KR100860703B1

KR100860703B1 - 뇌경색 예방 및 치료용 약제의 제조에서엘-부틸프탈라이드의 용도

Info

Publication number: KR100860703B1
Application number: KR1020067006909A
Authority: KR
Inventors: 이푸 펭; 시아올리앙 왕; 징후아 양; 잉 펭
Original assignee: 스자좡 파마 그룹 중치 파마슈티컬 테크놀로지 (스자좡) 컴퍼니 리미티드; 인스티튜드 오브 머테리아 메디카, 차이니스 아케데미 오브 메디컬 싸이언시스
Priority date: 2003-10-10
Filing date: 2004-09-29
Publication date: 2008-09-26
Also published as: BRPI0415123A; EP2974722A1; CA2549931A1; JP2011116781A; EP1679070A4; CN1863523A; CA2902337A1; CA3028912A1; AU2004279655A1; WO2005034936A1; JP2014205724A; EP1679070A1; EP2689776A1; RU2336870C2; CN1605336A; AU2004279655B2; CN102008464A; US20070112065A1; US20110082201A1; US8598225B2

Abstract

본 발명은 뇌경색, 특히 국소뇌허혈(focal cerebral ischemia)에 의해 유발되는 뇌경색 예방 및 치료용 약제의 제조에서 화학식(Ⅰ)의 L-부틸프탈라이드의 용도를 기재한다.

Description

뇌경색 예방 및 치료용 약제의 제조에서 엘-부틸프탈라이드의 용도{USE OF L-BUTYLPHTHALIDE IN THE MANUFACTURE OF MEDICAMENTS FOR PREVENTION AND TREATMENT OF CEREBRAL INFARCT}

본 발명은 뇌경색, 특히 국소뇌허혈(focal cerebral ischemia)에 의해 유발되는 뇌경색의 예방 및 치료용 약제의 제조에서 L-n-부틸프탈라이드의 용도 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

뇌혈관 질환(Cerebrovascular diseases)은 중국에서 사망의 주요 원인 중 하나이며, 급성 허혈성 뇌졸중(acute ischemic cerebral stroke)의 치료를 위한 보다 좋은 치료제는 전세계에서 필요로 한다. 1996년 미국 식품의약국(U.S. Food and Drug Administration; FDA)에 의해 승인받은 혈전용해제(thrombolytic agent)인 t-PA는 뇌출혈(encephalic bleeding)의 높은 위험에 관련된 부작용 때문에 이러한 질환에 대하여 이론이 분분한 치료효과를 가지고 있다. 여러 가지 뇌 보호제에 관한 연구결과는, 많은 약제의 임상치료효과가 불충분하거나 상대적으로 심각한 부작용을 갖고 있음을 보여준다. 몇몇 약제는 여전히 임상시험중이다.

최근 10년 이상, 본 발명자들은 라세믹 부틸프탈라이드(또는 butylphthalide, NBP)가 급성 허혈성 뇌졸중에 중요한 치료효과를 갖는 약물이라는 것을 발견하였다. 이의 약동역학적(pharmacodynamical) 특징은 1. 허혈성 뇌의 에너지 대사의 개선; 2. 유의적으로 쥐에서 국소뇌허혈에 의해 유발되는 뇌경색의 면적 감소, 및 신경 기능의 결손 완화; 3. 국소뇌허혈에 의해 유발되는 뇌부종(cerebral edema) 완화; 4. 유의적으로 허혈 부위(ischemic area)에서 국소 뇌혈류량(focal cerebral blood flow) 및 쥐의 대뇌 연질막(cerebral pia mater) 개선; 및 5. 유의적으로 국소뇌허혈에 의해 유발되는 기억장애(memory disorder) 완화를 포함한다. 게다가, 독성 부작용이 덜하다. 본 출원인은 중국에서 관련된 분야로 두개의 용도특허를 획득했으며, 각각 국제특허분류 A61K31/34호 하에, 1999년 등록된 "뇌허혈에 의해 유발되는 질환의 예방 및 치료용 약제의 제조에서 부틸프탈라이드의 용도"라고 표제된 중국특허 ZL93117148호, 및 2002년에 등록된 "항혈전 약제의 제조에서 부틸프탈라이드의 용도"라고 표제된 중국특허 ZL98125618.X호이다.

전임상시험(pre-clinical studies) 후, 임상시험 Ⅱ 단계 및 Ⅲ 단계를 542건 수행하였으며, 192건은 다중심, 무작위, 이중맹검 위약대조군(multi centered, random, double blinded placebo control)을 사용하였다. 투여군에서 총유효율(total effective rate)은 70.7%이며, 위약군에서 유효율은 41.0%임을 발견하였다. 따라서 우수한 치료효과를 얻었다. I 등급 신약을 위한 신약인증(New Drug Certificate) 및 제품허가(Production Licence)는 2002년 중국의 국가약품감독관리국(State Drug Administration of China)에 의해 급성 허혈성 뇌졸중 치료용 NBP로 승인받았다(국가 의약품 허가 번호 H20020374; H20020375; 2002H0551, 및 2002H0552).

화학적 분리는 라세믹 부틸프탈라이드(이후 dl-NBP라 약칭함)에 대해 수행하였으며, 개별적으로 레보-부틸프탈라이드(이후 l-NBP라 약칭함) 및 덱스트로-부틸프탈라이드(이후 d-NBP라 약칭함)를 얻었다. 본 출원인은 "광학 활성인 3-n-부틸프탈라이드를 제조하는 방법"의 제목으로 중국출원번호 99109673.8호(공개번호 CN1283621A호)로 출원하였다. 게다가, L-부틸프탈라이드의 기능은 선행중국특허 ZL93117148호에서 언급되지 않았다.

종래기술의 단점을 극복하기 위하여, 본 발명은 뇌경색 예방 또는 치료용 약제의 제조에서 화학식(Ⅰ)의 L-n-부틸프탈라이드(이후 l-NBP라 약칭함)의 용도를 제공한다.

본 발명에 사용된 L-n-부틸프탈라이드는 첫째로 라세믹 n-부틸프탈라이드를 화학적으로 합성한 후, 화학적으로 분리(resolving)하여 n-부틸프탈라이드의 좌선성 광학이성질체(levorotary optical isomer)를 얻는다. 핵자기 공명분광분석, 질량스펙트럼분석, 적외선 분광분석 등, 특히 HP 5890 가스크로마토그래피인 키랄 가스크로마토그래피 컬럼(Chiraldex G-TA)을 사용하여 분석한 후, 광학적 순도 및 화학적 순도의 점에서 생성물이 하나의 광학입체이성질체(optical stereoisomer), 즉, 좌선성-n-부틸프탈라이드임을 확인하였다(고유 광학활성도(specific optical activity) > -66.49°, 광학적 순도 > 98%, 및 화학적 순도 > 98%). 분리방법은 출원번호 99109673.8호 및 공개번호 CN1283621호인 "광학 활성적인 3-n-부틸프탈라이드를 제조하는 방법"의 제목으로 중국특허출원에 기재하였다. 생성물은 셀러리와 그 씨앗에 함유된 n-부틸프탈라이드의 화학구조식과 동일한 화학구조식을 가진다.

본 연구는 광학이성질체인 l-NBP가 d-NBP보다 쥐의 뇌허혈에 대한 치료효과가 더 좋고, l-NBP의 동일한 양을 함유하는 dl-NBP보다 더 좋음을 보여준다.

연구에서, 뇌허혈에 대한 광학 활성적인 NBP의 치료효과는, 2시간의 중간 대뇌 동맥 폐쇄(middle cerebral artery occlusion) 및 이어지는 24시간의 재관류(reperfusion)에 의해 만들어지는 허혈성 뇌졸중의 쥐 모델을 사용함으로써 관찰되었다. 일시적 국소뇌허혈 유발쥐를 각군에 10마리씩 8개군으로 나누었다. 1)군은 1 ml/kg 의 식물성 오일과 함께 용매 대조군(vehicle control group); 2) 및 3)군은 40 및 80 mg/kg 의 dl-NBP; 4) 및 5)군은 20 및 40 mg/kg 의 d-NBP; 6) 및 7)군은 20 및 40 mg/kg 의 l-NBP; 및 8)군은 0.1 mg/kg 의 MK801 이었다. 1~7군에 있는 동물들은 경구투여하였으며, 8군에 있는 동물들은 복강내투여하였다. 쥐에 일시적 국소뇌허혈을 유발시키고 15분 후에 부틸프탈라이드의 용매군 및 양성 약물 대조군을 투여하였다. 일원배치 분산분석 (one-way ANOVA)에 의해 분석된 각 군 사이에서 유의차의 존재는, 경색량(infarct volume)이 l-NBP 군 (20 mg/kg 및 40 mg/kg)에서 용량 의존적으로 유의적으로 감소하였음을 가리켰다. 40 mg/kg의 군에서 감소효과가 가장 높았고, 경색량은 80.4%까지 감소하였다((p<0.001, 대 용매군). 이러한 군에서 치료효과는 MK801 군 (경색량은 81.8%로 감소하였음, p<0.001)의 치료효과와 유사하며, 반면 d-NBP 및 dl-NBP 군에서는 유의한 효과가 관찰되지 않았다(도 1 및 2 참조). 상기 결과는 경색량에 대한 l-NBP의 감소효과가 d-NBP보다 높다는 것을 보여주었다. 비록 dl-NBP (80 mg/kg) 및 d-NBP (40 mg/kg)군에서 경색량이 용매 대조군와 비교하여 감소하였을지라도, 그들 사이에 통계학적인 차이는 없었다. dl-NBP (80 mg/kg)는 l-NBP (40 mg/kg)를 포함하기 때문에, 결과는 dl-NBP에 있는 d-NBP의 존재가 아마 l-NBP의 효과를 상쇄하는 것을 암시하였다.

행동평가(behavioral evaluation)에 의하면, 용매대조군에 있는 대부분의 동물들의 신경학적 점수(neurological score)는 2이고, 반대편의 앞다리 굴곡(contralateral forelimbs flexion)으로 나타났고, 옆으로 밀기(lateral push)에 대한 저항은 감소하였다. 보다 적은 수의 쥐에서는 반대편의 회전이 발생하였고, 그들은 3의 점수로 등급이 매겨졌다. 더욱 적은 수의 동물들은 단지 반대편의 앞다리 굴곡으로 나타났으며, 1 등급이었다; 또는 4 등급으로 심각한 증상 및 자율적인 움직임의 결핍이 있었다. 용매 대조군에서 동물들의 평균 신경학적 점수는 2.6±0.3 이었다. 허혈 후 15분에 20 또는 40 mg/kg의 l-NBP의 경구투여가 신경학적 증상을 개선시키는 것을 보여주었고(1.4, p<0.01; 및 1.1, p<0.001), MK801의 효능은 가장 유의하였으며(0.8, p<0.001), 반면, d-NBP 및 dl-NBP의 군에서는 유의한 개선이 관찰되지 않았다. MK801 치료군에 있는 동물들에 관하여, 비록 뇌허혈에 의해 유발되는 증상이 유의하게 감소되었지만, 다리는 약해졌고, 팔다리를 흉하게 쭉 뻗었을때 비틀거렸고, 기능장애가 발생하였으며, 한쪽으로 회전하였다. 행동평가는 행동에 관한 개선정도가 동시에 경색량에 대한 약물의 효과를 감소시킨다는 것을 암시한다.

대략적으로, 본 발명은 생화학, 분자생물학 및 동물 수준에서 수행하였으며, 일치하는 결과를 얻었다. 즉, l-NBP의 뇌보호효과는 d-NBP 및 dl-NBP보다 높으며, dl-NBP에 있는 d-NBP의 존재는 l-NBP의 작용을 상쇄시킨다. 그래서 dl-NBP의 뇌허혈에 대한 보호효과는 감소된다.

선행 연구는 혈소판 응집(platelet aggregation) 및 혈전증(thrombosis)에 대해 l-NBP의 억제효과가 아스피린 및 티클리피딘(Ticlipidine)의 l-NBP의 효과와 유사하다고 보여주었다. 게다가, l-NBP는 아스피린 및 티클리피딘에 의해 가지고 있지 않은 뇌보호효과 및 미세순환(micro-circulation) 개선효과(d-NBP는 이러한 효과를 가지고 있지 않음)를 가지고 있다. 따라서, l-NBP는 뇌졸중의 이차 예방, 심근경색(cardiac infarct)의 예방뿐만 아니라 급성 허혈성 뇌졸중의 치료 및 말초혈관질환 (peripheral vascular diseases)의 치료에 사용될 수 있을 정도로 넓은 치료범위(therapeutic spectrum)를 가지고 있다.

본 발명은 라세믹 약물을 광학 단량체로 분리하고, 각각 명백한 특징을 만들고, 효능효과 또는 낮은 독성 부작용을 가진 광학 이성질체를 키랄 신약으로 발전시킴으로써 치료효과를 증가시키고 독성 부작용을 감소시키기 위해 국제적인 신약발견의 발전을 따른다. 이와 관련하여, 라세믹 부틸프탈라이드에 있는 l-NBP는 뇌허혈에 대해 상대적으로 강력한 억제효과를 가지고 있다. d-NBP는 뇌허혈에 대해 약한 효과뿐만 아니라 l-NBP의 억제효과를 상쇄시킨다. 따라서, L-부틸프탈라이드를 급성 허혈성 뇌졸중의 치료를 위한 새로운 키랄 약물로 발전시키기에 적합하다.

또한, 본 발명은 활성성분으로서 본 발명의 화합물 및 통상적인 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 보조제를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 일반적으로, 본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 화합물의 0.1~95 중량%를 포함한다.

본 발명의 화합물을 포함하는 약학적 조성물은 기술분야에서 잘 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 이러한 목적 때문에, 본 발명의 화합물은 사람용 또는 수의학용으로 알맞는 투여형태 또는 제제 형태로 제형화하기 위해, 하나 또는 그 이상의 고체 또는 액체, 바람직하게는 약제학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 보조제와 결합할 수 있다.

본 발명의 화합물 및 이를 포함하는 조성물은 단위 제형으로 투여할 수 있으며, 투여경로는 경구, 근육내, 피하, 비강, 경구 점막, 경피, 복강내, 직장내 투여와 같은 장내 또는 비경구적일 수 있다.

본 발명의 화합물 또는 이를 포함하는 약학적 조성물의 투여경로는 정맥내 주사, 근육내 주사, 피하주사, 피내주사, 및 경혈주사(acupoint injection)를 포함하는 주사일 수 있다.

투여 제형은 액체 제형 또는 고체 제형일 수 있다. 예를 들어, 액체 제형은 용액, 콜로이드, 미세입자, 에멀젼 및 현탁액일 수 있다. 또한, 정제, 캡슐, 환약, 에어로졸, 펠렛, 분말, 용액, 현탁액, 에멀젼, 입자, 좌약 및 동결건조된 분말 등과 같은 다른 제형을 사용할 수 있다.

본 발명의 화합물은 서방형 제제, 방출제어형 제제, 표적지향형 제제, 및 여러 가지 미립자 투여 시스템뿐만 아니라 통상적인 제형으로 제조될 수 있다.

단위 제형을 정제로 제조하기 위해 기술분야에서 잘 알려진 여러 가지 벡터를 널리 사용할 수 있다. 예를 들면, 벡터의 예는 전분, 덱스트린, 칼슘 설페이트, 락토스, 만니톨, 수크로스, 소듐 클로라이드, 글루코스, 우레아, 칼슘 카보네이트, 백도토(bolus alba), 미세결정 셀룰로오스, 알루미늄 실리케이트 등과 같은 희석제 및 흡수제; 물, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜, 에탄올, 프로판올, 전분 슬러리, 덱스트린, 시럽, 꿀, 글루코스 용액, 아라비아검 슬러리, 젤라틴 슬러리, 소듐 카복시메틸 셀룰로오스, 쉐락, 메틸 셀룰로오스, 포타슘 포스페이트, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 습윤제 및 결합제; 건조 전분, 알기네이트, 아가 분말, 갈조전분(Phaeophyta starch), 소듐 바이카보네이트 및 시트르산, 칼슘 카보네이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스터, 소듐 라우릴 설포네이트, 메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 등과 같은 붕해제; 수크로스, 글리세롤 트리스테아레이트, 카카오 버터, 경화유(hydrogenated oil) 등과 같은 붕해 억제제; 4차 암모늄염, 소듐 도데실 설페이트 등과 같은 흡수촉진제; 탈크 분말, 실리카 다이옥사이드, 옥수수 전분, 스테아레이트 염, 보론산, 액체 파라핀, 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 윤활제이다. 정제는 당의정, 필름코팅정, 장용성 코팅정, 또는 이중층 정제 및 다층 정제와 같은 코팅된 정제로 더 제형화할 수 있다.

단위 제형을 펠렛으로 제형화하기 위해, 기술분야에서 잘 알려진 여러 가지 벡터를 널리 사용할 수 있다. 예를 들면, 벡터의 예는 글루코스, 락토스, 전분, 카카오 버터, 식물성 경화유, 폴리비닐피롤리돈, 카올린, 탈크 분말 등과 같은 희석제 및 흡수제; 아라비아검, 트라가칸트검, 젤라틴, 에탄올, 꿀, 액체 설탕, 쌀 페이스트(rice paste) 또는 파나다 등과 같은 결합제; 아가 분말, 건조 전분, 알기네이트, 소듐 라우릴 설포네이트, 메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 등과 같은 붕해제이다.

단위 제형을 캡슐로 제형화하기 위해, 활성성분으로서 본 발명의 화합물을 상기 기재된 여러 가지 벡터와 혼합하고, 이렇게 얻어진 혼합물을 경질캡슐 또는 연질캡슐에 넣는다. 또한, 활성성분으로서 본 발명의 화합물을 미세캡슐로 제형화할 수 있으며, 수용성 매질과 혼합하여 현탁액을 형성할 수 있고, 사용을 위해 경질 캡슐에 채우거나 주사제로 제형화할 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 화합물은 수용성 또는 비수용성일 수 있고, 하나 및/또는 그 이상의 약제학적으로 허용가능한 벡터, 희석제, 결합제, 윤활제, 보존제, 계면활성제 또는 분산제를 포함할 수 있는 용액, 현탁액, 에멀젼, 주사용 동결건조된 분말과 같은 주사용 제형으로 제형화할 수 있다. 예를 들어, 희석제는 물, 에탄올, 폴리에틸렌 글리콜, 1,3-프로필렌 글리콜, 에톡실레이티드 이소스테아릴 알콜, 다중-옥실레이티드 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스터 등으로부터 선택될 수 있다. 게다가, 등장 주사(isotonic injections)를 제조하기 위하여 소듐 클로라이드, 글루코스 또는 글리세롤의 적당한 양을 주사용 제형으로 추가할 수 있다. 또한, 통상적인 용해제, 완충제, pH 조절제를 추가할 수 있다. 이러한 보조제는 기술분야에서 통상적으로 사용된다.

또한, 바람직하게는 약학적 제형에 착색제, 보존제, 방향제, 착향료, 감미제 등을 추가할 수 있다.

투여 목적을 달성하고 치료효과를 증가시키기 위해, 약제 또는 약학적 조성물은 기술분야에서 잘 알려진 어떠한 투여 방법으로도 투여할 수 있다.

본 발명의 화합물을 포함하는 약학적 조성물의 투여량은 예방 또는 치료하려는 질환의 특징 또는 중증도, 성별, 나이, 체중, 환자 또는 동물의 특성 및 개별적 반응, 투여경로, 투여횟수 및 치료목적과 같은 많은 요소에 의존한다. 따라서, 본 발명에서 치료량은 넓은 범위로 변화할 수 있다. 일반적으로, 본 발명에서 약학적 성분의 양은 기술분야에서 숙련된 자에게 잘 알려져 있으며, 치료적 유효량에 도달하기 위해서는 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물의 최종 제형에 함유된 약물의 정확한 양에 의존하여 적당하게 조절할 수 있고, 따라서 본 발명의 예방 또는 치료 목적을 달성할 수 있다. 적당한 일일 투여량은 바람직하게 0.1 내지 100 mg/kg 체중, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/day/person 이다. 복용량은 단위 제형으로 또는 투여자의 임상 경험에 의존하여 한번 이상, 예를 들어 2, 3 또는 4 제형으로 분할할 수 있으며, 다른 치료수단을 사용하는 다른 복용 처방을 포함한다.

각 치료에서 필요한 총 복용량은 하나 이상의 복용량 또는 한번의 복용량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물 또는 조성물은 단독으로, 또는 다른 치료제와 병용하거나 조절된 복용량으로 이종 경로제(heteropathic agents)로 사용될 수 있다.

용어 :

dl-NBP : 라세믹 부틸프탈라이드(racemic butylphthalide)

d-NBP : 우선성 부틸프탈라이드(dextral butylphthalide)

l-NBP : 좌선성 n-부틸프탈라이드(levorotatory n-butylphthalide)

tMCAO : 일시적 국소뇌허혈 모델(transient focal cerebral ischemic model)

도 1은 일시적 중간 대뇌 동맥 폐쇄 후 15분에 위관영양(gavage)에 의해 NBP를 투여한 쥐의 뇌경색량에 대한 효과를 나타낸 디지털 사진이다.

도 2는 일시적 중간 대뇌 동맥 폐쇄 후 15분에 위관영양에 의해 NBP를 투여한 쥐의 뇌경색량에 대한 효과를 보여준다. 결과는 경색부분을 반대편(정상) 반구의 부분으로 나눠서 얻어진 양 백분율로 표시하였으며, 평균값±평균 오차로 표시되었다.

*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, 대 용매군.

도 3은 일시적 중간 대뇌 동맥 폐쇄후 15분에 위관영양에 의해 NBP를 투여한 쥐의 행동점수에 대한 효과를 보여준다. 결과는 평균값±평균 오차로 표시되었다.

*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, 대 용매군.

실시예 1 : tMCAO 쥐의 뇌경색량에 대해 광학 부틸프탈라이드의 효과

실험 물질 및 방법

시약 및 약물

>99%의 광학적 및 화학적 순도, 및 광학 활성이 각각 -66.49°, +66.88°및 0°인 1-, d-, 및 dl-NBP은 우리 연구소의 합성약학화학 부문에 의해 모두 제공받았다. 이들은 식물성 오일로 제형화하였다. MK801은 시그마 제품이며, 생리식염수로 제형화하였다. 베이징 화학설비에 의해 제조된 트리페닐테트라졸륨 클로라이드(TTC)는 사용을 위해 증류수와 함께 4% 용액으로 제형화하였다.

일시적 국소뇌허혈 모델(tMCAO)의 제조

280~320g 무게의 수컷 비스타(Wistar) 쥐를 사용하였고, 각 5마리의 쥐를 하나의 우리에 두었다. 동물들은 23℃로 조절된 실온에서 음식과 물을 자유롭게 접할수 있게 허용되었다. 쥐를 40 mg/kg의 소듐 펜토바비탈(sodium pentobarbital)로 마취시켰다. 수술 현미경(surgical microscope) 아래서, 중앙선 목피부를 절개하여 우총경동맥(right common carotid artery)을 노출시켰고, 내경동맥(internal carotid artery, ICA) 및 외경동맥(external carotid artery, ECA)을 신경과 근막(fascia) 주변으로부터 자유롭게 분리하였으며, 문합가지(anastomotic branch)를 결찰하였다. ECA을 결찰하고 자른 다음, ICA와 일직선으로 잡아당겨 수평이 되게하였다. 둥근 팁 및 0.28㎜의 직경을 가진 나일론 구조(폴리-L-리신으로 코팅된)를 ECA로부터 20㎜ 정도의 ICA의 내강으로 도입시켜, 중간대뇌동맥(middle cerebral artery)의 시작점으로 내분비적으로(endocranially) 전진시켰다. 허혈 2시간 후, 나일론 구조를 조심스럽게 회수하고, ECA를 열린 위치에서 결찰하였다. 쥐를 봉합한 다음 새장으로 되돌려 놓고, 24시간 후 재관류하였다. 수술 내내 실내온도는 24~25℃를 유지하였다. 쥐를 37℃의 가열판(heating plate)에 올려놓고, 수술 내내 체온을 유지하였다. 허혈후 15분에 투여를 수행하였다.

군분류 및 약물 투여(Grouping and Drug Administration)

쥐를 각 군에 10마리씩 8개군으로 나누었다. 1)군은 1 ml/kg 의 식물성 오일과 함께 용매 대조군; 2) 및 3)군은 40 및 80 mg/kg 의 dl-NBP; 4) 및 5)군은 20 및 40 mg/kg 의 d-NBP; 6) 및 7)군은 20 및 40 mg/kg 의 l-NBP; 및 8)군은 0.1 mg/kg 의 MK801 이었다. 1~7군에 있는 동물들은 경구투여하였으며, 8군에 있는 동물들은 복강내투여하였다

신경학적 행동 평가(Neurological Behavioral Evaluation)

신경학적 행동 관찰은 허혈의 24시간 후 수행하였다. 쥐는 꼬리를 들어올려 땅으로부터 1인치 떨어지게 하였고, 양쪽 앞다리의 상태를 관찰하였다; 양 측면에 의한 저항 사이에 어느 차이점이 있는지 양 어깨를 잡아당겨 관찰하였다; 쥐를 땅에 내려놓고 그들의 걸음 상태를 관찰하였다. 점수는 하기 표준에 따라 주어졌다.

0 : 강한 앞다리, 땅을 향해 균형적으로 폄; 양쪽 어깨의 동일한 저항, 및 정상 걷기.

1 : 반대편 어깨 굴곡, 앞다리 굴곡; 양쪽 어깨의 동일한 저항; 및 정상 걷기.

2 : 반대편 어깨 굴곡, 앞다리 굴곡; 잡아당겨 반대편 어깨의 감소된 저항; 및 정상 걷기.

3 : 반대편 어깨 굴곡, 앞다리 굴곡; 잡아당겨 반대편 어깨의 감소된 저항; 및 걸을때 회전.

4 : 반대편 어깨 굴곡, 앞다리 굴곡; 자율적으로 움직일 수 없음.

점수가 높을수록, 동물의 행동장애는 더욱 더 심각하다.

뇌경색량의 측정(Measurement of Cerebral Infarct Volume)

수술 후 24시간, 쥐를 100 mg/kg의 소듐 펜토바비탈로 마취시키고, 목을 베었다. 그 다음 빨리 뇌를 제거하고, 6개의 관상절편(coronal sections)으로 자른 다음(첫번째부터 다섯번째 절편의 각각은 2㎜ 두께이고, 여섯번째 절편은 4㎜ 두께였다.), 차광된 1.5 ml의 14% TTC 및 0.1 ml의 1M K₂HPO₄을 함유한 5 ml의 용액에 빨리 놓았다. 37℃에서 30분 동안 배양한 후, 그동안 매 7 ~ 8분마다 전복(overturning)이 수행되었다. TTC로 착색한 후, 정상 뇌조직은 장미빛 색을 나타내었으며, 반면 경색 조직은 명확한 경계로 흰색을 나타내었다. 배양 후, 각 군의 뇌 절편을 순서대로 정렬하고, 저장을 위해 디지털 카메라로 사진을 찍었다. 각 절편은 컴퓨터 영상 분석 시스템(computerized image analyzer system, SPOT 3.5 소프 트웨어)으로 분석하였고, 경색량은 모아진 경색범위로 계산하였다. 경색량은 뇌부종(cerebral edema)의 영향을 피하기 위해 대뇌반구(cerebral hemisphere)의 백분율로 표시하였다. 계산을 위한 공식 : 뇌경색량(%) = (수술하지 않은 반구의 량 - 수술한 반구의 경색되지 않은 부분의 량) / 수술하지 않은 반구의 량

통계학적 분석

결과는 평균값±평균 오차로 표시되었다. 신경학적 행동점수 및 뇌경색량은 일원배치 분산분석 (one-way ANOVA)을 이용하여 통계학적으로 분석하였고, 군간의 차이를 posthoc LSD 테스트를 이용하여 통계학적으로 분석하였다. 결과는 p<0.05일때, 유의차를 보여주었다.

결과

tMCAO 쥐의 뇌경색량에 대해 광학 부틸프탈라이드의 효과

일원배치 분산분석에 의해 분석된 다른 군에서 유의차의 존재는 경색량이 매우 유의적이며, l-NBP 군 (20 mg/kg 및 40 mg/kg)에서 용량 의존적으로 감소하였음을 가리킨다. 40 mg/kg의 l-NBP 군에서 감소효과가 가장 높았고, 경색량은 80.4%까지 감소하였다((p<0.001, 대 용매군). 이러한 군에서 치료효과는 MK801 군 (경색량은 81.8%로 감소하였음, p<0.001)의 치료효과와 유사하며, 반면, d-NBP 및 dl-NBP 군에서는 유의한 효과가 관찰되지 않았다(도 1 및 2 참조). 상기 결과는 경색량에 대한 l-NBP의 감소효과가 d-NBP보다 높다는 것을 보여준다. 비록 dl-NBP (80 mg/kg) 및 d-NBP (40 mg/kg)군에서 경색량이 용매 대조군과 비교하여 감소하였을지라도, 그들 사이에 통계학적인 차이는 없었으며, dl-NBP에 있는 d-NBP의 존재가 아마 l-NBP의 효과를 상쇄한다고 암시하였다.

행동평가(behavioral evaluation)

용매대조군에 있는 대부분의 동물들의 신경학적 점수(neurological score)는 2이고, 반대편의 앞다리 굴곡(contralateral forelimbs flexion)으로 나타나고, 옆으로 밀기(lateral push)에 대한 반대편의 신근(contralateral extensor)의 저항은 감소하였다. 보다 적은 수의 쥐에서는 반대편의 회전이 발생하였고, 3 등급이 매겨졌다. 더욱 적은 수의 동물들은 단지 반대편의 앞다리 굴곡으로 나타났으며, 1 등급이었고; 또는 4 등급으로 심각한 증상 및 자율적으로 움직일 수 없었다. 평균 신경학적 점수는 2.6±0.3 이었다. 허혈 후 15분에 20 또는 40 mg/kg의 l-NBP의 경구투여가 신경학적 증상을 개선시키는 것을 보여주었고(1.4, p<0.01; 및 1.1, p<0.001), MK801의 효능은 가장 유의하였으며(0.8, p<0.001), 반면 d-NBP 및 dl-NBP의 군에서는 유의한 개선이 관찰되지 않았다. MK801 치료군에 있는 동물들에 관하여, 비록 뇌허혈에 의해 유발되는 증상이 유의하게 감소되었지만, 다리는 약해졌고, 팔다리를 흉하게 쭉 뻗었을때 비틀거렸고, 기능장애가 발생하였으며, 한쪽으로 회전하였다. 행동평가는 약물의 행동 개선 정도가 경색량에 대한 약물의 감소효과와 병행하는 것을 암시하였다(도 3 참조).

토의

우리가 전에 사용한 모델은 영속적인 국소 허혈(뇌중동맥(brain middle artery)을 태움으로써)이고, 반면 본 연구에서는 일시적 국소뇌허혈 모델(2시간의 허혈 + 24시간의 재관류)을 사용하였다. 후자는 전자에 비해 큰 뇌경색량을 가진다. 비록 선택된 dl-NBP의 투여량이 전의 모델의 투여량과 동일할지라도, dl-NBP는 사용된 투여량에서 뇌경색량에 감소효과를 가지지 않는다. 결과에서 이러한 차이는 두 모델 사이의 차이에 기인한다.

본 발명은 생화학, 분자생물학 및 동물 수준에서 수행하였으며, 일치하는 결과를 얻었다. 즉, l-NBP의 뇌보호효과는 d-NBP 및 dl-NBP보다 높으며, dl-NBP에 있는 d-NBP의 존재는 l-NBP의 작용을 상쇄시킨다. 그래서 dl-NBP의 뇌허혈에 대한 보호효과는 감소된다.

치료효과를 증가시키고 독성 부작용을 감소시키기 위하여, 문헌에 기재한 대로 및 신약 발견의 필요에 따라, 각각 명백한 특징을 만들고, 효능 있는 효과 또는 낮은 독성 부작용을 가진 광학 이성질체를 키랄 신약으로 발전시키기 위해 라세믹 약물을 광학 단량체로 분리하는 것이 바람직하다. 이러한 문맥에서 기재한 대로, 라세믹 부틸프탈라이드에 있는 l-NBP는 뇌허혈에 대해 상대적으로 강력한 보호효과를 가지고 있다. d-NBP는 뇌허혈에 대해 약한 효과뿐만 아니라 l-NBP의 보호효과를 상쇄시킨다. 따라서, L-부틸프탈라이드를 급성 허혈성 뇌졸중의 치료를 위한 새로 운 키랄 약물로 발전시키는 것은 타당하다.

선행 연구는 혈소판 응집(platelet aggregation) 및 혈전증(thrombosis)에 대한 l-NBP의 효과가 아스피린 및 티클리피딘(Ticlipidine)의 효과와 유사하다는 것을 보여주었다. 게다가, l-NBP는 아스피린 및 티클리피딘이 가지고 있지 않은 뇌보호 효과 및 미세순환(micro-circulation) 개선효과(d-NBP는 이러한 효과를 가지고 있지 않음)를 가지고 있다. 따라서, l-NBP는 뇌졸중의 이차 예방, 심근경색(cardiac infarct)의 예방뿐만 아니라 급성 허혈성 뇌졸중의 치료 및 말초혈관질환 (peripheral vascular diseases)의 치료에 사용될 수 있을 정도로 넓은 치료범위(therapeutic spectrum)를 가지고 있다. l-NBP를 뇌졸중의 치료를 위한 약물로 발전시킬 전망이 있을 정도로, 중요한 사회적 이익 및 경제적 이익이 생산되기를 기대한다. 국소뇌허혈에 대한 좌선성 부틸프탈라이드의 치료효과는 국내 및 해외의 문헌에 기재되어 있지 않다.

Claims

화학식(Ⅰ)의 L-부틸프탈라이드의 치료적 유효량, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 뇌경색(cerebral infarct) 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 뇌경색은 국소뇌허혈(focal cerebral ischemia)에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는, 뇌경색 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
삭제
청구항 1에 있어서, 상기 약학적 조성물은 상기 화학식(Ⅰ)의 L-부틸프탈라이드를 0.1 ~ 95중량% 포함하는, 뇌경색 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 약학적 조성물은 정제, 캡슐, 환약, 주사, 서방형 제제, 방출제어형 제제, 및 여러 가지 미립자 전달 시스템을 포함하는, 뇌경색 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 1에 기재된 뇌경색 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제조하기 위한 방법으로서, 상기 화학식(Ⅰ)의 L-부틸프탈라이드를, 약학적으로 허용가능한 담체의 치료적 유효량과 혼합하여, 사람 또는 동물을 위한 투여 형태 또는 단위용량 형태로 조제하는 것을 특징으로 하는, 뇌경색 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제조하는 방법.
청구항 6에 있어서, 상기 뇌경색은 국소뇌허혈(focal cerebral ischemia)에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는, 뇌경색 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제조하는 방법.