KR100876343B1 - 항종양제 및 그 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 항종양제는 양친매성 또는 수용성 폴리머에 결합한 헴옥시게나제 저해 활성을 갖는 금속 포르피린 유도체, 특히 폴리에틸렌글리콜과 결합한 Zn-프로토포르피린(ZnPP)를 유효 성분으로 하는 것으로, 폴리에틸렌글리콜과 같은 양친매성 또는 수용성 폴리머에 결합시킴으로써, 정맥 주사가 가능해지고, 또한 종양 선택적인 전달(delivery)에 의해, 현저한 항종양 효과를 나타낸다.
항종양제, 금속 포르피린 유도체, 헴옥시게나제

Description

항종양제 및 그 제조 방법{ANTITUMOR AGENTS AND PROCESS FOR PRODUCING THE SAME}
본 발명은 종양부로의 국소적 집적능이 높고, 그로 인해 항종양 활성이 뛰어나고, 부작용이 적은 항종양제 및 그 제조 방법에 관한 것이다. 더 자세하게는, 물과 오일의 쌍방에 용해하는 양친매성(amphipathic) 또는 수용성 폴리머가 결합한 헴옥시게나제(heme oxygenase) 저해 활성을 갖는 금속 포르피린(metalloporphyrin) 유도체를 유효 성분으로 하는 항종양제 및 상기 폴리머가 결합한 금속 포르피린 유도체를 수율 좋게 제조하는 방법에 관한 것이다.
발명자들은 지금까지 종양의 발생, 억제와 헴옥시게나제의 관계를 연구한 결과, 종양내에는 헴옥시게나제가 고농도로 발현되어 있고, 이 효소는 종양내에서는 헴을 분해하여, 빌베르딘(bilverdin), 일산화탄소 및 유리 철을 방출함을 알아내었다.
빌베르딘은 생체내에서 빌리루빈(bilirubin)으로 용이하게 대사변환된다. 이 빌리루빈은 강력한 항산화물이다. 한편, 숙주(암환자)가 생체 방어를 위해 동원하는 백혈구 등이 방출하는 슈퍼옥사이드(superoxide)나 H2O2, NO 등의 활성 산소 에 대해, 빌리루빈은 암 세포가 저항하기 위해 방출하는 암 세포를 위한 방어 분자이다. 따라서 활성 산소에 대한 최대의 방어 인자를 생성하는 헴옥시게나제의 활성을 정지시키면 종양은 암에 걸린 숙주의 생체 방어력으로 자멸한다.
발명자들은 이 관점에서, 헴옥시게나제의 저해제를 체내에 주입함으로써, 암 세포를 사멸시킴을 시도하여, 헴옥시게나제의 저해제인 Zn-프로토포르피린 (ZnPP)을 동맥내 주사에 의해서 암의 국소에 주입하여, 헴옥시게나제를 정지시킴과, 항종양 활성이 있음을 증명하였다(Doi, K et al., Br. J. Cancer 80, 1945-1954(1999)).
그러나 이 ZnPP를 항종양제로서 암의 치료법에 사용할 때에는 몇가지 문제점이 있었다. 첫 번째로 ZnPP는 난수용성이므로, 유제(oily formulation)로서 동맥내 투여해야만 하며, 동맥내 투여는 정맥내 투여보다도 절차가 복잡하다. 또한 ZnPP는 종양부에 국소적으로 집적하지 않기 때문에 그대로 투여해도 항종양 효과가 충분히 발휘되지 않고, 또한 약제가 종양부 이외의 전신에 넓게 분포해 버리므로, 예기치 못한 부작용이 염려된다.
한편, 발명자들은 수년에 걸쳐 고형암 국소의 물질 투과와 집적에 대하여 연구를 거듭하였다. 그 결과, 혈액 중에 투여한 물질은 종양혈관에 고유의 성상과 복수의 인자에 의해 고분자 물질만이 선택적으로, 그 국소(종양부)에 누출(침출)집적하고, 또한 정상 조직보다도 장기간 체류함을 알아내었다. 이 현상을 EPR 효과(Enhanced permeability and retention effect)로 명명하였다.(예를 들면, Y. Matsumura, H. Maeda: Cancer Res 47, 6387-6392(1986); H. Maeda: Inadvances in Enzyme Regulation(by G. Weber ed), Elsevier Scientific Ltd., Amsterdam, 41, 189-207(2001)).
EPR 효과에 의하면, 약물의 체내에서의 겉보기 분자량 40,000 이상으로 혈중 농도를 높게 유지할 수 있으면, 수시간 후에는 혈중 농도보다도 종양내 농도가 훨씬더 높게 되어, 24∼48시간후에는 종양내 농도는 혈중 농도의 수배로 된다. 즉 약물을 고분자화함에 의해, 약물의 종양 선택적인 전달이 가능해짐을 알 수 있다.
그런데, ZnPP를 비롯한 헴옥시게나제 저해 활성을 갖는 금속 포르피린 유도체에 대해서 투여법의 개선법 및, 종양 국소로의 선택적 집적을 시키는 수단으로서 상기 EPR 효과를 이용함을 검토하였다. 그 결과, 폴리에틸렌글리콜 등, 물과 오일의 쌍방에 용해하는 양친매성 또는 수용성 폴리머를 금속 포르피린 유도체와 결합시킴에 의해, 금속 포르피린 유도체의 수용액을 제조할 수 있게 되므로, 동맥 주사뿐만이 아니라 정맥 주사가 가능해지고, 또한 이들 폴리머로 고분자화시킴으로써 EPR 효과가 발휘되어, 고형 종양 국소에 선택적으로 집적되고, 더욱이 정맥 주사나 동맥 주사 후에도 집적을 장시간 지속시킬 수 있게 되었다. 그 결과 마우스의 종양 모델에서의 실험에서는 불과 2∼3회의 투여에 의해, 현저한 항종양 효과(종양 소실)가 나타났다.
양친매성 또는 수용성 폴리머와 결합한 헴옥시게나제 저해 활성을 갖는 금속 포르피린 유도체는, 그 합성 방법도 알려져 있지 않지만, 발명자들은 양친매성 또는 수용성 폴리머와, 헴옥시게나제 저해 활성을 갖는 금속 포르피린 유도체를 아미드 결합을 거쳐서 결합함에 의한 합성 방법을 알아내었다. 이렇게 하여 얻어진 폴리머와 결합한 금속 포르피린 유도체는 지금까지 알려져 있지 않은 신규 물질이다.
[발명의 개시]
즉 본 발명은, 양친매성 또는 수용성 폴리머에 결합한 헴옥시게나제 저해 활성을 갖는 금속 포르피린 유도체, 특히 Zn-프로토포르피린(ZnPP)을 유효 성분으로 하는 항종양제이다.
또한 본 발명은, 양친매성 또는 수용성 폴리머와 헴옥시게나제 저해 활성을 갖는 금속 포르피린 유도체가 아미드 결합을 거쳐서 결합한 항종양제의 성분으로서 유용한 신규 화합물, 및 그 제조 방법이다.
도 1은 아미노기 도입 포르피린 및 PEG 결합 포르피린의 클로로포름 중에서의 겔 여과 크로마토그래피이다.
도 2는 Lineweaver-Burk 플롯(plot)에 의한 PEG-ZnPP의 헴옥시게나제 활성 저해를 나타내는 도면이다.
도 3은 플로우 사이토미터(flow cytometer)를 사용하여, 형광 강도 측정에 의해 PEG-ZnPP 처리함으로써 배양 암세포내에 산화물이 생성, 축적해 있는 것을 나타내는 도면이다.
도 4는 고형 종양 모델 마우스에 대한 PEG-ZnPP 투여군에서의 항종양 활성을 나타내는 도면이다.
도 5는 PEG-ZnPP 치료 후의 체중 추이를 나타내는 도면이다.
[발명을 실시하기 위한 최량의 형태]
금속 포르피린 유도체에 결합되는 양친매성 또는 수용성 폴리머로는, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리프로필렌글리콜(PPG), 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알콜, 각종 젤라틴과 그 유도체(석시닐 화합물 등), 폴리아미노산(글루타민산, 아스파라긴산, 리신, 알라닌, 글리신, 프롤린, 티로신 등), 히드록시프로필화 등의 폴리메타크릴산 폴리머, 스티렌·말레인산 공중합체(SMA) 또는 그의 각종 유도체 등이다. 이들 양친매성 또는 수용성의 폴리머 중, 특히 폴리에틸렌글리콜 및 SMA가 바람직하다.
폴리에틸렌글리콜은 분자량이 2000∼5000인 것이 바람직하다.
스티렌·말레인산 공중합체(SMA)는 스티렌과 말레인산의 공중합체이고, 말레인산의 카복실기가 결합손으로 되어 금속 포르피린 유도체와 직접 또는 간접적으로 결합한다. SMA는 그 자신 또는 말레인산의 일부가 에스테르화된 유도체로서 사용할 수 있다.
금속 포르피린 유도체는 포르피린환을 갖는 화합물에 금속이 배위한 착화합물이거나, 포르피린환을 갖는 화합물로서 프로토포르피린이 입수 용이하여, 적합하게 사용된다.
배위되는 금속으로는, 철과 같이 헴옥시게나제 저해 활성이 없는 것, 수은과 같이 유독한 금속, 1가 금속과 같이 배위가 곤란한 금속 이외의 것이면 특별히 한정되지 않고, 아연, 주석, 코발트, 니켈, 동 등을 사용할 수 있지만, 특히 아연 및 주석이 바람직하다. 프로토포르피린에 아연이 배위한 Zn-프로토포르피린(ZnPP)은 식(B)으로 표시된다.
본 발명의 항종양제는 이 금속 포르피린 유도체에 양친매성 또는 수용성 폴리머가 결합한 고분자 화합물이지만, 금속 포르피린 유도체가 물에 난용성이기 때문에, 금속 포르피린 유도체의 상태로 폴리머의 부가 반응을 일으키는 것은 곤란하다. 그래서 금속을 배위시키기 전의 포르피린에 폴리머를 부가시킨 후 금속을 배위시켰다.
Figure 112004005211153-pct00001
양친매성 또는 수용성 폴리머와 금속 포르피린 유도체의 결합은 직접 결합 외에, 폴리머와의 결합을 용이하게 하기 위해, 적당한 관능기를 도입하여, 이 관능기를 거쳐서 간접적으로 결합시켜도 좋다. 금속 포르피린 유도체로서 ZnPP를 예로 들면, 프로토포르피린은 2개의 카복실기를 가지고 있으므로, 이 카복실기에 폴리머를 직접 결합해도 좋지만, 프로토포르피린 분자 중의 카복실기는 반응성이 약하기 때문에, 직접 결합에 의한 폴리머 부가는 유리한 방법이 아니다. 발명자들은 이 점에 대해서 검토한 결과, 식(A)으로 나타내는 디아민 구조를 거쳐서 PEG가 부가한 ZnPP(식(5))를 합성함에 성공하였다.
Figure 112004005211153-pct00002
(식 중, R은 양친매성 또는 수용성 폴리머 잔기, Me는 금속을 표시한다.)
이러한 고분자화 ZnPP는, 프로토포르피린 IX로의 아미노기의 도입, 각종 고분자와의 반응, 포르피린환으로의 아연의 배위의 순차 반응에 의해 합성할 수 있다.
예를 들면, PEG 결합 ZnPP는 하기 식으로 나타내는 합성 도식에 의해 단계적으로 행해진다.
[반응a] 프로토포르피린 IX (식(1))을 테트라히드로푸란 중, 에틸클로로포름에이트와 반응시켜, 카복실기를 활성화시킨다(식(2)).
[반응 b] 이것에 에틸렌디아민을 첨가하여, 아미노기 도입 포르피린 IX (식(3))를 얻는다.
[반응 c] 이어서 활성화 PEG를 첨가하여 포르피린에 PEG쇄를 도입한다 (식(4)).
[반응 d] 마지막으로 아세트산아연을 반응액에 첨가하여 포르피린환에 아연 을 도입하여, PEG 결합 ZnPP를 얻는다(식(5)). 또한 아세트산아연 대신에 아세트산주석을 사용하면 PEG 결합 주석포르피린(PEG 결합 SnPP)을 얻을 수 있다.
Figure 112004005211153-pct00003
양친매성 또는 수용성 폴리머로서 PEG 이외의 폴리머, 예를 들면 SMA를 사용한 경우도 PEG 부가의 경우와 마찬가지로, 아미노기 도입 포르피린(식(3))에 SMA를 축합시킴으로써, 고분자화 반응을 행할 수 있다.
식(A)에 나타내는 양친매성 또는 수용성 폴리머에 결합한 헴옥시게나제 저해 활성을 갖는 금속 포르피린 유도체는 고형 종양 국소에 선택적으로 집적되어, 약효도 뛰어나므로, 항종양제의 성분으로서 유용한 신규 물질이다. 식(A)에서 금속이 아연, 폴리머가 PEG인 화합물(5)을, 상기[반응 a∼d]에 의해 합성하고, 그 구조가 식(5)임은 하기의 분석 결과에 의해 확인할 수 있었다.
먼저 아미노기 도입 포르피린(식(3))의 구조를 하기의 방법에 의해 확인하였다.
(1)적외선 흡수 스펙트럼 측정에 의해, 1641cm-1, 1552cm-1에서 흡수가 인정되므로, 새로운 아미드 결합의 생성을 확인하였다.
(2)다음에 분자량 측정에 의해, 식(3)의 구조(계산값 646)와 일치하는 분자량 실측값(646)이 얻어졌다.
그 다음에, 식(3)의 아미노기 도입 포르피린에 PEG쇄를 도입하고, 아연을 배위시켜 얻어진 ZnPP의 구조를, 분자량 측정 및 자외선 흡수 스펙트럼에 의해 확인하였다. 분자량 측정은 비행 시간형 분자량 측정(TOF-MS) 분석으로 분자량 11,000부근의 피크를 얻었다. 또한, 자외 가시 흡수 스펙트럼으로부터 아연이 포르피린환에 배위해 있음을 확인하였다(화합물식(5)의 최대 흡수 421, 543, 583 nm). 상 기의 결과로부터, 얻어진 화합물이 식(5)의 구조를 갖는 PEG-ZnPP인 것이 확인되었다.
또한, 포르피린 IX를 원료로 하여, [반응 a]∼[반응 d]에 의한 PEG 부가 ZnPP의 제조 방법은 신규한 제조 방법이다.
이렇게 하여 얻어진 본 발명의 양친매성 또는 수용성 폴리머와 결합한 금속 포르피린 유도체는 수용성이며 수용액으로서 주사용제(정맥 및 동맥)의 형태로 사용할 수 있다.
다음에 제조예, 실시예 및 실험예를 들어 본 발명 PEG-ZnPP의 제조 방법, PEG-ZnPP의 헴옥시게나제 활성 저해, 및 PEG-ZnPP의 동맥내 투여 후의 항종양 효과 등에 대해 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이들에만 한정되는 것은 아니다.
[제조예] 폴리에틸렌글리콜 결합 ZnPP(PEG-ZnPP)의 합성
100mg의 프로토포르피린 IX를 20㎖의 테트라히드로푸란에 용해하고, 2.45㎖의 트리에틸아민을 첨가하였다. 그 용액을 약 0℃로 될 때까지 얼음 위에 유지하고, 거기에 1.7㎖의 에틸클로로포름에이트를 소량씩 교반 하에 첨가하고, 2시간 더 반응시켰다. 그 후, 생성된 트리에틸아민염산염을 여과하여 제거하고, 이 여과액에 1.2㎖의 에틸렌디아민을 더첨가하여, 실온에서 24시간 반응시켰다. 감압하에 증류 제거하여 용매인 테트라히드로푸란을 제거한 후, 다갈색의 고형물을 증류수 50㎖로서 7회 세정하여, 1분자당 2개의 아미노기를 도입한 포르피린 유도체(60mg)를 얻었다([반응 a,b]).
5mg의 아미노기 도입 포르피린을 클로로포름 25㎖에 용해하고, 거기에 800mg의 폴리에틸렌글리콜(PEG, 분자량 5000)의 석신이미드에스테르를 첨가하여, 교반 하, 실온에서 24시간 반응시켰다([반응 c]).
얻어진 PEG 결합 포르피린을, 클로로포름을 용리액으로 하는 겔 여과 크로마토그래피로 전개하면, 도 1에 나타내는 바와 같이 PEG 결합 포르피린에는 미반응의 아미노기 도입 포르피린이 전혀 없고, 모든 아미노기 도입 포르피린이 PEG와 반응하여, 고분자화 포르피린이 생성되어 있음이 나타났다. 또한, 미수식의 프로토포르피린은, 획분(fraction) 번호 20을 중심으로 용출하여, 아미노기 도입 포르피린과 동일한 거동을 나타내었다.
그 후, 이 PEG 결합 포르피린 용액에 40mg의 아세트산아연을 첨가하고, 실온에서 2시간 더 반응시켜, PEG 결합 아연 포르피린(PEG-ZnPP)을 얻었다([반응 d]).
[실험예 1] PEG-ZnPP의 헴옥시게나제에 대한 저해 활성
래트 비장(rat spleen)으로부터 정제한 헴옥시게나제 획분에 대해, 그 기질인 헤민, 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드, 빌리루빈 리덕타제(bilirubin reductase)를 함유하는 세포질 획분을 첨가하여 37℃에서 배양(incubation)하여, 생성하는 빌리루빈을 클로로포름으로 추출한 뒤, 465nm 파장의 측정에 의해, PEG-ZnPP 첨가, 미수식 ZnPP 첨가 및 저해제 무첨가의 각각의 경우에 대해서 헴옥시게나제 활성을 정량하여, Lineweaver-Burk 플롯에 의한 PEG-ZnPP의 헴옥시게나제 활성 저해를 해석하였다(도 2). 도 2의 결과로부터, 금회 합성한 PEG-ZnPP는 농도 의존적으로 헴옥시게나제 활성을 저해하고, 그 저해 정수(Ki)는 0.13μM이고, 저해 양식은 경쟁적 저해임이 명백해졌다. 이 수치는 종래의 미수식 ZnPP의 수치(Ki=0.12μM)에 거의 필적하는 것이다.
[실험예 2] 배양 세포에 대한 PEG-ZnPP의 작용, 특히 세포에 대한 산화적 저해
배양 폐선암 세포(Lung adenocarcinoma cell)의 A549 세포를 플라스틱 플레이트에 파종하고, 하룻밤 배양한 후, 증류수에 용해한 농도 5μM 및 1 0μM의 PEG-ZnPP를 각각 플레이트에 첨가하였다. 37℃에서 8시간 배양한 뒤, 산화 반응의 지시약으로서 디클로로디히드로플루오레세인 아세트산 에스테르(DCDHF)를 첨가하여, 30분 더 배양하였다. 이 디클로로디히드로플루오레세인 아세트산 에스테르는 세포내의 산화물에 의해 형광을 갖는 플루오레세인으로 변하기 때문에, 형광 강도의 측정에 의해 생긴 플루오레세인을 정량함으로써 세포내의 산화물의 생성을 측정할 수 있다. 트립신 처리로서 세포를 플레이트로부터 회수하고, 플로우 사이토미터로 세포내에 생성한 플루오레세인을 정량하여, PEG-ZnPP 농도 5μM, 10μM 및 PEG-ZnPP 무첨가의 경우의, 형광 강도와 세포의 수를 도 3에 나타내었다. 도 3에서 명백한 바와 같이, PEG-ZnPP는 농도 의존적으로 세포내에 산화물의 생성·축적을 야기하였다.
[실험예 3] 마우스 고형 종양 모델에서의 PEC-ZnPP의 종양내 헴옥시게나제 활성의 저해 효과
체중 약 35g의 웅성 ddY 마우스의 등부위 피하에 S180 육종을 이식하였다. 이식 후 약 1주 후에 고형 종양의 크기가 5mm사방으로 된 시점에 증류수에 용해한 PEG-ZnPP를 체중 1kg 당 O.5mg ZnPP 상당으로 되도록 꼬리 정맥으로부터 투여하였다. PEG-ZnPP 투여 24시간 후, 고형 종양을 적출하여, 조직 중의 헴옥시게나제 활성을 상기 실험예 1과 동일한 조작에 의해 측정하였다. 대조로서 PEG-ZnPP를 함유하지 않는 증류수를 투여한 마우스로부터 적출한 종양을 사용하였다. 표 1에 나타내는 바와 같이, 꼬리 정맥으로부터 투여된 PEG-ZnPP는 현저하게 종양 조직내의 헴옥시게나제 활성을 저하시켰다. 또한 미수식 ZnPP는 물에 불용이기 때문에 투여할 수 없었다.
[표 1]
PEG-ZnPP의 꼬리 정맥 투여에 의한 고형 종양내 헴옥시게나제 저해 활성
종양내 헴옥시게나제 활성 (nmol 빌리루빈/mg단백질/시간)
대조군 4.17 ± 1.07
PEG-ZnPP 투여군 2.30 ± 0.54 (P < 0.02)
미수식 ZnPP 물에 불용성이므로 실험불가

[실험예 4] 마우스 고형 종양 모델에 대한 PEG-ZnPP의 항종양 효과 및 체중의 변화
상기 실험예 3과 마찬가지로, 마우스 S180 육종을 등부위 피하에 이식한 ddY 마우스에 대해, 이식 후 10, 13 및 15일째에 각각 30nmol, 30nmol, 및 50nmol의 PEG-ZnPP를 꼬리 정맥으로부터 투여하였다(도면 중 화살표). 대조로서 PEG-ZnPP를 함유하지 않은 증류수를 투여한 마우스의 그룹을 마련하였다. 경시적으로 종양의 크기를 측정하였다(도 4). 도 4로부터 명백한 바와 같이, PEG-ZnPP를 투여한 그룹에서는, 대조 그룹에 비해서 종양의 증식이 현저히 억제되었다.
또한 이 때 동시에 체중 변화를 측정했지만, 도 5에 나타내는 바와 같이 PEG-ZnPP 투여의 마우스에서도 현저한 체중의 감소는 보이지 않았다.
본 발명에 의하면, 헴옥시게나제의 저해제인 금속 포르피린 유도체를 물과 오일의 쌍방에 용해하는 양친매성 또는 수용성 폴리머와 결합시킴으로써, 약제의 정맥 주사가 가능해지고, 또한 종양부로의 국소적 집적능이 높은 신규한 항종양제 및 그 제조법을 알아내었다. 본 발명의 항종양제는 현저한 부작용을 수반하지 않고 우수한 항종양 활성을 나타내며, 또한 지금까지의 저분자 항종양제와는 다른 작용 기작과, 뛰어난 종양 집적능을 갖는 유용한 의약품이다.

Claims (7)

  1. 하기 식(A)으로 나타내는 양친매성 또는 수용성 폴리머에 결합한 헴옥시게나제 저해 활성을 갖는 금속 포르피린 유도체를 유효 성분으로 하는 항종양제.
    Figure 112008046896555-pct00010
    (식 중, R은 폴리에틸렌글리콜 잔기, Me는 아연을 표시한다.)
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 하기 식(A)으로 나타내는 양친매성 또는 수용성 폴리머에 결합한 헴옥시게나제 저해 활성을 갖는 금속 포르피린 유도체.
    Figure 112008046896555-pct00004
    (식 중, R은 폴리에틸렌글리콜 잔기, Me는 아연을 표시한다.)
  7. 프로토포르피린 IX에 에틸렌디아민을 부가시킨 다음, 활성화 폴리에틸렌글리콜을 첨가하여 포르피린에 폴리에틸렌글리콜쇄를 도입한 뒤, 아연염을 첨가하여 포르피린환에 아연을 도입하는 것을 특징으로 하는 제6항 기재의 금속 포르피린 유도체의 제조 방법.
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