KR100852417B1 - 항산화 활성을 갖는 클로로젠티실 알코올 화합물을함유하는 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항산화 활성을 갖는 클로로젠티실 알코올 화합물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것이다. 상세하게는 본 발명의 조성물은 자유라디칼과 수퍼옥사이드 라디칼(superoxide radical)의 소거 활성 및 하이드록실(hydroxyl) 라디칼에 의해 유도되는 DNA 손상억제 활성과 관련하여 강한 항산화 효과를 나타냄으로써, 산화관련 질환의 예방 및 치료에 유용한 약학조성물 및 건강기능식품을 제공한다.

클로로젠티실 알코올, 화합물, 항산화, 산화 관련 질환, 약학조성물, 건강기능식품

Description

항산화 활성을 갖는 클로로젠티실 알코올 화합물을 함유하는 조성물 {Composition comprising chlorogentisyl alcohol compound having anti-oxidative activity}

도 1은 클로로젠티실 알코올 및 비타민 C에 대한 DPPH 자유 라디칼 소거 활성을 나타낸 도이고,

도 2는 클로로젠티실 알코올 및 비타민 C에 대한 수퍼옥사이드 라디칼 소거 활성을 나타낸 도이며,

도 3은 TEAC법에 의한 클로로젠티실 알코올 및 비타민 C의 항산화 활성을 나타낸 도이고,

도 4는 과산화수소 및 자외선에 의해 유도된 DNA 사슬 절단에 대한 클로로젠티실 알코올 화합물의 효과를 나타낸 도이다.

본 발명은 산화 관련 질환의 예방 및 치료용으로써 클로로젠티실 알코올 화 합물을 함유하는 조성물에 관한 것이다.

산화활성이란 생체 내 활성산소의 생성을 방지하고 세포에 회복 불가능한 손상을 일으키는 산화현상을 방지하는 활성을 말한다. 안정한 상태의 산소(triplet oxygen)는 효소계, 환원 대사, 화학약품, 공해물질 및 광화학 반응과 같은 환경적, 생화학적 요인 등에 의해 인체 내 독성물질인 활성 산소(Reactive oxygen species: ROS)로 전환되어 다양한 세포 구성 성분인 지질, 단백질 및 DNA를 산화시킴으로써 염증을 유발하거나 여러 기관들을 손상시킨다고 알려져 있다(Beckman JS, et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 87, pp 1620~1624, 1990; Sagar S, et al., Mol . Cell Biochem ., 111, pp 103~108, 1992; Ames BN, et al., Proc . Natl . Acad , USA, 90, pp 7915~7922, 1993). 이러한 ROS의 종류로는 슈퍼옥사이드 음이온(superoxide anion, ·O₂), 과산화수소(hydrogen peroxide, H₂O₂), 히드록실 라디칼(hydroxyl radical), 일중항 산소(singlet oxygen, 1O₂) 및 지질과산화에 의해 생성되는 알콕실 라디칼(alkoxyl radical, RO·), 퍼옥실 라디칼(peroxyl radical, ROO·) 및 과산화질소 이온(ONOO-)을 들 수 있다.

이들 활성산소의 작용은 체내 방어기구인 수퍼옥사이드 디스뮤타제(Superoxide dismutase), 카탈라아제(catalase) 및 퍼옥시다아제(peroxidase) 등의 항산화성 효소와 비타민 C, E, 및 글루타치온(glutathione) 등의 항산화 물질의 작용에 의하여 최소화될 수 있다. 그러나 생체방어력에 이상이 생기거나 과도한 활성산소에 노출될 경우에는 이 균형이 깨지면서 활성산소가 기질, 단백질 및 DNA 등 을 비가역적으로 파괴하게 되고, 그 결과 노화(aging), 암, 복합성 동맥경화(multiple atherosclerosis), 관절염 및 파킨슨병(parkinson's disease)과 같은 각종 질병이 유발된다는 것이 보고되었다(Griffiths HR, et al., FEBS Lett ., 388, pp 161-164, 1996; Squadrito GL, et al., Free Radic . Biol . Med ., 25, pp 392-493, 1998; Choi JS, Phytochem . Res ., 16, pp 232-235, 2002; Dreher D, et al., Eur . J. Cancer , 32A(1), pp 30-38, 1996; Sohal RS, et al., Free Radic . Biol . Med ., 33(1), pp 37-44, 2002).

항산화제의 작용 메커니즘은 3가지를 포함한다. 효소의 저해 및 자유 라디칼에 연관되는 영향요소들을 킬레이팅(chelating)하여 활성산소(ROS)의 생성을 억제하거나 활성산소를 제거하고, 항산화적 방어능을 업-레귤레이팅(upregulating)하거나 촉진한다. 수퍼옥사이드 음이온(Superoxide anion), 하이드록실 라디칼(hydroxyl radicals), 일중항 산소(singlet oxygen) 및 과산화수소를 포함하는 활성산소는 모든 포유류의 세포에서 미토콘드리아의 산소호흡 및 독성물질에의 노출로부터 생성된다. 반면에 생체 내에서 활성산소 중의 일부는 에너지 생산과 세포자살, 스트레스 및 증식을 위한 세포 내 신호 경로의 표시 및 생물학적으로 중요한 성분의 합성에서 긍정적인 역할을 한다(Pietta PG., J. Nat . Prod ., 63, pp 1035~1042, 2000).

활성산소로부터의 세포 내 방어 메카니즘은 교정시스템과 과산소 디스뮤타아제(superoxide dismutases, SOD)와 같은 해독작용효소 및 글루타치온(glutathione)과 같은 소거제(scavenger)가 포함된다. 이러한 활성산소의 발생과 이로부터의 방 어메커니즘이 균형적이지 않을 때, 불필요한 활성산소의 생산이 심혈간질환 및 암과 같은 퇴행성 질환과 노화에 강하게 연관되어있다고 제시된다. 또한, 활성산소는 산화반응을 통하여 세포막 지질의 과산화 및 세포막의 유동성 저하와 같은 세포막 손상을 유도함으로써 DNA를 공격할 수 있으며 이는 또한 암 발생을 초래하는 DNA의 변성을 일으키게 한다(Burdon RH., Free Radic . Biol. Med ., 18, pp 775~794, 1995; Russo A., et al., Cell Biol . Toxicol ., 16, pp 91~98, 2000; Sanchez-Moreno C., Food Res . Int ., 32, pp 407~412, 1999). 이러한 관측들은 활성산소가 노화와 관계된 질병을 위한 예방적 화학요법의 중요한 목표가 될 수 있음을 말하고 있다.

지금까지 개발된 합성 항산화제로는 부틸화 하이드록시아니솔(BHA, Butylated hydroxyanisole), 부틸화 하이드록시톨루엔(BHT, Butylated hydroxytoluene), 프로필 갈레이트 (PG, Propyl galate), 터셔리부틸 하이드로퀴논(TBHQ, Teritiarybutyl hydroquinone) 및 노르디히드로 구아야레트산(NDGA, nordihydro-guaiaretic acid) 등이 있으나 실험동물에 고농도로 투여할 경우에는 간 비대증이 유발되거나 발암성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 특히 부틸화 하이드록시톨루엔은 여러 연구 결과를 통하여 실험동물의 간에서 마이크로솜 효소 활성(microsomal enzyme activity)을 증가시킨다는 것이 알려지면서, 이들 페놀계 합성 항산화제의 안전성에 대하여 논란이 제기되어 현재는 그 사용량이 법적으로 규제되어 있다(Brannen AL., J. Amer . Oil Chem. Soc ., 52, pp59-63, 1975 ; Ito N., et al., J. Natl . Cancer Inst ., 70, p343, 1983 ; Chan KM., et al., J. Food . Sci ., 58, pp1-4, 1993).

이에 따라 산화적 스트레스에 기인한 질병을 예방하고 식품의 산화적 변패를 방지하기 위해 식용 및 약용식물로부터 강력하고 무해한 천연 항산화제를 분리, 동정, 개발하려는 많은 연구가 진행되고 있다. 또한 식물에서 유래한 천연 화합물들은 자유 라디칼, 활성 산소종의 소거제 및 환원제로서 산화 과정을 지연시킨다고도 알려져 있다(Pratt, D. E., American Chemical Society, pp 54-71, 1994 : Larson, R. A., Phytochem., 27, pp 969-978, 1988).

현재까지 알려진 천연 항산화 물질로는 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 퍼옥시다아제, 카탈라아제 및 글루타치온 퍼옥시다아제 등의 항산화효소와 토코페롤(비타민E), 비타민C(Vitamin C, ascorbic acid), 카르테노이드 및 글루타치온 등의 비효소적 항산화물질 등이 있다. 특히 자연계에 널리 분포되어있으며 가장 대표적인 항산화제로 간주되고 있는 페놀성 화합물은 고리구조에 치환 가능한 하이드록실기를 한 개 이상 가지는 이차대사산물이다. 이 화합물은 포유동물 효소계의 다양함을 위한 저해제 및 촉진제, 산소라디칼의 소거제 및 금속 킬레이터로써도 작용한다. 이러한 항산화 활성은 컨쥬게이션된 환 및 하이드록실기에 연관되어 있으므로 대부분의 페놀성 화합물이 항산화 활성을 가지는 점은 놀라운 일이 아니라 할 수 있다(Sanchez-Moreno C., et al., Food Res . Int ., 32, pp 407~412, 1999; Decker EA., Nutr . Rev ., 53, pp 49~58, 1995).

육지의 환경과 물리적, 화학적으로 현저히 다른 해양 환경은 생물학적 활성과 독특한 구조를 지닌 자연산물의 무한한 보고이다. 이는 최근 항암, 항염증, 무 통증 및 알레르기 등의 주목할 만한 활성을 지닌 무한한 자원들이 밝혀지며 입증되고 있다. 지금까지 해양 자원으로부터 얻어져 이미 널리 시판되고 있는 3가지의 의약인 세팔로스포린(cephalosporins), 시타라빈(cytarabine) 및 비다라빈(vidarabine)을 제외하고도 브리오스타틴-1(bryostatin-1), 스퀄아민(squalamine) 및 ET743이 지난 2년 동안 희귀성 의약품으로 인정되었다(Haefner, B., Drug Discov . Today , 8(12), pp 536-544, 2003). 최근에는 열두 가지 이상의 해양화합물 및 그 유도체들이 임상 연구 중에 있어, 해양천연물은 의약 개발에 있어 유망한 미래를 가져다줄 것이다.

바다에 사는 균은 구조적으로 새로우면서도 생물학적 활성을 지닌 이차대사산물의 풍부한 원천임이 증명되어지고 있으며, 이러한 이차대사산물은 의약품 개발에 있어 획기적인 화학자원으로 떠오르고 있다(Blunt, J.W., et al., J. Nat . Prod. Rep ., 20, p 1, 2003; Faulkner D., J. Nat . Prod . Rep ., 19, pp 1-48, 2002).

클로로젠티실 알코올(chlorogentisyl alcohol)은 1971년에 세퀸-프뤠이(Sequin-Frey)와 탐(Tamm)에 의하여 육지의 포마(Phoma sp.) 균종으로부터 처음 분리되었으며 그 후 페니실린 카나댄스(Penicillium canadense) 및 필로스틱타(phyllosticta sp.) 육지 균종에서 더 발견되었다. 최근 아스퍼질러스(Aspergillus sp.)로부터 처음 분리된 클로로젠티실 알코올이 보고된바 있으며, 이에 관한 생물학적 기능에 관하여 많은 연구가 이루어져 오고 있다. 필로스틱 타(Phyllosticta sp.)로부터 분리된 클로로젠티실 알코올은 붉은 정향의 잎에 해로운 갈변 현상을 가져오며, 암펠로마이세스(Ampelomyces sp .)로부터 분리된 클로로젠티실 알코올은 배 밑의 오손방지와 살균효과를 지니고 있음이 연구된 바 있다(Sakamura S., Agric. Biol . Chem ., 35, pp 105-110, 1971; Kwong T., Marine Biotechnology , 2006).

그러나 클로로젠티실 알코올에 관한 항산화 활성은 연구되어진 바가 없어 본 발명에서는 항노화제에 관한 연구개발 노력의 일환으로 DPPH, NBT법, TEAC법(assay) 및 하이드록실(hydroxyl) 라디칼에 의해 유도되는 DNA 손상 정도를 측정하여 클로로젠티실 알코올의 항산화 활성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 클로로젠티실 알코올(chlorogentisyl alcohol) 화합물을 유효성분으로 함유하는 산화관련 질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물 및 건강기능식품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 구조식(I)로 표기되는 3-클로로-2,5-디하이드록시벤질알코올(3-chloro-2,5-dihydroxybenzyl alcohol; 이하 클로로젠티실 알코올이라 함) 화합물을 유효성분으로 함유하는 산화관련 질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물을 제공한다.

클로로젠티실 알코올(chlorogentisyl alcohol)

또한, 상기 화합물은 아스퍼질러스 파라시티쿠스(Aspergillus parasiticus) 아스퍼질러스 캐스피토수스(A. caespitosus), 아스퍼질러스 캔디더스(A. condidus), 아스퍼질러스 셰발리에리(A. chevalieri), 아스퍼질러스 오리지(A. oryzae), 아스퍼질러스 푸미가투스(A. fumigatus), 아스퍼질러스 피아부스(A. fiavus), 아스퍼질러스 니둘란스(A. nidulans), 아스파길러스 소자에(A. sojae), 아스퍼질러스 루버(A. ruber) 또는 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus), 보다 바람직하게는 아스퍼질러스 파라시티쿠스(Aspergillus parasiticus)로부터 분리되어 수득되어질 수 있다.

본원에서 정의되는 상기의 산화관련 질환은 노화, 관상 동맥경화, 당뇨병, 간질 및 신경퇴행성 질환을 포함한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 클로로젠티실 알코올 화합물은 하기와 같이 수득될 수 있다.

아스퍼질러스 파라시티쿠스(Aspergillus parasiticus)를 가-제로 여과하여 에틸아세테이트로 배양액을 추출하여 얻은 엑스를 실리카겔 칼럼에 주입하고, 헥산-초산에틸(n-hexaneEtOAc)(0-100%)을 전개용매로 용출하여 클로로젠티실 알코올 분획물을 얻었다. 이 분획물을 중압고속액체크로마토그래피(농도시스템 1:1 내지 1:5의 H₂O/MeOH)로 분리하고, 다시 고속액체크로마토그래피(YMC, ODS-A, 50 % 내지 100 %의 MeOH, 30분)로 분리 및 정제하여 클로로젠티실 알코올 화합물을 수득할 수 있다.

본 발명은 상기 제조방법으로 수득한 클로로젠티실 알코올 화합물을 유효성분으로 함유하는 산화관련 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

상기 구조식 (Ⅰ)으로 표기되는 본 발명의 화합물은 당해기술분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용 가능한 염 및 용매화물로 제조될 수 있다.

약학적으로 허용 가능한 염으로는 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과 같은 수혼화성 유기 용매를 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.

이 때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염 산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산 (propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르빈산, 카본산, 바닐릭산 및 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토 금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

본 발명의 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 본 발명의 화합물에 존재할 수 있는 산성 및 염기성기의 염을 포함한다. 예를 들면, 약학적으로 허용 가능한 염으로는 하이드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨염이 포함되며, 아미노기의 기타 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트) 염이 있으며, 당업계에서 알려진 염의 제 조방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.

본 발명의 항산화 활성을 갖는 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.

본 발명의 화합물을 포함하는 약학조성물은, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 및 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제를 예로 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose), 락토오스 (lactose) 및 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트 및 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물 및 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜 및 올리브 오일과 같은 식물성 기름 및 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지 및 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 화합물은 0.0001 ~ 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 ~ 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 조성물에서 본 발명의 화합물은 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 ~ 50 중량%의 함량으로 배합될 수 있다.

또한, 본 발명의 화합물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 쥐, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 및 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 클로로젠티실 알코올 화합물을 유효성분으로 함유하는 산화관련 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제 및 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제 및 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 화합물은 산화관련 질환의 예방 및 치료를 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 화합물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강 기능 식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 50 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로써 상기 화합물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르 탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 화합물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 화합물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 클로로젠티실 알코올 화합물의 분리 및 정제

숙주인 홍조 사이다가시우무(Hypnea saidana)를 통해 아스퍼질러스 파라시티쿠스(Aspergillus parasiticus)를 배양하고 가-제로 여과하여 균사체와 배양액을 분리하였다. 초산에칠(EtOAc)로 배양액을 추출하여 얻은 0.6 g의 엑스를 실리카겔 칼럼에 주입하고 헥산-초산에틸(n-hexaneEtOAc)(0-100%)로 용출하여 클로로젠티실 알코올 분획물 50 mg을 얻었다. 이 분획물을 중압고속액체크로마토그래피(농도시스템 1:1 내지 1:5의 H₂O/MeOH)로 분리하고, 다시 고속액체크로마토그래피(YMC, ODS-A, 50 % 내지 100 %의 MeOH, 30분)로 분리 및 정제하여 클로로젠티실 알코올 화합물 22 mg을 얻었다. 이 화합물을 DMSO에 용해시킨 후 -20℃에 보관하여 사용하였다. 그리고 모든 실험이 수행되기 전 샘플은 즉시 희석하여 사용하였으며 각 실험에서 DMSO의 최종농도는 0.1%를 초과하지 않았다.

실험예 1. DPPH 자유라디칼 소거활성 분석

1-1. 실험준비

상기 실시예 1에서 얻은 클로로젠티실 알코올 화합물이 라디칼 소거활성(DPPH radical scavenging activity)을 나타내는지를 평가하기 위하여 기존 문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같이 DPPH소거법을 수행하였다. (Keum YS, et al., Cancer Lett. 150, pp41-48, 2000)

다양한 농도의 클로로젠티실 알코올에 0.4 mM DPPH-에탄올(ethanol)용액 및 50 mM pH 7.4 Tris-HCl 완충액(buffer) 2:1을 포함한 반응혼합물에서 실온 하에 30분간 반응시켰다. 반응 후, 517 nm에서 흡광도를 측정함으로써 DPPH 자유라디칼이 하이드라진(hydrazin)형태로 환원되는 정도를 측정하였다.

이 때, 비타민C가 양성대조군으로 사용되었으며 산화 억제율(%)은 하기 수학식 1에 따라 계산하였다.

1-2. 실험결과

상기 실험 결과, 도 1에서 보여지는 바와 같이, 클로로젠티실 알코올은 3.125μM 내지 50μM까지의 농도 영역에서 대조군인 비타민C에 비하여 강한 라디칼 소거활성을 보여주었다. 50%의 소거활성을 보이는 농도(IC₅₀)를 비교해 보았을 때, 비타민 C는 13.0μM인 반면, 클로로젠티실 알코올은 8.7μM로 더 낮은 IC₅₀을 보여주었다. 따라서 클로로젠티실 알코올은 강한 DPPH 자유 라디칼 포획자로서의 활성을 확인할 수 있었다.

실험예 2. 클로로젠티실 알코올의 수퍼옥사이드 라디칼 소거 활성 효과

2-1. 실험준비

이 실험에서 사용된 NBT법은 기존 문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같은 과정으로 실험을 수행하였다(Kirby AJ, et al., J. Ethnopharmacol., 56(2), pp103-108, 1997).

클로로젠티실 알코올 화합물의 수퍼옥사이드 라디칼 소거활성 측정을 위하여 NBT법을 수행하였다. 크산틴 산화제는 생체 내 실험(In vivo)에서 활성산소종을 만 드는 주요 효소중의 하나이다. 하이포크산틴-크산틴 산화제(Hypoxanthine-xanthine oxidase)는 수퍼옥사이드 라디칼을 생성하고 이것이 NBT를 환원시켜 푸른색의 포마잔(formazan)을 생성한다.

25℃에서 반응혼합액(20μL의 15mM Na₂EDTA, 50μL의 0.6mM NBT, 30μL의 3mM 하이포크산틴(hypoxanthine), pH 7.4인 50 mM KH₂PO₄/KOH 완충액 및 3μL의 클로로젠티실 알코올)에 50μL의 크산틴 산화제(xanthine oxidase) (1unit/ 10ml 완충용액)를 제일 마지막에 첨가시킴으로써 반응을 개시하였다.

본 실험 분석은, 10분 동안 30초 간격으로 570nm에서 멀티 마이크로플레이트 리더(Multi Microplate Reader, synergy HT, BIO-TEK)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 대조군은 클로로젠티실 알코올을 대신하여 동량의 에탄올을 이용하였고 비교물질로 비타민 C가 사용되었다.

분석 결과는 대조군에 대한 상대적인 NBT 환원 억제율(%)로 하기 수학식 2와 같이 계산하였다.

2-2. 실험결과

상기 실험 결과, 도2에서 보여지는 바와 같이 클로로젠티실 알코올은 농도 의존적으로 하이포크산틴-크산틴산화효소에 의한 NBT의 환원을 저해하였다. 약 3μM의 농도에서 클로로젠티실 알코올은 약 100%의 환원 억제율을 보여주었으나 비타민C는 같은 농도에서 약 30%의 환원 억제율을 보였고, 본 실험 영역의 최고 농도인 6.25μM에서는 50%의 환원 억제율도 보여주지 못했다. 따라서, 클로로젠티실 알코올이 아주 강한 수퍼옥사이드 라디칼 소거 활성을 지니고 있음을 확인하였다.

실험예 3. TEAC 값의 측정

3-1. 실험준비

상기 실시예 1에서 수득한 클로로젠티실 알코올에 대한 총 항산화 활성(TAA, total antioidant activity)은 TEAC(Trolox equivalent antioxidant capacities)분석을 통해 문헌에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같이 실험하였다. (Re R., et al., Free Radic . Biol . Med ., 26, pp 1231~1237, 1999).

본 실험 분석에서는, 표준물질인 트롤록스 항산화제의 ABTS 라디칼2,2'-아지노비스(3-에틸벤조-티아졸린-6-술폰산)(2,2'-azinobis(3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulfonic acid))의 소거 반응성을 기준으로 시료의 항산화 정도를 비교하였다.

어두운 장소에서 12시간 동안 실온을 유지하여 2.45mM의 과황산칼륨(potassium persulfate) 및 7mM의 ABTS^ㆍ+ 용액의 혼합액으로 ABTS^ㆍ+(ABTS radical cation)을 얻었다. 이 ABTS^ㆍ+ 용액을 5mM의 인산완충용액(PBS)를 이용하여 734nm에서 흡광도 값이 0.70 ± 0.02가 되도록 희석한 후, ABTS^ㆍ+ 용액 1ml에 10μL의 시 료 또는 트롤록스(trolox) 표준용액를 가하고 30℃에서 6분간 반응시켜 734nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로는 비타민C를 사용하였으며 클로로젠티실 알코올 및 비타민C의 항산화 활성은 각기 다른 농도의 트롤록스에 의해 구한 표준곡선을 이용하여 TEAC 값으로 나타내었다.

3-2. 실험결과

상기 실험 결과, 도3에서 보여지는 바와 같이 TEAC실험에서 클로로젠티실 알코올 및 비타민C는 농도 의존적으로 ABTS 라디칼 소거 활성을 보여주었다. 클로로젠티실 알코올 및 비타민C의 TEAC값은 각각 1.06 및 1.05로 유사하여 클로로젠티실 알코올이 비타민C 및 트롤록스보다 조금 더 강한 항산화 활성을 지니고 있음을 알 수 있었다.

실험예 4. 과산화수소와 자외선에 의해 유도된 DNA 사슬 절단에 대한 클로로젠티실 알코올 화합물의 효과 측정

4-1. 실험준비

본 실험은 기존 문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같은 과정으로 실험하여 수행하였다(Keum YS, et al., Cancer Lett., 150, pp41-48, 2000).

30μL의 반응혼합액(0.15μg pBR322 plasmid DNA, 30mM H₂O₂ 및 pH 8.0인 10mM Tris-EDTA 완충액)에 다양한 농도의 클로로젠티실 알코올 화합물 5μL를 최종농도 가 15, 30 및 60μM이 되도록 첨가시키되, 상기 반응혼합액에 과산화수소를 첨가하기 전에 클로로젠티실 알코올 화합물을 반응액에 혼합시켰다. 히드록실 라디칼을 생성시키기 위하여 12W 자외선 램프를 사용하여 20cm 떨어진 높이로 실온에서 30분 동안 조사 후, 0.25% 브로모페놀 블루 트랙킹 염료(bromophenol blue tracking dye) 및 50% 자당(sucrose)을 포함하는 로딩(loading) 완충액을 첨가시킴으로써 반응을 종결시켰다. 그 후, 0.8% 서브머린(submarine) 아가로스 젤 전기영동법으로 분석하였으며, 젤은 에티디움 브로마이드(ethidium bromide;EtBr)로 염색하고 물로 세척한 후 UV 트랜스일루미네이터(TEX-20-M, VILBER LOURMAT)에서 분석하였다.

4-2. 실험결과

상기 실험 결과, 도 4에서 보여지는 바와 같이 응축된(supercoiled) DNA에 과산화수소 또는 자외선을 단독으로 조사할 때 DNA 사슬의 절단은 일어나지 않았지만, 과산화수소 및 자외선을 처리함으로써 DNA가 이완된(relaxed) 나선형 형태로 90% 이상 전환되었고 클로로젠티실 알코올 화합물은 농도 의존적으로 DNA 사슬의 절단을 감소시켰다.

DNA를 30μM 클로로젠티실 알코올 화합물과 함께 처리하였을 때 DNA 사슬 절단이 50% 이상 보호되어 클로로젠티실 알코올 화합물이 과산화수소 및 자외선으로부터 유도된 하이드록실 라디칼에 의해 일어나는 산화적 스트레스를 효과적으로 감소시킨다는 것을 확인할 수 있었다.

하기에 본 발명의 화합물을 포함하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

클로로젠티실 알코올 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

클로로젠티실 알코올 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

클로로젠티실 알코올 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

클로로젠티실 알코올 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO₄12H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

클로로젠티실 알코올 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 음료의 제조

클로로젠티실 알코올 100 mg

비타민 C 15 g

비타민 E (분말) 100 g

젖산철 19.75 g

산화아연 3.5 g

니코틴산아미드 3.5 g

비타민 A 0.2 g

비타민 B1 0.25 g

비타민 B2 0.3g

물 정량

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 아스퍼질러스 파라시티쿠스로부터 분리된 클로로젠티실 알코올 화합물은 자유라디칼과 수퍼옥사이드 라디칼(superoxide radical)의 소거 활성 및 하이드록실(hydroxyl) 라디칼에 의해 유도되는 DNA 손상억제 활성과 관련하여 강한 항산화 효과를 가지고 있는 바, 본 발명의 클로로젠티실 알코올 화합물은 산화관련 질환의 예방 및 치료에 유용한 약학조성물 및 건강기능식품으로 사용될 수 있다.

Claims (6)

1. 클로로젠티실 알코올(chlorogentisyl alcohol) 화합물을 유효성분으로 함유하는 관상 동맥경화의 예방 및 치료용 약학조성물.
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5. 클로로젠티실 알코올(chlorogentisyl alcohol) 화합물을 유효성분으로 함유하는 관상 동맥경화의 예방 및 개선용 건강기능식품.
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