KR100844083B1

KR100844083B1 - 난황항체 보존액

Info

Publication number: KR100844083B1
Application number: KR1020070077211A
Authority: KR
Inventors: 정홍걸; 이선재
Original assignee: (주)애드바이오텍
Priority date: 2007-07-31
Filing date: 2007-07-31
Publication date: 2008-07-04

Abstract

본 발명은 난황항체, 올리고당 및 두충엽과 상엽의 혼합 추출물을 포함하고, 난황항체의 갈변화를 방지할 수 있는 보존액에 관한 것이다. 본 발명의 난황항체 보존액은 최종 중량에 대하여 5 내지 10%(w/w)의 두충엽과 상엽의 혼합 추출물, 40 내지 70%(w/w)의 올리고당 및 20 내지 55%(w/w)의 물을 포함한다. 본 발명의 난황항체 보존액은 장기간 난황항체의 갈변화를 효과적으로 방지할 수 있으므로, 난황항체를 이용한 보다 효과적인 질병의 치료 및 예방에 널리 활용될 수 있을 것이다.

난황항체, 올리고당, 두충엽 추출물, 상엽 추출물, 갈변화

Description

난황항체 보존액{A Solution for Preservation of IgY}

본 발명은 난황항체 보존액에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 난황항체, 올리고당 및 두충엽과 상엽의 혼합 추출물을 포함하고, 난황항체의 갈변화를 방지할 수 있는 보존액에 관한 것이다.

난황항체(immunoglobulin yolk, IgY)는 조류의 면역체계에 의하여 형성되는 특이적인 항체로서, 조류가 능동면역으로 획득한 면역항체 중의 일부가 난황에 축적된 형태의 항체를 의미한다. 일반적으로, 포유동물로부터 특정한 항원에 대한 항체를 수득하기 위하여는, 포유동물에 항원을 투여하여 면역시킨 후, 일정한 기간이 경과한 후에, 상기 포유동물로부터 채혈하고, 채혈된 혈액을 정제하여, 항체를 수득한다. 이처럼 채혈된 혈액은 매우 적은 량의 항체를 포함하기 때문에, 항체의 수득율을 향상시기키 위하여, 항원이 투여된 포유동물로부터 모든 혈액을 채혈하는 것이 일반적이다. 이에 반하여, 닭과 같은 조류로부터 특정한 항원에 대한 항체를 수득하기 위하여는, 상술한 바와 같이 채혈하는 방법을 사용할 수도 있고, 난황항 체의 형태로 항체를 수득할 수도 있다. 난황항체의 형태로 항체를 수득하기 위하여는, 조류에 항원을 투여하여 면역시킨 후, 일정한 기간이 경과한 후에, 상기 조류로부터 채란하고, 채란된 알의 난황을 정제하여 항체를 수득한다. 이처럼 난황항체는 조류의 알을 통하여 지속적으로 수득할 수 있기 때문에, 난황항체의 형태로 항체를 수득하는 방법을 사용할 경우, 보다 경제적이면서도 효과적으로 항체를 수득할 수 있어, 많은 관심이 집중되고 있는 실정이다.

그러나, 상술한 방법으로 수득한 난황항체는 혈액으로부터 수득한 항체에 비하여, 낮은 역가를 나타내기 때문에, 난황항체는 높은 민감도를 필요로 하지 않으면서도, 상대적으로 많은 량을 필요로 하는 가축용 치료 및 예방제로서 활용되고 있는 실정이다.

이러한 난황항체를 이용하는 방법으로는, 난황항체를 포함하는 생계란을 직접 복용하거나 또는 난황만을 추출하여 분무건조 또는 동결건조시키는 방법이 사용되어 왔다. 또한, 특수한 목적으로 사용하기 위하여, 프로판올, 아세톤 등의 유기용매를 이용하여 난황항체를 높은 순도로 추출하고 정제하는 방법이 사용되기도 하였다. 그러나, 생계란을 직접 복용할 경우에는 보존기간이 제한되고, 분무건조 또는 동결건조방법을 이용할 경우에는 난황항체의 안정성이 저하되어, 항체의 역가가 현저히 저하되며, 유기용매를 이용하여 추출할 경우에는 식용으로서 사용하지 못한다는 단점이 있었기 때문에, 이러한 단점을 극복하고자 다양한 연구가 진행되어 왔다.

예를 들면, 나가시모(Nagashimo H.)는 난황항체를 50% 수크로스 용액에 보존 할 경우, 고온에서도 난황항체의 활성을 유지시킬 수 있다고 보고하였고(참조: Nagashimo H., J. Food Science, 59(4):763, 2003), 대한민국 특허공개 제 2004-74145호에는 난황항체를 포함하는 난황을 카라기난이 용해된 알칼리성 이온수에 혼합하고, 정치하여 난황항체를 포함하는 수용성 분획을 수득하는 방법이 개시되어 있으며, 대한민국 특허공개 제 2004-85831호에는 특이면역난황항체(IgY)를 함유한 계란을 난황항체가 변성되지 않은 70℃이하의 온도로 열처리하여, 가공하는 방법이 개시되어 있고, 대한민국 특허등록 제 606637호에는 난황항체의 수용액에 히알루론산 및 폴리비닐피롤리돈을 첨가하고, 건조시키는 단계를 포함하는 난황항체의 보존방법이 개시되어 있다.

이러한 방법을 이용하여 수득하거나 가공된 난황항체는 모두 장기간 난황항체의 역가를 유지시킬 수 있었으나, 제조된 직후에 갈변화되어 항체의 역가가 저하되는 현상이 나타났다. 이러한 난황항체의 갈변화는 난황항체의 아미노산과 보존액에 포함된 당류와의 반응에 의하여 발생되는 것이며, 상기 갈변화로 인하여 난황항체의 역가가 일정비율 감소하게 되나, 이를 방지하는 연구는 전혀 수행되지 않고 있다.

따라서, 난황항체의 보존시 갈변화를 방지하기 위한 방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.

이에, 본 발명자는 난황항체의 보존시 갈변화를 방지하기 위한 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 올리고당, 두충엽 추출물 및 상엽 추출물을 포함하는 보존액을 사용할 경우, 난황항체의 갈변화를 장기간 방지할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 난황항체의 갈변화를 방지할 수 있는 보존액을 제공하는 것이다.

본 발명자는 난황항체의 보존시 갈변화를 방지하기 위한 방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하던 중, 갈변화의 원인이 난황항체의 보존액에 포함된 당류에 있음에 주목하게 되었다. 보존액에 포함된 글루코스, 프럭토스 등의 단당류와 난황항체에 포함된 아미노산이 반응하여, 난황항체에 갈변화를 초래하므로, 난황항체의 아미노산에 대한 반응성이 낮은 올리고당으로 상기 단당류를 대체할 경우, 난황항체의 갈변화를 방지할 수 있을 것으로 예상하였다.

이에, 다양한 올리고당을 포함하는 보존액을 대상으로 하여 난황항체의 갈변화 억제정도를 측정한 결과, 단당류를 포함하는 보존액에 비하여 40 내지 70%(w/w)의 올리고당을 포함하는 대부분의 보존액이 난황항체의 갈변화를 억제할 수 있으나, 억제할 수 있는 시간이 짧아, 효과적이지 못함을 알 수 있었다. 이에, 난황항체의 갈변화를 억제할 수 있는 시간을 증대시키기 위하여, 통상적으로 갈변화를 억 제한다고 알려진 비타민 C를 비롯한 각종 천연의 항산화 물질을 대상으로 하여 검색하였다. 그 결과, 두충엽 추출물과 상엽 추출물이 난황항체의 갈변화를 억제할 수 있는 시간을 증대시킬 수 있음을 확인하였다. 특히, 두충엽 추출물과 상엽 추출물이 1:1 내지 4:1(w/w)로 혼합된 혼합 추출물을 5 내지 10%(w/w)로 포함하고, 40 내지 70%(w/w)의 올리고당을 포함하는, 난황항체 보존액 65 내지 95%(w/w) 및 난황항체 5 내지 35%(w/w)를 혼합할 경우, 난황항체의 갈변화를 장기간 방지할 수 있음을 확인하였다.

그러나, 올리고당이 아닌 단당류를 포함하는 보존액 또는 당류를 포함하지 않는 보존액에는 상기 두충엽 추출물과 상엽 추출물을 다량으로 가하여도, 난황항체의 갈변화를 방지할 수 없었으므로, 상기 두충엽 추출물과 상엽 추출물은 올리고당의 갈변화 방지효과를 상승시키는 역할을 수행할 뿐, 독자적으로 난황항체의 갈변화를 방지할 수는 없다는 점을 알 수 있었다.

결국, 본 발명의 난황항체 보존액은 최종 중량에 대하여 5 내지 10%(w/w)의 두충엽과 상엽의 혼합 추출물, 40 내지 70%(w/w)의 올리고당 및 20 내지 55%(w/w)의 물을 포함한다. 이때. 두충엽과 상엽의 혼합 추출물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 두충엽 추출물과 상엽 추출물이 1:1 내지 4:1(w/w)로 혼합된 혼합물을 사용함이 바람직하고, 두충엽 추출물과 상엽 추출물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 두충엽과 상엽의 에탄올 추출물을 사용함이 바람직하며, 올리고당은 특별히 이에 제한되지 않으나, 갈락토올리고당, 프럭토올리고당, 말토올리고당, 이소말토올리고 당 등을 사용함이 바람직하다.

아울러, 상기 난황항체 보존액 65 내지 95%(w/w) 및 난황항체 5 내지 35%(w/w)를 혼합하여, 이를 사료첨가제로 사용하는 것도 가능하다.

본 발명의 난황항체 보존액은 장기간 난황항체의 갈변화를 효과적으로 방지할 수 있으므로, 난황항체를 이용한 보다 효과적인 질병의 치료 및 예방에 널리 활용될 수 있을 것이다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 올리고당을 포함하는 보존액의 난황항체 갈변화 억제효과

실시예 1-1: 난황항체의 제조

닭에서 병원성을 유발하는 살모넬라 갈리나륨(Salmonella gallinarum)을 사용하여 면역형성용 항원을 제조하고, 이를 닭에 주사하여 특이적인 난황항체를 제조하였다.

먼저, 살모넬라 갈리나륨균을 5㎖의 트립티카아제 소이 액상배지(Trypticase soy broth, pH 7.4)(Sigma Chem. Co., USA)에 4시간 동안 배양하고, 이를 다시 500㎖의 트립티카아제 소이 액상배지에 접종하여 37℃의 호기조건으로 18시간동안 배양하였다. 상기 배양액에 0.3%(v/v)가 되도록 포르말린을 가하여 실온에서 48시간 동안 방치하여, 사균액을 수득하였다. 상기 사균액을 5,000rpm에서 20분간 원심분리하여 균체를 수득하고, 수득한 균체를 PBS로 세척한 다음, 0.3%(v/v) 포르말린을 포함하는 PBS에 현탁시켜서, O.D.₄₁₀ 값이 0.5 내지 1.5가 되도록 조절하였다.

상기 현탁액을 동일부피로 혼합한 혼합액과 유화제인 ISA70(Sepic, 프랑스)를 3:7(w/w)로 혼합하고, 균질기를 적용하여, 30,000rpm에서 20분간 균질화시켜서 면역형성제를 수득하였다.

전기 수득한 면역형성제를 20주령의 산란계의 흉근에 1㎖씩 접종하여 면역반응을 유도시키고, 산란계의 스트레스를 감소시키기 위하여, 스트레스 감소제인 놉스르레스(DIASHAM RESOURCES, Singapore)가 첨가된 사료를 접종전 3일동안 및 접종후 7일동안 경구투여하였다.

상기 면역반응을 유도시킨 산란계에서 계란을 채란하고, 채란된 계란으로부터 난황을 수득한 다음, 난황을 3배 부피의 PBS에 현탁시키고, 13,000rpm으로 1시간 동안 원심분리하여 상층액인 난황분획을 수득하였다.

상기 난황분획에 특이적인 항체가 포함되었는지의 여부를 효소면역분석 법(ELISA)을 수행하여 확인하였다.

구체적으로, 상기 면역항원으로 사용된 사균된 균주를 초음파처리하여 분쇄하고, 상기 분쇄물을 흡착용 완충용액(1.59g/L sodium carbonate, 2.93g/L sodium bicarbonate, 0.20g/L sodium azide, pH 9.6)으로 희석하여 효소면역분석용 마이크로플레이트에 가하고, 4℃에서 16시간 반응시켜서, 상기 항원을 플레이트에 흡착시켰다. 상기 항원이 흡착된 플레이트에 상기 수득한 난황분획을 가하고 37℃에서 1시간동안 반응시킨 후, PBS로 3회 세척하였다. 이어, 페록시다아제가 포함되어있는 닭의 면역항체(IgG)에 대한 항체(anti-chicken IgG HRP labeled)(BioRad Co., Ltd., USA)인 2차 항체를 가하고 37℃에서 1시간동안 반응시킨 다음, 다시 PBS로 3회 세척하였다. 그런 다음, 발색기질인 TMB를 가하고, 3분동안 반응시킨 후, 0.25몰 황산을 가하여 반응을 정지시키고, 분광광도계를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여, 항체가 형성된 난황을 선별하였다.

상기 선별된 난황을 포함하는 계란을 수득할 수 있는 산란계로부터 계란을 채란한 다음, 채란된 계란으로부터 난황을 수득하고, 이를 분무건조시켜서, 분말형태의 특이적 난황항체를 제조하였다.

실시예 1-2: 올리고당을 포함하는 보존액에서의 난황항체의 갈변화 및 역가측정

나가시모(Nagashimo H.)는 난황항체를 50% 수크로스 용액에 보존할 경우, 고 온에서도 난황항체의 활성을 유지시킬 수 있다고 보고하였으므로(참조: Nagashimo H., J. Food Science, 59(4):763, 2003), 수크로스 또는 다양한 올리고당을 포함하는 보존액에서 난황항체의 갈변화 정도 및 역가를 측정하였다.

우선, 상기 실시예 1-1에서 제조한 난황항체 1g을, 70%(w/w) 수크로스 및 30%(w/w) 물을 포함하는 보존액 10㎖, 70%(w/w) 갈락토올리고당 및 30%(w/w) 물을 포함하는 보존액 10㎖, 60%(w/w) 프럭토올리고당 및 40%(w/w) 물을 포함하는 보존액 10㎖, 50%(w/w) 말토올리고당 및 50%(w/w) 물을 포함하는 보존액 10㎖ 또는 40%(w/w) 이소말토올리고당 및 60%(w/w) 물을 포함하는 보존액 10㎖과 각각 혼합하였다. 다음으로, 상기 혼합물을 25℃에서 180일간 보존하면서, 30일 간격으로 각 보존액을 대상으로 색도계를 이용한 색도색차 분석을 수행하여 L값을 측정함으로써, 난황항체의 갈변화 정도를 간접적으로 산출하였다(참조: 표 1a).

보존액에서 시간의 경과에 따른 난황항체의 갈변화 정도(단위: L값)

보존액에 포함된 당류	0일	30일	60일	90일	120일	150일	180일
수크로스 갈락토올리고당 프럭토올리고당 말토올리고당 이소말토올리고당	43 45 44 43 47	68 53 52 54 55	75 59 59 60 61	82 65 66 66 68	82 70 70 71 71	82 75 74 75 73	82 82 82 82 82

상기 표 1a에서 보듯이, 수크로스를 포함하는 보존액 보다도 올리고당을 포함하는 보존액에서 난황항체의 갈변화 정도가 감소함을 알 수 있었다. 구체적으로, 수크로스를 포함하는 보존액은 30일동안 58%, 60일동안 74%, 90일동안 90% 정도 갈변화가 증가되었으나, 올리고당을 포함하는 보존액은 30일동안 약 20%, 60일동안 약 33%, 90일동안 약 48%, 120일동안 약 57%, 150일동안 약 66% 및 180일동안 약 90% 정도 갈변화가 증가되었으므로, 수크로스를 포함하는 보존액 보다도 올리고당을 포함하는 보존액에서 난황항체의 갈변화 정도가 감소함을 알 수 있었다.

또한, 상기 30일 간격으로 각 보존액을 대상으로 난황항체의 역가를 다음과 같이 측정하였다: 즉, 상기 실시예 1-1에서 사용한 항원이 흡착된 플레이트에 상기 각 보존액을 각각 가하고, 37℃에서 1시간동안 반응시킨 후, PBS로 3회 세척하였다. 이어, 페록시다아제가 포함되어있는 닭의 면역항체(IgG)에 대한 항체인 2차 항체를 가하고 37℃에서 1시간동안 반응시킨 다음, 다시 PBS로 3회 세척하였다. 그런 다음, 발색기질인 TMB를 가하고, 3분동안 반응시킨 후, 0.25몰 황산을 가하여 반응을 정지시키고, 분광광도계를 이용하여 측정한 450nm에서 흡광도를 각 보존액에 포함된 항체의 역가로 간주하였다(참조: 표 1b).

보존액에서 시간의 경과에 따른 난황항체의 역가변화(단위: O.D.450)

보존액에 포함된 당류	0일	30일	60일	90일	120일	150일	180일
수크로스 갈락토올리고당 프럭토올리고당 말토올리고당 이소말토올리고당	2.37 2.36 2.37 2.38 2.37	1.54 2.01 2.13 2.08 2.06	1.07 1.80 1.75 1.82 1.71	0.52 1.53 1.62 1.57 1.59	0.51 1.32 1.45 1.38 1.42	0.51 0.98 1.01 1.06 0.99	0.50 0.74 0.75 0.78 0.74

상기 표 1b에서 보듯이, 갈변화의 정도가 증가될 수록, 이에 반비례하여 난황항체의 역가가 감소됨을 알 수 있었다. 또한, 갈변화의 정도가 더 이상 증가하지 않더라도 난황항체의 역가가 완전히 소멸되지는 않았으나, 최초 역가에 대하여 약 31% 정도만이 유지되었으므로, 상품성이 현저하게 저하됨을 알 수 있었는 바, 올리고당을 포함하는 보존액의 난황항체 갈변화 방지기간을 증대시킬 필요가 있었다.

실시예 1-3: 난황항체의 갈변화를 억제할 수 있는 첨가물의 검색

상기 실시예 1-2에서 기재한 바와 같이, 올리고당을 포함하는 보존액의 장점을 증대시키고자, 상기 보존액에 첨가하여 난황항체의 갈변화 억제기간을 증대시킬 수 있는 물질을 검색하였다. 이때, 검색대상은 안전성이 입증되고, 통상적으로 갈변화와 관련성이 있다고 알려진 항산화활성을 갖는 비타민류 및 천연식품의 에탄올 추출물을 대상으로 하였다.

구체적으로, 상기 실시예 1-1에서 제조한 난황항체 1g을, 보존액의 최종중량에 대하여 45%(w/w)의 갈락토올리고당, 50%(w/w)의 물 및 5%(w/w)의 다양한 첨가물(비타민 C, 비타민 E, 복숭아 추출물, 자두 추출물, 포도 추출물, 오렌지 추출물, 망고 추출물, 파파야 추출물, 녹차잎 추출물, 상엽 추출물, 두충엽 추출물, 마늘 추출물, 양파 추출물 또는 고추 추출물)을 포함하는 보존액 10㎖과 혼합하고, 상기 혼합물을 25℃에서 540일간 보존하면서, 90일 간격으로 각 보존액을 대상으로 색도계를 이용한 색도색차 분석을 수행하여 L값을 측정함으로써, 난황항체의 갈변화 정도를 간접적으로 산출하였다(참조: 표 2). 이때, 상기 각 추출물은 세절한 각 원료를 에탄올에 침지하고, 45℃에서 3시간 동안 추출한 다음, 여과하여 고형분을 제거하고, 동결건조하여 수득하였다. 또한, 대조군으로는 추출물이 첨가되지 않은 보존액과 혼합한 것을 사용하였다.

각종 첨가물을 포함하는 보존액에서 시간의 경과에 따른 난황항체의 갈변화 정도(단위: L값)

보존액에 포함된 첨가물	0일	90일	180일	270일	360일	450일	540일
대조군 비타민 C 비타민 E 복숭아 추출물 자두 추출물 포도 추출물 오렌지 추출물 망고 추출물 파파야 추출물 녹차 추출물 상엽 추출물 두충엽 추출물 마늘 추출물 양파 추출물 고추 추출물	45 45 45 45 45 45 45 45 45 45 45 45 45 45 45	65 64 66 64 62 67 68 66 69 70 42 37 65 64 62	82 83 84 82 85 84 83 83 84 85 67 59 87 86 85	82 83 84 82 85 84 83 83 84 85 81 83 87 86 85	82 83 84 82 85 84 83 83 84 85 84 84 87 86 85	82 83 84 82 85 84 83 83 84 85 84 84 87 86 85	82 83 84 82 85 84 83 83 84 85 84 84 87 86 85

상기 표 2에서 보듯이, 대부분의 첨가물은 대조군과 유사한 수준의 갈변화 정도를 나타내었으나, 두충엽 추출물과 상엽 추출물은 대조군 보다 갈변화 정도가 감소됨을 나타내었다.

따라서, 난황항체의 갈변화 억제기간을 증대시키기 위하여는, 올리고당을 포함하는 보존액에 두충엽 추출물과 상엽 추출물을 첨가함이 바람직함을 알 수 있었다.

이에, 두충엽 추출물과 상엽 추출물의 혼합물이 난황항체의 갈변화 억제기간을 보다 증대시킬 수 있는지를 확인하기 위하여, 상기 두충엽 추출물과 상엽 추출물을 단독으로 또는 혼합하여 첨가하는 것을 제외하고는, 상술한 바와 동일한 방법으로 난황항체의 갈변화 정도를 산출하였다(참조: 표 3).

상엽 추출물 및/또는 두충엽 추출물을 포함하는 보존액에서 시간의 경과에 따른 난황항체의 갈변화 정도(단위: L값)

보존액에 포함된 첨가물	0일	90일	180일	270일	360일	450일	540일
대조군 상엽 추출물 두충엽 추출물 상엽 및 두충엽 혼합추출물	45 45 45 45	65 42 37 28	82 67 59 36	82 81 83 59	82 84 84 82	82 84 84 82	82 84 84 82

상기 표 3에서 보듯이, 두충엽 추출물과 상엽 추출물이 각각 첨가된 보존액은 난황항체의 갈변화 억제기간을 증대시킬 수 있고, 상기 두충엽 추출물과 상엽 추출물의 혼합물이 첨가된 보존액은 난황항체의 갈변화 억제기간을 더욱 증대시킬 수 있음을 확인하였다.

따라서, 난황항체의 갈변화 억제기간을 증대시키기 위하여는, 올리고당을 포함하는 보존액에 두충엽 추출물과 상엽 추출물의 혼합물을 첨가함이 바람직함을 알 수 있었다.

실시예 1-4: 보존액에 첨가되는 두충엽 추출물과 상엽 추출물의 혼합비 결정

상기 실시예 1-3에서 보듯이, 난황항체의 갈변화 억제기간을 증대시키기 위하여는, 올리고당을 포함하는 보존액에 두충엽 추출물과 상엽 추출물의 혼합물을 첨가함이 바람직함을 알 수 있었으므로, 난황항체의 갈변화 억제기간을 효과적으로 증대시킬 수 있는 두충엽 추출물과 상엽 추출물의 혼합비를 결정하고자 하였다.

상기 실시예 1-3에서 수득한 두충엽 추출물과 상엽 추출물을 0:10 내지 10:0(w/w)으로 혼합한 각각의 혼합물을 보존액의 최종 중량에 대하여 5%(w/w)로 포함하고, 270일동안 보존하여 L값을 측정하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1-3과 동일한 방법으로 난황항체의 갈변화 정도를 산출하였다(참조: 표 4).

두충엽 추출물과 상엽 추출물의 혼합물을 포함하는 보존액에서 두충엽 추출물과 상엽 추출물의 혼합비에 따른 난황항체의 갈변화 정도(단위: L값)

두충엽 추출물과 상엽 추출물의 혼합비(w/w)	갈변화 정도
0:10 1:9 2:8 3:7 4:6 5:5 6:4 7:3 8:2 9:1 10:0	81 78 76 74 71 59 50 48 57 75 83

상기 표 4에서 보듯이, 두충엽 추출물과 상엽추출물의 혼합비가 5:5 내지 8:2(w/w)인 혼합물이 첨가된 보존액은 그 외의 비율로 혼합된 혼합물이 첨가된 보존액 보다도 난황항체의 갈변화 정도가 현저히 감소됨을 알 수 있었다.

따라서, 난황항체의 갈변화 억제기간을 보다 효과적으로 증대시키기 위하여는, 올리고당을 포함하는 보존액에 두충엽 추출물과 상엽 추출물이 5:5 내지 8:2(w/w), 즉 1:1 내지 4:1(w/w)로 혼합된 혼합물을 첨가함이 바람직함을 알 수 있었다.

실시예 1-5: 보존액에 첨가되는 두충엽과 상엽의 혼합추출물의 함량결정

상기 실시예 1-4에서 보듯이, 난황항체의 갈변화 억제기간을 보다 효과적으로 증대시키기 위하여는, 올리고당을 포함하는 보존액에 두충엽 추출물과 상엽 추출물이 1:1 내지 4:1(w/w)로 혼합된 혼합물을 첨가함이 바람직함을 알 수 있는 바, 보존액에 첨가되는 상기 혼합물의 최적함량을 결정하고자 하였다.

구체적으로, 갈락토올리고당, 상기 실시예 1-3에서 수득한 두충엽 추출물과 상엽 추출물을 7:3(w/w)으로 혼합한 혼합 추출물 및 물을 다양한 비율로 혼합하여 각각의 보존액을 수득하였다(참조: 표 5). 이때, 대조군으로는 혼합추출물을 포함하지 않는 보존액을 사용하였다.

각 보존액에 포함된 올리고당, 혼합 추출물 및 물의 혼합비(단위: %, w.w)

실험군	올리고당	혼합 추출물	물
대조군 실험군 1 실험군 2 실험군 3 실험군 4	45 45 45 45 45	0 5 10 15 20	55 50 45 40 35

이어, 상기 수득한 각각의 보존액 10㎖과 상기 실시예 1-1에서 제조한 난황항체 1g을 혼합하고, 25℃에서 270일간 보존한 다음, 색도계를 이용한 색도색차 분석을 수행하여 L값을 측정함으로써, 난황항체의 갈변화 정도를 간접적으로 산출하였다(참조: 표 6).

보존액에 포함된 혼합 추출물의 함량에 따른 난황항체의 갈변화 정도(단위: L값)

실험군	갈변화 정도
대조군 실험군 1 실험군 2 실험군 3 실험군 4	82 48 41 41 41

상기 표 6에서 보듯이, 5 내지 10%(w/w)의 혼합추출물을 포함하는 보존액(실험군 1 및 2)은 대조군에 비하여 갈변화 정도가 현저히 감소되었으나, 10%(w/w) 이상의 혼합추출물을 포함하는 보존액(실험군 3 및 4)은 더 이상 갈변화 정도가 감소하지 않음을 알 수 있었다.

따라서, 난황항체의 갈변화 억제기간을 보다 효과적으로 증대시키기 위하여는, 올리고당을 포함하는 보존액에 두충엽 추출물과 상엽 추출물의 혼합 추출물을 5 내지 10%(w/w)로 첨가함이 바람직함을 알 수 있었다.

실시예 1-6: 보존액에 혼합되는 난황항체의 혼합량 결정

상기 실시예 1-2 내지 1-5의 결과로부터, 두충엽 추출물과 상엽 추출물이 1:1 내지 4:1(w/w)로 혼합된 혼합 추출물을 보존액의 최종 중량에 대하여 5 내지 10%(w/w)로 포함하고, 보존액의 최종 중량에 대하여 40 내지 70%(w/w)의 올리고당을 포함하는 보존액에 난황항체를 혼합할 경우, 난황항체의 갈변화를 장기간 효과적으로 방지함을 알 수 있었는 바, 상기 보존액에 혼합할 수 있는 난황항체의 최적 혼합량을 결정하고자 하였다.

구체적으로, 40%(w/w)의 갈락토올리고당, 10%(w/w)의 상기 실시예 1-3에서 수득한 두충엽 추출물과 상엽 추출물을 5:5(w/w)로 혼합한 혼합 추출물 및 50%(w/w)의 물을 포함하는 보존액 1; 50%(w/w)의 프럭토올리고당, 10%(w/w)의 상기 실시예 1-3에서 수득한 두충엽 추출물과 상엽 추출물을 6:4(w/w)로 혼합한 혼합 추출물 및 40%(w/w)의 물을 포함하는 보존액 2; 60%(w/w)의 말토올리고당, 5%(w/w)의 상기 실시예 1-3에서 수득한 두충엽 추출물과 상엽 추출물을 7:3(w/w)으로 혼합한 혼합 추출물 및 35%(w/w)의 물을 포함하는 보존액 3; 및, 70%(w/w)의 이소말토올리고당, 5%(w/w)의 상기 실시예 1-3에서 수득한 두충엽 추출물과 상엽 추출물을 8:2(w/w)로 혼합한 혼합 추출물 및 25%(w/w)의 물을 포함하는 보존액 4를 각각 제조하였다.

이어, 상기 제조한 보존액 1 내지 4에, 보존액의 최종중량에 대하여 5 내지 50%(w/w)의 함량으로 상기 실시예 1-1에서 제조한 난황항체를 각각 혼합하고, 25℃에서 270일간 보존한 다음, 색도계를 이용한 색도색차 분석을 수행하여 L값을 측정함으로써, 난황항체의 갈변화 정도를 간접적으로 산출하였다(참조: 표 7a).

보존액에 혼합한 난황항체의 함량에 따른 난황항체의 갈변화 정도(단위: L값)

난황항체 함량(%, w/w)	보존액 1	보존액 2	보존액 3	보존액 4
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50	42 43 45 46 48 49 49 73 81 84	41 41 43 44 46 46 48 70 76 81	42 43 43 45 46 48 49 69 76 84	44 44 45 45 47 49 49 71 83 84

상기 표 7a에서 보듯이, 다소 차이는 있었으나, 모든 보존액에서 유사한 결과를 나타내었다. 즉, 난황항체를 보존액의 중량에 대하여 5 내지 35%(w/w)로 혼합한 경우에는, 난황항체의 갈변화가 방지되었으나, 40%(w/w) 이상으로 혼합한 경우에는, 난황항체의 갈변화가 방지되지 않음을 알 수 있었다.

또한, 상기 보존액에 혼합된 난황항체가 단순히 갈변화만 방지된 것인지 아니면 난황항체의 역가의 저하까지도 방지된 것인지를 확인하기 위하여, 상기 각 보존액에 혼합된 난황항체의 역가를 실시예 1-2의 방법으로 확인하였다(참조: 표 7b).

보존액에 혼합한 난황항체의 함량에 따른 난황항체의 역가변화(단위: O.D.450)

난황항체 함량(%, w/w)	보존액 1	보존액 2	보존액 3	보존액 4
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50	2.41 2.33 2.25 2.17 2.09 2.04 2.01 1.25 1.14 0.98	2.37 2.29 2.25 2.18 2.15 2.11 2.05 1.34 1.21 1.10	2.43 2.37 2.29 2.21 2.14 2.08 2.02 1.24 1.17 1.04	2.32 2.27 2.22 2.17 2.14 2.10 2.04 1.57 1.48 1.37

상기 표 7b에서 보듯이, 모든 보존액에서 유사한 정도의 결과를 나타내었는데, 난황항체를 보존액의 중량에 대하여 5 내지 35%(w/w)로 혼합한 경우에는, 난황항체의 역가가 크게 저하되지 않았으나, 40%(w/w) 이상으로 혼합한 경우에는, 난황항체의 역가가 크게 저하됨을 알 수 있었다.

따라서, 상기 보존액은 난황항체의 갈변화를 방지할 수 있을 뿐만 아니라, 난황항체의 역가가 감소되는 것까지도 방지할 수 있음을 알 수 있었다.

결국, 상기 실시예 1-2 내지 1-5의 결과를 종합하면, 두충엽 추출물과 상엽 추출물이 1:1 내지 4:1(w/w)로 혼합된 혼합 추출물을 보존액의 최종 중량에 대하여 5 내지 10%(w/w)로 포함하고, 보존액의 최종 중량에 대하여 40 내지 70%(w/w)의 올리고당을 포함하며, 나머지 중량의 물을 포함하는 보존액에, 보존액의 최종중량에 대하여 5 내지 35%(w/w)의 난황항체를 혼합할 경우, 난황항체의 갈변화를 장기간 효과적으로 방지할 수 있음을 확인하였다.

실시예 2: 난황항체를 포함하는 다양한 보존액의 제조

상기 실시예 1에서 보듯이, 두충엽 추출물과 상엽 추출물이 1:1 내지 4:1(w/w)로 혼합된 혼합물을 5 내지 10%(w/w)로 포함하고, 40 내지 70%(w/w)의 갈락토올리고당을 포함하는 보존액에 난황항체를 혼합할 경우, 난황항체의 갈변화를 장기간 효과적으로 방지할 수 있음을 확인하였는 바, 다른 올리고당을 사용할 경우에도 동일한 효과를 나타낼 수 있는지를 확인하였다.

구체적으로, 서로 다른 함량의 난황항체, 올리고당, 혼합 추출물 및 물을 포함하는 보존액을 제조하고, 이들 각각을 25℃에서 270일간 보존한 다음, 색도계를 이용한 색도색차 분석을 수행하여 L값을 측정함으로써, 난황항체의 갈변화 정도를 간접적으로 산출하였다(참조: 표 8). 이때, 난황항체는 실시예 1-1에서 수득한 것을 사용하고, 올리고당은 프럭토올리고당, 말토올리고당 또는 이소말토올리고당을 사용하며, 혼합 추출물은 실시예 1-3에서 수득한 두충엽 추출물과 상엽 추출물을 7:3(w/w)으로 혼합하여 수득한 것을 사용하고, 양성대조군으로는 올리고당이 포함되지 않은 보존액을 사용하며, 음성대조군으로는 올리고당이 아니라 수크로스를 포함하는 보존액을 사용하였다.

보존액에 포함된 각 성분의 함량에 따른 난황항체의 갈변화 정도(단위: L값)

당류	당류의 함량	난황항체의 함량	혼합 추출물의 함량	물의 함량	갈변화 정도
- 수크로스 프럭토올리고당 말토올리고당 이소말토올리고당 프럭토올리고당 말토올리고당	0 60 70 60 50 45 40	20 5 10 15 20 25 30	10 10 5 10 10 5 10	70 25 15 15 20 25 20	82 82 45 48 50 52 55

상기 표 8에서 보듯이, 최종 중량에 대하여 40 내지 70%(w/w)의 올리고당, 5 내지 10%(w/w)의 혼합 추출물 및 15 내지 25%(w/w)의 물을 포함하는 다양한 보존액에 최종 중량에 대하여 5 내지 35%(w/w)의 난황항체를 혼합하고 상온(25℃)에서 270일 동안 보존하여도, 올리고당이 포함되지 않은 보존액을 사용한 양성대조군에 비하여 난황항체의 갈변화가 감소됨을 알 수 있었다.

또한, 당류로서 수크로스를 포함하는 보존액에서는 혼합 추출물의 갈변화 억제효과가 나타나지 않은 결과를 감안한다면, 두충엽과 상엽의 혼합 추출물의 갈변화 억제효과는 올리고당을 포함하는 보존액에서만 나타남을 알 수 있었다.

이상에서 상세하게 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 난황항체, 올리고당 및 두충엽과 상엽의 혼합 추출물을 포함하고, 난황항체의 갈변화를 방지할 수 있는 보존액을 제공한다. 본 발명의 난황항체 보존액은 장기간 난황항체의 갈변화를 효과적으로 방지할 수 있으므로, 난황항체를 이용한 보다 효과적인 질병의 치료 및 예방에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Claims

최종 중량에 대하여 5 내지 10%(w/w)의 두충엽과 상엽의 혼합 추출물, 40 내지 70%(w/w)의 올리고당 및 20 내지 55%(w/w)의 물을 포함하는 난황항체 보존액.
제 1항에 있어서,

두충엽과 상엽의 혼합 추출물은 두충엽 추출물과 상엽 추출물이 1:1 내지 4:1(w/w)로 혼합된 것을 특징으로 하는

난황항체 보존액.
제 2항에 있어서,

두충엽 추출물과 상엽 추출물은 각각 두충엽과 상엽의 에탄올 추출물인 것을 특징으로 하는

난황항체 보존액.
제 1항에 있어서,

올리고당은 갈락토올리고당, 프럭토올리고당, 말토올리고당 또는 이소말토올 리고당인 것을 특징으로 하는

난황항체 보존액.
제 1항에 개시된 난황항체 보존액 65 내지 95%(w/w) 및 난황항체 5 내지 35%(w/w)를 포함하는 사료첨가제.