙주 세포에서 자가 복제할 수 있고, 염색체내로 삽입될 수 있으며, KIAA1036 폴리펩티드 유전자의 전사를 위한 적당한 위치에서 프로모터를 포함하는 벡터를 사용할 수 있다.

(i) 원핵세포를 숙주로서 사용한 경우

KIAA1036 의 발현 벡터는 원핵세포에서 자가 복제할 수 있을 뿐만 아니라, 바람직하게는 프로모터, 리보좀 결합 서열, KIAA1036 및 전사 종결 서열을 이용하여 구축된다. 프로모터를 조절하는 유전자를 포함할 수 있다.

발현 벡터는 예컨대, pBTrp2, pBTacl, pBTac2 (Roche Diagnostics), BluescriptII SK(+), pBluescriptII SK(-) (STRATAGENE), pSTV28, pUC118, pUC19(TaKaRa), pKK233-2 (Pharmacia), pSE28O, pSupex, pUB11O, pTP5, pC194, pTrxFus (Invitrogen), pGEMEX-1 (Promega), pQE-8 (QIAGEN), pGEX (Pharmacia), pETsystem (Novagen), pMAL-c2 (New England BioLabs), pKYP1O (JP1982-110600), pKYP200 (Agricultural Biological Chemistry, 48, 669(1984)), pLSA1 (Agricultural Biological Chemistry 53, 277(1989)), pGEL1 (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 82, 4306(1985)), pEG400 (Journal of Bacteriology, 172, 2392(1990)), pTrs3O (FERM BP-5407), pTrs32 (FERM BP-5408), pGHA2 (FERM BP-400), pGKA2 (FERM BP-6798), pPA1 (JP1987-233798) or pTerm2 (JP1990-22979, US4686191, US4939094, US5160735) 이다.

대장균(Escherichia coli)과 같은 숙주 세포에서 발현할 수 있는 임의의 프로모터가 사용될 수 있다. 예컨대, 이는 대장균 또는 파아지 유래의 프로모터, 예컨대, trp 프로모터 (Ptrp), lac 프로모터 (Plac), PL 프로모터, PR 프로모터 또는 PSE 프로모터, SPO1 프로모터, SPO2 프로모터 또는 penP 프로모터이다. 인공적으로 변형된 프로모터, 예컨대, 2 개의 Ptrps 를 일련으로 연결한 프로모터 (Ptrp x 2), tac 프로모터, lacT7 프로모터 또는 letI 프로모터를 사용할 수 있다.

리보좀 결합 서열인 샤인-달가르노 (Shine-Dalgarno) 서열 및 개시 코돈 사이의 거리가 적당한 거리, 예컨대, 6 내지 8 개의 염기로 조절된 플라스미드가 바람직하다. 전사 종결 서열이 KIAA1036 폴리뉴클레오티드의 발현에 항상 필요하지는 않으나, 전사 종결 서열이 구조 유전자의 오른쪽 하류에 위치하는 것이 바람직하다.

숙주 세포는 예컨대, 에셰리키아(Escherichia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 마이크로박테리움(Microbacterium) 속 또는 슈도모나스(Pseudomonas) 속의 원핵세포, 예컨대, 에셰리키아(Escherichia) 속으로서 대장균의 XL1-Blue 균주, XL2-Blue 균주, DJJ1 균주, MC1000 균주, KY3276 균주, W1485 균주, JM1O9 균주, HB1O1 균주, No.49 균주, W3110 균주, NY49 균주, BL21 (DE3) 균주, BL21 (DE3) pLysS 균주, HMS174 (DE3) 균주 또는 HMS174 (DE3) pLysS 균주, 세라티아(Serratia) 속으로서 에스. 피카리아(S.ficaria) 균주, 에스. 폰티콜라(S.fonticola) 균주, 에스.리쿠에파시엔스(S.liquefaciens) 균주 또는 에스. 마르세센스(S.marcescens) 균주, 바실러스(Bacillus) 속으로서 비. 서틸리스(B.subtilis) 균주 또는 비. 아밀로리쿠에파시엔스(B.amyloliquefaciens) 균주, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속으로서 비. 암모니아게네스(B.ammoniagenes) 균주, 비. 임마리오필룸(B.Immariophilum) (ATCC:14068) 균주 또는 비. 사카로리티쿰(B.saccharolyticum) (ATCC:14066) 균주, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속으로서 시. 글루타미쿰 (C.glutamicum) (ATCC:13032) 균주, 시. 글루타미 쿰(C.glutamicum)(ATCC:14067) 균주, 시. 글루타미쿰(C.glutamicum)(ATCC:13869) 균주 또는 시. 아세토아시도필룸(C.acetoacidophilum)(ATCC:13870) 균주, 마이크로박테리움(Microbacterium) 속으로서 엠. 암모니아풀룸(M.ammoniaphulum)(ATCC:15354) 균주 또는 슈도모나스(Pseudomonas) 속으로서 에스. 메피티카(S.mephitica) 균주이다.

상기 숙주 세포에 DNA 를 도입하는 임의의 방법, 예컨대 전기천공법 (Nucleic Acids Research, 16, 6127(1988)), 칼슘 포스페이트법 (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 69, 2110(1972)), 원형질법 (JP1987-2483942) 또는 [Gene, 17, 107(1982)] 또는 [Molecular & General Genetics, 168, 111(1979)]에 기재된 방법이 재조합 벡터의 도입 방법으로서 사용될 수 있다.

(ii) 효모를 숙주로 이용하는 경우

효모를 숙주로 이용하는 경우에, 발현 벡터는, 예컨대, YEp13 (ATCC:37115), YEp24 (ATCC:37051), YCp5O (ATCC:37419), pHS19 또는 pHS15 이다.

효모에서 발현하는 임의의 프로모터는 프로모터로서 사용될 수 있는데, 이는 예컨대, ADH1 (알코올 탈수소효소) 프로모터, PHO5 (산 포스파타아제) 프로모터, PGK1 (포스포글리세레이트 키나아제) 프로모터, GNPDH (글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소) 프로모터, GALl (갈락토오스 키나아제) 프로모터, GAL1O (UDP 갈락토오스-4-에피머라아제) 프로모터, MFα1 (α페로몬) 프로모터 또는 CUP1 (메탈로티오네인) 프로모터이다.

숙주는, 예컨대, 사카로마이세스(Saccharomyces) 속의 에스. 세레비지 애(S.cerevisiae) 종, 쉬조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 속의 에스. 폼베(S.pombe) 종, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 속의 케이. 락티스(K.lactis) 종, 트리코스포론(Trichosporon) 속의 티. 풀루란스(T.pullulans) 종, 쉬와니오마이세스(Schwanniomyces) 속의 에스. 알루비우스(S.alluvius) 종 또는 피키아(Pichia) 속의 피. 파스토리스(P.pastoris) 종이다.

숙주 세포에 DNA 를 도입하는 임의의 방법, 예컨대 전기천공법 (Methods in Enzymology, 194, 182(1990)), 등형질체(spheroplast)법 (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84, 1929(1978)) 또는 리튬 아세테이트법 (Journal of Bacteriology, 153, 163(1983) 또는 Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 75, 1929(1978))이 재조합 벡터의 도입 방법으로서 사용될 수 있다.

(iii) 동물 세포를 숙주로 이용하는 경우

동물 세포를 숙주로 이용하는 경우에, 발현 벡터는, 예컨대, pcDNA1/Amp, pcDNA1, pCDM8, pREP4 (Invitrogen), pAGE107 (Cytotechnology, 3, 133(1990)), pAGE103 (The Journal of Biochemistry 101, 1307(1987)), pAMo, pAMoA (pAMoPRSA) (The Journal of Biological Chemistry, 268, 22782-22787(1993)) 또는 pAS3-3 (JP1990-22705)이다.

숙주에서 발현하는 임의의 프로모터는 프로모터로서 사용될 수 있는데, 이는 예컨대, 인간 시토메갈로바이러스 (hCMV)의 IE (극초기) 유전자 프로모터, SV40 의 초기 프로모터, 몰로니 뮤린 류레미아 바이러스 (Moloney Murine Leulemia Virus) 의 장 말단 반복 프로모터, 레트로바이러스 프로모터, HSP 프로모터, SRα프로모터 또는 메탈로티오네인 프로모터이다.

숙주로서 동물 세포는 예컨대, 인간 유래의 확립된 세포의 HEK293 (인간 태아 신장세포, ATCC:CRL-1573), Namalwa (Burkitt 림프종, ATCC:CRL-1432), HeLa (자궁경부암 세포, ATCC:CCL-2), UBT5637 (백혈병 세포, JP1987-299), BALL-1 (백혈병 세포) 또는 HCT-15 (대장암 세포), 마우스 유래의 확립된 세포의 Sp2/0-Ag14 (마우스 골수종 세포, ATCC:CRL-1581) 또는 NSO (마우스 골수종 세포), 원숭이 유래의 확립된 세포의 COS-l (아프리카 녹색 원숭이 신장세포 (SV4O 형질전환된 세포), ATCC:CRL-1650) 또는 COS-7 (아프리카 녹색 원숭이 신장세포 (SV4O 형질전환된 세포), ATCC:CRL-1651), 햄스터 유래의 확립된 세포의 CHO-K1 (차이니즈 햄스터 난소세포, ATCC:CCL-61) 또는 BHK-21 (C-13)(시실리안 햄스터 신장세포, ATCC:CCL-l0), 래트 유래의 확립된 세포의 PC12 (부신 수질암, ATCC:CRL-1721) 또는 YB2/0 (래트 골수종 세포, ATCC:CRL-1662)이다.

숙주 세포에 DNA 를 도입하는 임의의 방법, 예컨대 전기천공법 (Cytotechnology, 3, 133, (1990)), 칼슘 포스페이트법 (JP1990-22705) 또는 리포펙션법 (Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 84, 7413(1987) 또는 Virology 52, 456 (1973))이 재조합 벡터의 도입 방법으로서 사용될 수 있다.

(iv) 식물 세포를 숙주로 이용하는 경우

식물 세포를 숙주로 이용하는 경우에, 폴리펩티드를 주지의 방법으로 생산할 수 있다 (The Tissue Culture, 20(1994), The Tissue Culture, 21(1995) 또는 Trends in Biotechnology, 15, 45(1997)). 발현 벡터는 예컨대, Ti 플라스미드 또는 담배 모자이크 바이러스 벡터이다. 식물 세포에서 발현할 수 있는 임의의 프로모터는 유전자 발현용 프로모터로서 사용될 수 있는데, 예컨대, 카울리플라워 모자이크 바이러스(Cauliflower mosaic virus) (CaMV)의 35S 프로모터 또는 벼 액틴 1 프로모터이다. 유전자의 발현 생산성은 프로모터와 발현 산물 사이에 옥수수의 알코올 탈수소효소의 인트론 1을 삽입함으로써 증가될 수 있다.

숙주는 예컨대, 식물 세포, 예컨대, 감자, 담배, 옥수수, 벼, 평지, 대두, 토마토, 당근, 밀, 보리, 호밀, 알팔파 또는 아마이다.

숙주 세포에 DNA 를 도입하는 임의의 방법, 예컨대 아그로박테리움(Agrobacterium) (JP1983-140885, JP1984-70080 또는 W094/00977), 전기천공법 (JP1984-251887) 또는 입자총 (유전자총)법 (JP2606856, JP2517813)이 재조합 벡터의 도입 방법으로서 사용될 수 있다.

(v) 곤충 세포를 숙주로 이용하는 경우

곤충 세포를 숙주로 이용하는 경우에, 전달 벡터는 예컨대, pVL1392, pVL1393 또는 pBlueBacIII (Invitrogen) 이고, 감염용 바이러스는 예컨대, 마메스트라 브라시코에(Mamestra brassicoe) 패밀리의 곤충을 감염시키는 배큘로바이러스(Vaculovirus); 오토그라파 캘리포니카(Autographa californica) 핵 폴리헤드론형성 바이러스(Autographa california nuclear polyhedrosis virus) (AcMNPV) Bac-N-Blue DNA 이다. 곤충 세포의 형질전환 방법은 예컨대, [Baculovirus Expression Vector: A Laboratory Manual (1992) (W.H.Freeman and Company), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제 2 판 (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press), Current Protocols in Molecular Biology (1994) (Wiley-InterScience) 또는 Biotechnology 6, 47(1988)]에 기재된 방법이다.

곤충 세포로의 감염용 표적 유전자 및 배큘로바이러스 DNA 를 포함하는 전달 벡터를 배양물에 첨가하고, 재조합으로 제조된 표적 유전자를 발현하는 바이러스를 곤충 세포에 감염시켜 폴리펩티드를 발현하게 한다.

숙주로서 곤충 세포는 예컨대, 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) (마메스트라 브라시코에(Mamestra brassicoe)) 유래의 확립된 세포 또는 트리코플루시아 엔아이(Trichoplusia ni) 유래의 확립된 세포이다. 예컨대, 에스. 프루기페르다(S.frugiperda) 유래의 세포에는 Sf9 (ATCC: CRL-l711, 난소세포) 또는 Sf21 (난소세포)이고, 티. 엔아(T.ni) 유래의 세포 균주는 예컨대, High Five 또는 BTI-TN-5B1-4 (난세포, Invitrogen)이다.

숙주에 DNA 를 도입하는 임의의 방법, 예컨대 칼슘 포스페이트법 (JP1990-22705) 또는 리포펙션법 (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84, 7413(1987))이 재조합 벡터의 도입 방법으로서 사용될 수 있다. 그리고, 전기천공법 (Cytotechnology 3, 133(1990))을 동물 세포에서와 같이 사용할 수 있다.

(vi) 배양 방법

본 발명의 KIAA1O36 폴리펩티드를 코딩하는 삽입된 DNA를 갖는 재조합 벡터를 갖는 형질전환체가 대장균, 효모, 동물 세포 또는 식물 세포인 경우에, 모든 종 류의 숙주에 적합한 통상의 배양 방법에 의한 배양을 한다. 그리고, 형질전환체 또는 배양액으로부터 폴리펩티드를 생산하고, 축적하고, 수합하여 폴리펩티드를 제조한다. 형질전환체가 동물 또는 식물인 경우에, 이들을 모든 종류의 숙주에 적합한 통상의 성장 방법에 의해 배양한다. 그리고, 동물 또는 식물로부터 폴리펩티드를 생산하고, 축적하고, 수합하여 폴리펩티드를 제조한다.

숙주가 동물인 경우에, 예컨대, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 갖는 비인간 트랜스제닉 동물을 배양한다. 그리고, 재조합 DNA 에 의해 코딩되는 KIAA1O36 폴리펩티드를 동물에서 생산하고, 축적하고, 이들을 동물로부터 수합하여 KIAA1O36 폴리펩티드를 제조한다. 동물에서 생산/축적 위치는 예컨대, 동물의 우유, 침 또는 알이다.

숙주가 식물인 경우에, 예컨대, 본 발명의 KIAA1O36 폴리뉴클레오티드를 갖는 트랜스제닉 식물을 배양한다. 그리고, 재조합 DNA 에 의해 코딩되는 KIAA1O36 폴리펩티드를 식물에서 생산하거나 축적하고, 식물로부터 수합하여 KIAA1O36 폴리펩티드를 제조한다.

숙주가 대장균과 같은 원핵생물 또는 효모와 같은 진핵생물인 경우에, 예컨대, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 갖는 형질전환체를 배지에서 배양한다. 그리고, 재조합 DNA 에 의해 코딩되는 KIAA1O36 폴리펩티드를 배양액에서 생산하거나 축적하고, 배양물로부터 수합하여 본 발명의 폴리펩티드를 제조한다.

본 발명의 KIAA1036 의 형질전환체를 배지에서 배양하는 방법은 배양을 위한 통상의 방법으로 수행한다.

숙주가 대장균과 같은 원핵생물 또는 진핵생물인 경우에, 숙주가 동화할 수 있는 탄소원, 질소원 및 미네랄을 갖고, 형질전환체의 배양이 효율적으로 유지되는 배지라면, 천연 배지 또는 합성 배지를 수득된 형질전환체가 배양된 배지로서 사용할 수 있다. 예컨대, 박토트립톤, 효모추출액 및 염화나트륨을 포함하는 YT 배지가 숙주가 대장균인 형질전환체를 배양하는 경우에 배지로서 바람직하다.

각각의 미생물이 동화할 수 있는 임의의 탄소원, 예컨대, 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 이를 포함하는 시럽, 전분 또는 전분 가수분해물과 같은 탄수화물, 아세트산 또는 프로피온산과 같은 유기산 또는 에탄올 또는 프로판올과 같은 알코올을 사용할 수 있다.

질소원은 예컨대, 모든 종류의 무기산, 예컨대, 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 아세트산 암모늄, 인산 암모늄, 유기산의 암모늄염, 기타 질소성 물질, 펩톤, 육류 추출액, 효모추출액, 옥수수 침지수 농축물(corn steep liquor), 카세인 가수분해물, 대두 케이크, 대두 케이크 가수분해물, 모든 종류의 박테리아 또는 섭식물이다.

미네랄은 예컨대, 제1인산칼륨, 제2인산칼륨, 인산 마그네슘, 황산 마그네슘, 염화나트륨, 황산철, 황산 망간, 황산구리 또는 탄산칼슘이다. 배양을 호기 조건, 예컨대, 진탕 배양 또는 침지 배양하에 유지한다.

배양 온도는 바람직하게는 15 내지 40℃이고, 배양 시간은 통상 5 시간 내지 7 일이다. 배양 동안, pH 는 3.0 내지 9.0 으로 유지된다. pH 의 조정은 무기산 또는 유기산, 알칼리 용액, 우레아, 탄산칼슘 또는 암모니아로 유지한다. 그리고, 항생제, 예컨대, 암피실린 또는 테트라사이클린을 임의로 배양 동안 배지에 첨가할 수 있다.

유도성 프로모터를 갖는 발현 벡터로 형질전환한 미생물을 배양할 경우에, 유도물질을 임의로 배지에 첨가한다. 예컨대, lac 프로모터를 갖는 발현 벡터로 형질전환한 형질전환체를 배양할 경우에, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드를 배지에 첨가할 수 있다. trp 프로모터를 갖는 발현 벡터로 형질전환한 형질전환체를 배양할 경우에, 인돌아크릴산을 배지에 첨가할 수 있다. 유전자가 도입된 식물의 세포 및 기관은 자(jar) 발효기를 이용한 대량 배양을 할 수 있다. 배양 배지는 예컨대, 통상적으로 사용되는 무라시게 및 스쿠그(Murashige & Skoog)(MS) 배지, White 배지, 또는 옥신 또는 시토키닌과 같은 식물 호르몬을 상기 배지에 첨가한 배지이다.

KIAA1036 폴리펩티드의 제조용 형질전환체가 동물 세포인 경우에, 세포를 배양하는 배지는 통상적으로 사용되는 RPMI1640 배지 (The Journal of the American Medical Association, 199, 519(1967)), MEM 배지 (Science, 130, 432(1959)), D-MEM 배지 (Virology 8, 396(1959)), 199 배지 (Proceedings of the Society for the Biological Medicine, 73, 1(1950)) 또는 태아 소 혈청 (FCS)을 상기 배지에 첨가한 배지이다.

배양을 1 내지 7 일 동안 5% CO₂ 의 존재하에 25 내지 40℃에서 pH 6 내지 8 에서 통상 수행한다. 항생제, 예컨대, 카나마이신, 페니실린 또는 스트렙토마 이신은 임의로 배양 동안 배지에 첨가될 수 있다.

형질전환체가 곤충 세포인 경우에, 배양 배지는 통상적으로 사용되는 TNM-FH 배지 (Pharmingen), Sf-90011 SFM 배지 (Invitrogen), ExCell400, ExCell4O5 (JRH Biosciences Inc.) 또는 Grace 곤충 배지(Nature, 195, 788(1962))이다.

(vii) 제조 방법

형질전환체를 배양하고, KIAA1036 폴리펩티드를 배양물로부터 분리하고, 정제하여 KIAA1036 폴리펩티드를 제조한다. KIAA1036 폴리펩티드의 분리/정제 방법은 당해 분야에 주지된 통상의 방법, 예컨대, 효소의 분리/정제 방법 또는 Sandler 에 의한 트랜스글루코실라아제의 정제 방법일 수 있다 (Methods in Enzymology 83, 458).

KIAA1036 폴리펩티드를 용해된 폴리펩티드로서 생산하고 축적할 경우에, 전술한 형질전환체를 배양한 배양액을 예컨대, 원심 분리에 의해 세포 또는 진균체 및 배지로 분리한다. 추출된 세포 또는 진균체를 적당한 완충액, 예컨대, STE 용액으로 세정하고, 초음파, 프렌치 프레스, Manton Gaulin 균질기 또는 다이노밀(Dynomill)로 분쇄한 후에, KIAA1036 폴리펩티드가 숙주 세포에 존재하는 경우에, KIAA1036 폴리펩티드는 원심분리 또는 여과에 의해 무세포 용액으로서 수득될 수 있다.

적당한 양의 계면활성제를 KIAA1036 폴리펩티드의 분리/정제용 완충액에 포함할 수 있다. 예컨대, 소듐 라우릴 술페이트 (SDS) 또는 소듐 N-도데카노일사르코시네이트(사르코실)를 사용할 수 있다.

수득된 조(crude) 물질에 포함된 표적 단백질의 분리/정제 방법은 모든 종류의 주지된 분리/정제 방법의 조합으로 수행될 수 있다. 주지된 방법은 예컨대, 용매 추출법, 황산암모늄을 이용한 염석법, 투석, 유기용매를 이용한 침강, 한외여과법, 겔 여과, 모든 종류의 크로마토그래피, 예컨대, 디에틸아미노에틸 (DEAE)-세파로오스 크로마토그래피, DIMON HPA-75 (Mitsubishi Chemical Corporation)과 같은 라이신을 이용한 음이온 크로마토그래피 또는 이온 교환 크로마토그래피, S-세파로오스 FF (Pharmacia)과 같은 라이신을 이용한 양이온 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피 또는 부틸세파로오스와 같은 친화성 크로마토그래피 또는 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 일렉트로 포커싱 전기영동과 같은 모든 종류의 전기영동이다. 친화성 크로마토그래피는 KIAA1036 폴리펩티드에 대한 항체를 이용하여 수행할 수 있다.

KIAA1036 폴리펩티드를 불용성 폴리펩티드로서 생산하고 축적할 경우에, 세포 또는 진균체는 전술한 바와 같이 분리하고, 적당한 방법으로 분쇄한다. 폴리펩티드를 포함하는 분액을 수합한다. 수합된 시료를 계면활성제, 예컨대, 소듐 라우릴 술페이트 (SDS) 또는 소듐 N-도데카노일사르코시네이트(사르코실)과 같은 용해제로서 용해한다. 용해된 용액을 용해제가 포함되지 않거나 거의 포함되지 않는 농도로 희석하거나 투석하고, 폴리펩티드를 정상 입체 구조로 구축하고, 정제 시료를 전술한 분리/정제 방법으로 수득할 수 있다.

KIAA1036 폴리펩티드는 다른 단백질과 융합 단백질로서 제조될 수 있고, 융합 단백질과 친화성을 갖는 물질을 이용하여 친화성 크로마토그래피로 정제할 수 있다 (Yamakawa Akio, "Experimental Medicine", 13, 469-474(1995)). 융합 단백질로서 사용된 부가적인 단백질은 예컨대, 단백질 A 또는 FLAG (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 86, 8227(1989), Genes Development, 4, 1288(1990), JP1993-336963 또는 JPl994-823021) 이다. 단백질 A 를 사용할 경우에, KIAA1O36 폴리펩티드와 단백질 A 를 갖는 융합 단백질을 제조하고, 면역글로불린 G 를 이용한 친화성 크로마토그래피로 정제할 수 있다. FLAG 펩티드를 사용할 경우에, KIAA1O36 폴리펩티드와 FLAG 를 갖는 융합 단백질을 제조하고, 항-FLAG 항체를 이용한 친화성 크로마토그래피로 정제할 수 있다.

KIAA1O36 폴리펩티드는 또한 시험관내 전사/번역 시스템 [(Journal of Biomolecular NMR, 6, 129-134(1995)), (Science, 242, 1162-1164(1988)) 또는 (The Journal of Biochemistry 110, 166-168(1991))]을 이용한 주지의 방법ㅇ로 제조될 수 있다.

KIAA1O36 폴리펩티드는 화학 합성법, 예컨대, Fmo 법 (플루오레닐메틸 옥시카르보닐법) 또는 tBoc 법 (t-부틸 옥시카르보닐법), 또는 시판되는 펩티드 합성 장치, 예컨대, APEX396 (Advanced Chemtech), 433A (Applied Biosystems), P53 (Protein Technologies), 9050 (Perseptive) 또는 PSSM-8 (Shimazu corporation)에 의해 아미노산 서열에 기초하여 화학합성될 수 있다.

KIAA1O36 폴리펩티드의 구조 분석은 단백질 화학의 분야에서의 통상적인 방법, 예컨대, "A protein structural analysis for gene cloning" (Hisashi Hirano, TOKYO KAGAKU DOZIN Co., LTD., 1993)에 기재된 방법으로 수행할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 코르딘(chordin) 활성은 주지된 분석법을 이용하여 측정할 수 있다 (The Journal of Biological Chemistry, 258, 9893-9898(1983)., The Journal of Biological Chemistry, 262, 15649-15658(1987)., The Journal of Biological Chemistry, 273, 58-65(1998)., The Journal of Biological Chemistry, 273, 433-440(1998)., The Journal of Biological Chemistry, 273, 12770-12778(1998)., Archives of Biochemistry and Biophysics, 270, 630-646(1989)., Archives of Biochemistry and Biophysics, 274, 14-25(1989). 또는 JP1994-181759).

(3) 변이체 폴리펩티드 돌연변이의 제조 방법

KIAA1O36 폴리펩티드의 결실, 치환 또는 부가는 주지의 기술인 부위 특이적 잠재적으로 돌연변이유발법에 의해 수행할 수 있다. 1 개 또는 수 개의 아미노산(들)의 결실, 치환 또는 부가는 하기에 기재된 방법으로 제조될 수 있다: Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 제 2 판 (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press.), Current Protocols in Molecular Biology (1994) (Wiley-InterScience), Nucleic Acids Research, 10, 6487(1982)., Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 79, 6409(1982)., Gene, 34, 315(1985)., Nucleic Acids Research, 13, 443 1(1985)., Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 82, 488(1985)., Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 81, 5662(1984)., Science, 224, 1431(1984)., W085/00817 또는 Nature, 316, 601(1985).

(4) KIAA1O36 폴리펩티드에 대한 항체의 제조

(i) 다클론 항체의 제조

항체는 항원으로서 전체 길이의 KIAA1036 폴리펩티드, 펩티드의 일부 또는 펩티드의 일부를 포함하는 폴리펩티드를 포유동물에게 제공함으로써 제조할 수 있다. 펩티드 자체 및 담체는 예컨대, 소혈청 알부민(BSA), 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin)(KLH) 또는 소 티로글로불린(bovine thyroglobulin)(BTG)와 조합된 담체를 항원으로서 사용할 수 있다. 항원과의 면역 반응을 증가시키기 위해, 예컨대, 완전 프로인트 보조제 (CFA) 및 불완전 프로인트 보조제 (IFA)를 제공할 수 있다. 마우스, 래트, 토끼, 염소 또는 햄스터를 면역하기 위한 포유동물로서 사용할 수 있다.

다클론 항체를 예컨대, Lane 등 (Antibodies: A Laboratory Manual, 제 2 판 (1989)(Cold Spring Harber Laboratory Press))의 방법으로 제조할 수 있다.

제 1 면역화 후에, 포유동물을 1 내지 2 주 간격으로 적당한 항원으로 3 내지 10 회 면역화한다. 이어서, 포유동물 유래의 혈청을 추출하고, 정제하여 항체를 생산한다.

항원을 1 내지 2 주 간격으로 3 내지 10 회 면역화한다. 항원의 바람직한 투여량은 동물 당 1회에 50 내지 100 ㎍ 이다. 펩티드를 사용할 경우에, 적당한 담체에 공유 결합된 펩티가 항원으로서 바람직하게 사용된다. 항원으로서 펩티드는 유전공학 방법 또는 펩티드 합성기로 합성될 수 있다. 면역화 후 3 내지 7 일에, 안저(eyeground)의 정맥얼기(venous plexus)의 혈액을 수합하고, 항원에 대한 혈청의 반응성을 효소결합 면역흡수 분석법(Enzyme-liked-immunosorbent assay (ELISA): Igaku-Shoin Ltd. (1976), Antibodies: A Laboratory Manual, 제 2 판 (1989)(Cold Spring Harbor Laboratory Press)으로 측정할 수 있다.

혈액을 면역화된 포유동물로부터 수합하고, 항체 역가를 측정한다. 혈액을 면역화된 동물이 충분한 항체 역가를 보여줄 때 수합한 후, 다클론 항체를 혈청으로부터 제조할 수 있다. 다클론 항체의 분리 및 정제는 단독으로 또는 모든 종류의 크로마토그래피, 예컨대, 원심분리, 황산암모늄을 이용한 염석법, 카프릴산 침전 (Antibodies: A Laboratory Manual, 제 2 판 (1989)(Cold Spring Harbor Laboratory Press), DEAE-세파로오스 칼럼, 음이온 교환 칼럼, 단백질 A 칼럼 또는 G-칼럼 또는 겔 여과 칼럼의 조합으로 수행할 수 있다.

(ii) 단클론 항체의 제조

(a) 항체를 생산하는 세포의 제조

(i) 에서 충분한 항체 역가가 수득된 후에, 비장 또는 림프절을 포유동물로부터 추출한다. 이어서, 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 비장 또는 림프절 유래의 항체 생산 세포와 골수종 세포를 융합함으로써 수득할 수 있다. 골수종 세포에 대해, 마우스 또는 래트로부터 확립된 세포주를 사용할 수 있다. 세포 융합을 이미 주지된 방법, 예컨대, Kohler 및 Milstein (Nature, 256, 495-497(1975))의 방법에 따라 수행할 수 있다.

KIAA1O36 폴리펩티드, 펩티드의 일부 또는 펩티드의 일부를 포함하는 폴리펩티드를 래트에 면역화한다. 래트가 충분한 항체 역가를 보여준 후 3 내지 7 일에, 래트를 최종적으로 항원으로 면역화하고, 이의 비장을 항체 생산 세포로서 추출한다. 비장을 MEM 배지 (Nissui Pharmaceutical Co. Ltd.)로 절단하고, 핀셋으로 풀어 놓는다. 이어서, 침전물을 1,200 rpm 에서 5 분 동안 원심분리 후에 수득한다. 비장세포를 Tris-염화암모늄 완충액 (pH 7.65)으로 1 내지 2 분 동안 첨전물을 처리하여 분리하여 적혈구를 제거한다. 비장세포를 MEM 배지로 3회 세정하고, 항체 생산 세포로서 사용한다.

(b) 골수종 세포의 제조

마우스 또는 래트 유래의 확립된 세포주를 골수종 세포로서 사용한다. 예컨대, 8-아자구아닌 내성 마우스 (BALB/c 유래), P3-X63Ag8-U1 균주 (하기에 P3-U1로서 기재됨) (Current Topics Microbiological Immunology 81, 1(1978). 또는 European Journal of Immunology 6, 511(1976).), SP2/0-Ag14 균주 (하기에 SP-2로서 기재됨) (Nature, 276, 269(1978).), P3-X63-Ag8653 균주 (하기에 653 으로서 기재됨) (Journal of Immunology, 123, 1548(1979).) 또는 P3-X63-Ag8 (하기에 X63 으로서 기재됨) (Nature, 256, 495(1975).)의 골수종 세포이다. 상기 세포주는 8-아자구아닌 배지 (15 ㎍/ml 8-아자구아닌 (1.5mM 글루타민, 5 ×10^-5M 2-메르캅토에탄올, 10 ㎍/ml 게나마이신 및 CSL 사가 제조한 10 % FCS 를 함유하는 RPMI164O 배지)을 포함하는 정상 배지)에서 계대배양하고, 세포 융합 전에 3 내지 4 일 동안 정상 배지에서 배양한다. 세포 융합을 위해 2 ×10⁷ 이상의 세포를 제조한다.

(c) 하이브리도마의 제조

(a)에서 제조된 항체 생산 세포 및 (b)에서 제조된 골수종 세포를 MEM 배지 또는 PBS (1L 당; 1.83 g 제2인산나트륨, 0.21 g 제1인산칼륨, 7.65 g NaC1, pH 7.2) 로 세정하고, 항체 생산 세포의 수를 골수종 세포의 것보다 5 내지 10 배 크게 혼합한다. 1,200 rpm 에서 5 분 동안 원심분리 후에, 침전물을 수득한다. 침전된 세포를 잘 풀어 놓고, 10⁸ 항체 생산 세포 당 0.2 내지 1 ml 의 폴리에틸렌 글리콜 용액 (2g 폴리에틸렌 글리콜-1000 (PEG-10OO), 2 ml MEM 배지, 0.7 ml 디메틸 술폭시드 (DMSO))을 교반하면서 37℃에서 세포에 첨가한다. 이어서, 1 내지 2 ml 의 MEM 배지를 1 내지 2 분 마다 수회 첨가한다. MEM 배지를 이용하여 총 50 ml로 용액을 제조한다. 900 rpm 에서 5 분 동안 원심분리 후에, 100 ml의 HAT 배지 (10^-4 M 하이포크산틴, 1.5 ×10^-5 M 티민 및 4 ×10^-7 M 아미노프테린을 함유하는 정상 배지)를 침전물에 첨가하고, 침전물을 천천히 풀어 놓고, 현탁한다.

현탁액을 웰당 100㎕로 96 웰 배양 플레이트에 쏟고, 37℃에서 7 내지 14 일 동안 5% CO₂ 의 존재하에 배양하였다. "Enzyme immunoassay"(Antibodies: A Laboratory Manual, 제 2 판 (1989)(Cold Spring Harbor Laboratory Press))에 기재된 방법에 따라, KIAA1O36 폴리펩티드와 특이적으로 반응하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 선택한다.

(5) KIAA1036 폴리펩티드의 면역분석법

효소, 형광물질, 방사성동위원소 또는 라텍스에 직접 또는 간접으로 결합된, 폴리펩디드 또는 펩티드의 일부를 인식하는 항체를 사용하여 폴리펩디드 또는 펩티 드의 일부를 측정하는 방법을 KIAA1036 폴리펩티드의 면역분석법으로서 사용할 수 있다. 분석법은 예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제 또는 알칼리 포스파타아제와 같은 효소 활성을 검출하는 ELISA 또는 화학발광법, 루미놀 또는 GFP (녹색 형광 단백질)과 같은 형광 표지를 검출하는 FITC 법, ¹²⁵I 와 같은 방사성동위원소를 검출하는 RIA 법 또는 라텍스와의 결합을 검출하는 라텍스 응집법이다.

분석법은 예컨대, 웨스턴 블롯팅 또는 면역구조 염색법이다.

더욱이, KIAA1036 폴리펩티드 또는 펩티드의 일부를 분석법으로 정량화할 수 있다.

면역분석법용 항체는 고체상 담체에 고정될 수 있고, 포획된 폴리펩티드를 리포터기 또는 시약을 이용한 2 차 항체를 이용함으로써 검출할 수 있다. KIAA1036 폴리펩티드를 리포터기로 표지하고, 항체 및 시료와 반응하고, 고정된 항체와 결합하는 경쟁법을 이용하여 검출할 수 있다. 시료의 KIAA1036 폴리펩티드에 의한 표지된 폴리펩티드 및 항체의 결합 저해의 수준은 시료의 고정된 항체와의 반응성에 의해 보여지며, 시료내의 KIAA1036 폴리펩티드의 농도를 계산할 수 있다. 항체가 부착하고, 당업자에게 주지된 임의이 물질을 고체상 담체로서 사용할 수 있다. 물질에는 예컨대, 마이크로타이터 플레이트, 니트로셀룰로오스막과 같은 막, 비드, 디스크, 유리, 유리섬유, 가소성 물질, 예컨대, 라텍스, 폴리스티렌 또는 폴리비닐 클로라이드가 포함된다. 자성입자 또는 섬유광학 센서 (US 5359681)를 사용할 수 있다. 당해 분야에서 사용된 주지의 방법을 항체를 담체 에 고정하는 방법으로서 사용할 수 있다. 본 명세서에서, "고체상"은 담체상에 흡착과 같은 물리적인 방법 또는 항체와 작용기 사이의 공유결합에 의한 화학결합에 의한 고정화를 의미한다. 담체 상의 항체 및 작용기는 직접 또는 가교제를 통해 결합될 수 있다.

물리적인 방법에 의한 고정화는 적당한 시간 동안 적당한 완충액에서, 담체, 바람직하게는, 마이크로타이터 플레이트 또는 막과 접촉한 적당히 희석된 항체로 수행할 수 있다. 접촉 시간은 온도에 따라 다르나, 전형적으로 약 1 시간 내지 1 일이다. 약 10 ng 내지 1 ㎍, 바람직하게는, 약 100 내지 200 ng 의 항체를 첨가하고, 폴리스티렌 또는 폴리비닐 클로라이드와 같은 플라스틱으로 제조된 마이크로타이터 플레이트의 각 웰 상에 고정한다.

화학적인 방법에 의한 고정화는 담체와 항체의 작용기의 반응, 예컨대, 담체와 수산기와 아미노기 및 담체와 반응하는 2 작용기 시약의 반응에 의해 수행될 수 있다. 예컨대, 항체는 벤조퀴논을 이용한 공유결합 또는 담체 상의 알데히드기 및 아민 또는 조합 파트너 상의 활성 수소 사이의 축합을 갖는 적당한 중합체 코트를 갖는 담체에 고정될 수 있다. 방법은 예컨대, 참고자료로서 [Pierce immunotechnology Catalog and Handbook (1991) A12 내지 A13]을 이용하여 수행할 수 있다.

담체 고정된 항체를 적당한 차단제, 예컨대, 소혈청 알부민 또는 Tween 20 (Sigma-Aldrich)을 이용하여 당업자에게 주지된 방법에 의해 다른 폴리펩티드의 물리적인 흡착을 저해하도록 처리한다.

담체 고정된 항체를 시료와 반응시키고, 본 발명의 폴리펩티드 및 항체를 결합한다. 시료를 적당한 희석액, 예컨대, 인산 완충 염용액 (PBS)으로 적당히 희석할 수 있다. 시료 및 항체의 반응 시간은 암을 가진 개인으로부터 수득된 시료에서 본 발명의 폴리펩티드의 존재를 검출하도록 충분해야 하며, 바람직하게는 결합 및 미결합 폴리펩티드가 평형화된 수준과 비교하여 95% 이상의 결합 수준을 달성하는 시간이다. 평형에 도달하는 시간은 시간에 따른 결합 수준을 측정함으로써 용이하게 결정할 수 있다. 결합된 폴리펩티드 이외의 물질은 고체 담체를 적당한 완충액, 예컨대, PBS (0.1% Tween 20 을 포함)로 세정함으로써 제거할 수 있다. 표지된 2 차 항체를 고체 담체와 반응시킨다. 표지는 바람직하게는 호스래디쉬 퍼옥시다아제와 같은 효소, 기질, 보충원소, 저해제, 안료, 방사성동위원소, 발색 물질 또는 형광물질이다. 항체와 표지 사이의 결합은 당업자에게 주지된 방법으로 수행할 수 있다. 2 차 항체는 고정된 항체 및 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 복합체에 결합하도록 충분한 시간 동안 반응한다. 적당한 시간은 시간에 따른 결합 수준을 측정함으로써 용이하게 결정할 수 있다. 미결합 2 차 항체는 고체 담체를 적당한 완충액, 예컨대, PBS (0.1% Tween 20 을 포함)로 세정함으로써 제거할 수 있다. 2 차 항체의 표지의 검출 방법은 표지의 종류에 따라 상이하다. 방사성동위원소를 표지로서 사용할 경우에, 섬광계수기 또는 오토라디오그라피에 의한 검출을 사용할 수 있다. 안료, 발색 물질 또는 형광 물질을 표지로서 사용할 경우에, 분광 광도계에 의한 검출을 사용할 수 있다. 효소를 표지로서 사용할 경우에, 기질을 효소에 대한 기질을 첨가하고, 고정된 시간 동안 반응하고, 생성물을 분광 광도계로 검출한다. 표지 및 2 차 항체는 아비딘-바이오틴 방법에 의해 직접 또는 간접으로 결합할 수 있다. 이들이 간접으로 결합할 경우에, 아비딘-바이오틴의 한 부분은 2 차 항체에 결합되고, 또 다른 부분은 표지에 결합된다. KIAA1036 폴리펩디드는 플로우 스루 (flow through) 시험 또는 스트립 시험으로 검출할 수 있다. 플로우 스루 시험에서, 시료를 항체가 고정된 니트로셀룰로오스막에 첨가하고, 시료가 막을 통과할 때, 폴리펩티드를 고정된 항체에 결합시켜 면역 복합체를 형성한다. 표지된 2 차 항체를 포함하는 용액이 막을 통과할 때, 이는 면역 복합체에 결합한다. 스트립 시험에서, 시료를 첨가하면, 시료는 표지된 항체를 포함하는 영역을 통과하고, 폴리펩티드가 표지된 항체에 결합하여 면역 복합체를 형성한다. 시료가 고체상 항체를 포함하는 영역을 통과할 경우에, 폴리펩티드가 면역 복합체에 결합한다. 고정된 항체를 갖는 영역에서 검출된 2 차 항체의 양은 암의 존재 또는 부재를 보여준다. 검출 부분에서의 표지는 확인을 위해 가시화될 수 있다. 이것이 확인될 수 없다면, 이는 음성 결과를 보여준다. 막에 고정된 항체의 양은 바람직하게는 약 25ng 내지 1 ㎍, 더욱 바람직하게는 약 50ng 내지 1 ㎍이다.

(6) mRNA 의 분석

KIAA1036 폴리뉴클레오티드로부터 제조된 올리고뉴클레오티드를 이용하여, mRNA 를 노던 혼성화 또는 RT-PCR 로 정량화한 후, KIAA1036 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 정량할 수 있다.

mRNA 를 정상 또는 질환 모델 동물, 예컨대, 마우스, 래트, 토끼, 양, 돼지, 소, 고양이, 개 또는 원숭이를 이용하여 정량할 경우에, 항암제와 같은 물질을 임의로 제공한다. 고정된 시간 후에, 기관 또는 조직, 예컨대, 혈액, 뇌, 위 또는 신장을 분리하고, 세포를 제조한다. mRNA 를 당해 분야에서 주지된, 통상의 방법으로 수득된 세포로부터 추출하고, RT-PCR 또는 노던 블롯 혼성화로 정량/분석할 수 있다.

KIAA1036 폴리펩티드 또는 펩티드의 일부를 발현하는 형질전환체의 mRNA 를 정량할 경우에, mRNA 를 당해 분야에서 주지된, 통상의 방법으로 형질전환체로부터 추출하고, RT-PCR 또는 노던 블롯 혼성화로 정량/분석할 수 있다.

(7) 유전자 구조의 확인

최근에, 기능이 알려지지 않은 수 많은 인간 게놈 서열이 데이타베이스에 등록되었다. 그러므로, KIAA1036 폴리뉴클레오티드 서열과 데이타베이스에 등록된 인간 게놈 서열을 비교함으로써, KIAA1036 폴리펩티드를 코딩하는 인간 유전자를 확인하고, 유전자의 구조를 명확히 할 수 있다. cDNA 서열과 일치하는 게놈 서열이 등록된다면, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 프로모터 영역 및 엑손 및 인트론의 구조를 cDNA 서열과 유전자 서열을 비교함으로써 스크리닝할 수 있다. 프로브로서 KIAA1036 폴리뉴클레오티드를 이용하고, 당해 분야에 주지된, 통상의 방법 (Division of Oncology, Institute of Medical Science, Univ. of Tokyo, New Protocol for Molecular and Cellular Biology, Shujunsba(1993))을 이용하여, 유전자의 프로모터 영역을 수득할 수 있다. 프로모터 영역은 포유동물 세포에서 KIAA1036 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 전사와 관련된 모든 프로모터 영역이다.

(8) 질환의 검출 방법

발현이 혈관신생에서 증가하기 때문에, KIAA1036 폴리펩티드는 혈관신생, 예컨대, 혈관 질환, 염증 질환, 안내 혈관신생 질환, 생식계 질환, 중추신경계 질환 또는 암에 관련된 질환의 진단에 사용될 수 있다. 더욱이, 폴리펩티드의 발현이 난소암 및 대장암에서 증가하므로, 상기 암의 진단에 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드 또는 mRNA 와 같은 폴리뉴클레오티드는 생물 시료, 예컨대, 암 또는 정상 조직 시료, 해부 조직, 혈액, 림프절, 혈청, 환자로부터 수득된 소변 또는 다른 조직 및 이의 균질액 또는 추출액으로부터 특이적으로 검출된다. 환자에서 암의 존재 또는 부재는 환자와 정상인 또는 정상 조직에서의 발현 수준을 비교함으로써 결정될 수 있다.

질환의 검출 방법에는 예컨대, 폴리펩티드의 검출의 면역분석법 또는 분자생물학적 방법이 포함된다.

폴리펩티드의 면역분석법에는 예컨대, 샌드위치 ELISA 가 포함된다. 이 방법에서, 폴리펩티드의 상이한 에피토프를 인식하는 한 쌍의 항체가 사용되며, 하나의 항체는 효소로 직접 또는 간접으로 표지된다. 또 다른 방법은 ¹²⁵I 와 같은 방사성동위원소로 표지된 폴리펩티드를 사용하고, 항체가 이를 인식하는 경쟁 RIA 이다.

검출의 분자생물학적 방법에는 예컨대, 인 시투(in situ) 혼성화 또는 PCR 이 포함된다. PCR 은 환자의 생물 시료로부터 분리된 mRNA 로부터 제조된 cDNA 를 증폭하기 위해 사용될 수 있다. PCR 에 대한 프라이머는 서열 번호 1 의 DNA 서열에 기초하여 화학적으로 합성될 수 있다. 프라이머 l 이 서열 번호 4의 올리고뉴클레오티드 (5'-GTTCAGGACTGTCTTTCAGC-3')이거나, 또는 프라이머 2 가 서열 번호 5의 올리고뉴클레오티드 (5'-GTCAATACTGATGGACTTGC-3')인 것이 바람직하다. PCR 로 증폭된 cDNA 는 겔 전기영동으로 분리한 후, 당업자에게 주지된 방법으로 볼 수 있게 된다. 통상, 시료를 동일한 개인 또는 상이한 개인의 암 조직 및 정상 조직인 한 쌍의 조직으로부터 적당히 제조하고, PCR 을 한다. PCR 에 의한 증폭 반응은 바람직하게는 주형 cDNA 의 연속적인 2 자리수 희석을 행한다. 일부 희석 포인트에서, 정상 시료와 비교하여 암 시료의 발현에서 두 배 이상의 증가는 양성 결과로서 고려된다.

암의 존재 또는 부재는 정상 시료 및 환자 시료에서 검출된 본 발명의 마커를 측정하고, 비교함으로써 판단한다. 일반적으로, 암이 없는 건강한 사람 유래의 마커의 평균값을 컷오프 값으로 고려하고, 컷오프 값을 환자 시료 유래의 마커의 검출값과 비교한다. 일반적으로, 검출값이 표준 편차 + 컷오프 값의 3 배 이상일 경우에, 시료를 암에 관하여 양성으로 고려한다. 컷오프 값은 [Sackett 등, Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicene 106-107, (1985)(Little Brown and Co)]에 기재된 Receiver Oparator Curve 로 결정한다.

(9) 진단 키트

KIAA1O36 폴리뉴클레오티드는 노던 혼성화 또는 PCR 에 의해 혈관신생 관련 된 질환, 예컨대, 혈관 질환, 염증 질환, 안내 혈관신생 질환, 생식계 질환, 중추신경계 질환 또는 난소암 또는 대장암과 같은 암의 진단에 사용될 수 있다. 혈관신생 관련된 질환, 예컨대, 혈관 질환, 염증 질환, 안내 혈관신생 질환, 생식계 질환, 중추신경계 질환 또는 난소암 또는 대장암과 같은 암의 진단은 KIAA1O36 폴리펩티드에 대한 항체를 이용한 면역학적 방법으로 행할 수 있다. 그러므로, 폴리뉴클레오티드를 이용한 진단의 경우에, 표지된 KIAA1O36 폴리뉴클레오티드가 키트내에 포함된다. 항체를 이용한 진단의 경우에, KIAA1O36 폴리펩티드가 KIAA1O36 폴리펩티드에 대한 항체외에 표준 항원으로서 포함된다. 키트에서, 표준 곡선이 포함될 수 있다.

(10) mRNA 번역을 저해하는 방법

KIAA1O36 폴리뉴클레오티드를 제공하면 KIAA1O36 폴리펩티드의 생산을 저해할 수 있다. 즉, KIAA1O36 폴리뉴클레오티드 및 당해 분야에 공지된 안티센스 RNA/DNA 기술을 사용함으로써, KIAA1O36 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 의 전사 및 상기 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA 의 번역은 저해될 수 있다.

(11) 결합 물질의 스크리닝 방법

본 발명의 마커에 대한 결합 물질의 탐색 또는 스크리닝용 시약으로서, KIAA1O36 폴리펩티드가 유용하다. 즉, 마커와 대상 사이의 접촉을 포함하는, 본 발명의 마커에 대한 결합 물질의 스크리닝 방법이 제공된다. 대상에는 예컨대, 천연적으로 또는 화학적으로 합성된 화학 물질, 단백질, 포유동물, 예컨대, 인간, 마우스, 래트, 돼지, 소, 양 또는 원숭이의 조직 추출액 또는 세포 배양물이 포함된다. 상기 대상을 본 발명의 마커에 첨가하고, 혼합물을 혈관 내피세포의 DNA 합성 활성을 측정하면서 분리한다. 결국, 단일 리간드를 수득할 수 있다.

예컨대, 본 발명의 결합 물질의 스크리닝 방법에는 KIAA1O36 폴리펩티드 또는 부분적인 펩티드를 이용하고, 재조합 폴리펩티드의 발현 시스템을 구축하고, 발현 시스템을 이용한 결합 분석을 이용하고, KIAA1O36 폴리펩티드에 결합하고, 세포 촉진 활성, 예컨대, BrdU (브로모데옥시우리딘)을 삽입하여 DNA 합성을 촉진 또는 저해하는 활성 또는 세포 이동 활성을 측정하거나 또는 현미경으로 혈관 내피세포의 가시적인 망 형성을 측정하는 방법이 포함된다.

먼저, 폴리펩티드 B 를 함유하는 임의의 폴리펩티드를 결합 물질의 스크리닝 방법용 폴리펩티드로서 사용할 수 있으나, 동물세포를 이용하여 대량으로 발현된 폴리펩티드가 바람직하다. 폴리펩티드 B 를 생산하기 위해, 전술한 발현 방법이 사용되나, 포유동물 세포 또는 곤충 세포에서 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 를 발현하는 것을 포함하는 경우의 방법이 바람직하다. 일반적으로 cDNA 는 발현되는 단백질을 코딩하는 단편으로서 사용되나, 항상 cDNA 는 아니며, 게놈 DNA 또는 합성 DNA 의 단편을 사용할 수 있다. KIAA1O36 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 단편을 숙주 동물세포내로 도입하고, 이를 효과적으로 발현하기 위해, DNA 단편을 숙주로서 곤충을 사용하는 배큘로바이러스의 핵다각체병 바이러스(NPV)의 폴리헤드린 프로모터, SV4O 유래의 프로모터, 레트로바이러스 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 인간 열충격 프로모터, 시토메갈로바이러스 프로모터 또는 SRα프로모터의 하류에 삽입하는 것이 바람직하다. 발현된 폴리펩티드의 양 및 질의 조사는 주 지의 방법으로 수행할 수 있다. 예컨대, [The Journal of Biological Chemistry, 267, 19555-19559(1992)]에 기재된 방법이다.

그러므로, 본 발명의 결합 물질의 스크리닝 방법에서, 주지의 방법으로 정제된 폴리펩티드 또는 부분 펩티드, 폴리펩티드를 포함하는 세포 또는 이의 상층액을 KIAA1036 폴리펩티드 또는 부분 펩티드를 포함하는 것으로서 사용할 수 있다. 본 발명의 결합 물질의 스크리닝 방법에서, KIAA1036 폴리펩티드를 포함하는 세포를 사용하는 경우에, 세포가 아가로스 겔에 고정될 수 있다. 고정화 방법은 주지의 방법으로 수행할 수 있다. KIAA1036 폴리펩티드를 포함하는 세포는 KIAA1036 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포를 의미한다. 예컨대, 대장균, 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis), 효모, 곤충 세포 및 동물 세포를 숙주 세포로서 사용한다.

KIAA1036 폴리펩티드에 대한 결합 물질의 스크리닝을 위해, 적당한 폴리펩티드 분획 및 표지된 시험 물질이 필요하다. 폴리펩티드 분획으로서, 예컨대, 천연 폴리펩티드 분획 또는 천연 폴리펩티드 분획과 동일한 활성을 갖는 재조합 폴리펩티드 분획이 바람직하다. 동일한 활성은 예컨대, 동일한 리간드 결합 활성 또는 동일한 신호전달 활성을 의미한다. 표지된 시험 물질은 예컨대, ³H, ¹²⁵I, ¹⁴C 또는 ³⁵S 로 표지된 물질이다.

예컨대, KIAA1036 폴리펩티드에 대한 결합 물질의 스크리닝 방법에 대해, 먼저, 폴리펩티드 시료를 KIAA1036 폴리펩티드를 포함하는 세포 또는 세포의 막 분획 을 스크리닝 방법에 적합한 완충액 중에 현탁함으로써 제조한다. 리간드와 폴리펩티드가 결합하는 것을 저해하지 않는 임의의 완충액, 예컨대, pH 4 내지 10, 바람직하게는 pH 6 내지 8 인 인산 완충액 또는 Tris-HC1 완충액을 완충액으로서 사용한다. 비특이적 결합을 감소시키기 위해, 계면활성제, 예컨대, CHAPS, Tween-80 (Kao-Atlas), 디지토닌 또는 데옥시콜레이트 또는 모든 종류의 단백질, 예컨대, 소혈청 알부민 또는 젤라틴을 완충액에 첨가할 수 있다. 더욱이, 프로테아제에 의한 수용체 및 리간드의 분해를 억제하기 위해, 프로테아제 저해제, 예컨대, PMSF, 류펩틴, E-64 (PEPTIDE INSTITUTE, INC.) 또는 펩스타틴을 첨가할 수 있다. 시험 물질은 예컨대, 일정한 양, 바람직하게는 5000 cpm 내지 500,000 cpm 의 ³H, ¹²⁵I, ¹⁴C 또는 ³⁵S 로 표지되고, 0.01 내지 10 ml 의 폴리펩티드 용액에 공존한다. 비특이적 결합(NSB)의 양을 측정하기 위해, 과량의 비표지된 시험 물질을 갖는 반응 튜브를 또한 제조한다. 반응을 0℃ 내지 50℃, 바람직하게는 4℃ 내지 37℃에서 20 분 내지 24 시간, 바람직하게는 30 분 내지 3 시간 수행한다. 반응 후에, 용액을 유리섬유 여과지로 여과하고, 적당한 양의 동일한 완충액으로 세정한다. 유리섬유 여과지에 잔존하는 방사성을 액체 섬광계수기 또는 γ-계수기로 측정한다. 모든 양의 결합(B)에서 비특이적 결합 (NSB)의 양을 뺌으로써 수득된 결과인 카운트(B-NSB)가 0 cpm 초과인 시험 물질을 본 발명의 마커에 대한 결합 물질로서 선택할 수 있다.

본 발명의 마커에 대한 결합 물질의 스크리닝을 위해, 폴리펩티드를 통한 세 포 촉진 활성, 예컨대, BrdU (브로모데옥시우리딘)을 삽입하여 DNA 합성을 촉진 또는 저해하는 활성 또는 세포 이동 활성을 주지의 방법 또는 시판되는 측정 키트로 측정할 수 있다. 활성을 현미경으로 혈관 내피세포의 가시적인 망 형성을 측정함으로써 측정할 수 있다. 예컨대, 폴리펩티드를 포함하는 세포를 다중웰 플레이트 상에 배양한다. 결합 물질의 스크리닝을 행할 경우에, 미리, 배지 또는 완충액의 세포에 비독성인 신선한 배지 또는 적당한 완충액으로 변화하고, 시험 물질을 첨가한다. 고정된 시간 동안 배양 후에, 세포를 추출하거나 이의 상층액을 수합하고, 생성물을 이의 제조 방법으로 정량한다.

(12) 결합 물질의 스크리닝 키트

본 발명의 마커에 결합된 결합 물질의 스크리닝 키트는 폴리펩티드 B 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 이의 상층액 분획을 포함하는 키트이다. 결합 물질의 스크리닝 키트의 예는 하기이다.

(i) 결합 물질의 스크리닝 시약

스크리닝 용액 및 세정 용액으로서, Hank's Balanced Salt Solution (Invitrogen)에 0.05 % 소혈청 알부민(SIGMA-Aldrich)이 첨가된 용액을 45 ㎛ 필터를 이용한 여과로 멸균하고, 4℃에서 보관하거나 사용 전에 제조한다.

*(a) 본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 COS-7 세포를 5 ×10⁵ 세포/웰로 12 웰 플레이트 상에 배양하고, 37℃에서 2 일 동안 배양한다.

(b) 표지된 대상

³H, ¹²⁵I, ¹⁴C 또는 ³⁵S 로 표지된 시판되는 대상을 포함하는 용액을 4℃ 또는 20℃에서 보관하고, 사용 전에 분석 완충액을 이용하여 1 μM 로 희석한다. 물에 대한 낮은 용해도를 갖는 대상을 디메틸 포름아미드, DMS0 또는 메틸 알코올 중에 용해한다.

(c) 비표지된 대상

표지된 물질과 동일한 것을 100 내지 1000 배 더 높은 농도로 제조한다.

(ii) 분석

(a) 본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 COS-7 세포를 조직 배양용 12 웰 플레이트 상에 배양하고, 분석 완충액(1 ml)으로 2회 세정한 후, 분석 완충액을 첨가한다 (웰당 490㎕).

(b) 표지된 대상(5㎕)을 첨가하고, 용액을 실온에서 1 시간 동안 반응한다. 비표지된 대상(5㎕)을 첨가하여 비특이적 결합의 양을 측정한다.

(c) 반응액을 제거하고, 잔존 세포를 세정액(1 ml)으로 3회 세정한다. 세포에 결합된 표지된 대상을 0.2M NaOH (1% SDS 포함)를 이용하여 용해하고, 용액을 액체 섬광기 A (4 ml) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)와 혼합한다.

(d) 방사성을 액체 섬광계수기(Beckman Coulter)로 측정한다.

(13) 결합 활성 조절 물질의 스크리닝 방법

본 발명의 마커는 마커에 대한 결합 활성 조절 물질을 탐색 또는 스크리닝하 는 시약으로서 유용하다. 마커의 결합 활성 조절 물질 및 결합 물질, 즉, 결합 활성을 변화시키는 물질의 스크리닝 방법으로서, 본 발명의 마커를 발현하는 재조합 발현 시스템을 구축하고, 생물분석 시스템 또는 결합 분석 시스템을 사용한다. 이어서, 결합 물질 및 본 발명의 마커 사이의 결합 활성을 변화시키는 물질, 예컨대, 펩티드, 단백질, 비펩티드 물질, 합성 물질 또는 발효 산물을 효과적으로 스크리닝할 수 있다. 물질은 (a) 결합 물질 및 본 발명의 마커 사이의 세포 촉진 활성, 예컨대, BrdU (브로모데옥시우리딘) 삽입에 의해 모니터링된 DNA 합성을 촉진 또는 저해하는 활성 또는 세포 이동 활성을 촉진 또는 저해하는 활성, 또는 (b) 결합 물질 및 본 발명의 마커 사이의 결합 활성을 증가시키거나 감소시키는 물질을 포함한다.

즉, 본 발명은 (i) 본 발명의 마커 및 결합 물질을 접촉할 경우와 (ii) 본 발명의 마커, 결합 물질 및 대상을 접촉할 경우, 결합 물질의 결합량을 비교하는 것을 특징으로 하는, 결합 물질 및 본 발명의 마커 사이의 결합 활성 조절 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 결합 활성 조절 물질의 스크리닝 방법은 예컨대, (i) 및 (ii)의 경우에 세포 촉진 활성을 측정함으로써 마커 및 결합 물질 사이의 결합량을 비교하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 결합 활성 조절 물질의 스크리닝 방법은 예컨대, (a) 표지된 결합 물질이 KIAA1O36 폴리펩티드에 접촉하고, 표지된 결합 물질 및 대상이 접촉할 경우에, 폴리펩티드에 대한 표지된 물질의 결합량을 측정하고 비교하는 것을 포함하는, 결합 물질 및 KIAA1O36 폴리펩티드 사이의 결합 활성을 변화시킬 수 있는 결합 활성 조절 물질을 스크리닝하는 방법, (b) KIAA1O36 폴리펩티드를 발현하는 세포 또는 세포 배양액 및 표지된 결합 물질을 접촉하고, 표지된 결합 물질 및 대상을 접촉할 경우에, 세포 또는 세포 배양물에서 폴리펩티드에 대한 표지된 물질의 결합량을 측정하고 비교하는 것을 포함하는, 결합 물질 및 본 발명의 폴리펩티드 사이의 결합 활성을 변화시킬 수 있는 결합 활성 조절 물질을 스크리닝하는 방법 또는 (c) KIAA1O36 폴리뉴클레오티드를 갖는 형질전환체를 배양함으로써 세포 배양액에 분비된 폴리펩티드 및 표지된 결합 물질을 접촉하고, 표지된 결합 물질 및 대상을 접촉할 경우에, 폴리펩티드에 대한 표지된 물질의 결합량을 측정하고 비교하는 것을 포함하는, 결합 물질 및 KIAA1O36 폴리펩티드 사이의 결합 활성을 변화시킬 수 있는 결합 활성 조절 물질을 스크리닝하는 방법이다.

(14) 결합 활성 조절 물질의 스크리닝 키트

KIAA1O36 폴리펩티드 및 결합 물질 사이의 결합 활성을 변화시키는 결합 활성 조절 물질의 스크리닝 키트는 폴리펩티드를 포함하는 세포 또는 세포 배양액을 포함하는 키트이다. 본 발명의 스크리닝 키트의 예는 하기이다.

(i) 결합 활성 조절 물질의 스크리닝 시약

(a) KIAA1O36 폴리펩티드

KIAA1O36 폴리펩티드를 발현하는 COS-7 세포를 5 ×10⁵ 세포/웰로 12 웰 플레이트 상에 배양하고, 37℃에서 2 일 동안 배양한다.

(b) 표지된 대상

³H, ¹²⁵I, ¹⁴C 또는 ³⁵S 로 표지된 시판되는 대상을 포함하는 용액을 4℃ 또는 20℃에서 보관하고, 사용 전에 분석 완충액을 이용하여 1 μM 로 희석하여 제조한다. 물에 대한 낮은 용해도를 갖는 대상을 디메틸 포름아미드, DMS0 또는 메틸 알코올 중에 용해한다.

(c) 비표지된 대상

(ii) 분석

(d) 방사성을 액체 섬광계수기(Beckman Coulter)로 측정한다.

(15) 발현 조절 물질의 스크리닝 방법

폴리뉴클레오티드 A, 폴리펩티드 B 또는 폴리펩티드에 대한 항체는 본 발명의 마커에 대한 발현 조절 물질을 탐색 또는 스크리닝하는 시약으로서 유용하다.

즉, 본 발명의 발현 조절 물질의 스크리닝 방법은 예컨대, (i) 비인간 포유동물의 혈액, 특정 기관, 기관으로부터 분리된 조직 또는 세포 또는 (ii) 형질전환체 등에 포함된 mRNA 또는 KIAA1036 폴리펩티드 또는 부분 펩티드의 단백질을 측정함으로써 본 발명의 마커의 발현 조절 물질의 스크리닝 방법이다.

(16) 발현 조절 물질의 스크리닝 키트

KIAA1O36 폴리펩티드의 발현 조절 물질 또는 이의 염의 스크리닝 키트는 폴리펩티드 A 또는 폴리펩티드 B 또는 폴리펩티드를 포함하는 세포배양액을 포함하는 키트이다. 본 발명의 스크리닝 키트의 예는 하기이다.

(17) 면역 분석법에 기초한 스크리닝 키트

KIAA1O36 폴리펩티드의 분석법은 예컨대, 이의 에피토프가 액상의 폴리펩티드와 반응하는 항체에서 상이한 2 종류의 단클론 항체를 이용하는 샌드위치 ELISA, 또는 ¹²⁶I 와 같은 방사성동위원소로 표지된 KIAA1O36 폴리펩티드 및 이를 특이적으로 인식하는 항체를 사용하는 방사성면역분석법이다. 그러므로, 항체를 이용한 진단의 경우에, KIAA1O36 폴리펩티드가 본 발명의 항체 이외에 표준 항원으로서 포함된다. 더욱이, 표준 곡선이 키트에 포함될 수 있다.

(18) 분자생물학적 분석에 기초한 스크리닝 키트

KIAA1O36 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 의 발현 수준은 KIAA1O36 폴리뉴클레오티드로부터 제조된 올리고뉴클레오티드를 이용하여 노던 혼성화 또는 PCR 에 의해 mRNA 수준에서 정량화할 수 있다.

예컨대, (i) 시약, 예컨대, 항암제를 정상 또는 질환 모델 비인간 포유동물 (예컨대, 마우스, 래트, 토끼, 양, 돼지, 소, 고양이, 개 또는 원숭이)에 제공하고, 고정된 시간 후에, 혈액, 특정 기관, 예컨대, 뇌, 신장, 직장, 난소, 기관으로부터 분리된 조직 또는 세포를 수득한다. 수득된 세포에 포함된 본 발명의 폴리펩티드 또는 부분 펩티드의 mRNA 를 예컨대, 당해 분야에서 주지된 추출 방법으로 추출하고, TaqManPCR 과 같은 방법으로 정량하거나 주지된 노던 블롯으로 분석하거나, 또는 (ii) KIAA1O36 폴리펩티드 또는 부분 펩티드를 발현하는 형질전환체를 전술한 방법으로 생산하고, 형질전환체에 포함된 KIAA1O36 폴리펩티드 또는 부분 펩티드의 mRNA 를 정량/분석할 수 있다.

그리고, 폴리뉴클레오티드를 이용한 진단의 경우에, 표지된 KIAA1O36 폴리뉴클레오티드가 키트에 포함된다.

(19) 약학 조성물

폴리뉴클레오티드 A, 상기 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 B, 이의 항체 또는 폴리뉴클레오티드 A를 갖는 유전자 치료용 벡터와 같은 물질로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 약학 조성물을 치료제로서 독립적으로 제공할 수 있다. 그러나, 통상 약학 조성물을 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체(들)과 혼합하고, 제제학의 기술 분야에서 주지된 임의의 방법으로 제 조된 약학 제제로서 제공되는 것이 바람직하다. KIAA1036 은 혈관 내피세포에서 DNA 합성 및 세포 이동 활성을 저해하므로, DNA 합성 저해제 및 세포 이동 활성 저해제가 포함된다. 스크리닝 방법으로 수득된 물질 또는 본 발명의 스크리닝 키트 및 이의 염이 포함된다. 물질은 예컨대, (a) 결합 물질 및 KIAA1036 폴리펩티드 사이의 결합을 통해 세포 촉진 활성, 예컨대, DNA 합성 활성, 이동 활성, 혈관 내피세포의 망 형성 활성을 증가 또는 감소시키는 물질, (b) 결합 물질 및 KIAA1036 폴리펩티드 사이의 결합 활성을 증가 또는 감소시키는 물질 또는 (c) KIAA1036 폴리펩티드의 발현 수준을 증가 또는 감소시키는 물질이다. 물질은 예컨대, 저분자량 화합물, 펩티드, 단백질, 비펩티드 물질, 합성 물질 또는 발효 산물이다. 상기 물질은 신규 또는 주지의 물질 및 천연 또는 합성 물질일 수 있다. KIAA1036 폴리펩티드에 대한 아고니스트가 KIAA1036 폴리펩티드에 대한 결합 물질의 생활성화와 동일한 활성을 가지므로, 이들은 결합 물질 활성에 대한 안전한, 저독성 약물로서 유용하다. KIAA1036 폴리펩티드에 대한 길항제는 KIAA1036 폴리펩티드에 대한 결합 물질의 생활성화를 저해할 수 있으므로, 이들은 결합 물질 활성을 저해하는 안전한, 저독성 약물로서 유용하다. 결합 물질 및 KIAA1036 폴리펩티드 사이의 결합 활성을 증가시키는 물질은 안전한, 저독성 약물로서 유용하여, KIAA1036 폴리펩티드에 대한 결합 물질의 생활성화를 증가시킨다. 결합 물질 및 KIAA1036 폴리펩티드 사이의 결합 활성을 감소시키는 물질은 안전한, 저독성 약물로서 유용하여, KIAA1036 폴리펩티드에 대한 결합 물질의 생활성화를 감소시킨다. KIAA1036 을 발현하는 유전자 치료용 발현 벡터가 포함된다. KIAA1036 은 혈관신생, 혈관 질환, 염증 질환, 안내 혈관신생 질환, 생식계 질환, 중추신경계 질환 또는 암에 대한 마커일 수 있으므로, KIAA1036 이 상기 질환에 관련되며, 이들이 상기 질환의 유전자 치료에 유용하다고 제안된다. 유전자 치료용 발현 벡터는 KIAA1036 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전부를 갖는 발현 벡터이며, 이들이 세포 또는 조직에 도입될 경우에, 이들은 유전자 수준에서 일부 천연 또는 후천적 질환을 야기하는 질환을 정상화할 수 있다. 즉, 벡터는 정상 유전자로서 세포를 보충하고, 유전자의 결함을 수복/변형하고, 유전자의 발현을 조절할 수 있다.

(20) 치료제

폴리펩티드 B, 폴리펩티드에 대한 항체, 폴리뉴클레오티드 A, 상기 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드, 결합 물질, 결합 조절 물질, 발현 조절 물질, DNA 합성 저해제, 세포 이동 활성 저해제 또는 유전자 치료용 벡터를 포함하는 약학 조성물을 치료제로서 독립적으로 제공할 수 있다. 그러나, 통상 약학 조성물을 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체(들)과 혼합하고, 제제학의 기술 분야에서 주지된 임의의 방법으로 제조된 약학 제제로서 제공되는 것이 바람직하다.

치료에서 가장 효과적인 투여 경로가 투여 경로, 예컨대, 경구 투여 또는 비경구 투여, 예컨대, 구강내 투여, 기관지, 직장내, 피하, 근육내 또는 정맥내가 바람직하다. 투여 형태는 예컨대, 스프레이, 정제, 과립, 시럽, 에멀션, 좌약, 주사제, 연고 또는 테이프이다.

경구 투여의 적당한 약학 제제는 예컨대, 에멀션, 시럽, 캡슐, 정제, 분말 또는 과립이다. 예컨대, 에멀션 또는 시럽과 같은 액체 제제를 부형제로서 물, 사카라이드, 예컨대, 수크로오스, 소르비톨 또는 프룩토오스, 글리콜, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 또는 프로필렌 글리콜, 오일, 예컨대, 참깨유, 올리브 오일 또는 대두유, 방부제, 예컨대, p-히드록시 에스테르 벤조에이트 또는 향료, 예컨대, 딸기 또는 박하를 사용함으로써 제조할 수 있다. 캡슐, 정제, 분말 또는 과립을 부형제로서 운반체, 예컨대, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스 또는 만니톨, 붕괴제, 예컨대, 전분 또는 소듐 알기네이트, 윤활제, 예컨대, 마그네슘 스테아레이트, 또는 활석, 결합제, 예컨대, 폴리비닐 알코올, 히드록시프로필셀룰로오스 또는 젤라틴, 표면 활성제, 예컨대, 지방산 에스테르 또는 가소제, 예컨대, 글리세롤을 사용함으로써 제조할 수 있다.

비경구 투여용 적당한 약학 제제는 예컨대, 주사제, 좌약 또는 스프레이이다. 예컨대, 주사제는 염 용액, 덱스트로오스 용액 또는 이들의 혼합물을 포함하는 담체를 사용하여 제조된다. 좌약은 카카오 버터, 지방 수소화물 또는 카르복실산과 같은 담체를 사용하여 제조된다. 스프레이는 구강 및 수용체의 기도점막을 자극하지 않고, 흡수가 용이하도록 미립자로서 물질을 전이하는 물질 또는 담체를 사용하여 제조된다. 담체에는 예컨대, 락토오스 또는 글리세롤이 포함된다. 물질 및 사용된 담체의 성질이 이에 적합하면, 에어로졸 또는 건조 분말과 같은 약학 제제가 가능하다. 상기 비구강제에서, 경구제에 부형제로서 사용된 성분을 첨가할 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법에 의해 수득된 물질 또는 스크리닝 키트 또는 염은 결합 물질, 결합 활성 조절 물질, 발현 조절 물질, DNA 합성 저해제 또는 세포 이동 활성 저해제, 예컨대, (a) 결합 물질 및 폴리펩티드 B 사이의 결합을 통해 세포 촉진 활성, 예컨대, BrdU (브로모데옥시우리딘) 흡수에 의해 모니터링될 수 있는 DNA 합성을 촉진 또는 저해하는 활성, 세포 이동 활성을 촉진 또는 저해하는 활성을 증가 또는 감소시키는 물질, (b) 결합 물질 및 폴리펩티드 B 사이의 결합 활성을 증가 또는 감소시키는 물질 또는 (c) 본 발명의 마커의 발현 수준을 증가 또는 감소시키는 물질이다.

물질은 저분자량 화합물, 펩티드, 단백질, 비펩티드 물질, 합성 물질 또는 발효 산물이다. 상기 물질은 신규 또는 주지의 물질 및 천연 또는 합성 물질일 수 있다. KIAA1036 폴리펩티드에 대한 아고니스트가 KIAA1036 폴리펩티드에 대한 결합 물질의 생활성화와 동일한 활성을 가지므로, 이들은 결합 물질 활성에 대한 안전한, 저독성 약물로서 유용하다. KIAA1036 폴리펩티드에 대한 길항제는 KIAA1036 폴리펩티드에 대한 결합 물질의 생활성화 또는 이와 같은 어떤 것을 저해할 수 있으므로, 이들은 결합 물질 활성을 저해하는 안전한, 저독성 약물로서 유용하다. 결합 물질 및 KIAA1036 폴리펩티드 사이의 결합 활성을 증가시키는 물질은 안전한, 저독성 약물로서 유용하여, KIAA1036 폴리펩티드에 대한 결합 물질의 생활성화를 증가시킨다. 결합 물질 및 KIAA1036 폴리펩티드 사이의 결합 활성을 감소시키는 물질은 안전한, 저독성 약물로서 유용하여, KIAA1036 폴리펩티드에 대한 결합 물질의 생활성화를 감소시킨다. KIAA1036 폴리펩티드의 발현 수준을 변화시키는 물질을 포함하는 모든 종류의 질환에 대한 치료제 KIAA1036 폴리펩티드는 예컨대, 전술한 중추신경계에 중요한 역할을 하는 것 같다. 그러므로, KIAA1036 폴리펩티드 또는 부분 펩티드의 발현 수준을 변화시키는 발현 조절 물질을 KIAA1036 폴리펩티드의 불충분과 관련된 질환의 치료제로서 사용될 수 있다. 물질을 KIAA1036 폴리펩티드의 불충분과 관련된 질환의 치료제로서 사용할 경우에, 이는 통상적인 방법에 의해 약학 제제로 전환될 수 있다. 예컨대, 물질은 당 코팅된 정제, 캡슐, 엘릭서 또는 미세캡슐로서 경구로 사용될 수 있으며, 때로는 요구에 따라 물 또는 다른 약학적으로 허용가능한 용액 또는 현탁 주사액을 갖는 멸균 용액으로서 비경구적으로 사용될 수 있다. 예컨대, 물질은 생리적으로 허용가능한 주지된 담체, 향미제, 운반체, 방부제, 안정제 또는 결합제와 함께 일반적으로 허용가능한 약학 제제를 실시하기 위해 요구되는 단위 투여량 형태로서 혼합하여 제조될 수 있다. 상기 약학 제제에서 활성 성분의 양은 지시된 범위로 적당한 용량을 수득할 수 있도록 결정된다.

정제 또는 캡슐과 혼합될 수 있는 부형제는 예컨대, 결합제, 예컨대, 젤라틴, 옥수수 전분, 트라가칸트 또는 아라비아고무, 운반체, 예컨대, 결정성 셀룰로오스, 팽윤제, 예컨대, 옥수수 전분, 젤라틴 또는 알긴산, 윤활제, 예컨대, 마그네슘 스테아레이트, 감미제, 예컨대, 수크로오스, 락토오스 또는 사카린 또는 향미제, 예컨대, 박하 또는 벚나무이다. 투여 형태가 캡슐인 경우에, 상기 형태의 성분 및 액체 담체, 예컨대, 지방 및 오일이 포함될 수 있다. 주사용 방부 조성물은 통상의 약학 제제, 예컨대, 활성 물질을 운반체, 예컨대, 주사용 물 또는 식물성 오일, 예컨대, 참깨유 또는 코코넛 오일에 용해 또는 현탁함으로써 제조될 수 있다. 주사용 수용액은 예컨대, 등장액 예컨대, D-소르비톨, D-만니톨 또는 생리적인 염 용액을 포함하는 염화나트륨, 덱스트로오스 또는 보조제이다. 이는 적당한 가용화제, 예컨대, 알코올, 예컨대, 에탄올, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜, 비이온성 표면 활성제, 예컨대, 폴리소르베이트 80 또는 HCO-50 을 이용할 수 있다. 오일 용액은 예컨대, 참깨유 또는 대두유이며, 가용화제, 예컨대, 벤질 벤조에이트 또는 벤질 알코올을 사용할 수 있다.

상기 예방제/치료제를 예컨대, 완충액, 예컨대, 인산 완충액 또는 초산 나트륨 완충액, 무통제, 예컨대, 벤즈알코늄 클로라이드 또는 프로카인 히드로클로라이드, 안정제, 예컨대, 인간 혈청 알부민 또는 폴리에틸렌 글리콜, 보존제, 예컨대, 벤질 알코올 또는 페놀 또는 항산화제와 혼합할 수 있다. 제조된 주사액은 통상 적당한 앰퓰내로 충전된다.

(21) 치료 방법

전술한 약학 조성물은 혈관 질환, 염증 질환, 안내 혈관신생 질환, 생식계 질환, 중추신경계 질환 또는 암에 대한 치료제일 수 있으므로, 질환, 예컨대, 혈관 질환, 염증 질환, 안내 혈관신생 질환, 생식계 질환, 중추신경계 질환 또는 암의 치료 방법이 적당한 방법으로 약학 조성물을 제공함으로써 제공된다. 전술한 약학 조성물이 치료에서 가장 효과적인 치료 방법으로 사용되는 것이 바람직하다. 방법은 예컨대, 경구 투여 또는 비경구 투여, 예컨대, 구강내, 기관지, 직장내, 피하, 근육내 또는 정맥내이다.

전술한 치료제는 안전하고, 저독성이며, 예컨대, 포유동물, 예컨대, 인간, 래트, 마우스, 토끼, 양, 돼지, 소, 고양이, 개 또는 원숭이에게 제공될 수 있다. 1회당 예방제 또는 치료제의 투여량은 치료 대상, 목적 기관, 질환 상태 또는 치료 방법에 따라 다르다. 그러나 경구 투여의 경우에, 예컨대, 체중이 60 kg 인 근긴장항진의 환자에 대해, 통상 대략 1일에 0.1 내지 100 mg, 바람직하게는 대략 1.0 내지 50mg, 더욱 바람직하게는 대략 1.0 내지 20 mg 을 제공한다. 예컨대, 비경구적 주사의 경우에, 예컨대, 체중이 60 kg 인 근긴장항진의 환자에 대해, 통상 대략 1일에 0.01 내지 30mg, 바람직하게는 대략 0.1 내지 20 mg, 더욱 바람직하게는 대략 0.1 내지 10 mg 을 정맥내 주사로 제공한다. 다른 동물의 경우에, 체중 kg 당 양으로 전환되는 양이 제공될 수 있다. 투여량 또는 회수는 목적하는 치료 효과, 치료 방법, 치료 기간, 나이 또는 체중에 따라 다르나, 통상 성인에 대해 1일에 10 ㎍ 내지 8 mg/kg 이다.

본 발명은 KIAA1036 mRNA 의 검출 방법, KIAA1036 폴리펩티드의 검출 방법, 혈관신생, 혈관 질환, 염증 질환, 안내(眼內) 혈관신생 질환, 생식계 질환, 중추신경계 질환 또는 악성종양에 대한 마커, 진단 키트 및 치료제를 제공한다.

하기 실시예는 예시하기 위해 제공되며, 본 발명을 제한하지 않는다. 유전 공학 방법으로서, 특정하게 제공하지 않는다면, [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제 2 판 (Cold Spring Harbor Laboratory)]에 기재된 방법을 사용한다.

실시예 1

인간 제대 정맥 내피세포 (HUVEC)에서의 발현이 혈관 내피세포 증식 인자(VEGF)의 자극에 의해 증가된 유전자의 확인

인간 제대 정맥 혈관 내피세포인 3 개의 Endocell HUVEC (KURAB0)을 녹인 후, 10% 송아지 혈청 (FCS) (Sanko Junyaku)을 포함하는 EBM 배지를 쏟은 콜라겐 코팅된 16 개의 배양 플레이트 (IWAKI)상에 접종하였다. 37℃에서 3 일 동안 배양 후에, 배지를 동일한 배지로 교환하고, 2 일 동안 배양하였다. 세포가 합류점에 도달한 후에, 배지를 1 % FCS (Nissui)를 포함하는 M199 배지로 교환하고, 세포를 24 시간 동안 배양하였다. VEGF 처리를 갖는 배양을 위해, 배지를 1 % FCS 및 1nM 인간 VEGF₁₆₅ (R&D Systems)를 포함하는 M199 배지로 교환하였다. VEGF 가 없는 배양을 위해 (대조군), 배지를 인간 VEGF₁₆₅ 를 포함하지 않는 동일한 배지로 교환하였다. 세포를 37℃에서 배양하고, 0 시간, 0.5 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간 및 24 시간 후에 수합하였다. 수합된 세포를 PBS 로 2회 세정하고, 총 RNA 를 ISOGEN (Nippon Gene)으로 제조하고, mRNA 를 올리고 dT 셀룰로오스 칼럼으로 제조하였다. 상기 mRNA 를 Incyte Genomics 의 지시에 따라 유전자 발현 마이크로어레이 분석을 통해 LifeArrayhumanUniGENE (Incyte Genomics)으로 분석하였다.

그 결과, 6393 종류의 인간 유전자에 대해, 유전자 발현 수준을 각 시간 포 인트에서 미처리 세포의 것과 비교하여 VEGF 처리된 세포에서의 발현 수준의 비로서 계산하였다. 상기 유전자 중에서, 이의 기능이 미지인 유전자 GenBank ID: AP055021 의 발현 수준은 VEGF 처리로 증가하여, 발현 수준이 24 시간 후에 3.8 배에 도달하였다. 단백질 번역된 영역은 NCBI (National Center for Biothechnology Information)의 데이타베이스에서 AF055021 의 서열정보로부터 불명확하므로, 동일한 유전자의 염기 서열을 AssEst (옥수수) 데이타베이스로 검색하고, EST 클러스터의 보존 서열을 수득하였다. 상기 보존 서열에 기초하여, AssEst 의 Blastx 데이타베이스 를 이용한 상동성 검색은 이의 기능이 미지인 KIAA1O36 폴리펩티드 (서열 번호 2)를 코딩하는 것으로 나타났다. 부가적으로, 이는 이의 기능이 미지인 AK022567 폴리펩티드와 58% 상동성을 가졌다 (도 1). KIAA1036 유전자 및 NCBI 데이타베이스 상의 AK022567 유전자는 번역 개시 코돈으로부터 시작되는, 각각 365 및 290 아미노산 잔기에 해당하는 개방형 해독틀을 가지며, 이들은 거의 총 길이 cDNA 인 것 같다. AK022567 폴리펩티드는 이미 분비성 단백질로서 국제 공개되었다 (W099/3881). KIAA1O36 은 이들의 아미노산 서열의 상동성이 58% 이므로, 분비성 단백질로 예상된다.

실시예 2

인간 정상 조직에서 KIAA1036 의 발현

인간 제대 정맥혈관 내피세포 유래의 KIAA1O36 유전자의 클로닝을 시도하였다. 2 종류의 올리고뉴클레오티드를 NCBI 데이타베이스 유래의 KIAA1036 유전자의 미번역 영역의 핵산 서열에 기초하여 PCR 용 프라이머로서 합성하였다.

프라이머 1: (서열 번호 4)

5'-GTTCAGGACTGTCTTTCAGC-3'

프라이머2: (서열 번호 5)

5'-GTCAATACTGATGGACTTGC-3'

총 RNA 를 인간 제대 정맥혈관 내피세포인 HUVEC 로부터 RNeasy Midi (QIAGEN) 에 첨부된 매뉴얼에 따라 제조하였다. 단일 가닥 cDNA 단편을 SuperscriptII (Invitrogen)를 이용하여 수득된 총 RNA (10㎍)로부터 제조하였다. 수득된 단일 가닥 cDNA 를 주형으로 사용하고, 유전자 단편을 프라이머 1 (서열 번호 4) 및 프라이머2 (서열 번호 5)를 이용하여 PCR 로 증폭하였다.

단일 가닥 cDNA 의 1/50 에 TaKaRa Ex Taq (TaKaRa)(1.25 유닛), 프라이머l 및 프라이머2 (각각 1 μM), TaKaRa Ex Taq (5㎕)이 첨가된 PCR 반응용 완충액 (+ Mg²⁺) 및 최종 농도가 200μM 인 dNTP 혼합물을 첨가하였다. 증류수를 혼합물에 첨가하여 총 50㎕ 가 되었다. 이것이 PCR 용 시료가 제조되는 방법이다. PCR 반응을 하기 조건하에 수행하였다: 94℃, 3 분, 1회 및 사이클 (94℃, 1 분; 50℃, 1 분; 및 72℃, 1 분)을 30회 한 후, 72℃, 5 분, 1회. PCR 반응으로 증폭된 cDNA 단편을 아가로스 전기영동으로 분리하고, 750bp cDNA 단편 (서열 번호 6)을 수합하였다. 수득된 cDNA 단편을 제한효소, ApaI, HincII 및 PstI 으로 절단하고, 아가로스 겔 전기영동으로 분리된 cDNA 단편의 길이를 측정하였다. 수합된 cDNA 단편을 표적으로서 확인하였다. 프라이머 1 및 프라이머2 를 이용 하여 증폭된 cDNA 단편 (50 ng)을 Rediprime II DNA Labeling System (Amersham Pharmacia Bioteque)에 첨부된 매뉴얼에 의해 [α-³²P]dCTP (30000Ci/mmol, 10 mCi/ml) (Amersham Pharmacia Bioteque)를 이용하여 ³²P 로 표지하였다. 노던 혼성화를 프로브로서 ³²P 로 표지된 상기 cDNA 단편으로 수행하였다.

Multiple Tissue Northern (MTN^TM) Blots Human 12-Lane MTN Blot (Clontech)의 나일론막을 GMC 완충액 (0.5M 인산 완충액, pH 7.2, 1% 소혈청 알부민, 1mM EDTA 및 7 % SDS 를 포함)에 침지하고, 예비혼성화를 65℃에서 1 시간 동안 수행하였다. 그 후에, 나일론막을 ³²P 로 표지된 프로브를 포함하는 GMC 완충액에 침지하고, 혼성화를 65℃에서 16 시간 동안 수행하였다. 혼성화 후에, 나일론막을 2xSSC (1xSSC 는 15mM 시트르산 나트륨, 150mM NaC1, pH7.0) 로 실온에서 5 분 동안, 1xSSC (0.2% SDS 포함)로 50℃에서 30 분 동안 및 0.5xSSC (0.2% SDS 포함)로 50℃에서 30 분 동안 교대로 세정하고, 공기로 건조시켰다. 이어서, 상기 나일론막을 이미지 플레이트 (FUJI FHOTO FILM CO., LTD.)를 갖는 이미지 플레이트 카세트 (FUJI FHOTO FILM CO., LTD.)에 넣었다. 이미지 분석을 이미지 분석기 FLA3000 (FUJI FHOTO FiLM CO., LTD.)로 수행하였다.

그 결과, 약 6 kb 길이를 보여주는 신호를 뇌, 심장, 골격근, 비장, 신장, 간, 소장 및 태반에서 검출하고, 강한 발현을 뇌 및 태반에서 선택적으로 관찰하였다.

실시예 3

인간 제대 정맥 내피세포에서 KIAA1O36 의 발현

KIAA1O36 의 VEGF 유도된 발현을 실시예 1 에 기재된 DNA 칩을 이용하여 유전자 발현 마이크로어레이 분석에 의해 최초로 발견했을 때, 결과는 KIAA1O36 프로브 및 VEGF 처리된 HUVEC 로부터 제조된 총 RNA 를 이용한 노던 블롯으로 확인하였다. 인간 제대 정맥 내피세포인 Endocell HUVEC (KURABO)을 실시예 1 에 기재된 바와 같이 1% FCS 및 1nM 인간 VEGF₁₆₅ (R&D Systems)를 포함하는 M199 배지에서 배양하였다. 0, 0.5, 1, 2, 6, 12 및 24 시간 후에, 총 RNA 를 RNeasy Midi (QIAGEN)에 첨부된 메뉴얼에 따라 상기 세포로부터 제조하였다.

각 RNA 시료 (5㎍)의 전기영동 후에, 시료를 나일론막인 Hybond-XL (Amersham Pharmacia Bioteque)으로 옮겼다. 나일론막을 GMC 완충액에 침지하고, 예비혼성화를 65℃에서 1 시간 동안 수행하였다. 나일론막을 실시예 2에서와 같이 ³²P 로 표지된 프로브를 포함하는 GMC 완충액에 침지하고, 혼성화를 65℃에서 16 시간 동안 수행하였다. 혼성화 후에, 나일론막을 2xSSC로 실온에서 5 분 동안, 1xSSC (0.2% SDS 포함)로 50℃에서 30 분 동안 및 0.5xSSC (0.2% SDS 포함)로 50℃에서 30 분 동안 교대로 세정하고, 공기로 건조시켰다. 이어서, 상기 나일론막을 이미지 플레이트 (FUJI FHOTO FILM CO., LTD.)를 갖는 이미지 플레이트 카세트 (FUJI FHOTO FILM CO., LTD.)에 넣었다. 이미지 분석을 이미지 분석기 FLA3000 (FUJI FHOTO FiLM CO., LTD.)로 수행하였다.

다음, 동일한 나일론막을 끓는 물의 용기에 침지함으로써 프로브를 탈혼성화하고, 노던 블롯을 프로브로서 실시예 2에서와 같이, ³²P 로 표지된 β-액틴 cDNA 단편을 이용하여 수행하였다. KIAA1O36 유전자의 신호 강도는 각 시간 포인트에서의 β-액틴의 것을 이용하여 표준화하였다. 이어서, 0 시간에 대한 각 시간 포인트에서의 KIAA1O36 의 발현 수준의 비를 계산하였다.

그 결과, 발현은 VEGF 를 첨가 후 0.5 내지 2 시간에 저해되었으나, 3.2 배의 높은 유전자 발현이 24 시간 후에 유도되었다. 이 결과는 DNA 칩에 의해 수득된 결과와 동일하였다 (도 2).

실시예 4

인간 암 조직에서 KIAA1O36 의 발현

인간 유래의 모든 종류의 기관의 정상 조직 및 암 조직에서의 유전자의 발현 수준의 차이를 분석하였다.

동일한 환자의 가슴, 자궁, 직장, 위, 난소(ovary), 폐, 신장, 난소(rectum), 자궁경관, 소장 또는 전립선의 암 조직 및 정상 조직으로부터 합성된 cDNA 를 이용하여 나일론막인 Matched Tumor/Normal Expression Array (Clontech)를 실시예 2에서와 같이 ³²P 로 표지된 프로브를 포함하는 GMC 완충액에 침지하고, 혼성화를 65℃에서 16 시간 동안 수행하였다. 혼성화 후에, 나일론막을 2xSSC로 실온에서 5 분 동안, 1xSSC (0.2% SDS 포함)로 50℃에서 30 분 동안 및 0.5xSSC (0.2% SDS 포함)로 50℃에서 30 분 동안 교대로 세정하고, 공기로 건조시켰다. 이어서, 상기 나일론막을 이미지 플레이트 (FUJI FHOTO FILM CO., LTD.)를 갖는 이미지 플레이트 카세트 (FUJI FHOTO FILM CO., LTD.)에 넣었다. 이미지 분석을 이미지 분석기 FLA3000 (FUJI FHOTO FiLM CO., LTD.)로 수행하였다.

나일론막의 혼성화 후에, 신호 강도를 실시예 3에서와 같이, 프로브로서 ³²P 로 표지된 β-액틴 유전자를 이용하여 측정하였다. KIAA1O36 의 신호 강도는 각 기관에서의 β-액틴 프로브의 신호 강도를 이용하여 표준화하고, 동일한 환자에서 정상 조직에 대한 암 조직의 비를 계산하였다. 이어서, 모든 종류의 암 조직에서의 유전자의 발현 수준의 변화를 분석하였다.

그 결과, KIAA1O36 유전자의 발현은 난소암을 갖는 모든 4 명의 환자 및 직장암을 갖는 11 명의 환자의 암 조직에서 증가되었다 (도 3).

실시예 5

COS 세포에서 KIAA1O36 의 발현

3XFLAG 서열을 서열 번호 2의 1 위치의 Met 에서 365 위치의 Val 로 표시된 KIAA1036 아미노산 서열의 카르복시 말단에 첨가한 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA 를 동물 세포에서 발현 벡터에 삽입하고, COS 세포에서 발현하였다.

KIAA1036 을 코딩하는 서열 번호 1의 386 위치의 A 에서 1480 위치의 C 로 표시된 염기 서열을 동물 세포에서 발현 벡터의 NotI/XbaI 자리에 삽입하고, p3 x FLAG-CMV-13 및 p3 x FLAG-CMV-14(SIGMA-Aldrich) 및 3 x FLAG 를 KIAA1036 의 카르복시 또는 아미노 말단에 첨가한 폴리펩티드를 발현하는 플라스미드인 pFLAG13- 1036 및 pFLAG14-1036 을 각각 구축하였다.

COS-7 세포 (아프리카 녹색 원숭이 신장세포 (SV4O 형질전환된 세포))를 pFLAG13-1036 및 pFLAG14-1036 의 숙주로서 사용하고, 형질전환을 FuGENE6 시약 (Roche Diagnostics)에 첨부된 매뉴얼에 따라 수행하였다.

COS-7 세포 (60mm 접시에 5 ×10⁵ 세포/웰)를 10% FCS를 포함하는 D-MEM 배지에서 37℃에서 16 시간 동안 배양하였다. 배지를 교환 후에, pFLAG13-1036(2㎍) 및 FuGENE6 (10㎕) 를 세포에 첨가하고, 세포를 48 시간 동안 배양하였다. 대조군으로서 KIAA1O36 cDNA 가 없는 p3xFLAG-CMV-14 및 pFLAG14-1036 를 또한 동일한 방법을 사용하여 트랜스펙턴트를 제조하고, 트랜스펙턴트를 배양하였다.

FLAG 와 융합된 KIAA1O36 폴리펩티드를 Laemli 의 방법인 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다.

모든 종류의 COS-7 트랜스펙턴트의 배양 상층액 (10㎕)를 SDS-PAGE 하고, 니트로셀룰로오스 막 키트(TEFCO)에서 니트로셀룰로오스 막에 전기적으로 옮겼다. 니트로셀룰로오스 막을 블록킹 시약 (TBS, pH7.6; 5%(w/v) 탈지우유를 포함)에 침지하고, 실온에서 1 시간 동안 진탕하였다. 막을 퍼옥시다아제(HRP) (SIGMA-Aldrich)로 표지된 항-FLAG M2 항체를 포함하는 TBS 시약 (pH7.6; 5%(w/v) 탈지우유를 포함)에 침지하고, 실온에서 1 시간 동안 방치하였다. 이어서, 니트로셀룰로오스 막을 세정액 (TBS, pH7.6; 0.05%(v/v) TritonX-100 을 포함)으로 10 분 동안 3 회 세정하였다. 니트로셀룰로오스 막 및 ECL Plus Western Blotting Detection Reagents (Amersham Pharmacia Bioteque)을 실온에서 반응시켰다. 니트로셀룰로오스 막 및 X-선 필름 X-OMAT AR (Kodak)을 X-OMAT 카세트 상에 즉시 위치하고, 수 분간 노출하였다.

그 결과, pFLAG13-1036 및 pFLAG14-1036으로 트랜스펙션된 COS 세포의 배양 상층액으로부터 약 50 kDa 을 보여주는 예상된 밴드를 검출하였으나, 대조군에서는 밴드가 검출되지 않았다. 그러므로, KIAA1O36 유전자가 발현할 수 있는 KIAA1O36 단백질을 코딩하며, KIAA1O36 이 동물 세포에서 분비성 단백질이라는 것을 확인하였다.

실시예 6

배큘로바이러스 시스템에서 KIAA1O36 단백질의 발현

배큘로바이러스 시스템에서의 발현을 첨부된 매뉴얼에 따라 Bac-to-Bac Baculovirus Expression System (Invitrogen)을 이용하여 수행하였다.

실시예 5 에 기재된 카르복시 말단에 3 X FLAG 를 갖는 KIAA1O36 을 코딩하는 cDNA 단편을 곤충 세포의 발현 플라스미드인 플라스미드 pFastBacl의 NotI/XhoI 자리에 삽입하여, pFASTBac1O36 을 제조하였다. 재조합 플라스미드를 Max Efficiency DH1O Bac Competent 세포 에 도입하고, cDNA 를 배큘로바이러스 게놈(bacmid DNA)내로 옮겨, 재조합 bacmid DNA 를 야기하였다. 재조합 bacmid DNA 를 세포FECTIN 시약(Invitrogen)을 이용하여 Sf9 (ATCC: CRL-1711, 난소세포)에 도입하여 재조합 배큘로바이러스를 수득하였다. Sf9 트랜스펙턴트의 배양 상층액 (0.5 ml)을 혈관 질환, 염증 질환, 안내 혈관신생 질환, 생식계 질환, 중추 신경계 질환 또는 악성종양을 갖는 Sf9 세포의 배양 배지 (50 ml)(농도는 1.5 X 10⁶ 세포/ml)에 첨가하고, 28℃에서 96 시간 동안 배양하였다. 형질전환된 세포를 원심분리로 수합하였다. FLAG-태깅된 KIAA1O36 의 발현은 실시예 5 에 기재된 웨스턴 블롯팅으로 확인하였다.

수합된 형질전환체를 PBS (5 ml, pH7.4)로 1회 세정하였다. 세정 후에, 세포를 용해(Lysis) 시약 (5ml) (50mM Tris-HC1, pH7.4; 0.15M NaCl, 0.1mM EDTA/2Na, 0.1mM EGTA, 1mM DTT, 0.1mM 아미디노페닐 메탄술포닐 플루라이드 히드로클로라이드 또는 0.1% NP-40 을 포함)에 현탁하고, 얼음에서 MICR0C0N (HEART SYSTEMS)으로 15 초간 4회 초음파 처리하고, 14,500xg 에서 20 분 동안 원심분리하여 분리하였다. 동일한 양의 용해 시약을 상층액에 첨가하여 조 단백질 용액을 수득하였다.

조 단백질 용액 (10㎕)을 SDS-PAGE 한 후에, 니트로셀룰로오스 막 키트(TEFCO)에서 니트로셀룰로오스 막에 전기적으로 옮겼다. 니트로셀룰로오스 막을 블록킹 시약 (TBS, pH7.6; 5%(w/v) 탈지우유를 포함)에 침지하고, 실온에서 1 시간 동안 진탕하였다. 그 후에, 막을 퍼옥시다아제(HRP) (SIGMA-Aldrich)로 표지된 항-FLAG M2 항체를 포함하는 TBS 시약 (pH7.6; 5%(w/v) 탈지우유를 포함)에 침지하고, 실온에서 1 시간 동안 방치하였다. 이어서, 니트로셀룰로오스 막을 세정액 (TBS, pH7.4; 0.05%(v/v) TritonX-100 을 포함)으로 10 분 동안 3 회 세정하였다. 나일론막 및 ECL Plus Western Blotting Detection Reagents (Amersham Pharmacia Bioteque)을 실온에서 반응시켰다. 니트로셀룰로오스 막 및 X-선 하이퍼 필름 ECL (Amersham Pharmacia Bioteque)을 X-OMAT 카세트 상(Kodak)에 위치하고, 수 분간 노출하였다.

KIAA1O36FLAG 단백질DMF GKD-FLAG 항체를 이용한 친화성 크로마토그래피로 정제하였다.

항-FLAG M2-아가로스 (SIGMA-Aldrich) 친화성 칼럼을 TBS, pH7.4 (0.1% NP-40 을 포함)로 평형화하고, 조 단백질 용액을 첨가하고, FLAG 단백질을 분리하였다. 칼럼을 TBS(pH7.4; 0.1% NP-40 포함)으로 세정하고, 단백질을 Gly-HC1 (pH3.5; 0.1% NP-40 을 포함)을 용출하여 lml/분획이 되게 하였다. 각 분획을 1M Tris-HC1 (pH8.0; 20㎕)로 중화하여 친화성 정제 분획을 수득하였다.

조 단백질 분획 (10㎕) 및 친화성 정제된 분획 (10㎕)을 SDS-PAGE 하고, 겔을 Bio-Safe Coomassie (BIO-RAD)로 염색하였다.

그 결과, 약 5OkDa 의 예상된 밴드를 검출하였다.

더욱이, SDS-PAGE 후에, 정제된 분획을 PVDF 막 (BIO-RAD)에 전기적으로 옮기고, Bio-Safe Coomassie (BIO-RAD)로 염색된 밴드를 잘라서, 아미노 말단의 서열을 아미노산 서열기인 Procise Model 491 (Applied Biosystems)로 분석하였다.

그 결과, 서열 번호 2의 2 위치의 Pro 에서 10 위치의 Gly 로 표시된 아미노산 서열을 검출하고, 발현된 단백질이 KAA1O36 임을 확인하였다.

실시예 7

혈관 내피세포에서 KIAA1036 에 의한 DNA 합성의 차단 효과

혈관 내피세포의 증식에 대한 KIAA1O36 단백질의 효과를 조사하기 위해, BrdU (브로모데옥시우리딘) 혼입을 KIAA1036의 존재 (처리된 군) 또는 부재(대조군)하에 VEGF 로 처리된 HUVEC 세포에서 측정하였다. 실시예 6에서 배큘로바이러스 발현 시스템에 의해 발현되고, 친화성 크로마토그래피로 정제된 KIAA1O36 단백질을 이용하였다. 세포내로 BrdU 의 혼입을 첨부된 매뉴얼에 따라 세포 증식 ELISA 및 BrdU 화학발광 키트를 이용하여 측정하였다.

인간 혈관 내피세포(3000 세포/플레이트)인 Endocell HUVEC (KURABO)을 5% 송아지 혈청 (FCS)을 포함하는 M199 배지 (Nissui)를 갖는 콜라겐 코팅된 플레이트 (IWAKI)상에 37℃에서 24 시간 동안 배양하였다. VEGF 처리된 군에 대해, 배지를 1 % FCS, 1nM 인간 VEGF₁₆₅ (R&D Systems) 및 0, 1, 10nM KIAA1036 단백질을 포함하는 M199 배지로 교환하였다. VEGF 미처리 군 (대조군)에 대해, 배지를 0, 1, 10nM KIAA1036 단백질을 포함하는 인간 VEGF₁₆₅ 를 포함하지 않는 동일한 배지로 교환하였다. BrdU (0.02 ml/웰)로 표지된 용액을 첨가하고, 세포를 37℃에서 12 시간 동안 배양하였다. 배양된 세포를 실온에서 1 시간 동안 방치하여 고정시키고, POD(0.1ml/웰)로 표지된 항-BrdU 항체 용액을 첨가하고, 세포를 실온에서 1 시간 동안 방치하였다. 세포를 세정 완충액으로 5 분 동안 3회 세정하고, 발광 기질 (0.1ml/웰)을 첨가하였다. 3분간의 진탕 후에, 5 초간의 즉각적인 형광을 10분 내에 Luminescencer JNR (ATTO)로 측정하였다.

그 결과, VEGF 는 HUVEC 의 DNA 합성을 촉진하였으나, KIAA1O36 단백질 투여 는 의존적으로 이를 저해하였다 (도 4).

실시예 8

KIAA1O36 단백질에 의한 혈관 내피세포의 이동에 대한 차단 효과

KIAA1O36 단백질의 혈관 내피세포의 이동에 대한 효과를 변형된 Boyden 체임버법으로 조사하였다.

Transwell (Corning coaster)의 하단 체임버에, 0.25nM 인간 VEGF₁₆₅ (R&D Systems) 및 1 또는 10 nM KIAA1O36 단백질을 포함하는 M199 배지 (6OO㎕/웰)를 VEGF 처리된 시료 (시험군)에 첨가하고, VEGF 가 없는 1 또는 10 nM KIAA1O36 단백질을 포함하는 M199 배지 (600㎕/웰)를 대조군에 첨가하였다. Endocell HUVEC (KURABO) (4 X 10⁴ 세포/웰)을 5 % FCS를 포함하는 M199 배지에서 16 시간 동안 배양한 후, 상단 체임버에 접종하고, 37℃에서 4 시간 동안 배양하였다. Transwell 의 필터를 Diffquick 고정 시약 (Sysmex)으로 고정한 후, Diffquick 염색액 (Sysmex)으로 염색하였다. 필터의 상단 체임버의 측면을 닦은 후에, VEGF 에 대한 세포 이동능을 하단 부분으로 이동하는 세포의 수를 계산함으로써 측정하였다.

그 결과, VEGF 는 HUVEC 의 이동을 촉진하였으나, KIAA1O36 단백질은 현저하게 이를 저해하였다 (도 5).

실시예 9

KIAA1O36 단백질에 의한 혈관 내피세포의 망 형성에 대한 차단 효과

KIAA1O36 단백질에 의한 혈관 내피세포의 망 형성에 대한 효과를 조사하기 위해, KIAA1O36 단백질의 존재 (처리군) 또는 부재 (대조군)하에 HUVEC 의 망 형성을 관찰하였다.

Matrigel (Becton Dickinson Biosciences) (lml/웰)을 빙냉의 6-웰 조직 배양 플레이트에 나누고, 37℃에서 1 시간 동안 방치하여 젤라틴화하였다. Endocell HUVEC (KURABO)을 10 % FCS을 포함하는 EBM 배지에 현탁하고, 5X10⁴ 세포/웰로 matrigel에 쏟아, KIAA1O36 단백질의 최종 농도가 1 또는 lOnM (시험군)이 되게 하거나 또는 KIAA1O36 단백질이 없게 하였다. 37℃에서 9 시간 동안 배양 후에, 시험 군 및 대조군에서의 HUVEC 의 망 형성은 역상 현미경으로 관찰되었다.

그 결과, KIAA1036 단백질은 명백히 망 형성을 저해한다는 것을 확인하였다.

도 1 은 KIAA1036 의 아미노산 서열 및 AK022567 의 아미노산 서열을 비교한 모식도이다.

Query: 614 는 KIAA1036 의 아미노산 서열을 보여준다. Sbjct: 1 은 AK022567 의 아미노산 서열을 보여준다.

도 2 는 노던 블롯에 의한 인간 제대 정맥 내피세포에서 KIAA1036 의 발현 수준을 보여준다.

총 RNA 는 인간 제대 정맥 내피세포를 0, 0.5, 2, 6, 12 또는 24 시간 동안 1nM VEGF 로 처리함으로써 제조되었다. 이어서 β-액틴 유전자의 신호 강도에 대한 KIAA1036 유전자의 신호 강도를 계산하였다. 대조군 (1nM VEGF 를 첨가하지 않음)을 1 로 할 때의 상대적인 발현 수준을 보여준다.

VEGF 를 첨가한 후 0.5 내지 2 시간에 발현이 저해되었다. 그러나 VEGF 를 첨가한 후 24 시간에 3.2 배 높은 유전자 발현이 유도되었다.

도 3 은 돗 블롯 (Dot blot)에 의한 인간 암 조직에서 KIAA1036 의 발현 수준을 보여준다.

cDNA 가 인간 난소암 또는 대장암을 갖는 환자로부터 수득된 암 조작 및 동일한 환자로부터 수득된 정상 조직 유래인, cDNA 를 고정시킨 나일론막을 이용하여, β-액틴 유전자의 신호 강도에 대한 KIAA1036 유전자의 신호 강도를 계산하였다. 동일한 환자의 각각의 정상 조직에 대한 각각의 암 조직에서 신호 강도의 비를 계산하였다. 각각의 암 조직에서 유전자의 발현 수준의 변화를 분석하였 다. 그 결과, 난소암을 갖는 4 명의 환자 모두 및 대장암을 갖는 11 명의 환자 모두의 암 조직에서, KIAA1036 유전자의 발현이 증가되었다.

도 4 는 혈관 내피세포에 대한 KIAA1036 폴리펩티드의 성장억제 효과를 보여준다.

인간 혈관 내피세포에서 세포 증식은 DNA 합성에서 브로모데옥시우리딘 (BrdU)의 흡수를 측정함으로써 계산되었다. 인간 혈관 내피세포를 KIAA1036 폴리펩티드의 농도가 0, 1 또는 10 nM 인 M199 배지로 나누었다. BrdU 시약을 거기에 첨가하고, 세포를 12 시간 동안 배양하였다. 이어서, 세포에 흡수된 BrdU 의 양을 측정하였다 (레인 1 내지 3). 동일한 조작을 1 nM VEGF 를 첨가한 M199 배지를 이용하여 수행하고, 세포에 흡수된 BrdU 의 양을 측정하였다 (레인 4 내지 6).

그 결과, VEGF 의 첨가에 무관하게, 첨가된 KIAA1036 폴리펩티드의의 농도에 의존하여, 세포에서의 DNA 합성은 감소되었다.

도 5 는 혈관 내피세포의 이동 활성에 대한 KIAA1036 의 억제효과를 보여준다.

KIAA1036 폴리펩티드의의 농도가 0, 1 또는 10 nM 인 M199 배지를 필터로 나누어진 배양 장치의 하층에 첨가하고, 혈관 내피세포를 이의 상층에 첨가하였다. 세포를 4 시간 동안 배양하였다. 이어서 필터에 부착된 세포 집단을 측정하였다 (레인 1 내지 3). 동일한 작업을 0.25 nM VEGF를 첨가한 M199 배지를 이용하여 수행하고, 필터에 부착된 세포 집단을 측정하였다 (레인 4 내지 6).

그 결과, VEGF 의 첨가에 무관하게, 첨가된 KIAA1036 폴리펩티드의 농도에 의존하여, 세포의 이동 활성은 저해되었다.

<110> SHIONOGI & CO., LTD. <120> A polypeptide and its DNA as a maker of angiogenesis. <130> 01P00019WO <140> 01P00019 <141> 2001-05-07 <150> JP 136179/2001 <151> 2001-05-07 <160> 6 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 5481 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (386)..(1480) <300> <308> Genebank/XM#007415 <309> 2000-11-17 <400> 1 ccgctggtcc gagctgtctg gcctcagttt ccctccgact tttctccgct ctgccagccc 60 tcactgctgc ccgtcattgt tctcgcagtt agatgggggt gctttgtgac ggctgccaag 120 ttggggtgtg ttctctttat tccgtttttc aaacagaaca aggcctccaa ggctgacccc 180 agacaaccca ccccctcgga ccctaattca ccttattgca ctgatttttt ttatcaagtc 240 gtattttatt gtacaggagc cacgccctga tttcttaaag gcgccttgca ctctggccat 300 gtgttatctc tgcagccggt gtgtgggagg cctcttgtga gccagttgtt ttcccgcctc 360 caccaccccc ctcgaagatt taggg atg cca ggg ggg aag aag gtg gct 409 Met Pro Gly Gly Lys Lys Val Ala 1 5 ggg ggt ggc agc agc ggt gcc act cca acg tcc gct gcg gcc acc gcc 457 Gly Gly Gly Ser Ser Gly Ala Thr Pro Thr Ser Ala Ala Ala Thr Ala 10 15 20 ccc tct ggg gtc agg cgt ttg gag acc agc gaa gga acc tca gcc cag 505 Pro Ser Gly Val Arg Arg Leu Glu Thr Ser Glu Gly Thr Ser Ala Gln 25 30 35 40 aga gat gag gag cca gaa gag gaa ggg gaa gag gac ctg cga gac gga 553 Arg Asp Glu Glu Pro Glu Glu Glu Gly Glu Glu Asp Leu Arg Asp Gly 45 50 55 ggc gtc ccc ttc ttt gtc aac cgg ggt ggg cta cct gtg gat gag gcc 601 Gly Val Pro Phe Phe Val Asn Arg Gly Gly Leu Pro Val Asp Glu Ala 60 65 70 acc tgg gaa agg atg tgg aaa cac gtg gcc aag atc cac ccc gat gga 649 Thr Trp Glu Arg Met Trp Lys His Val Ala Lys Ile His Pro Asp Gly 75 80 85 gag aag gtg gcg caa cgg atc cgt ggg gcc aca gac ctg ccc aag atc 697 Glu Lys Val Ala Gln Arg Ile Arg Gly Ala Thr Asp Leu Pro Lys Ile 90 95 100 ccc ata ccg agt gtg cct acg ttc cag ccg tct aca cct gtc cct gag 745 Pro Ile Pro Ser Val Pro Thr Phe Gln Pro Ser Thr Pro Val Pro Glu 105 110 115 120 cgc ctg gaa gct gtg cag cgc tat atc aga gag ctg cag tac aat cac 793 Arg Leu Glu Ala Val Gln Arg Tyr Ile Arg Glu Leu Gln Tyr Asn His 125 130 135 aca ggg aca cag ttc ttt gaa att aag aag agc aga cct ctg aca ggg 841 Thr Gly Thr Gln Phe Phe Glu Ile Lys Lys Ser Arg Pro Leu Thr Gly 140 145 150 ctg atg gac ctg gcc aag gaa atg acc aaa gag gcc ctg cca atc aaa 889 Leu Met Asp Leu Ala Lys Glu Met Thr Lys Glu Ala Leu Pro Ile Lys 155 160 165 tgc ctg gaa gcc gtg atc ctg gga att tac ctc acc aac agc atg ccc 937 Cys Leu Glu Ala Val Ile Leu Gly Ile Tyr Leu Thr Asn Ser Met Pro 170 175 180 acc ctg gag cgc ttc ccc atc agc ttc aag acc tac ttc tca ggg aac 985 Thr Leu Glu Arg Phe Pro Ile Ser Phe Lys Thr Tyr Phe Ser Gly Asn 185 190 195 200 tac ttc cgc cac atc gtg ctg ggg gtg aac ttc gcg ggc cgc tac ggt 1033 Tyr Phe Arg His Ile Val Leu Gly Val Asn Phe Ala Gly Arg Tyr Gly 205 210 215 gcg ctg ggc atg agt cgg cgc gag gac ctg atg tac aag ccg ccc gcc 1081 Ala Leu Gly Met Ser Arg Arg Glu Asp Leu Met Tyr Lys Pro Pro Ala 220 225 230 ttc cgc acg ctc agc gag ctc gtg ctg gac ttc gag gcc gcc tac ggc 1129 Phe Arg Thr Leu Ser Glu Leu Val Leu Asp Phe Glu Ala Ala Tyr Gly 235 240 245 cgc tgc tgg cac gtg ctc aag aag gtg aag ctg ggc cag agc gtg tca 1177 Arg Cys Trp His Val Leu Lys Lys Val Lys Leu Gly Gln Ser Val Ser 250 255 260 cac gac ccg cac agc gtg gag cag atc gag tgg aag cac tcg gtg ctg 1225 His Asp Pro His Ser Val Glu Gln Ile Glu Trp Lys His Ser Val Leu 265 270 275 280 gac gtg gag cgc ctg ggc cgc gat gac ttc cgc aag gag ctg gag cgc 1273 Asp Val Glu Arg Leu Gly Arg Asp Asp Phe Arg Lys Glu Leu Glu Arg 285 290 295 cac gcc cgc gac atg cgg ctc aag att ggc aaa ggg acg ggc cct ccc 1321 His Ala Arg Asp Met Arg Leu Lys Ile Gly Lys Gly Thr Gly Pro Pro 300 305 310 tct ccc acc aag gac cgg aag aag gat gtt tct tcc ccg cag cgg gcc 1369 Ser Pro Thr Lys Asp Arg Lys Lys Asp Val Ser Ser Pro Gln Arg Ala 315 320 325 cag tcc agc ccc cac cgc agg aac agc cgc agt gaa aga cgg ccc tcg 1417 Gln Ser Ser Pro His Arg Arg Asn Ser Arg Ser Glu Arg Arg Pro Ser 330 335 340 ggt gac aag aag act tcc gag ccc aaa gcc atg cca gac ctt aac ggg 1465 Gly Asp Lys Lys Thr Ser Glu Pro Lys Ala Met Pro Asp Leu Asn Gly 345 350 355 360 tac cag atc cgg gtc tgaggcggat gccagcaccc caggccccac ccactcttgg 1520 Tyr Gln Ile Arg Val 365 gggccaggat ccacctgctg gaaccagcct tatgcatggg gaaggcgggg ctggtgacaa 1580 ggcagggcaa gaggctgcag gaagagtgtg ttccagctca gccccccaag ctgctctcgc 1640 tcccactgag ccaagccccc taactttggg cctagaggcc gttagtattt tatttggagt 1700 ttttaactct acaactgaag tttaaggtat ttggggaaaa cttagtccaa atggatctgc 1760 tgatggtggg aaggccagtg cttaacaaat ccatgtgtca tggggccagg tgagggaaac 1820 tgctggttct gctggtgcct ctgcccctgg cttctctctg ggagttgggt gcatcttatc 1880 agtgggaaat ctcccagcct taccaggcct gtgatggggg gtgggggtgg ggtggagatg 1940 tttctccagt tctgcctgcc ctggcagaat cttgacccag ggaaagggaa gcagggtagg 2000 agtccttctg agaaaggtct gtgtagccca ttaaccagga gcttggcaca ggccacatct 2060 gccccaagag catgagctcg tggctcagga gagccttcag gcccttgagg cccccatggg 2120 cagtgctgtg tgggcagagg aggggtgata tgagagcgag cccagggaag gacctctggg 2180 caaaaagttc ccaggcccta actgcgtcta cttgctcagt cccagctctg cctgttgctc 2240 tagcccacag gctccctgcg gagggtctgg gcttggcgga ggacccagaa tggcactgag 2300 gccagcatgg ctgtgggagt tgagcaaacc ctgggtgcca gtccaggagc tgtggctgga 2360 catggggtga tggggcggga tgcttgggcc tgggtctctc cgccagcagt gccaggagcc 2420 cttgctgggg aaatcaagac cagactagga tgcttctgcc ccaggcctgc cttccattct 2480 ttaacagccc atcttggctt ggggttgcaa tgatggctgg gccagtcact tgtggcaggg 2540 catcagggcc ctggcaggga agaacctagg cacctggggt tgtccccagc ctgcccgtca 2600 gcatgagata cccagtggga aagtgagagg atgcggagag gttggcagag ccaggggtag 2660 gttctggagg ctcaagcaac aaggaggtgc aggtaaaggg tgcagtgcag ccactgaggg 2720 acagctggga actgggggat gcaagtgaga aagggatgtg ggggagagtt caggatcagg 2780 ctgcttgagg agtaatgggt tacctacagc agagacgaga tggctgtttg tcaggaggcg 2840 gtagaaaggt agaaaggatt cagattgtgg aagggtaaat ggatgagatg accattaagg 2900 ttttgtttta ctgagaggct gtaagtctgc cagggacagc tgtcagtaag gctgcagaag 2960 ggctgggggg ctacacaagg aagagcagaa ctagggttgt aagctcaaat gacgagcaaa 3020 cggtgagaag gaggcctgaa gggctgtgtg gggactatgg ctacctgaag agggcacacc 3080 ctgttaaagg ggccacagct gctcagctgt tcttacagtg ccggccctgt gttgccagat 3140 tgtctgcttt gtcagaggcc agaattctga ctttttatgt gaaataggat ttttaaatgc 3200 tggtgatcac ttaaaaaaaa cttaaaaacc caatactggc aaaagaggat gccagtttgc 3260 aatccctgaa gtagagagag ctcgtgctgg ggagaagtcc accaagatgc tttgaggcgg 3320 gctgtagcaa agtcctgttt ctcagagctg ggctgggctg gggtaggatc cttgcagctg 3380 aggaggagga aaagccactg agtctcctcc cagagcggga caaaccagag gccctttgca 3440 gttgctgggt caccagcggg ggtggcgcat ggagtacaga cagtgtagct cttggcctgc 3500 cagggagacg gatggtgcct ttgaagcaaa gaggaaggga aggcagaacc agggatgcct 3560 ttgctgatga gagtgcctgt cagggaaggc gccacaggct ggcagctctt caaaccagca 3620 gcgcttgacc cagagccaga tccagcatgg cctggccaga ggcaccctgg gaggccagct 3680 ggtcagtccc ttgcctcccc aagttccccc tggggtcaat gagccctggg aggatgccta 3740 acctaactcc agccagacta ataggggcat ggtgaccctt gactcaccat cccatcccag 3800 ctttcaggga gtgggggtag tgtggtctcc atgttcctac tatgcctaag aagagatggc 3860 tcaccttggg aggtgccagg ctgaaactag gtcctttccg ggtctggatg ctgccgctca 3920 ggagcagggg cgtggcctca gctgcctctg ggagcttccc gggaatgaca gggtttgagg 3980 ggagtagata tgagagggag ccgctcctgg ttctggagtc ttaggaggtt ccaacttgca 4040 ggatcctttc ccagagccct ccatggagaa aacagcaaaa tgaagccctt acctgcttgc 4100 tgtctgcaag ggagggagcc gagccccagc tgataatccc ccagcactca cccttcctga 4160 gctgagactt cggggctgtg gagaccagca caggacatag tggtgctttt taaatttatt 4220 tttaactgtt tctcatatgt agcaacccct cctcccctcc tgggcatgtt tacacaggct 4280 ctgctctggg ggctggcctg gctgtgaggt ttctggggag gcagagaggc agggactttg 4340 gggccttagt caccatccat ggtatcacct catctcactt cctgtgaggg acagggcctg 4400 gctgatgtga tcccagctcc ccccagttca ggactgtctt tcagctcctt tgcccctgga 4460 ggtgggggct gctggctgag gaggggtcaa ggtgagttca agaaagctac ctgtggaaaa 4520 tggaccaggt tgggggggtg attgcaaagt ctccccaaag cctggctcct catgctcagt 4580 gccaggggca gaacactggg gagccaggta tagagagcct tcctgtcata actgccagtc 4640 ctcttcctcc aaggcctctg catattctca tgttcccctc acccatcatg ccagccaccc 4700 ctatccctct tctagcaggg ccaagatggg gacagcagca gccctctggc cttgggatgt 4760 gatgataaag caagcctagg gccagggttt ggggagcaga gagagccaag aagttgacca 4820 cgtgtgattt ccagcccttc ccactgggac ttgacttccc aggtcaagga gtccgtctca 4880 ttctggctgg tcgagtgacc agaggcctgt gtgaatgtgt gcacctgctt ttcctgcctg 4940 gaatgttttc tggctcagct gcagcaacat ctgtgagccc agtgtctgcc ctgtgtccct 5000 gggctcgctc caagtgcagg aacatacatg cagggcccaa catgatgatg gtgtgaaggg 5060 caggaaacag tcctctgaag gagtggggag gtgggcagtc tgcccccgcc aggtaccatc 5120 gcctcctgcc agcttcctta gaccaggcag ggctgccatg gtgctagctg caagtccatc 5180 agtattgacc gtctcgctcc atcttggtcc tccggagtcc caagtttcct tttcatcaaa 5240 tctgacaaga gagaagaaac atgggtgtgc ttggcccaca gggcctggtg gtgatggacc 5300 tccccgctcc ctcaagctct ggatggctgc agtgttgtac tagactttgt tcaggctgtt 5360 ctcatctcag tattgcccct tcctttcact ttcacacttc atctcattcc tgttgtcact 5420 ttccccgaaa cgaataaagt ctccccagct cctgctgtgt aggctgggca gaaaccacaa 5480 c 5481 <210> 2 <211> 365 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Pro Gly Gly Lys Lys Val Ala Gly Gly Gly Ser Ser Gly Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Ala Ala Ala Thr Ala Pro Ser Gly Val Arg Arg Leu Glu 20 25 30 Thr Ser Glu Gly Thr Ser Ala Gln Arg Asp Glu Glu Pro Glu Glu Glu 35 40 45 Gly Glu Glu Asp Leu Arg Asp Gly Gly Val Pro Phe Phe Val Asn Arg 50 55 60 Gly Gly Leu Pro Val Asp Glu Ala Thr Trp Glu Arg Met Trp Lys His 65 70 75 80 Val Ala Lys Ile His Pro Asp Gly Glu Lys Val Ala Gln Arg Ile Arg 85 90 95 Gly Ala Thr Asp Leu Pro Lys Ile Pro Ile Pro Ser Val Pro Thr Phe 100 105 110 Gln Pro Ser Thr Pro Val Pro Glu Arg Leu Glu Ala Val Gln Arg Tyr 115 120 125 Ile Arg Glu Leu Gln Tyr Asn His Thr Gly Thr Gln Phe Phe Glu Ile 130 135 140 Lys Lys Ser Arg Pro Leu Thr Gly Leu Met Asp Leu Ala Lys Glu Met 145 150 155 160 Thr Lys Glu Ala Leu Pro Ile Lys Cys Leu Glu Ala Val Ile Leu Gly 165 170 175 Ile Tyr Leu Thr Asn Ser Met Pro Thr Leu Glu Arg Phe Pro Ile Ser 180 185 190 Phe Lys Thr Tyr Phe Ser Gly Asn Tyr Phe Arg His Ile Val Leu Gly 195 200 205 Val Asn Phe Ala Gly Arg Tyr Gly Ala Leu Gly Met Ser Arg Arg Glu 210 215 220 Asp Leu Met Tyr Lys Pro Pro Ala Phe Arg Thr Leu Ser Glu Leu Val 225 230 235 240 Leu Asp Phe Glu Ala Ala Tyr Gly Arg Cys Trp His Val Leu Lys Lys 245 250 255 Val Lys Leu Gly Gln Ser Val Ser His Asp Pro His Ser Val Glu Gln 260 265 270 Ile Glu Trp Lys His Ser Val Leu Asp Val Glu Arg Leu Gly Arg Asp 275 280 285 Asp Phe Arg Lys Glu Leu Glu Arg His Ala Arg Asp Met Arg Leu Lys 290 295 300 Ile Gly Lys Gly Thr Gly Pro Pro Ser Pro Thr Lys Asp Arg Lys Lys 305 310 315 320 Asp Val Ser Ser Pro Gln Arg Ala Gln Ser Ser Pro His Arg Arg Asn 325 330 335 Ser Arg Ser Glu Arg Arg Pro Ser Gly Asp Lys Lys Thr Ser Glu Pro 340 345 350 Lys Ala Met Pro Asp Leu Asn Gly Tyr Gln Ile Arg Val 355 360 365 <210> 3 <211> 1945 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:AF055021 <300> <301> Andersson, Bjorn <302> A'double adaptor'method for improved shotgun library construction <303> Anal. Biochem. <304> 236 <305> 1 <306> 107-113 <307> 1998-04-02 <308> Genebank/AF055021 <400> 3 ctttgctgat gagagtgcct gtcagggaag gcgccacagg ctggcagctc ttcaaaccag 60 cagcgcttga cccagagcca gatccagcat ggcctggcca gaggcaccct gggaggccag 120 ctggtcagtc ccttgcctcc ccaagttccc cctggggtca atgagccctg ggaggatgcc 180 taacctaact ccagccagac taataggggc atggtgaccc ttgactcacc atcccatccc 240 agctttcagg gagtgggggt agtgtggtct ccatgttcct actatgccta agaagagatg 300 gctcaccttg ggaggtgcca ggctgaaact aggtcctttc cgggtctgga tgctgccgct 360 caggagcagg ggcgtggcct cagctgcctc tgggagcttc ccgggaatga cagggtttga 420 ggggagtaga tatgagaggg agccgctcct ggttctggag tcttaggagg ttccaacttg 480 caggatcctt tcccagagcc ctccatggag aaaacagcaa aatgaagccc ttacctgctt 540 gctgtctgca agggagggag ccgagcccca gctgataatc ccccagcact cacccttcct 600 gagctgagac ttcggggctg tggagaccag cacaggacat agtggtgctt tttaaattta 660 tttttaactg tttctcatat gtagcaaccc ctcctcccct cctgggcatg tttacacagg 720 ctctgctctg ggggctggcc tggctgtgag gtttctgggg aggcagagag gcagggactt 780 tggggcctta gtcaccatcc atggtatcac ctcatctcac ttcctgtgag ggacagggcc 840 tggctgatgt gattccagct ccccccagtt caggactgtc tttcagctcc tttgcccctg 900 gaggtggggg ctgctggctg aggaggggtc aaggtgagtt caagaaagct acctgtggaa 960 aatggaccag gttggggggg tgattgcaaa gtctccccaa agcctggctc ctcatgctca 1020 gtgccagggg cagaacactg gggagccagg tatagagagc cttcctgtca taactgccag 1080 tcctcttcct ccaaggcctc tgcatattct catgttcccc tcacccatca tgccagccac 1140 ccctatccct cttctagcag ggccaagatg gggacagcag cagccctctg gccttgggat 1200 gtgatgataa agcaagccta gggccagggt ttggggagca gagagagcca agaagttgac 1260 cacgtgtgat ttccagccct tcccactggg acttgacttc ccaggtcaag gagtccgtct 1320 cattctggct ggtcgagtga ccagaggcct gtgtgaatgt gtgcacctgc ttttcctgcc 1380 tggaatgttt tctggctcag ctgcagcaac atctgtgagc ccagtgtctg ccctgtgtcc 1440 ctgggctcgc tccaagtgca ggaacataca tgcagggccc aacatgatga tggtgtgaag 1500 ggcaggaaac agtcctctga aggagtgggg aggtgggcag tctgcccccg ccaggtacca 1560 tcgcctcctg ccagcttcct tagaccaggc agggctgcca tggtgctagc tgcaagtcca 1620 tcagtattga ccgtctcgct ccatcttggt cctccggagt cccaagtttc cttttcatca 1680 aatctgacaa gagagaagaa acatgggtgt gcttggccca cagggcctgg tggtgatgga 1740 cctccccgct ccctcaagct ctggatggct gcagtgttgt actagacttt gttcaggctg 1800 ttctcatctc agtattgccc cttcctttca ctttcacact tcatctcatt cctgttgtca 1860 ctttccccga aacgaataaa gtctccccag ctcctgctgt gtaggctggg cagaaaccac 1920 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1945 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer1 <400> 4 gttcaggact gtctttcagc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer2 <400> 5 gtcaatactg atggacttgc 20 <210> 6 <211> 764 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:fragmented cDNA <300> <301> Andersson, Bjorn <302> A'double adaptor'method for improved shotgun library construction <303> Anal. Biochem. <304> 236 <305> 1 <306> 107-113 <307> 1998-04-02 <308> Genebank/AF055021 <400> 6 gttcaggact gtctttcagc tcctttgccc ctggaggtgg gggctgctgg ctgaggaggg 60 gtcaaggtga gttcaagaaa gctacctgtg gaaaatggac caggttgggg gggtgattgc 120 aaagtctccc caaagcctgg ctcctcatgc tcagtgccag gggcagaaca ctggggagcc 180 aggtatagag agccttcctg tcataactgc cagtcctctt cctccaaggc ctctgcatat 240 tctcatgttc ccctcaccca tcatgccagc cacccctatc cctcttctag cagggccaag 300 atggggacag cagcagccct ctggccttgg gatgtgatga taaagcaagc ctagggccag 360 ggtttgggga gcagagagag ccaagaagtt gaccacgtgt gatttccagc ccttcccact 420 gggacttgac ttcccaggtc aaggagtccg tctcattctg gctggtcgag tgaccagagg 480 cctgtgtgaa tgtgtgcacc tgcttttcct gcctggaatg ttttctggct cagctgcagc 540 aacatctgtg agcccagtgt ctgccctgtg tccctgggct cgctccaagt gcaggaacat 600 acatgcaggg cccaacatga tgatggtgtg aagggcagga aacagtcctc tgaaggagtg 660 gggaggtggg cagtctgccc ccgccaggta ccatcgcctc ctgccagctt ccttagacca 720 ggcagggctg ccatggtgct agctgcaagt ccatcagtat tgac 764

Claims

하기 공정을 포함하는 동맥경화, 류마티스, 노화황반변성증, 당뇨병성 망막증 또는 고형암의 진단에 사용하기 위한, 서열 번호 1 의 386 위치의 A 에서 1480 위치의 C 로 표시된 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트:

(a) 폴리뉴클레오티드 및 시료를 접촉시키는 공정, 및

(b) 폴리뉴클레오티드와 결합하는 폴리뉴클레오티드를 검출하는 공정.
하기 공정을 포함하는 동맥경화, 류마티스, 노화황반변성증, 당뇨병성 망막증 또는 고형암의 진단에 사용하기 위한, 서열 번호 1의 386 위치의 A 에서 1480 위치의 C 로 표시된 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트:

(a) cDNA 를 시료에서 제조하는 공정, 및

(b) cDNA 를 폴리뉴클레오티드를 이용하여 증폭하고, 검출하는 공정.
하기 공정을 포함하는 동맥경화, 류마티스, 노화황반변성증, 당뇨병성 망막증 또는 고형암의 진단에 사용하기 위한, 서열 번호 2의 1 위치의 Met 에서 365 위치의 Val 로 표시된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 인식하는 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트:

(a) 항체 및 시료를 접촉시키는 공정, 및

(b) 항체와 폴리펩티드 사이의 결합을 검출하는 공정.
하기 공정을 포함하는, 서열 번호 2의 1 위치의 Met 에서 365 위치의 Val 로 표시된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드로 이루어지는 동맥경화, 류마티스, 노화황반변성증, 당뇨병성 망막증 또는 고형암에 대한 마커의 결합 물질의 스크리닝 방법:

(a) 서열 번호 2의 1 위치의 Met 에서 365 위치의 Val 로 표시된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드로 이루어지는 동맥경화, 류마티스, 노화황반변성증, 당뇨병성 망막증 또는 고형암에 대한 마커와 대상 (피검물질)을 접촉시키는 공정,

(b) 마커와 피검물질 사이의 결합을 검출하는 공정, 및

(c) 피검물질이 세포의 DNA 합성을 촉진 또는 억제하는 활성, 피검물질이 세포 이동을 촉진 또는 억제하는 활성, 또는 피검물질이 혈관 내피세포의 가시적인 망 형성을 촉진하는 활성 또는 억제하는 활성을 측정하는 공정.
제 4 항에 기재된 스크리닝 방법에 사용하기 위한, 서열 번호 2 로 표시된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 포함하는 스크리닝 키트.
하기 공정을 포함하는, 서열 번호 2의 1 위치의 Met 에서 365 위치의 Val 로 표시된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드로 이루어지는 동맥경화, 류마티스, 노화황반변성증, 당뇨병성 망막증 또는 고형암에 대한 마커와, 마커의 결합 물질 사이의 결합을 조절하는 결합 활성 조절 물질의 스크리닝 방법:

(a) 서열 번호 2의 1 위치의 Met 에서 365 위치의 Val 로 표시된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드로 이루어지는 동맥경화, 류마티스, 노화황반변성증, 당뇨병성 망막증 또는 고형암에 대한 마커와, 마커의 결합 물질을 대상 (피검물질)의 존재 또는 부재하에 접촉시키는 공정,

(b) 마커와 결합 물질의 결합 활성을 피검물질의 존재 또는 부재하에 비교하는 공정, 및

(c) 피검물질이 세포의 DNA 활성을 촉진 또는 억제하는 활성, 피검물질이 세포 이동을 촉진 또는 억제하는 활성, 또는 피검물질이 혈관 내피세포의 가시적인 망 형성을 촉진하는 활성 또는 억제하는 활성을 측정하는 공정.
서열 번호 2 로 표시된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 포함하는, 제 6 항의 결합 활성 조절 물질의 스크리닝 키트.
하기 공정을 포함하는, 동맥경화, 류마티스, 노화황반변성증, 당뇨병성 망막증 또는 고형암에 대한 마커의 발현 조절 물질의 스크리닝 방법:

(a) 서열 번호 1 의 386 위치의 A 에서 1480 위치의 C 로 표시된 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 1의 1 위치의 C 에서 1480 위치의 C 로 표시된 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 1의 1 위치의 C 에서 5481 위치의 C 로 표시된 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 인간 제대 정맥혈관 내피세포 (HUVEC)로부터 수득한 cDNA 를 주형으로 하고 서열 번호 4 및 5 의 프라이머를 이용한 PCR 증폭에 의하여 생산되는 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 2의 1 위치의 Met 에서 365 위치의 Val 로 표시된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 동맥경화, 류마티스, 노화황반변성증, 당뇨병성 망막증 또는 고형암에 대한 마커를 발현할 수 있는 세포와 대상 (피검물질)을 접촉시키는 공정,

(b) 마커의 발현 수준의 변화를 제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 방법을 이용하여 검출하는 공정, 및

(c) 피검물질이 세포의 DNA 활성을 촉진 또는 억제하는 활성, 피검물질이 세포 이동을 촉진 또는 억제하는 활성, 또는 피검물질이 혈관 내피세포의 가시적인 망 형성을 촉진하는 활성 또는 억제하는 활성을 측정하는 공정.
제 8 항의 방법을 이용하는 것을 특징으로 하는, 서열 번호 1 의 386 위치의 A 에서 1480 위치의 C 로 표시된 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 1의 1 위치의 C 에서 1480 위치의 C 로 표시된 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 1의 1 위치의 C 에서 5481 위치의 C 로 표시된 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 인간 제대 정맥혈관 내피세포로부터 수득한 cDNA 를 주형으로 하고 서열 번호 4 및 5 의 프라이머를 이용한 PCR 증폭에 의하여 생산되는 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 2의 1 위치의 Met 에서 365 위치의 Val 로 표시된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 동맥경화, 류마티스, 노화황반변성증, 당뇨병성 망막증 또는 고형암에 대한 마커의 발현 조절 물질의 스크리닝 키트.