JP7082845B2 - スチルベン化合物を含む水溶液及びその用途 - Google Patents

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Description

本発明は、スチルベン化合物を含む水溶液及びスチルベン化合物の水溶性向上剤に関する。また、水溶性に優れたスチルベン化合物を含む組成物及びその製造方法に関する。また、スチルベン化合物の効率的な抽出方法に関する。さらに、スチルベン化合物を含むスーパーオキサイド生成阻害剤に関する。
ぶどう果汁は、有効成分としてポリフェノール類を含むことが知られている。その中でもフレンチパラドックスで有名なワインに含まれる機能性化合物にレスベラトロールがある。レスベラトロールは、長寿、老化防止、抗高血糖、抗高尿酸血症、高ＬＤＬ血症、抗高血圧、抗炎症作用を持ち、肥満、糖尿病などを改善し、アルツハイマー発症予防効果も報告されている（非特許文献１～４参照）。ぶどう果皮には、レスベラトロール配糖体（ピセイド）が含まれているが、ぶどう果汁には極めて微量のピセイドしか含まれないため、当該果汁からの配糖体の大量供給は困難である。例えば、市販されているぶどう濃縮還元１００％果汁の成分組成の一例は、以下のとおりであり、僅か０．０２ｍＭのピセイドが含まれているに過ぎない。
水：８６．９±２．５ｇ／ｄＬ
グルコース：５．８７±０．２１ｇ／ｄＬ
フルクトース：５．７６±０．０５ｇ／ｄＬ
ピセイド：０．０００６８ｇ／ｄＬ（０．０２ｍＭ）
ポリフェノール（没食子酸として）：０．０８８ｇ／ｄＬ
レスベラトロールの供給源として、ぶどうの葉、茎及び種子の抽出物に含まれるレスベラトロールの利用が可能である。しかしながら、レスベラトロールは、疎水性であるために水には極めて溶けにくく、２０℃の水に対する溶解度は、わずか０．１９ｍＭに過ぎない（本願明細書表２を参照）。また、レスベラトロールの生理活性について報告している前記非特許文献１～４においては、それらの生理活性を発現させるために、かなり大量（５０～３０００ｍｇ／ｄａｙ）のレスベラトロールが摂取されている。そのため、効果を十分に発現させるためには、１日に０．２ｍｍｏｌ以上といった多量の摂取が要求されることになる。例えばサプリメントとして用いる場合に、効率のよい摂取のために、高濃度のレスベラトロールを含む飲料の調製が求められている。
生体への吸収が良いレスベラトロールを含む飲料を作製するために、配糖体への変換、シクロデキストリンによる包接化、水溶液へのアルコールの添加などの手法が試みられている（非特許文献５、６参照）。しかし、生体触媒によるレスベラトロールの効率のよい配糖化は未だ報告されていない。また、シクロデキストリン類とレスベラトロールとの包接化によって高濃度の水溶液を得る方法も未だ報告されていない。さらに、エタノール含有水溶液に対するレスベラトロールの溶解度は、エタノール含有量が少ないうちはそれほど大きくない（本願明細書図３を参照）。したがって、アルコール度数の低い酒に対して、多くのレスベラトロールを溶解させることはできないし、健康を考慮すればノンアルコール飲料にレスベラトロールを溶解させることが望まれる。
キサンチンオキシダーゼ（ＸＯ）は、生体内において、ヒポキサンチンを酸化してキサンチンを生成する反応を触媒するとともに、さらにキサンチンを酸化して尿酸を生成する反応を触媒する酵素である。したがって、キサンチンオキシダーゼの働きを抑制することが、高尿酸血症や痛風の治療に有効である。例えば、没食子酸アルキルエステルがキサンチンオキシダーゼ阻害剤として有効であることが非特許文献７に記載されている。ヒポキサンチンから、キサンチン、尿酸へと酸化される反応と、酸素（Ｏ２）がスーパーオキサイド（Ｏ２ －・）及び過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）に還元される反応とが、いわゆるピンポンメカニズムで進行する。スーパーオキサイドや過酸化水素などの活性酸素種（ＲＯＳ：Reactive Oxygen Species）の過剰産生は、過酸化脂質生成を含む酸化ストレスを起こし、健康及び食品工業に悪影響を及ぼすおそれがある（非特許文献８参照）。
Szkudelski T, Szkudelska K. Resveratrol and diabetes: from animal to human studies. Biochim Biophys Acta. 2015; 1852(6):1145-1154. Pasinetti GM, Wang J, Ho L, Zhao W, Dubner L. Roles of resveratrol and other grape-derived polyphenols in Alzheimer’s disease prevention and treatment. Biochim Biophys Acta. 2015; 1852(6):1202-1208. Khodabandehloo H, Seyyedebrahimi S, Esfahani EN, Razi F, Meshkani R. Resveratrol supplementation decreases blood glucose without changing the circulating CD14+CD16+ monocytes and inflammatory cytokines in patients with type 2 diabetes: a randomized, double-blind, placebo-controlled study. Nutr. Res, 2018; 54:40-51. 岡田武彦、小西祐理花、石原浩二、益岡典芳、スチルベン化合物の異性化とイタドリ(Polygonum cuspidatum)に含まれるスチルベンNaturalistae. 2009; 14: 17-21. Shimoda K, Kubota N, Hamada H, Hamada H. Synthesis of resveratrol glycosides by plant glucosyltransferase and cyclodextrin glucanotransferase and their neuroprotective activity. Nat. Prod. Commun. 2015; 10(6): 995-6. Szkudelska K, Deniziak M, Ros P, Gwozodz K, Szkudelski T. Resveratrol alleviates ethanol-induced hormonal and metabolic disturbances in the rat. Physiol. Res. 2017; 66: 135-145. Masuoka N, Nihei K, Kubo I, Xanthine oxidase inhibitory activity of alkyl gallates, Mol. Nutr. Food Res. 2006; 50, 725-731 藤田直、活性酸素，過酸化脂質，フリーラジカルの生成と消去機構並びにそれらの生物学的作用、YAKUGAKU ZASSHI 2002; 122(3): 203-218
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、高濃度のスチルベン化合物を含む水溶液を提供することを目的とするものである。また、水に対する溶解性の低いスチルベン化合物の溶解性を向上させることのできる水溶性向上剤を提供することも本発明の目的である。スチルベン化合物を含み水溶性の良好な組成物とその好適な製造方法を提供することも本発明の目的である。水を用いてスチルベン化合物を効率よく抽出する方法を提供することも本発明の目的である。さらに、前記スチルベン化合物又はそれを含む水溶液や組成物からなる、キサンチンオキシダーゼにより触媒されるスーパーオキサイド生成の阻害剤を提供することも本発明の目的である。
上記課題は、下記式（１）で表される化合物又はその配糖体若しくは多量体であるスチルベン化合物（Ａ）０．３～２００ｍＭ、及び下記式（２）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩であるフラビン誘導体（Ｂ）０．３～２００ｍＭが溶解した水溶液を提供することによって解決される。
Figure 0007082845000001
［式（１）中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子又はメチル基であり、Ｘは、水素原子、ヒドロキシ基又はメトキシ基である。］
Figure 0007082845000002
［式（２）中、ｎは、１又は２である。ｎが１のとき、Ｙは水素原子である。ｎが２のとき、Ｙは下記式（３）で表される基である。式（３）中、＊が付された直線は単結合である。］
Figure 0007082845000003
このとき、前記スチルベン化合物（Ａ）が、レスベラトロール、ピセアタンノール、ラポンチゲニン、イソラポンチゲニン、プテロスチルベン及びピノスチルベン並びにそれらの配糖体及び多量体からなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。スチルベン化合物（Ａ）に対するフラビン誘導体（Ｂ）のモル比（Ｂ／Ａ）が０．５～５０であることも好ましい。前記水溶液のｐＨが１．５～６であることも好ましい。また、溶媒中のエタノールの濃度が２０体積％未満であることも好ましい。
さらに、炭素数２～６のカルボン酸並びにアスコルビン酸及びその配糖体から選択されるｐＨ調整剤（Ｃ）を含む前記水溶液が、好適な実施態様である。本発明の好適な実施態様は、前記水溶液からなる、キサンチンオキシダーゼにより触媒されるスーパーオキサイド生成の阻害剤である。また、本発明の好適な実施態様は、前記水溶液からなる飲料又は化粧料である。
前記課題は、スチルベン化合物（Ａ）の水に対する溶解度を向上させるための、フラビン誘導体（Ｂ）からなる水溶性向上剤であって；スチルベン化合物（Ａ）が、前記式（１）で表される化合物又はその配糖体若しくは多量体であり、フラビン誘導体（Ｂ）が、前記式（２）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩である、水溶性向上剤を提供することによっても解決される。
前記課題は、前記式（１）で表される化合物又はその配糖体若しくは多量体であるスチルベン化合物（Ａ）、及び前記式（２）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩であるフラビン誘導体（Ｂ）を含み、スチルベン化合物（Ａ）に対するフラビン誘導体（Ｂ）のモル比（Ｂ／Ａ）が０．５～５０であり、粉体、顆粒、タブレット又はペーストから選択される形態の組成物を提供することによっても解決される。このとき、さらに、炭素数２～６のカルボン酸並びにアスコルビン酸及びその配糖体から選択されるｐＨ調整剤（Ｃ）を含むことが好ましい。
また、スチルベン化合物（Ａ）とフラビン誘導体（Ｂ）が溶解した水溶液を調製してから水分を除去する、前記組成物の製造方法が好ましい。本発明の好適な実施態様は、前記組成物からなる、キサンチンオキシダーゼにより触媒されるスーパーオキサイド生成の阻害剤である。
前記課題は、前記式（１）で表される化合物又はその配糖体若しくは多量体であるスチルベン化合物（Ａ）を含む植物原料、又は該植物原料から有機溶媒で抽出された粗抽出物と、前記式（２）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩であるフラビン誘導体（Ｂ）が溶解した水溶液とを接触させて、前記植物原料又は粗抽出物から前記水溶液にスチルベン化合物（Ａ）を抽出する、スチルベン化合物（Ａ）の抽出方法を提供することによっても解決される。
また前記課題は、前記式（１）で表される化合物又はその配糖体若しくは多量体であるスチルベン化合物（Ａ）を有効成分として含む、キサンチンオキシダーゼにより触媒されるスーパーオキサイド生成の阻害剤を提供することによっても解決される。好適な実施態様では、式（１）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＸが水素原子である。また、他の好適な実施態様では、式（１）中、Ｒ１及びＲ２が水素原子であり、Ｒ３が水素原子又はメチル基であり、Ｘがヒドロキシ基である。
本発明の水溶液には、レスベラトロールなどのスチルベン化合物が高濃度に溶解して含まれており、少量飲用するだけで、効率よくスチルベン化合物を摂取することができる。水に溶解しているので、摂取後の生体への吸収性能にも優れている。また本発明の水溶液は、エタノールなどの有機溶媒を添加しなくても、高濃度のスチルベン化合物を溶解させることができる。さらに、本発明の水溶液に含まれるフラビン誘導体も、ビタミンＢ２及びその代謝物として生体に対して有用な効果を奏することができる。したがって、本発明の水溶液は、飲料や化粧品として有用である。また、本発明の水溶性向上剤を用いることによって、スチルベン化合物の水への溶解度を大きく向上させることができる。
本発明の組成物は、粉体、顆粒、タブレット又はペーストという形態を有しながらも、水に対する溶解性に優れていて、生体への吸収性能にも優れている。したがって、本発明の組成物は、サプリメントなどとして有用である。また、本発明の抽出方法によれば、有機溶媒を用いなくても、水によって効率的にスチルベン化合物を抽出することができる。
さらに、前記スチルベン化合物、それを含む前記水溶液、及びそれを含む前記組成物は、キサンチンオキシダーゼにより触媒されるスーパーオキサイド生成を阻害することができる。
実施例１において、ＦＭＮの濃度を変化させたときの、スチルベン化合物の水への溶解度の変化を示したグラフである。 実施例２において、水溶液中のＦＭＮ及びＦＡＤの濃度を変化させたときの、レスベラトロールの当該水溶液への溶解度の変化を示したグラフである。 参考例１において、水溶液中のエタノールの濃度を変化させたときの、レスベラトロールの当該水溶液への溶解度の変化を示したグラフである。 実施例５において、１０ｍＭのピセアタンノールと１０ｍＭのＦＭＮを含む水溶液の吸収スペクトル（点線）と、１０ｍＭのＦＭＮのみを含む水溶液の吸収スペクトル（実線）とを比較したものである。 実施例５において、０．１ｍＭのピセアタンノールと０．１ｍＭのＦＭＮを含む水溶液の吸収スペクトル（点線）と、０．１ｍＭのＦＭＮのみを含む水溶液の吸収スペクトル（実線）とを比較したものである。 実施例８において、レスベラトロールとＦＭＮと酢酸を含む水溶液の酢酸濃度を変えた時のｐＨを示したグラフである。 参考例２において、ＦＭＮと各種の酸の濃度比率を変えた時のｐＨを示したグラフである。 図７の横軸の一部を拡大したグラフである。 実施例９において、レスベラトロール粉体とＦＭＮ粉体を混合して得た混合紛体１と、レスベラトロールとＦＭＮの混合水溶液を乾燥して得た混合粉体２との、水に対する溶解速度を比較したグラフである。 参考例６において、スチルベン化合物の濃度を変化させたときの、スーパーオキサイドスカベンジング活性の変化を示したグラフである。
本発明は、下記式（１）で表される化合物又はその配糖体若しくは多量体であるスチルベン化合物（Ａ）０．３～２００ｍＭ、及び下記式（２）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩であるフラビン誘導体（Ｂ）０．３～２００ｍＭが溶解した水溶液である。スチルベン化合物（Ａ）は疎水性であるために水への溶解度が小さいけれども、フラビン誘導体（Ｂ）とともに溶解させることにより、スチルベン化合物（Ａ）の溶解度を大きく上昇させることができる。
まず、スチルベン化合物（Ａ）について説明する。スチルベン化合物（Ａ）は、下記式（１）で表される化合物又はその配糖体若しくは多量体である。
Figure 0007082845000004
式（１）中のＲ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子又はメチル基である。水溶性の観点から、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３のうちの１つ以上が水素原子であることが好ましく、２つ以上が水素原子であることがより好ましく、３つ全てが水素原子であることがさらに好ましい。式（１）中のＸは、水素原子、ヒドロキシ基又はメトキシ基である。
スチルベン化合物（Ａ）は、式（１）で表される化合物の配糖体であってもよい。その場合、式（１）で表される化合物に含まれる水酸基に糖鎖が結合する。当該糖鎖は単糖であってもよいし多糖であってもよい。糖鎖が長い場合には、スチルベン化合物（Ａ）の水溶性が改善されて、フラビン誘導体（Ｂ）を用いなくても十分な水溶性を有する場合が多い。したがって、当該糖鎖が単糖又は二糖である場合、特に単糖である場合に本発明を採用する意義が大きい。糖鎖を形成する糖は特に限定されず、グルコース、β－ルチノースなどが例示されるが、グルコースが好ましい。好適には、グルコース１分子が結合したグルコシドである。また、スチルベン化合物（Ａ）の水酸基の一部が塩を形成していても構わないが、水溶液のｐＨが７未満に保たれる範囲の少量であることが好ましい。スチルベン化合物（Ａ）の好適な具体例を、その構造とともに表１に示す。
Figure 0007082845000005
レスベラトロールは水酸基を３つ有するスチルベン化合物であり、生理活性面で重要な化合物である。レスベラトロールの水酸基の１つにグルコース（Glc）が結合しているのが、ピセイド（レスベラトロール－３－グルコシド）とレスベラトロール－４’－グルコシドである。Ｘが水酸基であり合計で４つの水酸基を有するのがピセアタンノールである。ラポンチゲニンとイソラポンチゲニンは、ピセアタンノールの４つの水酸基のうちの１つがメトキシ基に変わったものであり、レスベラトロールの水酸基のうちの１つ又は２つがメトキシ基に変わったのがピノスチルベンとプテロスチルベンである。これらの化合物は、それぞれ、生理活性を有することが報告されている。
さらに、スチルベン化合物（Ａ）は、式（１）で表される化合物の多量体であってもよい。当該多量体は、式（１）で表される化合物の分子同士が単に結合したものであってもよいし、脱水素して結合したものであってもよいし、脱水して結合したものであってもよい。特に、脱水素して結合したものが好ましい。また、二量体であっても、三量体以上の多量体であってもよいが、二量体が好ましい。例えば、レスベラトロールの多量体としては、ε－ビニフェリン（下記式（４））、δ－ビニフェリン、グネチンＣなどの脱水素二量体、α－ビニフェリンなどの脱水素三量体、ホペアフェノールなどの脱水素四量体が例示される。
Figure 0007082845000006
次に、フラビン誘導体（Ｂ）について説明する。フラビン誘導体（Ｂ）は、下記式（２）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩である。
Figure 0007082845000007
式（２）中、ｎは０、１又は２であり、ｎが０又は１のときＹは水素原子であり、ｎが２のときＹは下記式（３）で表される基である。ｎが０でありＹが水素原子であるときの化合物は、リボフラビン（ビタミンＢ２）である。ｎが１でありＹが水素原子であるときの化合物は、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）である。また、ｎが２でありＹが下記式（３）で表される基であるときの化合物は、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）である。リボフラビンは水溶性ビタミンであり、健康の維持のために継続的な摂取が望まれるものである。しかも、過剰摂取の問題はほとんどないので、本発明の水溶液に溶解させることが望ましい化合物である。ＦＭＮ及びＦＡＤは、いずれもリボフラビンからの代謝生成物であり、リボフラビン同様に有用で安全な化合物である。
Figure 0007082845000008
フラビン誘導体（Ｂ）は、薬学的に許容される塩であってもよい。塩の種類は、薬学的に許容されるものであればよく、特に限定されるものではない。なかでも、ｎが１または２の時に式（２）で表される化合物に含まれるリン酸単位の少なくとも一部が、カチオンと塩を形成していることが望ましい。このときのカチオン種は特に限定されないが、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、アンモニウムなどが例示される。
本発明で用いられるフラビン誘導体（Ｂ）は、リボフラビン（ビタミンＢ２）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）のいずれであってもよいが、スチルベン化合物（Ａ）の溶解性を効果的に向上させる観点からは、ＦＭＮ及びＦＡＤが好ましい。実施例（図２）に示されるように、同じモル数のＦＭＮとＦＡＤは、同程度の量のスチルベン化合物（Ａ）を溶解させることができる。したがって、ＦＭＮとＦＡＤの分子量を比較すれば、より少ない質量で溶解度を向上させることのできるＦＭＮがより好ましい。
本発明の水溶液に溶解しているスチルベン化合物（Ａ）の濃度は０．３～２００ｍＭである。スチルベン化合物（Ａ）の濃度は、好適には１ｍＭ以上であり、より好適には２ｍＭ以上であり、さらに好適には５ｍＭ以上であり、特に好適には１０ｍＭ以上である。より多くのスチルベン化合物（Ａ）を溶解させるほど、少量の水溶液の飲用により効果的にスチルベン化合物（Ａ）を摂取することができる。また、化粧料として用いる場合にも、より効果的に肌から吸収させることができる。スチルベン化合物（Ａ）の種類によっては２００ｍＭも溶解することができないものもあるが、そのような場合には、水溶液中の飽和濃度が上限値となる。
本発明の水溶液に溶解しているフラビン誘導体（Ｂ）の濃度は０．３～２００ｍＭである。フラビン誘導体（Ｂ）の濃度は、好適には２ｍＭ以上であり、より好適には５ｍＭ以上であり、さらに好適には１０ｍＭ以上であり、特に好適には１５ｍＭ以上である。より多くのフラビン誘導体（Ｂ）を溶解させるほど、より多くのスチルベン化合物（Ａ）を溶解させることができる。フラビン誘導体（Ｂ）の種類によっては２００ｍＭも溶解することができないものもあるが、そのような場合には、飽和する濃度が上限値となる。
実施例１（図１）に示されるように、スチルベン化合物（Ａ）の溶解度は、フラビン誘導体（Ｂ）の濃度にほぼ比例して増加する。１分子のスチルベン化合物（Ａ）を溶解させるのに要するフラビン誘導体（Ｂ）の分子数は、スチルベン化合物（Ａ）の種類によって異なる。多量体を除き、元々水溶性の高いスチルベン化合物（Ａ）ほど、少ない数のフラビン誘導体（Ｂ）分子によって溶解させることができる。スチルベン化合物（Ａ）１分子を溶解させるのに要するフラビン誘導体（Ｂ）の分子数は、ピセアタンノールが１分子未満、ピセイド、ラポンチゲニン、イソラポンチゲニンが約１分子、レスベラトロールが約４分子、プテロスチルベンが約６分子である。レスベラトロールの脱水素２量体であるε－ビニフェリンは、元々の水溶性はそれほど高くないが、少ない量のフラビン誘導体（Ｂ）で水溶性が大きく向上する。
実施例５に示されるように、水溶液中のスチルベン化合物の吸収スペクトルにおいて、ＦＭＮを加えることにより各吸収極大が深色移動する。したがって、本発明の水溶液中においては、スチルベン化合物（Ａ）分子とフラビン誘導体（Ｂ）分子とが、所定の比率で会合していると考えられる。なおこの会合は、水溶液を希釈することによって消失することが実施例５（図４と図５の比較）で確認されている。したがって、スチルベン化合物（Ａ）の芳香環とフラビン誘導体（Ｂ）の芳香環のπ－π相互作用による会合は、比較的弱い力による会合であって、希釈によって解離しているものと考えられる。
本発明の水溶液において、スチルベン化合物（Ａ）に対するフラビン誘導体（Ｂ）のモル比（Ｂ／Ａ）が０．２～５０であることが好ましい。モル比（Ｂ／Ａ）は、０．５以上であることがより好ましく、０．８以上であることがさらに好ましい。スチルベン化合物（Ａ）がレスベラトロールである場合には、モル比（Ｂ／Ａ）は２以上であることが好ましく、３以上であることがより好ましい。フラビン誘導体（Ｂ）は過剰摂取による問題点がほとんどないので、会合に要する分子数よりも多い分子数のフラビン誘導体（Ｂ）を溶解させても構わない。
本発明の水溶液のｐＨは１．５～６であることが好ましい。実施例７（表４）に示されるように、ｐＨが７以上の水溶液とした場合には、スチルベン化合物（Ａ）の量が減少して他の化合物に変化しやすくなる。ｐＨはより好適には５．５以下であり、さらに好適には５以下である。一方、ｐＨが低すぎると、飲料として用いる際に酸味が強すぎたり、化粧料として用いる際に肌への刺激が強すぎたりするので、ｐＨは２．５以上であることがより好ましく、３以上であることがさらに好ましい。また、消費者が水で希釈して飲料や化粧料として用いる製品があることを考慮すれば、本発明の水溶液のｐＨは１．５以上であることがより好ましく、２以上であることがさらに好ましい。
本発明の水溶液のｐＨを１．５～６に調整する方法は特に限定されない。薬学的に許容される酸をｐＨ調整剤（Ｃ）として添加することが好ましい。ｐＨ調整剤（Ｃ）として用いられる酸として好適なものは、炭素数２～６のカルボン酸並びにアスコルビン酸及びその配糖体である。炭素数２～６のカルボン酸としては、酢酸、クエン酸、乳酸、酒石酸、コハク酸、リンゴ酸、グルタミン酸、グルコン酸などが例示される。なかでも、食味を考慮すればクエン酸及び酢酸が好ましい。また、アスコルビン酸及びその配糖体は、同時に酸化防止効果も得られるので好ましい。アスコルビン酸の配糖体としては、アスコルビン酸２－グルコシドなどが例示される。
フラビン誘導体（Ｂ）に対するｐＨ調整剤（Ｃ）のモル比（Ｃ／Ｂ）は０．２～５０であることが好ましい。モル比（Ｃ／Ｂ）が小さすぎると、ｐＨが十分に低下しない。したがって、モル比（Ｃ／Ｂ）は０．３以上であることがより好ましく、０．５以上であることがさらに好ましい。一方、モル比（Ｃ／Ｂ）が大きすぎると、酸味が強くなってしまうし、肌への刺激も強くなってしまう。したがって、モル比（Ｃ／Ｂ）は１０以下であることがより好ましく、５以下であることがさらに好ましく、２以下であることが特に好ましい。
本発明の水溶液は、スチルベン化合物（Ａ）、フラビン誘導体（Ｂ）及びｐＨ調整剤（Ｃ）以外の成分を含んでもよい。飲料や化粧料に用いられる各種の成分を、必要に応じて配合することができる。ただし、溶媒中のエタノールの濃度が２０体積％未満であることが好ましい。参考例１（図３）に示されるように、水とエタノールの混合溶媒を用いた場合のスチルベン化合物（Ａ）の溶解度は、エタノール含有量が２０体積％を超えてから大きく上昇する。したがって、溶媒中のエタノールの濃度が２０体積％未満である場合に、フラビン誘導体（Ｂ）を配合する意義が大きい。溶媒中のエタノールの濃度は５体積％以下であることがより好ましく、１体積％以下であることがさらに好ましく、０．０５体積％以下であることが特に好ましい。本発明の水溶液を用いれば、アルコールフリーの飲料を提供することができる。
本発明の水溶液の用途は特に限定されないが、飲料及び化粧料が好適な用途である。多量のスチルベン化合物（Ａ）が水に溶解していることから、スチルベン化合物（Ａ）の生体への吸収性に優れる。飲料の場合には、腸管から速やかに吸収されるし、化粧料の場合には肌から容易に吸収される。飲料としては、ノンアルコール飲料のみならず、２０％未満の低アルコール含有量のアルコール飲料とすることもできる。サプリメント飲料として特に好適に用いられる。化粧料としては、化粧水や乳液とすることができる。また、点滴液などの医薬とすることもできる。
実施例６及び実施例７（表４）に示されるように、スチルベン化合物（Ａ）及びフラビン誘導体（Ｂ）を含む本発明の水溶液は、光の照射によってスチルベン化合物（Ａ）の量が減少することがある。これに対し、フラビン誘導体（Ｂ）を含まずスチルベン化合物（Ａ）のみを含む場合には、光照射による及びスチルベン化合物（Ａ）量の減少が抑制される。したがって、フラビン誘導体（Ｂ）と会合することによってスチルベン化合物（Ａ）の光安定性が低下していると考えられる。そのため、本発明の水溶液は遮光して保存することが好ましい。また、前述のように本発明の水溶液はｐＨ１．５～６に保つことが安定性の面から望ましい。したがって、本発明の水溶液を保存する場合には、ｐＨを１．５～６にして遮光保存するのが望ましく、遮光可能な容器に収容された包装体が好適な実施態様である。
以上説明したように、フラビン誘導体（Ｂ）を配合することによって、スチルベン化合物（Ａ）の水に対する溶解性が向上する。したがって、本発明の課題は、スチルベン化合物（Ａ）の水に対する溶解度を向上させるための、フラビン誘導体（Ｂ）からなる水溶性向上剤を提供することによっても解決される。
また、本発明の他の態様は、スチルベン化合物（Ａ）及びフラビン誘導体（Ｂ）を含み、スチルベン化合物（Ａ）に対するフラビン誘導体（Ｂ）のモル比（Ｂ／Ａ）が０．５～５０であり、粉体、顆粒、タブレット又はペーストから選択される形態の組成物である。このような組成物は、前記水溶液を得るための原料として有用であるとともに、これを直接摂取又は塗布した場合にも、スチルベン化合物（Ａ）が生体に吸収されやすい。このとき、好適なモル比（Ｂ／Ａ）は、前記水溶液の説明のところに記載した通りである。また、炭素数２～６のカルボン酸並びにアスコルビン酸及びその配糖体から選択されるｐＨ調整剤（Ｃ）をさらに含むことも、前記水溶液のときと同様に好ましい。好適なモル比（Ｃ／Ｂ）は、前記水溶液の説明のところで記載した通りである。
本発明の組成物は、粉体、顆粒、タブレットのように、ほとんど水分を含まない形態であってもよいし、ペーストのように、スチルベン化合物（Ａ）が完全に水に溶解せずに高粘度の液体中に粒子として分散しているような形態であってもよい。これらの組成物は、必要に応じてスチルベン化合物（Ａ）、フラビン誘導体（Ｂ）、ｐＨ調整剤（Ｃ）及び水以外の成分を含んでもよい。本発明の組成物は、実施例６に示されるように水がほとんど存在しない状態であっても、光照射によってスチルベン化合物（Ａ）が少しだけ減少する。したがって、本発明の組成物も、本発明の水溶液と同様に遮光保存することが好ましい。また、遮光可能な容器に当該組成物が収容された包装体が好適な実施態様である。本発明の組成物の用途は特に限定されないが、健康食品やサプリメントとして用いることができる。また、カプセル、錠剤などの形態の医薬とすることもできる。
本発明の組成物の製造法は特に限定されず、スチルベン化合物（Ａ）の粉体とフラビン誘導体（Ｂ）の粉体とを、必要に応じて他の成分とともに単純に混ぜるだけであっても構わない。しかしながら、水への溶解速度の観点からは、スチルベン化合物（Ａ）とフラビン誘導体（Ｂ）が溶解した水溶液を予め調製してから、含まれる水分を除去して本発明の組成物を製造することが好ましい。実施例９（図９）に示されるように、予めスチルベン化合物（Ａ）とフラビン誘導体（Ｂ）の会合体を形成させてから乾燥して得られた組成物の粉体は、スチルベン化合物（Ａ）の粉体とフラビン誘導体（Ｂ）の粉体とを単純に混合しただけの粉体と比べて、水への溶解速度が格段に速い。したがって、組成物を水に溶かして水溶液を調製する際に要する時間を短縮できるので、消費者が容易に水溶液を調製することができる。また、組成物をそのまま体内に摂取した際の吸収速度や吸収率も向上させることができる。
さらに本発明の他の態様は、スチルベン化合物（Ａ）を含む植物原料、又は該植物原料から有機溶媒で抽出された粗抽出物と、フラビン誘導体（Ｂ）が溶解した水溶液とを接触させて、前記植物原料又は粗抽出物から前記水溶液にスチルベン化合物（Ａ）を抽出する、スチルベン化合物（Ａ）の抽出方法である。フラビン誘導体（Ｂ）が溶解した水溶液は、水に比べて多量のスチルベン化合物（Ａ）を溶解させることができるので、この水溶液を用いて、スチルベン化合物（Ａ）を効率的に抽出することができる。当該水溶液に溶解しているフラビン誘導体（Ｂ）の濃度は０．３～２００ｍＭである。フラビン誘導体（Ｂ）の濃度は、好適には２ｍＭ以上であり、より好適には５ｍＭ以上であり、さらに好適には１０ｍＭ以上であり、特に好適には１５ｍＭ以上である。
植物原料から、疎水性の有効成分を抽出する際には、抽出溶媒として有機溶媒が用いられることが多い。しかしながら、環境保護の面からは、周辺に有機溶媒を揮散させないために抽出溶媒として有機溶媒を用いないことが望ましい。また、飲料や化粧料に用いる場合にも、抽出過程で有機溶媒を用いない方が望ましい。それに対し、フラビン誘導体（Ｂ）が溶解した水溶液を用いれば、有機溶媒を用いることなくスチルベン化合物（Ａ）を効率的に抽出することができる。しかも、フラビン誘導体（Ｂ）と会合することのできるスチルベン化合物（Ａ）のみを選択的に抽出することができるので、純度の高いスチルベン化合物（Ａ）を得ることができる。また、得られたスチルベン化合物（Ａ）とフラビン誘導体（Ｂ）を含む水溶液は、そのまま飲料や化粧料の原料として用いることができる。さらに、植物原料から予め有機溶媒等で抽出した粗抽出分からフラビン誘導体（Ｂ）を含む水溶液で抽出する場合には、純度の高いスチルベン化合物（Ａ）を得ることができる。
また、前記式（１）で表される化合物又はその配糖体若しくは多量体であるスチルベン化合物（Ａ）を有効成分として含む、キサンチンオキシダーゼにより触媒されるスーパーオキサイド生成の阻害剤も、本発明の実施態様である。これらの化合物は、キサンチンオキシダーゼを触媒としてキサンチンから尿酸を生成する反応を阻害するよりも、スーパーオキサイドを生成する反応の方をより強く阻害する。キサンチンオキシダーゼにより触媒されるスーパーオキサイド生成を特異的に阻害する化合物が報告されたのは初めてである。
このとき、式（１）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＸが水素原子であることが好ましい。すなわち、スチルベン化合物（Ａ）が、レスベラトロール又はその配糖体若しくは多量体であることが好適な実施態様である。レスベラトロール及びその誘導体は、生理活性物質として特に有用であるとされている。
またこのとき、前記式（１）中、Ｒ１及びＲ２が水素原子であり、Ｒ３が水素原子又はメチル基であり、Ｘがヒドロキシ基であることも好ましい。すなわち、スチルベン化合物（Ａ）が、ラポンチゲニン若しくはピセアタンノール、又はその配糖体若しくは多量体であることが好適な実施態様である。これらの化合物は、キサンチンオキシダーゼを触媒としてキサンチンから尿酸を生成する反応を強く阻害するとともに、スーパーオキサイドを生成する反応をさらに強く阻害する。ラポンチゲニンは、キサンチンオキシダーゼを触媒としてキサンチンから尿酸を生成する反応を特に強く阻害する。一方、ピセアタンノールは、キサンチンオキシダーゼを触媒としてキサンチンから尿酸を生成する反応を阻害するのに加えて、酸素から過酸化水素を生成する反応を加速させることによってスーパーオキサイドの生成をラポンチゲニンより強く阻害する。
また、スチルベン化合物（Ａ）とフラビン誘導体（Ｂ）が溶解した前記水溶液からなる、キサンチンオキシダーゼにより触媒されるスーパーオキサイド生成の阻害剤が好適な実施態様である。さらに、スチルベン化合物（Ａ）及びフラビン誘導体（Ｂ）を含み、粉体、顆粒、タブレット又はペーストから選択される形態の組成物からなる、キサンチンオキシダーゼにより触媒されるスーパーオキサイド生成の阻害剤も好適な実施態様である。
実施例１（ＦＭＮ水溶液への溶解度）
フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を２０℃の純水に溶解させて、濃度が２．５、５、１０、２０、２５、５０及び１００ｍＭ（ｍｍｏｌ／Ｌ）の水溶液を、それぞれ調製した。ここで用いたＦＭＮは、式（２）の化合物において、ｎが１でありＹが水素原子である化合物のナトリウム塩であり、ＦＭＮに含まれるリン酸基１モルが、約１モルのナトリウムイオンによって中和されているものである。当該ＦＭＮの２０ｍＭ水溶液のｐＨは５．８である。また、２０℃におけるＦＭＮの飽和水溶液の濃度は１７３ｍＭであった。以下に記載する他の実施例で用いたＦＭＮも同じものである。
純水及び各濃度のＦＭＮ水溶液に対して、東京化成工業株式会社製のレスベラトロール粉末を投入し、超音波を３０分間照射して溶解させた。１時間静置した後に、溶けなかった粉末を遠心分離することによって沈殿を除き、上清を分離した後、レスベラトロール濃度を測定した。測定に際しては、前記上清を０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）で希釈して、同濃度のＦＭＮ水溶液を対照とする差スペクトルを測定し、３１７ｎｍの吸収ピーク（モル吸光係数ε：２９，０００）の吸光度から、その水溶液におけるレスベラトロールの溶解度（ｍＭ）を算出した。得られた溶解度を表２にまとめて記載するとともに、図１のグラフにまとめて示す。
ピセイド（LKT lab製：吸収極大３１９ｎｍ、ε＝３０，５００）、ピセアタンノール（BLD pharm製：吸収極大３２４ｎｍ、ε＝２７，２００）、ラポンチゲニン（東京化成工業株式会社製：吸収極大３２４ｎｍ、ε＝２８，９００）、イソラポンチゲニン（東京化成工業株式会社製：吸収極大３２４ｎｍ、ε＝２９，３００）、プテロスチルベン（BLD pharm製：吸収極大３１７ｎｍ、ε＝２９，２００）及びε－ビニフェリン（富士フイルム和光純薬株式会社製：吸収極大３２２ｎｍ、ε＝２５，５００）についても、上記レスベラトロールと同様にして各波長において吸光度を測定して、溶解度を得た。測定結果を表２にまとめて記載するとともに、図１のグラフにまとめて示す。
Figure 0007082845000009
表２及び図１からわかるように、ピセイド、ラポンチゲニン、イソラポンチゲニンの、純水に対する溶解度は１．１９～２．７３ｍＭであるが、ＦＭＮ水溶液に溶かすことによって、純水に対する溶解度よりもはるかに高い溶解度が得られた。これらのスチルベン化合物の溶解度が、ＦＭＮの濃度に比例してほぼ１：１で直線的に増加することから、これらのスチルベン化合物の１分子を溶解させるのに、概ね１分子のＦＭＮを要することがわかった。したがって、これらのスチルベン化合物は、水溶液中においてＦＭＮと１対１で会合していることが推測される。
一方、純水に対する溶解度が０．１９ｍＭのレスベラトロールをＦＭＮ水溶液に溶解させた場合にも、レスベラトロールの溶解度が、ＦＭＮの濃度に比例してほぼ直線的に増加するが、レスベラトロール１分子を溶解させるのに、約４分子のＦＭＮを要した。したがって、レスベラトロールは、水中において、約４分子のＦＭＮに囲まれて溶解していると推定される。
純水に対する溶解度がより低いプテロスチルベン（０．０９ｍＭ）では、１分子を溶解させるのにレスベラトロールよりも多くのＦＭＮ分子が必要である。一方、純水に対する溶解度がより高いピセアタンノール（８．３４ｍＭ）及びε－ビニフェリン（３．８３ｍＭ）では、１分子を溶解させるのに要するＦＭＮは１分子以下である。
実施例２（ＦＡＤ水溶液への溶解度）
フラビンアデニンジモノヌクレオチド（ＦＡＤ）を２０℃の純水に溶解させて、濃度が５、１０及び２０ｍＭの水溶液を、それぞれ調製した。ここで用いたＦＡＤは、式（２）の化合物において、ｎが２でありＹが式（３）で表される基である化合物のナトリウム塩であり、ＦＡＤに含まれる二リン酸基が、約２モルのナトリウムイオンによって中和されているものである。また、２０℃におけるＦＡＤの飽和水溶液の濃度は３２４ｍＭであった。
純水及び各濃度のＦＡＤ水溶液に対して、実施例１と同様にして、レスベラトロール粉末を溶解させてレスベラトロールの溶解度を測定した。得られたＦＡＤ水溶液に対するレスベラトロールの溶解度を、実施例１で得られたＦＭＮ水溶液に対するレスベラトロールの溶解度とともに、表３と図２にまとめて示す。
Figure 0007082845000010
表３及び図２からわかるように、ＦＭＮ水溶液であってもＦＡＤ水溶液であっても、同じモル濃度であれば、同じモル数のレスベラトロールを溶解させることができる。したがって、ＦＭＮもＦＡＤも、レスベラトロール分子に対して同じように働いてその水溶性を助けているものと考えられる。
参考例７（リボフラビン水溶液への溶解度）
リボフラビンの飽和水溶液を調製したところ、その溶解度は０．４３ｍＭであった。当該リボフラビンは、式（２）の化合物において、ｎが０でありＹが水素原子である化合物である。このリボフラビンの飽和水溶液に対して、実施例１と同様にして、レスベラトロール粉末を溶解させてレスベラトロールの溶解度を測定した。その結果、０．４５ｍＭのレスベラトロールが溶解し、純水に対する溶解度（０．１９ｍＭ）に比べて倍以上の溶解度になった。
参考例１（エタノール水溶液への溶解性）
純水にエタノールを添加して、濃度が５、１０、２０、３０及び４０体積％のエタノール水溶液を、それぞれ調製した。純水及び各濃度のエタノール水溶液に対して、実施例１と同様にして、レスベラトロール粉末を溶解させてレスベラトロールの溶解度を測定した。エタノール濃度ごとのレスベラトロールの溶解度（ｍＭ）は、０．１９±０．０３（純水）、０．２５±０．０２（５体積％）、０．３７±０．０２（１０体積％）、１．３０±０．３０（２０体積％）、７．３８±１．１０（３０体積％）、３２．９±３．０（４０体積％）であった。エタノール濃度に対する溶解度を、図３のグラフに示す。
図３からわかるように、エタノール濃度が上昇するにしたがってレスベラトロールの溶解度は上昇する。しかしながら、エタノール濃度２０体積％くらいまでのレスベラトロールの溶解度はそれほど高くなく、３０体積％、４０体積％となることによって、急激に溶解度が上昇する。溶媒の極性の変化によって溶解度が変化しているようであり、フラビン誘導体の濃度に比例してスチルベン化合物の溶解度が直線的に上昇するのと大きく異なっている。
実施例４（スチルベン化合物とＦＭＮの混合粉体の調製）
スチルベン化合物（レスベラトロール、ピセイド又はピセアタンノール）と、ＦＭＮとを含む水溶液を調製した。このとき、実施例１の結果（表２）を参考にして、それぞれのスチルベン化合物が完全に水に溶けるために必要な量のＦＭＮを加えた。すなわち、レスベラトロールのモル数の４倍、ピセイドのモル数の１．５倍、及びピセアタンノールのモル数の１倍のモル数のＦＭＮを加えた。
具体的には、４ｍｍｏｌ（１９１３ｍｇ)のＦＭＮを２００ｍＬの水に溶解させた水溶液に、１ｍｍｏｌ（２２８ｍｇ）のレスベラトロールを完全に溶解させた。また、３ｍｍｏｌ（１４３６ｍｇ）のＦＭＮを１５０ｍＬの水に溶解させた水溶液に、２ｍｍｏｌ（７８０ｍｇ）のピセイドを完全に溶解させた。さらに、１ｍｍｏｌ（４７９ｍｇ）のＦＭＮを１００ｍＬの水に溶解させた水溶液に、１ｍｍｏｌ（２４４ｍｇ）のピセアタンノールを完全に溶解させた。こうして得られた水溶液を減圧乾燥して、レスベラトロールとＦＭＮを１：４のモル比で含む混合粉体、ピセイドとＦＭＮを２：３のモル比で含む混合粉体、及びピセアタンノールとＦＭＮを１：１のモル比で含む混合粉体をそれぞれ得た。ここで、ＦＭＮ１モルを含む各混合粉体の質量は、それぞれ５３５ｇ、７３８ｇ、７２３ｇである。
実施例５（スチルベン化合物とＦＭＮの混合水溶液のスペクトル）
実施例４で得られた、スチルベン化合物とＦＭＮの混合粉体を水に溶解させると、いずれも赤橙色を呈した。スチルベン化合物を含まない同濃度のＦＭＮ水溶液は黄色を呈することから、スチルベン化合物を含むことによって色調が変化していることがわかった。この現象を定量的に把握するために、各水溶液の吸光スペクトルを測定した。
実施例４で得られたピセアタンノールとＦＭＮの混合粉体を純水に７．２３ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させて、ピセアタンノールとＦＭＮをいずれも１０ｍＭ含む水溶液を調製した。得られた水溶液の可視光吸収スペクトルを、光路長０．１ｍｍのガラスキュベットで測定することによって、ピセアタンノールとＦＭＮの混合物の水溶液のスペクトル（図４の点線）が得られた。図４には、１０ｍＭのＦＭＮのみを含む水溶液のスペクトルを実線で併せて記載した。混合水溶液の各吸収極大における吸光係数εは、それぞれ、２７，８００（３３１ｎｍ）、６，４９０（３７７ｎｍ）、８，３３０（４４９ｎｍ）、２，０２０（５１０ｎｍ）であった。５１０ｎｍ付近の弱い吸収の出現が黄色から赤橙色への色調の変化を起こしていると推定される。この吸収帯は水で希釈すると減少した。前記混合水溶液を純水で１００倍に希釈して、ＦＭＮ濃度を０．１ｍＭにして光路長１０ｍｍのキュベットで測定したところ、スペクトル（図５の点線）は、ピセアタンノール単独のスペクトルとＦＭＮ単独のスペクトルの和とほぼ同じになった。
実施例４で得られたピセイドとＦＭＮの混合粉体を純水に７．３８ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させて、ピセイドを６．７ｍＭとＦＭＮを１０ｍＭ含む水溶液を調製した。これを上記と同様にスペクトル測定したところ、各吸収極大における吸光係数εは、それぞれ、２１，１００（３２８ｎｍ）、６，９００（３８０ｎｍ）、８，７３０（４４９ｎｍ）、１，７００（５１０ｎｍ）であった。また、実施例４で得られたレスベラトロールとＦＭＮの混合粉体を純水に５．３５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させて、レスベラトロールを２．５ｍＭとＦＭＮを１０ｍＭ含む水溶液を調製した。これをスペクトル測定したところ、各吸収極大における吸光係数εは、それぞれ、１０，１００（３３６ｎｍ）、８，０７０（３７６ｎｍ）、９，９２０（４４８ｎｍ）、７３０（５１０ｎｍ）であった。
スチルベン化合物の吸収スペクトルにおいて、ＦＭＮを加えることにより各吸収極大が深色移動することがわかった。また、スチルベン化合物とＦＭＮを含む水溶液では５１０ｎｍの吸収がみられることから、水溶液中で両化合物の複合体が生成されていると考えられる。高濃度の水溶液で生じた複合体が希釈することにより減少することから、スチルベン化合物とＦＭＮとは、両者の間で生じる比較的弱いπ－π相互作用によって、水溶液中で会合しているものと推定される。
実施例６（レスベラトロールとＦＭＮの混合物の安定性）
実施例４で得られた、レスベラトロールとＦＭＮの混合粉体を透明ガラス瓶に入れ、蛍光灯下の室内において室温（２０℃）で３０日間保存してから、吸光度を測定したところ、当該混合粉体中に含まれるレスベラトロールの減少量は僅か３．６±１．５％であった。当該混合粉体を５．３５ｍｇ／ｍＬの濃度で純水に溶解させ、レスベラトロールを２．５ｍＭ及びＦＭＮを１０ｍＭ含有する水溶液を調製した。得られた水溶液を透明ガラス瓶に入れ、蛍光灯下の室内において室温（２０℃）で５日間保管してレスベラトロールの量を測定すると２５．６％の減少が認められた。一方、透明ガラス瓶の代わりに褐色ガラス瓶に入れて同様の条件で保管すると１７日後でもレスベラトロールの減少量は、僅か３．４％であった。また、前記水溶液を純水で１００倍に希釈して、レスベラトロールを０．０２５ｍＭ及びＦＭＮを０．１ｍＭ含有する水溶液を調製した。この希釈水溶液を遮光せずに２０℃で、そのまま１日間静置したところ、レスベラトロールの吸光度(３１７ｎｍ)は著しく減少し、残存するレスベラトロールの量は半分以下になった。光を遮蔽するとレスベラトロールの吸光度の減少は抑えられた。
実施例７（レスベラトロールとＦＭＮの混合水溶液への光及びｐＨの影響）
ｐＨ４の緩衝液として１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液を、ｐＨ６及びｐＨ７の緩衝液として１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を、ｐＨ８の緩衝液として４０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を、それぞれ準備した。飽和(０．１９ｍＭ)レスベラトロール水溶液０．６ｍＬに、上記ｐＨ４、６、７及び８のそれぞれの緩衝液を添加して全量３．００ｍＬにして混合して４種の水溶液を得た。また、レスベラトロール２．５ｍＭとＦＭＮ１０ｍＭを含む水溶液０．０３ｍＬにも上記それぞれの緩衝液を添加して全量３．００ｍＬにして混合して４種の水溶液を得た。こうして得られた水溶液を、石英ガラス製の測定用キュベットに入れた。得られたそれぞれの水溶液の３１７ｎｍの吸光度を２０℃で、光を照射しながら、あるいは遮光下で、１時間静置してから測定した。このときの光源は蛍光灯であり、２２５０ルーメンの蛍光灯２本の真下約２ｍの位置で容器越しに光を照射した。こうして得られた吸光度からレスベラトロール量の減少率（％）を算出した。結果を表４にまとめて示す。
Figure 0007082845000011
表４に示されるように、レスベラトロールとＦＭＮの混合粉体を水に溶解して調製した希薄水溶液中のレスベラトロールは、光に対して不安定であることがわかる。これは、ＦＭＮを含むためであると推定される。また、ｐＨが高くなると徐々に不安定になることもわかる。したがって、レスベラトロール及びＦＭＮを含んだ水溶液を保管する場合には、酸性に維持して遮光することが望ましいことがわかった。
実施例８（レスベラトロールとＦＭＮと酢酸を含む水溶液のｐＨ）
５ｍＭのレスベラトロールと２０ｍＭのＦＭＮを含む水溶液に対し、ＦＭＮのモル数に対する酢酸のモル数の比（酢酸／ＦＭＮ）が、０、０．２５、０．５、１、２、５、１０、２５、５０及び１００となるように酢酸を加えて水溶液を調製し、それらのｐＨを測定した。また、それぞれの水溶液からレスベラトロールを除いた水溶液を調製し、それらのｐＨも測定した。その結果を図６に示す。レスベラトロールとＦＭＮを含む水溶液に対し、配合する酢酸の量を調整することによって、水溶液のｐＨを所望の値に調整することができた。レスベラトロールの有無は水溶液のｐＨに大きな影響を与えなかったが、これは、スチルベン化合物（Ａ）のｐＫａの値が大きいためであると考えられる。このように、適切な量の酸を添加することによって、ｐＨを低下させてスチルベン化合物（Ａ）の安定性を確保しながら、適度な酸味の混合物を得ることができる。
参考例２（ＦＭＮと酸を含む水溶液のｐＨ）
２０ｍＭのＦＭＮ水溶液に、酸（酢酸、クエン酸、乳酸、アスコルビン酸）を、ＦＭＮのモル数に対する当該酸のモル数の比（酸／ＦＭＮ）が、０、０．２５、０．５、１、２、５、１０、２５、５０及び１００となるように加えて水溶液を調製し、そのｐＨを測定した。その結果を図７及び図８にまとめて示す。酸の種類と配合比を調整することによって、水溶液のｐＨを１．５～６の間の所望の値に調整することができる。
実施例９（混合粉体の水への溶解速度）
レスベラトロール粉体１１４ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）とＦＭＮ粉体９５７ｍｇ（２ｍｍｏｌ）を混合し、メノウ乳鉢で混和して、混合粉体１を調整した。一方、実施例４でレスベラトロールとＦＭＮの混合水溶液を乾燥して得られた混合粉体２を準備した。０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）３ｍＬに、混合粉体１と混合粉体２のいずれかの粉末約０．２ｍｇを加え、直ちにゆるやかに撹拌して３分毎に３１７、３７４及び４４５ｎｍの吸光度を測定し、３３分後まで攪拌と測定を繰り返した。３１７ｎｍがレスベラトロール由来の吸収ピークであり、３７４ｎｍと４４５ｎｍがＦＭＮ由来の吸収ピークである。３１７ｎｍの吸光度からレスベラトロールの溶解量を計算し、図９に示した。図９に示されるように、単に粉末を混合するだけでなく、あらかじめ混合水溶液を調製してから乾燥させる方が、溶解速度の大きい粉末を得ることができた。なお、レスベラトロール、ＦＭＮ及びクエン酸の混合物粉体の味は適度な酸味を有していて、レスベラトロール及びＦＭＮの混合物粉体は、ほぼ無味であった。
実施例１０（レスベラトロールの抽出）
ブドウ等から有機溶媒で抽出して乾燥して得られた粗抽出物粉末の市販品を用いた。当該粗抽出物粉末はレスベラトロールを約１０質量％含有している。粗抽出物粉末１００ｍＬに、以下に示す水溶液又は純水１０ｍＬを加え、超音波を３０分間照射して抽出した。静置した後、不溶分を遠心分離し、上清を抽出液とした。得られた抽出液を０．１Ｍクエン酸緩衝液(ｐＨ４．０)で希釈して測定した３１７ｎｍの吸光度より、レスベラトロールの溶解度を計算した。こうして得られたレスベラトロール回収率は、抽出液として純水を用いたとき９．２％、２５ｍＭのＦＭＮ水溶液を用いたとき８４％、５０体積％エタノール水溶液を用いたとき９６％であった。このことから、ＦＭＮ水溶液を用いることで有機溶媒を使用せずに水溶液として高効率で抽出できることが明らかになった。
参考例３（尿酸生成のアッセイ）
キサンチンオキシダーゼ（ＸＯ）酵素液（ＥＣ１．１．３．２２，ＧｒａｄｅＩＶ)は、シグマ・アルドリッチ社から購入した。スチルベン化合物をＤＭＳＯに溶解させて、１０ｍＭのサンプル溶液を調製した。０～２００μＭのキサンチンと、スチルベン化合物のＤＭＳＯ溶液（０～０．０３ｍＬ）を、０．１ｍＭのＥＤＴＡを含む４０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０）に加えて混合液（２．８８ｍＬ）を調製した。２５℃の当該混合液に、０．１２ｍＬのＸＯ酵素液（０．０４ｕｎｉｔｓ）を加えて反応を開始し、２９３ｎｍ（尿酸の紫外部吸収極大）の吸光度を６０秒間測定した。対照実験は、サンプル溶液をＤＭＳＯに代えて測定した。反応速度は吸光度の直線的増加から求めた。スチルベン化合物による尿酸生成反応の阻害定数Ｋｉ（μＭ）と、キサンチン濃度が２００μＭのときの５０％阻害濃度ＩＣ５０（μＭ）を求め、その結果を表５に示した。なお、スチルベン化合物による吸収が２９３ｎｍで認められるために、スチルベン化合物の濃度が０．１ｍＭ未満のときのみ、尿酸の定量が可能であった。
それぞれの測定は別々の実験で３回以上測定した。分析はSigma plot 2001 (SPSS Inc., Chicago, IL)で行った。阻害モードと速度論はSigma plot 2001に付属しているEnzyme Kinetics Module 1.1 (SPSS Inc.)で解析した。これらの方法は、以下の参考例４～６でも同様に採用した。
Figure 0007082845000012
表５に示されるように、レスベラトロール、レスベラトロール－４’－グリコシド、ピセアタンノール、ラポンチゲニン及びイソラポンチゲニンは、阻害定数Ｋｉのみが算出されて他の阻害定数が算出されなかったので、競合的阻害によって、尿酸生成を阻害すると分析される。この競合的阻害は、キサンチンの酸化反応の速度が遅く、酸素の還元反応が早いことから予想されることである。ＩＣ５０の値からみて、これらのうちラポンチゲニンが、特に強い尿酸生成阻害活性を有することがわかった。
参考例４（スーパーオキサイド生成のアッセイ）
０～２００μＭのキサンチン、０．５％ウシ血清アルブミン０．０３ｍＬ、２．５ｍＭニトロブルーテトラゾリウム０．０３ｍＬ及びスチルベン化合物１０ｍＭをＤＭＳＯに溶かしたサンプル溶液０．０６ｍＬを、０．１ｍＭのＥＤＴＡを含む４０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０）に加えて、混合液（２．８８ｍＬ）を調製した。２５℃の当該混合液に、０．１２ｍＬのＸＯ酵素液（０．０４ｕｎｉｔｓ）を加えて反応を開始し、５６０ｎｍの吸光度を６０秒間測定した。対照実験は、サンプル溶液をＤＭＳＯに代えて測定した。反応速度は吸光度の直線的増加から求めた。上記反応は、不安定なスーパーオキサイド（Ｏ２ －・）を検出するためにｐＨ１０の条件下で行った。スーパーオキサイドは、ニトロブルーテトラゾニウムを還元してブルーホルマザン（吸収極大５６０ｎｍ）に変換するので、これを定量検出した。キサンチンの濃度を０～２００μＭに変化させた時、スーパーオキサイドの生成はスチルベン化合物によって抑制された。その結果を表６にまとめて示す。
Figure 0007082845000013
表６に示されるように、ピセアタンノールを除くスチルベン化合物は、阻害定数Ｋｉのみが算出されて他の阻害定数が算出されなかったので、競合阻害によって、スーパーオキサイド生成を阻害したと分析される。一方、さらに阻害定数Ｋ’ｉが算出されたピセアタンノールは、混合型（mixed）阻害によってスーパーオキサイド生成を阻害したと分析される。ＩＣ５０の値からみて、これらのうちピセアタンノールが、特に強いスーパーオキサイド生成阻害活性を有することがわかった。これらのスチルベン化合物が尿酸生成より、スーパーオキサイド生成をより強く抑制することから、スチルベン化合物がキサンチンオキシダーゼ（ＸＯ）内のＦＡＤサイトに結合することが示唆されている。
参考例５（ＤＰＰＨスカベンジング活性）
安定遊離ラジカルであるＤＰＰＨ（２，２－ジフェニル－１－ピクリルヒドラジル）をスカベンジする方法は、Blois, M.S. (1958). Antioxidant determinations by the use of a stable free radical. Nature, 181, 1199-1200に記載された手法である。また、ＤＰＰＨ活性は電子または水素原子の供与の性質を示すものである（Zhang, R., Kang, K.A., Piao, M.J., Lee, K.H., Jang, H.S., Park, M.J., Kim, B.J., Kim, J.S., Kim, Y.S.,Ryu, S.Y., Hyun, J.W. (2007)）。試験管に、１.０ｍＬの１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）、１．８７ｍＬエタノールと３ｍＭのＤＰＰＨのエタノール溶液０．１ｍＬを入れてから、スチルベン化合物１０ｍＭをＤＭＳＯに溶かしたサンプル溶液０．０３ｍＬを加え、２５℃で２０分間反応させた。その間、５１７ｎｍの吸光度（ＤＰＰＨ、ε＝８．３２×１０３）を測定した。対照実験は、サンプル溶液をＤＭＳＯに変えて測定した。２０分間の吸光度の減少を測定し、スチルベン化合物１分子がスカベンジングするＤＰＰＨの分子数を算出し、スカベンジング活性とした。スカベンジング反応の初速度はサンプルの添加後の吸光度の減少から求めた(Masuoka, N., Isobe, T., Kubo, I. (2006). Antioxidants from Rabdosia japonica. Phytother. Res., 30(3), 206-213)。結果を表７にまとめて示す。
Figure 0007082845000014
表７に示されるように、レスベラトロールとその配糖体、及びプテロスチルベンは、アルケニルフェノールのように弱いスカベンジング活性を示した。一方、ピセアタンノール、ラポンチゲニン及びイソラポンチゲニンは、同程度の強い活性を示した。しかし、これらの化合物のスカベンジング活性の初速度を測定すると、ピセアタンノールの初速度が他の２つの化合物より速かった。このことは、ピセアタンノールがＸＯ分子を還元できることを示唆している（Hille, R., & Massey, V. (1981) Studies on the oxidative half-reaction of xanthine oxidase. J. Biol. Chem. 256, 9090-9095及びMasuoka, N., Kubo, I (2018) Characterization of the xanthine oxidase inhibitory activity of alk(en)yl phenols and related compounds. Phytochemistry (2018) 155, 100-106を参照）。なお、酸化防止効果を有する食品添加剤の没食子酸ドデシルのＤＰＰＨスカベンジング活性は７．３２±０．０４である。
参考例６（スーパーオキサイドスカベンジング活性）
スーパーオキサイド（Ｏ２ －・）はＰＭＳ－ＮＡＤＨシステム（Nishikimi, M., Rao, N.A., Yagi, K. (1972). The occurrence of superoxide anion in the reaction of reduced phenazine methosulfate and molecular oxygen. Biochem. Biophys. Res. Commun. 46,849-854）で非酵素的に発生させた。０．１ｍＭのＥＤＴＡを含む４０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０）２．８２ｍＬ、０．５％ウシ血清アルブミン水溶液０．０３ｍＬ、２．５ｍＭニトロブルーテトラゾリウム水溶液０．０３ｍＬ、スチルベン化合物１０ｍＭをＤＭＳＯに溶かしたサンプル溶液０．０６ｍＬ、及び７．８ｍＭのＮＡＤＨ水溶液０．０３ｍＬの混合液（２．９７ｍＬ）を調製した。２５℃の当該混合液に、ＰＭＳ（フェナジンメトサルフェート）の１１５μＭ水溶液０．０３ｍＬを加え反応を開始させ、５６０ｎｍの吸光度を６０秒間測定した。スーパーオキサイドはスチルベン化合物との反応でスカベンジング（消去）される。未反応のスーパーオキシドラジカルがニトロブルーテトラゾリウムと反応して青色(ホルマザン)になるので、それを定量した。対照実験は、サンプル溶液をＤＭＳＯに変えて測定した。反応速度は吸光度の直線的増加から求め、スカベンジング活性は次式から求めた。スチルベン化合物のスカベンジング活性を図１０に示す。
Scavenging activity (%) = [1 - (rate of sample) / (rate of control)] X 100
このラジカルスカベンジング反応では、スーパーオキサイド（Ｏ２ －・）とスチルベン化合物が１：１のモル比で反応する。これらのスチルベン化合物の中で、ピセアタンノールの活性は異常に高い。カフェ酸（ＩＣ５０＝５１μＭ）や没食子酸（ＩＣ５０＝２９μＭ）と比べても、ピセアタンノールのＩＣ５０値(９．０±２．０μＭ)は明らかに小さく、ピセアタンノールが強いスカベンジャーであることが示された。このスカベンジング活性はピセアタンノールの長い共役エンジオール構造によるピセアタンノールラジカルのより強い安定化が関係しているかも知れない。

Claims (14)

  1. 下記式（１）で表される化合物又はその配糖体若しくは多量体であるスチルベン化合物（Ａ）０．３～２００ｍＭ、及び下記式（２）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩であるフラビン誘導体（Ｂ）０．３～２００ｍＭが溶解した水溶液であって；前記配糖体はグルコース１分子が結合したグルコシドであり、かつ前記多量体は脱水素二量体である水溶液。
    Figure 0007082845000015
     ［式（１）中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子又はメチル基であり、Ｘは、水素原子、ヒドロキシ基又はメトキシ基である。］
    Figure 0007082845000016
     ［式（２）中、ｎは、１又は２である。ｎが１のとき、Ｙは水素原子である。ｎが２のとき、Ｙは下記式（３）で表される基である。式（３）中、＊が付された直線は単結合である。］
    Figure 0007082845000017
  2. 前記スチルベン化合物（Ａ）が、レスベラトロール、ピセアタンノール、ラポンチゲニン、イソラポンチゲニン、プテロスチルベン及びピノスチルベン並びにそれらの配糖体及び多量体からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１に記載の水溶液。
  3. スチルベン化合物（Ａ）に対するフラビン誘導体（Ｂ）のモル比（Ｂ／Ａ）が０．５～５０である請求項１又は２に記載の水溶液。
  4. ｐＨが１．５～６である請求項１～３のいずれかに記載の水溶液。
  5. さらに、炭素数２～６のカルボン酸並びにアスコルビン酸及びその配糖体から選択されるｐＨ調整剤（Ｃ）を含む、請求項１～４のいずれかに記載の水溶液。
  6. 溶媒中のエタノールの濃度が２０体積％未満である、請求項１～５のいずれかに記載の水溶液。
  7. 請求項１～６のいずれかに記載の水溶液からなる、キサンチンオキシダーゼにより触媒されるスーパーオキサイド生成の阻害剤。
  8. 請求項１～６に記載の水溶液からなる飲料又は化粧料。
  9. スチルベン化合物（Ａ）の水に対する溶解度を向上させるための、フラビン誘導体（Ｂ）からなる水溶性向上剤であって；
    スチルベン化合物（Ａ）が、下記式（１）で表される化合物又はその配糖体若しくは多量体であって、該配糖体はグルコース１分子が結合したグルコシドであり、該多量体は脱水素二量体であり、かつ
    フラビン誘導体（Ｂ）が、下記式（２）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩である、水溶性向上剤。
    Figure 0007082845000018
     ［式（１）中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子又はメチル基であり、Ｘは、水素原子、ヒドロキシ基又はメトキシ基である。］
    Figure 0007082845000019
     ［式（２）中、ｎは、１又は２である。ｎが１のとき、Ｙは水素原子である。ｎが２のとき、Ｙは下記式（３）で表される基である。式（３）中、＊が付された直線は単結合である。］
    Figure 0007082845000020
  10. 下記式（１）で表される化合物又はその配糖体若しくは多量体であるスチルベン化合物（Ａ）、及び下記式（２）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩であるフラビン誘導体（Ｂ）を含む組成物であって；
    前記配糖体はグルコース１分子が結合したグルコシドであり、前記多量体は脱水素二量体であり、
    スチルベン化合物（Ａ）に対するフラビン誘導体（Ｂ）のモル比（Ｂ／Ａ）が０．５～５０であり、かつ
    粉体、顆粒、タブレット又はペーストから選択される形態の組成物。
    Figure 0007082845000021
     ［式（１）中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子又はメチル基であり、Ｘは、水素原子、ヒドロキシ基又はメトキシ基である。］
    Figure 0007082845000022
     ［式（２）中、ｎは、１又は２である。ｎが１のとき、Ｙは水素原子である。ｎが２のとき、Ｙは下記式（３）で表される基である。式（３）中、＊が付された直線は単結合である。］
    Figure 0007082845000023
  11. さらに、炭素数２～６のカルボン酸並びにアスコルビン酸及びその配糖体から選択されるｐＨ調整剤（Ｃ）を含む、請求項１０に記載の組成物。
  12. 請求項１０又は１１に記載の組成物からなる、キサンチンオキシダーゼにより触媒されるスーパーオキサイド生成の阻害剤。
  13. スチルベン化合物（Ａ）とフラビン誘導体（Ｂ）が溶解した水溶液を調製してから水分を除去する、請求項１０～１２のいずれかに記載の組成物の製造方法。
  14. 下記式（１）で表される化合物又はその配糖体若しくは多量体であるスチルベン化合物（Ａ）を含む植物原料、又は該植物原料から有機溶媒で抽出された粗抽出物と、下記式（２）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩であるフラビン誘導体（Ｂ）が溶解した水溶液とを接触させて、前記植物原料又は粗抽出物から前記水溶液にスチルベン化合物（Ａ）を抽出する、スチルベン化合物（Ａ）の抽出方法であって；前記配糖体はグルコース１分子が結合したグルコシドであり、かつ前記多量体は脱水素二量体である、抽出方法。
    Figure 0007082845000024
     ［式（１）中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子又はメチル基であり、Ｘは、水素原子、ヒドロキシ基又はメトキシ基である。］
    Figure 0007082845000025
     ［式（２）中、ｎは、１又は２である。ｎが１のとき、Ｙは水素原子である。ｎが２のとき、Ｙは下記式（３）で表される基である。式（３）中、＊が付された直線は単結合である。］
    Figure 0007082845000026
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