KR100811614B1 - 좀주름찻잔버섯 균사체 배양물 유래의 항산화 활성추출물, 이로부터 분리된 신규한 활성산소소거능을 가지는화합물 및 그 제조방법 - Google Patents

좀주름찻잔버섯 균사체 배양물 유래의 항산화 활성추출물, 이로부터 분리된 신규한 활성산소소거능을 가지는화합물 및 그 제조방법 Download PDF

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김종평
강학수
전은미
박순혜
허수진
유익동
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한국생명공학연구원
재단법인 제주하이테크산업진흥원
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Abstract

본 발명은 좀주름찻잔버섯 균사체 배양물 유래의 항산화 활성이 있는 추출물, 상기 추출물로부터 분리된 신규한 활성산소 소거능을 가지는 화합물 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 국내에서 서식하는 좀주름찻잔버섯(Cyathus stercoreus)의 균사체를 배양하여, 항산화 활성이 우수한 균사체 배양물의 추출물을 제조한 후 상기 추출물로부터 활성물질의 분리를 수행하여 활성산소 소거활성이 있는 4개의 신규 화합물을 획득함으로써 2,2-아지노-비스(3-에틸벤조씨알로진썰폰산) 라디칼(ABTS) 및 1,1-디페닐-2-피크릴하이드라질 라디칼(DPPH) 소거능을 가지는 신규 화합물을 제공하는 매우 뛰어난 효과가 있다.
cyathusal, pulvinatal, 항산화 활성, 좀주름찻잔버섯

Description

좀주름찻잔버섯 균사체 배양물 유래의 항산화 활성 추출물, 이로부터 분리된 신규한 활성산소소거능을 가지는 화합물 및 그 제조방법{Antioxidant extract of Fermented Mushroom Cyathus stercoreus, antioxidant compounds isolated therefrom and a method for preparation of the same}
도 1은 버섯 균주 좀주름찻잔버섯(Cyathus stercoreus)의 균사체 배양물의 추출물로부터 본 발명 활성산소소거능을 가지는 신규 화합물 시아투살(cyathusal) A, B, C와 풀비나탈(pulvinatal)을 분리하는 과정을 간략히 나타낸 흐름도이다.
도 2는 본 발명 화합물 시아투살(cyathusal) A의 완전한 화학구조를 규명하기 위하기 위한 HMBC 스펙트럼을 측정한 결과이다.
도 3은 본 발명 화합물 시아투살(cyathusal) A의 완전한 화학구조를 규명하기 위한 HMBC 스펙트럼 해석 결과 나타난 1H-13C 장범위 상호연관성(long-range correlation)을 나타낸다.
도 4는 본 발명 화합물 시아투살(cyathusal) A의 화학구조를 규명하기 위하여 측정한 HREIMS 스펙트럼의 결과이다.
도 5는 본 발명 화합물 시아투살(cyathusal) A의 화학구조를 규명하기 위하여 KBr 펠렛 방법에 의하여 측정한 IR 스펙트럼 결과이다.
도 6은 본 발명 화합물 시아투살(cyathusal) A의 화학구조를 규명하기 위하여 CDCl3에서 1H (400MHz) NMR을 이용하여 측정한 스펙트럼 결과이다.
도 7은 본 발명 화합물 시아투살(cyathusal) A의 화학구조를 규명하기 위하여 CDCl3에서 13C (100MHz) NMR을 이용하여 측정한 스펙트럼 결과이다.
도 8은 본 발명 화합물 시아투살(cyathusal) B의 화학구조를 규명하기 위하여 측정한 HREIMS 스펙트럼의 결과이다.
도 9는 본 발명 화합물 시아투살(cyathusal) B의 화학구조를 규명하기 위하여 KBr 펠렛 방법에 의하여 측정한 IR 스펙트럼 결과이다.
도 10은 본 발명 화합물 시아투살(cyathusal) B의 화학구조를 규명하기 위하여 CDCl3에서 1H (400MHz) NMR을 이용하여 측정한 스펙트럼 결과이다.
도 11은 본 발명 화합물 시아투살(cyathusal) B의 화학구조를 규명하기 위하여 CDCl3에서 13C (100MHz) NMR을 이용하여 측정한 스펙트럼 결과이다.
도 12는 본 발명 화합물 시아투살(cyathusal) C의 화학구조를 규명하기 위하여 측정한 HREIMS 스펙트럼의 결과이다.
도 13은 본 발명 화합물 시아투살(cyathusal) C의 화학구조를 규명하기 위하여 KBr 펠렛 방법에 의하여 측정한 IR 스펙트럼 결과이다.
도 14는 본 발명 화합물 시아투살(cyathusal) C의 화학구조를 규명하기 위하 여 CDCl3에서 1H (400MHz) NMR을 이용하여 측정한 스펙트럼 결과이다.
도 15는 본 발명 화합물 시아투살(cyathusal) C의 화학구조를 규명하기 위하여 CDCl3에서 13C (100MHz) NMR을 이용하여 측정한 스펙트럼 결과이다.
도 16은 본 발명 화합물 풀비나탈(pulvinatal)의 화학구조를 규명하기 위하여 측정한 HREIMS 스펙트럼의 결과이다.
도 17은 본 발명 화합물 풀비나탈(pulvinatal)의 화학구조를 규명하기 위하여 KBr 펠렛 방법에 의하여 측정한 IR 스펙트럼 결과이다.
도 18은 본 발명 화합물 풀비나탈(pulvinatal)의 화학구조를 규명하기 위하여 CDCl3에서 1H (400MHz) NMR을 이용하여 측정한 스펙트럼 결과이다.
도 19는 본 발명 화합물 풀비나탈(pulvinatal)의 화학구조를 규명하기 위하여 CDCl3에서 13C (100MHz) NMR을 이용하여 측정한 스펙트럼 결과이다.
본 발명은 버섯 유래의 신규한 활성산소소거물질 및 그 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 좀주름찻잔버섯(Cyathus stercoreus) 균사체 배양물로부터 우수한 항산화활성을 갖는 추출물을 제조하고 상기 추출물로부터 분리 한 신규한 활성산소소거물질 시아투살 A, B, C 및 풀비나탈과 그 제조방법에 관한 것이다.
활성 산소와 유리 라디칼은 여러 가지 산화반응에 의하여 생성되며 세포에 산화적 손상을 가하여 각종 질환을 야기한다. 즉 각종 산화반응, 화학약품, 식품, 인체질환 및 방사선 등에 의해 슈퍼옥사이드(superoxide, O2 -), 하이드록실라디칼(hydroxyl radical, ·OH) 및 과산화수소(H2O2) 등과 같은 반응성이 큰 활성산소와 유리라디칼(free radical) 등이 생체 내에 생성되면 이들에 의해서 불포화 지방산이 다량 함유된 세포막의 지질이 산화되어 세포막에 지질 과산화물이 생성되게 된다.
세포막에 지질과산화물이 축적되면 세포막의 유동성과 기능성이 저하되어 세포의 전체적인 기능이 억제되고 세포의 구조도 변화하는 등 조직상에 국소적인 장해가 생기면서 각종 질환이 유발되는 것이다. 또한 활성산소와 유리라디칼은 세포 구성성분인 핵산, 당 등을 변형 또는 파괴함으로써 노화 및 암을 비롯하여 알콜성 간염 등의 간장질환, 뇌혈관 장해로 인한 뇌졸중, 심근경색, 당뇨병성 혈관장애, 고지혈증, 급성염증, 류마티스 질환 등 각종 인체 질환을 일으키게 된다.
따라서 강력하면서도 독성이 없는 활성산소소거물질의 발견은 각종 질병의 치료제 개발이나 노화방지용 화장품첨가제 및 식품첨가제 등으로 매우 유용하게 활용될 것이다. 지금까지 지질과산화저해제로는 부틸 하이드록시 톨루엔(butylated hydroxy toluene:BHT) 및 부틸 하이드록시 아니솔(butylated hydroxy anisol:BHA) 등과 같은 합성 항산화제가 사용되어 왔으나, 이들 BHT나 BHA는 항산화활성은 우수하나 암 또는 기형을 유발할 수 있는 가능성이 매우 높아 계속적으로 사용할 수 없는 단점이 있었다. 따라서 천연물로부터 새로운 활성산소소거물질을 창출하여 독성이나 부작용이 전혀 없는 항산화제를 개발하는 것이 요구되고 있다.
미생물 및 천연물로부터 신규 활성산소 소거작용을 나타내는 생리활성물질의 탐색연구는 비교적 최근에 이루어졌다. 즉 유칼리나무 추출물로부터 화장품 및 의약품으로 이용 가능한 신규 후라보노이드 배당체(일본특허 특개평6-65278, 1994.3.8), 활성산소 소거활성을 나타내는 항산화제(JP 05186768, 1993.7.27), 식품 및 화장품에 사용할 수 있는 항산화제(JP 05186769, 1993년.7.27) 등이 알려져 있으나 이들보다 더 강력하면서도 독성이 없는 활성산소 소거활성을 갖는 새로운 물질이 요구되고 있으며 이러한 물질이 발견된다면 각종 질병의 치료제 개발이나 노화방지용 화장품첨가제 및 식품첨가제 등으로 매우 유용하게 활용될 것이다.
종래 본 발명자들에 의해 국내에 공개된 활성산소소거능이 있는 물질과 그 제조방법으로는 대한민국 특허등록 제0320787호 "히스피딘계 활성산소소거물질 및 그 제조방법", 대한민국 특허등록 제0462844호 "느릅나무과로부터 분리한 신규한 화합물 및 그 제조방법", 대한민국 특허등록 제0462843호 "곰팡이 유래의 활성산소 소거물질 및 그의 신규한 용도", 대한민국 특허등록 제0473420호 "곰팡이 유래의 멜라닌 생합성 저해물질과 활성 산소 소거물질 및 그의 신규한 용도", 대한민국 특허등록 제597233호 "신규한 세스키테르펜계 화합물 및 그 제조방법" 등에 곰팡이 또는 버섯으로부터 항산화 화합물의 분리방법이 개시되어 있다.
본 발명자들은 이 후 미생물, 버섯류 또는 약용식물 등 각종 천연물로부터 새로운 활성산소소거물질을 탐색하던 중, 좀주름찻잔버섯(Cyathus stercoreus) 균사체 배양물의 추출물로부터 활성산소소거능을 가지는 시아투살(cyahtusal) A, B, C와 풀비나탈(pulvintal)을 분리하였으며 이 4개의 물질의 이화학적 특성을 규명함과 동시에 그 제조방법을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 좀주름찻잔버섯(Cyathus stercoreus) 균사체 배양물의 추출물을 제조하고 상기 추출물로부터 활성산소 소거작용이 우수한 시아투살(cyathusal) A, B, C 및 풀비나탈(pulvinatal)을 분리하여 제공함에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 시아투살(cyathusal) A, B, C 및 풀비나탈(pulvinatal) 화합물의 제조방법을 제공함에 있다.
본 발명의 상기 목적은 좀주름찻잔버섯 균사체 배양물의 추출물을 정제하여 얻은 순수한 화합물을 질량스펙트럼, 자외선 흡수 스펙트럼, 적외선 흡수 스펙트럼, 수소 핵자기 공명 스펙트럼, 탄소핵자기 공명 스펙트럼으로 조사하여 시아투살(cyathusal) A, B, C 및 풀비나탈(pulvinatal) 화합물로 동정하고 그 구조를 결정한 후 상기 본 발명 시아투살(cyathusal) A, B, C 및 풀비나탈(pulvinatal) 화합물의 2,2-아지노-비스(3-에틸벤조씨알로진썰폰산)[2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate): ABTS] 라디칼 소거능 및 1-1-디페닐-2-피크릴하이드라질(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl: DPPH) 라디칼 소거능을 각각 측정하여 본 발명의 신규한 시아투살(cyathusal) A, B, C 및 풀비나탈(pulvinatal) 화합물의 탁월한 활성산소 소거활성과 안전성을 확인함으로써 달성하였다.
이하, 본 발명의 구성 및 작용을 설명한다.
본 발명은 좀주름찻잔버섯 균사체 배양물을 헥산(hexane), 에틸아세테이트(ethyl acetate) 및 부탄올(buthanol)로 분획 추출하여 추출물을 제조하고 이 중 항산화활성이 우수한 에틸아세테이트 추출물을 클로로포름과 메탄올로 각각 다시 추출한 후 메탄올 추출물로부터 재결정에 의하여 본 발명 풀비나탈(pulvinatal)을 제조하는 단계; 클로로포름 추출물로부터 역상 컬럼크로마토그라피, 실리카겔 컬럼 크로마토그라피, prep-HPLC로 순차적으로 정제하여 활성산소소거능을 가지는 본 발명의 신규한 시아투살(cyathusal) A, B, C 및 풀비나탈(pulvinatal) 화합물을 분리하는 단계; 상기 추출 정제한 본 발명의 신규한 시아투살(cyathusal) A, B, C와 풀비나탈(pulvinatal) 활성산소소거물질의 질량스펙트럼, 자외선 흡수 스펙트럼, 적외선 흡수 스펙트럼, 수소핵자기 공명 스펙트럼, 탄소핵자기 공명 스펙트럼을 조사하여 이화학적 성질을 조사하고 화학구조식을 결정하는 단계; ABTS+ 용액과 DMSO에 녹인 본 발명의 신규한 시아투살(cythusal) A, B, C와 풀비나탈(pulvinatal) 활성산소소거물질을 섞은 후 광흡수도를 측정하고 같은 방법으로 대조물질의 광흡수도를 측정하여 ABTS+ 라디칼 소거능을 비교 조사하는 단계; 및 DPPH 용액과 DMSO에 녹인 본 발명의 신규한 시아투살(cythusal) A, B, C와 풀비나탈(pulvinatal) 활성산소소거물질을 섞은 후 광흡수도를 측정하고 같은 방법으로 대조물질의 광흡수도를 측정하여 DPPH 라디칼 소거능을 비교 조사하는 단계로 구성된다.
본 발명은 좀주름찻잔버섯(Cyathus stercoreus) 균사체 배양액의 아세톤(acetone) 추출물을 에틸아세테이트(ethylacetate)와 부탄올(BuOH)로 분액 추출하여 얻은 항산화 활성 추출물을 제공한다.
또한, 본 발명은 활성산소소거능을 가지며 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제공한다.
Figure 112006071803593-pat00001
여기에서, R은 H, OH,
Figure 112006071803593-pat00002
또는 OCH3임.
본 발명은 상기의 좀주름찻잔버섯(Cyathus stercoreus) 균사체 배양액 유래의 추출물 또는 상기 화학식 1 기재의 화합물을 유효성분으로 포함하는 활성산소소거용 조성물을 제공한다.
본 발명은 좀주름찻잔버섯(Cyathus stercoreus) 균사체 배양물을 에틸아세테 이트(Ethyl acetate) 및 클로로포름(chloroform)으로 추출하여 항산화활성 추출물을 얻는 단계; 상기 단계의 추출물을 클로로포름과 메탄올로 각각 다시 추출하는 단계; 및 상기 단계의 메탄올 추출물을 재결정하거나, 클로로포름 추출물을 역상 컬럼크로마토그라피, 실리카겔 컬럼 크로마토그라피, prep-HPLC로 순차적으로 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 화학식 1 기재의 화합물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 신규한 시아투살(cythusal) A, B, C 및 풀비나탈(pulvinatal) 화합물은 하기 화학식 1로 표시되는 바와 같이 폴리케타이드(polyketide) 타입의 골격을 함유하며 버섯의 균사체 배양물로부터 물이나 유기용매(알콜, 에테르, 아세톤 등)에 의한 추출, 초산에틸과 그 밖의 유기용매, 각종 크로마토그라피 등, 활성물질의 분리 추출에 이용할 수 있는 공지의 방법을 단독 또는 적당히 혼용하여 얻을 수가 있고 조추출물은 필요에 따라서 상법에 의해 더욱 순수하게 정제할 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112006071803593-pat00003
여기에서, R=H인 경우 시아투살 A, R=OH인 경우 시아투살 B, R=
Figure 112006071803593-pat00004
인 경우 시아투살 C이며, R=OCH3인 경우 풀비나탈 화합물이다.
본 발명의 폴리케타이드 타입의 신규한 시아투살(cyathusal A, B, C) 및 풀비나탈(pulvinatal) 화합물은 활성산소나 유리라디칼을 소거하는 작용을 가지고 있으며, 상기 본 발명 화합물과 유사한 공지의 다른 화합물보다도 더욱 강한 항산화활성을 나타내 생체 내 항산화제 분야 이외에도 생체막 지질의 과산화 반응과 관련되는 생리활성분야에서 매우 유용하게 이용할 수 있다.
본 발명의 폴리케타이드 타입의 신규한 시아투살(cyathusal) A, B, C 및 풀비나탈(pulvinatal) 화합물은 탁월한 활성산소 소거활성을 나타냄과 동시에 안전성도 매우 높아 항산화제로서 식품이나 화장품 등에 첨가하는 경우 이외에도 탁월한 생체 내 항산화 활성을 이용한 각종 의약품으로서 사용 가능하다. 의약품으로 사용할 경우에는 본 발명에서 명시한 각 화합물들을 유효성분으로 하며 그에 상응하는 무기 또는 유기 담체를 가하여, 고체, 반고체 또는 액체의 형태로 제제화하고 경구 투여제 뿐만 아니라 외상용 등 비경구투여제로 제제화 할 수 있다. 경구투여를 위한 제제화에는 정제, 환제, 과립제, 캡슐제, 펠렛제, 산제, 세립제, 분제, 유탁제, 현탁제, 시럽제 등을 열거할 수 있으며, 비경구투여제로는 주사제, 점적제, 수액, 연고, 스프레이제, 현탁제, 유제, 좌제 등을 들 수 있다.
본 발명의 유효성분을 제제화하기 위하여 상법에 따르면 비교적 쉽게 제제화할 수 있으며 계면활성제, 부형제, 착색제, 착향제, 보존제, 안정제, 완충제, 현탁제 등도 상법에 따라 적당히 선별하여 사용할 수 있다.
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 본 발명 버섯 좀주름찻잔버섯 균사체 배양물로부터 활성산소 소거 능을 갖는 추출물의 제조
야생버섯 균사체를 배양하여 배양액과 균사체의 추출물의 프리라디칼 소거활성을 조사하여 우수한 활성을 보이는 좀주름찻잔버섯(Cyathus stercoreus) 균사체를 선발하였다.
상기 활성산소 소거물질을 생산하는 본 발명 좀주름찻잔버섯 균사체(Cyathus stercoreus)를 2006년 8월 14일자로 생명공학연구소내 유전자은행에 기탁번호 KCTC 10979BP로 기탁하였다.
상기 본 발명 좀주름찻잔버섯(Cyathus stercoreus) 균사체를 PDA(potato dextrose agar)배지에서 약 2주간 배양하였다. PDA고체배지에서 배양된 버섯균사체를 YPS액체배지에 옮겨 500mL 삼각플라스크를 이용하여 28℃, 140rpm으로 일주일간 seed 배양한 후 발효기(fermentor)에 YPS배지를 채우고 여기에 seed 배양액을 접종하여 약 2주간 배양하였다. 배양액 및 균사체의 80% 아세톤(acetone) 추출물을 헥 산(hexane), 에틸아세테이트(ethylacetate)와 부탄올(BuOH)로 분액 추출하여 추출물을 제조하였다. 이중 에틸아세테이트와 부탄올 추출물에서 항산화활성이 관찰되었다. 상기와 같이 제조된 좀주름찻잔버섯 균사체 배양물 유래의 추출물의 항산화활성을 표 1, 2 및 3에 나타내었다.
좀주름찻잔버섯 균사체 배양물의 추출물의 ABTS+ 라디칼소거활성
　 헥산(Hexane) 에틸아세테이트(EtoAc) 부탄올(BuOH)
　 1 mg/mL 36% 91% 56%
0.5 mg/mL 19% 69% 30%
0.2 mg/mL 7% 31% 13%
0.1 mg/mL 2% 15% 7%
좀주름찻잔버섯 균사체 배양물의 추출물의 DPPH 라디칼소거활성
　 헥산(Hexane) 에틸아세테이트(EtoAc) 부탄올(BuOH)
　 1 mg/mL 6% 56% 36%
0.5 mg/mL 6% 37% 22%
0.2 mg/mL 0% 16% 13%
0.1 mg/mL 0% 7% 9%
좀주름찻잔버섯 균사체 배양물의 추출물의 슈퍼옥사이드 라디칼소거활성
　 헥산(Hexane) 에틸아세테이트(EtoAc) 부탄올(BuOH)
　 1 mg/mL 0% 55% 10%
0.5 mg/mL 0% 24% 0%
0.2 mg/mL 0% 0% 0%
0.1 mg/mL 0% 0% 0%
실시예 2: 에틸아세테이트 추출물로부터 활성산소 소거능을 가지는 신규한 시아투살( cythusal ) A, B, C 및 풀비나탈 ( pulvinatal ) 화합물의 분리
추출물 중 가장 좋은 항산화 활성을 나타내는 에틸아세테이트 추출물을 감압 하에서 농축하여 용매를 제거한 후 클로로포름(chloroform)과 메탄올(methanol)로 각각 다시 분액 추출하였다. 이 중에서 메탄올 추출물을 감압 하에서 농축하여 용매를 제거한 후 다시 소량의 메탄올을 첨가한 후 약 2일간 방치하여 알테하이드기를 아세탈기로 치환한 후 -20℃에서 재결정을 실시하여 얻어진 결정을 여과, 진공건조하여 아세탈 형태의 풀비나탈(pulvinatal) 화합물을 얻었다.
이를 클로로포름 용매 하에 약 3일간 방치하여 아세탈기를 다시 알데하이드기로 회복시킨 후 진공건조하여 약 540mg의 풀비나탈(pulvinatal) 화합물을 얻었다. 클로로포름 추출액을 감압하에서 농축하여 용매를 제거한 후 역상 컬럼 크로마토그래피 30% ACN(acetonitrile)에서 100% ACN용매로 순차적으로 극성을 줄이며 용출하여 분획하였다. 각 분획 중 프리 라디칼 소거활성을 가지는 분획들을 가지고 50% ACN과 60% ACN에서 각각 ODS컬럼을 사용하여 HPLC하여 풀비나탈 (pulvinatal), 시아투살(cyathusal) A, 시아투살(cyathusal) B 및 시아투살(cyathusal) C의 화합물을 얻었다(도 1 참조).
실시예 3: 본 발명 활성산소 소거물질 시아투살 ( cythusal ) A, B, C 및 풀비나탈( pulvinatal ) 화합물의 동정 및 물리화학적 특성 조사
상기 실시예 2에서 추출분리 정제된 4개의 화합물의 화학구조를 질량분석, 자외선 및 가시광선 분광 분석, 적외선 분광 분석, 수소 및 탄소 핵자기 공명 스펙트럼을 조사하여 동정하고, 스펙트럼 분석 및 물리화학적 특성을 조사한 결과 하기와 같았다.
1. 시아투살 ( cyathusal ) A
물질의 성상: 노란색 무결정 분말
분자량: 330
분자식: C17H14O7
질량분석치 (도 4 참조):
ESIMS m/z 329 [M - H]ㅡ, m/z 353 [M + Na]+ HREIMS m/z 330.0740 [M]+
(계산치: C17H14O7, 330.0739)
자외선 흡수 스펙트럼 UV (ACN) λmax (logε):
237 (5.42), 256 (5.32), 302 (5.09) and 372 (5.16) nm
적외선 흡수 스펙트럼(도 5 참조) IR (KBr) ν max:
3475, 2954, 2921, 2853, 1733, 1679, 1659, 1622, 1577, 1531, 1432, 1406, 1352, 1313, 1294, 1242, 1219, 1161, 1139, 1107, 1078, 1030, 973, 904, 848 cm-1
수소핵자기 공명 스펙트럼(도 6 참조) δppm (CDCl3, 400MHz):
δ 1.98 (3H, dd, J = 7.0, 1.6 Hz, H-16), 4.07 (3H, s, 3-OMe), 5.61 (1H, s, H-8), 6.07 (1H, s, 4-OH), 6.12 (1H, dd, J = 16.0, 1.6 Hz, H-14), 6.10 (1H, s, H-12), 6.86 (1H, dq, J = 16.0, 7.0 Hz, H-15), 10.36 (1H, s, H-1), 12.24(1H, s, 5-OH)
탄소핵자기 공명 스펙트럼(도 7) δppm (CDCl3, 100MHz):
δ 18.9 (C-16), 62.0 (3-OMe), 67.1 (C-8) 97.0 (C-8), 100.5 (C-12), 101.7 (C-10), 108.8 (C-6), 118.6 (C-2), 122.0 (C-7), 123.4 (C-14), 138.0 (C-15), 138.8 (C-4), 147.7 (C-5), 150.8 (C-3), 159.4 (C-13), 165.6 (C-9), 170.1 (C-11), 191.2 (C-1)
화학구조: 하기 화학식 2
Figure 112006071803593-pat00005
2. 시아투살 ( cyathusal ) B
물질의 성상: 밝은 노란색 무결정 분말
분자량: 346
분자식: C17H14O8
질량분석치 (도 8 참조):
ESIMS m/z 345 [M - H]ㅡ, m/z 369 [M + Na]+ HREIMS m/z 346.0688 [M]+
(계산치: C17H14O8, 346.0689)
자외선 흡수 스펙트럼 UV (ACN) λmax (logε):
194 (5.36), 231 (5.23), 303 (4.86) and 361 (4.96) nm
적외선 흡수 스펙트럼(도 9 참조) IR (KBr) ν max:
3412, 2923, 2854, 1666, 1632, 1585, 1530, 1416, 1348, 1313, 1215, 1130, 1078, 1012, 966, 931, 877 cm-1
수소핵자기 공명 스펙트럼(도 10 참조) δppm (CDCl3, 400MHz):
δ 1.99 (3H, dd, J = 6.8, 1.6 Hz, H-16), 4.10 (3H, s, 3-OMe), 3.94 (1H, d, J = 5.2 Hz, 8-OH), 6.11 (1H, dd, J = 15.6, 1.6 Hz, H-14), 6.18 (1H, s, 4-OH), 6.22 (1H, s, H-12), 6.87 (1H, dq, J = 15.6, 6.8 Hz, H-15), 7.23 (1H, d, J= 5.2 Hz, H-8), 10.41 (1H, s, H-1), 12.90(1H, s, 5-OH)
탄소핵자기 공명 스펙트럼(도 11 참조) δppm (CDCl3, 100MHz):
δ 18.9 (C-16), 62.0 (3-OMe), 96.7 (C-8), 101.1 (C-12), 101.1 (C-10), 108.2 (C-6), 117.6 (C-2), 121.2 (C-7), 121.7 (C-14), 137.7 (C-15), 139.5 (C- 4), 147.7 (C-5), 151.4 (C-3), 159.0 (C-13), 165.6 (C-9), 165.8 (C-11), 190.6 (C-1)
화학구조: 하기 화학식 3
Figure 112006071803593-pat00006
3. 시아투살 ( cyathusal ) C
물질의 성상: 갈색결정
분자량: 388
분자식: C20H20O8
질량분석치 (도 12 참조):
ESIMS m/z 387 [M - H]ㅡ, m/z 411 [M + Na]+ HREIMS m/z 388.1159 [M]+
(계산치: C20H20O8, 388.1158)
자외선 흡수 스펙트럼 UV (ACN) λmax (logε):
228 (5.33), 258 (5.20), 303 (4.98) and 362 (5.15) nm
적외선 흡수 스펙트럼(도 13) IR (KBr) ν max:
3224, 2968, 2921, 1664, 1629, 1578, 1528, 1414, 1352, 1319, 1242, 1215, 1169, 1121, 1072, 1014, 970, 947, 930, 893, 860 cm-1
수소핵자기 공명 스펙트럼(도 14) δppm (CDCl3, 400MHz):
δ 1.18 (3H, d, J = 6.0 Hz, H-2'), 1.26 (1H, d, J = 6.0 Hz, H-3'), 1.98 (3H, dd, J = 6.8, 1.6 Hz, H-16), 4.07 (3H, s, 3-OMe), 4.30 (1H, m, J = 6.0 Hz, H-1'), 6.12 (1H, dd, J = 15.6, 1.6 Hz, H-14), 6.16 (1H, s, 4-OH), 6.17 (1H, s, H-12), 6.87 (1H, dq, J = 15.6, 6.8 Hz, H-15), 7.24 (1H, s, H-8), 10.42 (1H, s, H-1), 12.76(1H, s, 5-OH)
탄소핵자기 공명 스펙트럼(도 15) δppm (CDCl3, 100MHz):
δ 18.9 (C-16), 22.5 (C-2'), 23.8 (C-3') 62.0 (3-OMe),73.7 (C-1'), 95.4 (C-8), 101.3 (C-12), 102.1 (C-10), 108.7 (C-6), 117.4 (C-2), 122.0 (C-7), 122.0 (C-14), 137.7 (C-15), 139.6 (C-4), 148.0 (C-5), 151.6 (C-3), 159.1 (C-13), 165.9 (C-9), 166.1 (C-11), 190.7 (C-1)
화학구조: 하기 화학식 4
Figure 112006071803593-pat00007
4. 풀비나탈( pulvinatal )
물질의 성상: 노란색 결정
분자량: 360
분자식: C18H16O8
질량분석치 (도 16 참조):
ESIMS m/z 359 [M - H]ㅡ, m/z 383 [M + Na]+, HREIMS m/z 360.0842 [M]+
(계산치: C18H16O8, 360.0845)
자외선 흡수 스펙트럼 UV (ACN) λmax (logε):
227 (5.38), 257 (5.25), 303 (5.05) and 363 (5.17) nm
적외선 흡수 스펙트럼(도 17 참조) IR (KBr) ν max:
3427, 2940, 2845, 1673, 1662, 1633, 1581, 1531, 1418, 1343, 1312, 1238, 1207, 1166, 1118, 1076, 1042, 1015, 948, 888 cm-1
수소핵자기 공명 스펙트럼(도 18 참조) δppm (CDCl3, 400MHz):
δ 1.99 (3H, dd, J = 6.8, 1.6 Hz, H-16), 3.65 (3H, s, R-OMe), 4.08 (3H, s, 3-OMe), 6.12 (1H, dd, J = 15.6, 1.6 Hz, H-14), 6.21 (1H, s, H-12), 6.87 (1H, dq, J = 15.6, 7.0 Hz, H-15), 6.96 (1H, s, H-8), 10.43 (1H, s, H-1)
탄소핵자기 공명 스펙트럼(도 19 참조) δppm (CDCl3, 100MHz):
δ 18.9 (C-16), 59.0 (R-OMe), 62.0 (3-OMe), 97.0 (C-8), 101.3 (C-12), 101.9 (C-10), 108.4 (C-6), 117.8 (C-2), 121.4 (C-7), 122.0 (C-14), 137.9 (C-15), 139.7 (C-4), 147.9 (C-5), 151.6 (C-3), 159.2 (C-13), 165.8 (C-9), 165.9 (C-11), 190.8 (C-1)
화학구조: 하기 화학식 5
Figure 112006071803593-pat00008
실시예 4: 본 발명의 신규한 시아투살 ( cyathusal ) A, B, C 및 풀비나탈( pulvinatal ) 화합물의 2,2- 아지노 - 비스 (3- 에틸벤조씨알로진썰폰산 ) 라디칼 소거능 조사
7mM ABTS 수용액을 2.45mM 포타슘퍼설페이트(potassium persulfate)와 혼합하여 ABTS+ 라디칼을 생성시킨 후 이를 734nm에서 약 0.7의 흡광도를 갖도록 희석하여 ABTS+ 라디칼 수용액을 만들었다. ABTS+ 라디칼 수용액 190μL와 DMSO에 녹인 본 발명의 신규한 시아투살(cyathusal) A, B, C 및 풀비나탈(pulvinatal) 화합물과 대조물질 각 농도의 시료 10μL를 섞은 후 7분간 방치한 다음 734nm에서의 광흡수도와 시료를 넣지 않고 DMSO만을 넣은 대조구의 광흡수도를 측정하여 하기 수학식 1에 따라 ABTS+ 라디칼 소거능을 산출하였다. 양성 대조군으로는 Trolox와 BHA를 사용하였다.
Figure 112006071803593-pat00009
A: 시료를 넣지 않은 것의 흡광도
B: 시료를 넣은 것의 흡광도
실험결과, ABTS+ 라디칼을 50% 소거하는 농도(EC50)를 지표로 나타낸 본 발명 의 신규한 시아투살(cyathusal) A, B, C 및 풀비나탈(pulvinatal) 화합물의 ABTS+ 라디칼 소거능을 하기 표 4에 나타내었다. 표 4를 통해 알 수 있듯이, 본 발명의 신규한 시아투살(cyathusal) A, B, C 및 풀비나탈(pulvinatal) 화합물의 ABTS+ 라디칼 소거능이 대조화합물에 비해 월등히 우수하였다.
본 발명의 신규한 시아투살(cyathusal) A, B, C 및 풀비나탈(pulvinatal) 화합물의 ABTS+ 라디칼 소거능
시료 EC50 (μM±SD )
시아투살(cyathusal) A 7.86±0.138
시아투살(cyathusal) B 11.06±0.440
시아투살(cyathusal) C 9.10±0.092
풀비나탈(pulvinatal) 8.36±0.154
BHA 11.70±0.261
Trolox 14.54±0.083
실시예 5: 본 발명의 신규한 시아투살 ( cyathusal ) A, B, C 및 풀비나탈( pulvinatal ) 화합물의 1,1- 디페닐 -2- 피크릴하이드라질 라디칼 소거능 조사
에탄올에 녹인 150μM의 1,1-디페닐-2-피크릴하이드라질(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl; DPPH) 용액 90μL와 DMSO에 녹인 본 발명의 신규한 시아투살(cythusal) A, B, C 및 풀비나탈(pulvinatal)과 대조물질 각 농도의 시료 10μL를 섞은 후 30분간 방치한 다음 517 nm에서의 광흡수도와 시료를 넣지 않고 DMSO만을 넣은 대조구의 광흡수도를 측정하여 하기 수학식 2에 따라 DPPH 라디칼 소거능을 산출하였다. 양성 대조군으로는 Trolox와 BHA를 사용하였다.
Figure 112006071803593-pat00010
A: 시료를 넣지 않은 것의 흡광도
B: 시료를 넣은 것의 흡광도
실험결과, DPPH 라디칼을 50% 소거하는 농도(EC50)를 지표로 나타낸 본 발명의 신규한 시아투살(cyathusal) A, B, C 및 풀비나탈(pulvinatal)의 DPPH 라디칼 소거능은 하기 표 5와 같았다. 표 5에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 신규한 시아투살(cyathusal) A, B, C 및 풀비나탈(pulvinatal)의 DPPH 라디칼 소거능이 대조화합물에 비해 현저히 우수하였다.
본 발명의 신규한 시아투살(cyathusal) A, B, C 및 풀비나탈(pulvinatal) 화합물의 DPPH 라디칼 소거능
시료 EC50 (μM±SD )
시아투살(cyathusal) A 41.59±2.384
시아투살(cyathusal) B 46.01±0.417
시아투살(cyathusal) C 26.64±0.840
풀비나탈(pulvinatal) 28.59±0.948
BHA 97.09±5.522
Trolox 37.61±1.687
이상, 상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이, 본 발명은 좀주름찻잔버 섯(Cyathus stercoreus)의 균사체 배양물로부터 우수한 항산화활성을 갖는 추출물을 제조하고 상기 추출물로부터 신규한 시아투살(cyathusal) A, B, C 및 풀비나탈(pulvinatal) 화합물을 분리한 뒤 이들 화합물이 우수한 2,2-아지노-비스(3-에틸벤조씨알로진썰폰산)(ABTS+)과 1,1-디페닐-2-피크릴하이드라질(DPPH) 라디칼 소거능을 가짐을 확인함으로써 좀주름찻잔버섯 유래의 활성산소소거능을 가지는 신규한 화합물 및 이의 제조방법을 제공할 수 있는 매우 뛰어난 효과가 있으므로 식품, 화장품 및 의약품 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (5)

  1. 항산화 활성 좀주름찻잔버섯(Cyathus stercoreus) 균사체 배양물.
  2. 좀주름찻잔버섯(Cyathus stercoreus) 균사체 배양물의 추출물을 클로로포름 (chloroform), 에틸아세테이트(ethylacetate) 및 부탄올(BuOH)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유기용매로 분액 추출하여 얻은 항산화 활성 추출물.
  3. 활성산소소거능을 가지며 하기 화학식으로 표시되는 화합물:
    Figure 112006071803593-pat00011
    여기에서, R은 H, OH,
    Figure 112006071803593-pat00012
    또는 OCH3임.
  4. 제 1항 기재의 좀주름찻잔버섯(Cyathus stercoreus) 균사체 배양물, 제 2항 기재의 좀주름찻잔버섯(Cyathus stercoreus) 균사체 배양액 유래의 추출물 또는 제 3항 기재의 화합물을 유효성분으로 포함하는 활성산소소거용 조성물.
  5. 좀주름찻잔버섯(Cyathus stercoreus) 균사체 배양물을 에틸아세테이트(Ethyl acetate) 및 클로로포름(chloroform)으로 추출하여 항산화활성 추출물을 얻는 단계;
    상기 단계의 추출물을 클로로포름과 메탄올로 각각 다시 추출하는 단계; 및
    상기 단계의 메탄올 추출물을 재결정하거나, 클로로포름 추출물을 역상 컬럼크로마토그라피, 실리카겔 컬럼 크로마토그라피, prep-HPLC로 순차적으로 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제 3항 기재의 화합물 제조방법.
KR1020060096391A 2006-09-29 2006-09-29 좀주름찻잔버섯 균사체 배양물 유래의 항산화 활성추출물, 이로부터 분리된 신규한 활성산소소거능을 가지는화합물 및 그 제조방법 KR100811614B1 (ko)

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