KR100794384B1 - 광합성세균인 티오캅사 로세오페르시키나 수소생산효소의생산 및 정제방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 광합성세균인 티오캅사 로세오페르시키나 수소생산효소의 생산 및 정제방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 광합성세균인 티오캅사 로세오페르시키나를 탄소원으로 아세테이트를 포함하는 배지에 배양하여 수소생산효소를 생산하는 방법 및 티오캅사 로세오페르시키나 배양물로부터 수소생산효소를 정제하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 의하면 광합성세균인 티오캅사 로세오페르시키나를 탄소원으로 아세테이트를 포함하는 배지에 배양함으로써 수소생산효소를 고농도로 생산할 수 있다. 또한, 본 발명의 수소생산 효소를 정제하는 방법에 의해 티오캅사 로세오페르시키나 배양물로부터 활성이 안정한 수소생산효소를 정제할 수 있다.
티오캅사 로세오페르시키나, 수소생산효소
Description
도 1a는 티오캅사 로세오페르시키나에 대한 아세테이트 첨가 배지에서의 생육곡선 및 하이드로게나아제 생산을 나타낸 것이다. (○, cell concentration; ●, hydrogenase activity)
도 1b는 티오캅사 로세오페르시키나 NCIB 8347을 연속적으로 영양물질을 공급하면서 배양할 때 균체 성장 및 하이드로게나아제 생산을 나타낸 것이다. (▽, cell concentration; ○, hydrogenase specific activity; ●, hydrogenase total activity)
도 2는 티오캅사 로세오페르시키나의 Q-sepharose chromatogram을 나타낸 것이다.
도 3a는 H-Ⅰ의 Phenyl Superose chromatogram을 나타낸 것이다.
도 3b는 H-Ⅱ의 Phenyl superose chromatogram을 나타낸 것이다.
도 4a는 H-Ⅰ의 Mono Q chromatogram을 나타낸 것이다.
도 4b는 H-Ⅱ의 Mono Q chromatogram을 나타낸 것이다.
도 5a는 H-Ⅰ의 Gel filtration chromatogram을 나타낸 것이다.
도 5b는 H-Ⅱ의 Gel filtration chromatogram을 나타낸 것이다.
도 6a는 T. roseopersicina H-Ⅰ의 Native PAGE 결과를 나타낸 것이다.
(Lane 1, phenyl superose; lane 2, mono Q; lane 3, superdex 200; lane 4, prep electrophoresis)
도 6b는 T. roseopersicina H-II의 Native PAGE 결과를 나타낸 것이다.
(Lane 1, phenyl superose; lane 2, mono Q; lane 3, superdex 200; lane 4, prep electrophoresis)
본 발명은 광합성세균인 티오캅사 로세오페르시키나 수소생산효소의 생산 및 정제방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 광합성세균인 티오캅사 로세오페르시키나를 탄소원으로 아세테이트를 포함하는 배지에 배양하여 수소생산효소를 생산하는 방법 및 티오캅사 로세오페르시키나 배양물로부터 수소생산효소를 정제하는 방법에 관한 것이다.
하이드로게나아제(Hydrogenase: 수소생산효소)는 분자상의 수소를 산화하거나, 양성자와 전자로부터 분자상의 수소를 생산하는 다음의 가역 반응 (
)을 촉매하는 효소이다. 이 효소들은 내부에 함유하는 금속의 종류에 따라 철 이온만 함유하는 철 수소생산효소, 니켈과 철 이온을 함유하는 철·니켈 수소생산효소, 그리고 금속을 함유하지 않은 것으로 분류된다.
수소생산효소는 또한 전자 전달체 종류, 균체 내 분포, 및 발현의 조절의 관점에서 매우 다양하다. 균체 내에서는 생체에너지 저장, 발효 중 생성되는 과잉 전자의 배출 등 여러 가지 작용에 관여하며, 미생물에 따라 1개에서 4개 이상 종류가 다른 것이 존재한다.
최근 미생물을 이용하여 물이나 폐자원으로부터 수소를 제조하는 생물학적 수소 생산 방법에 대한 관심이 점점 증가하고 있다. 생물학적인 수소 생산 방법은 화학공학적인 수소 생산방법에 비해 상온·상압 조건에서 조업이 이루어지기 때문에 덜 에너지 집약적이며, 물이나 바이오매스, 유기성 폐자원 등과 같은 재생 가능한 연료로부터 수소생산이 이루어지기 때문에 이론적으로는 무한정 수소생산이 가능하다. 또한, 수소 생산 미생물에 의한 수소생산 조건의 최적화 연구와 함께 그 효소에 관한 연구들이 진행되고 있다. 그러나 이들 효소에 관하여 충분한 연구가 되어 있지는 않으므로, 앞으로 미생물을 통한 수소생산뿐 아니라, 수소 생산에 직접 관여하는 효소들을 미생물로부터 분리하여 효소반응공정의 최적화를 통해 수소생산성을 높이려는 심도 있는 연구가 필요하다.
티오캅사 로세오페르시키나(Thiocapsa roseopersicina)는 홍색유황세균이며 여러 개의 수소생산 효소가 미생물 내부에 있다고 알려져 있다. 자세히 보면 2개의 세포막에 결합된 것과 1개의 세포질 내에 존재하는 것이 있다. 이 중에는 내열성, 산소, 단백질 분해효소 및 계면활성제에 안정성이 있는 수소생산효소가 있다는 것이 알려져 있으나 자세한 연구는 되어있지 않다.
대부분의 미생물이 생산하는 수소생산효소는 산소에 노출되면 즉시 활성을 잃고, 온도에도 민감하기 때문에 이 효소를 미생물로부터 추출하여 외부에서 수소생산을 하도록 유도할 수가 없었다.
본 발명은 상기 종래기술이 가지는 문제를 해결하기 위하여 제시되는 것으로, 본 발명의 목적은 광합성세균인 티오캅사 로세오페르시키나를 탄소원으로 아세테이트를 포함하는 배지에 배양하여 수소생산효소를 생산하는 방법 및 티오캅사 로세오페르시키나 배양물로부터 활성이 안정한 수소생산효소를 정제하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 수단으로, 본 발명은 광합성세균인 티오캅사 로세오페르시키나를 탄소원으로 아세테이트를 포함하는 배지에 배양하여 수소생산효소를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명은 티오캅사 로세오페르시키나 배양액을 초음파 분쇄하여 세포질 분획을 얻고 분획물로부터 수소생산효소를 정제하는 방법을 제공한다.
상기에서, 수소생산효소의 정제는 분획물을 초원심분리(ultracentrifuge)하여 하이드로게나아제 분획을 얻는 단계; 세포질 분획을 암모늄 설페이트 분획하여 비활성의 하이드로게나아제 분획을 얻는 단계; 60±5℃에서 20±5분 동안 열처리하여 비활성 수소생산효소를 얻는 단계; 큐 세팔로스(Q sepharose) 크로마토그래피 단계; 페닐 수퍼로즈 (Phenyl Superose) 크로마토그래피 단계; 모노(Mono)-Q 크로마토그래피 단계; 수퍼덱스 200(superdex 200) 크로마토그래피 단계; 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동 하는 단계를 포함한다.
이하, 본 발명의 내용을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명에서는 홍색 유황 세균인 티오캅사 로세오페르시키나를 광합성 조건에서 배양하여, 이로부터 유래한 세포질 내의 수소생산효소를 분리 정제하는 방법을 개발하고자 하였다.
본 발명에서 사용한 티오캅사 로세오페르시키나(Thiocapsa roseopercisina)는 수소를 생산하는 광합성 세균으로 홍색 유황세균이다. 티오캅사 로세오페르시키나는 탄소원으로 아세테이트를 포함하는 배지를 사용한 광합성 독립영양 조건에서 최적 배양조건을 나타낸다.
본 발명에 따르면 티오캅사 로세오페르시키나 균체의 생장을 촉진하기 위해 페니그 배지에 배양하며, 2±0.5%의 이산화탄소를 함유한 질소를 공급하며 26±0.5℃에서 광합성 독립영양 배양하는 것이 바람직하다.
또한, 배양 시작 후 20~24시간마다 0.05±0.01% 아세테이트를 탄소원으로 추가하며 3~5일 동안 배양하는 것이 바람직하다.
본 발명의 실시예에 의하면 탄소원으로 아세테이트의 첨가는 균체의 최대 생장속도를 7일에서 1일로 7배 증가시키며, 이로부터 얻어진 수소생산효소의 비활성역가 (specific activity)는 유사한 것으로 미루어 7배 많은 수소생산효소 양을 확보할 수 있다.
또한, 균체의 생장속도를 더욱 높이기 위해 아세테이트 외에 암모늄 클로라이드와 미량원소 Na2S·9H2O, Na2·EDTA, FeSO4·7H2O, CoCl2·6H2O, MnCl2·2H2O, ZnCl2, NiCl2·6H2O, Na2MoO4·2H2O, H3BO3, CuCl2·2H2O를 약 24시간 간격으로 추가하는 것이 바람직하다.
상기에서 암모늄 클로라이드는 1ℓ당 0.24 - 044g 첨가하는 것이 바람직하다. 또한, 미량원소는 1ℓ당 Na2S·9H2O 1.0~2.0g, Na2·EDTA 0.001~0.005g, FeSO4·7H2O 0.001~0.0015g, CoCl2·6H2O 0.00015~0.0002g, MnCl2·2H2O 0.00003~0.00005g, ZnCl2 0.00004~0.00005g, NiCl2·6H2O 0.00002~0.00003g, Na2MoO4·2H2O 0.00001~0.00002g, H3BO3 0.0002~0.0004g, CuCl2·2H2O 0.000001~0.000003g 첨가하는 것이 바람직하다.
수소생산효소의 활성은 배양 3-5일 때 가장 높은 활성을 보이고, 이후 감소한다. 따라서 3-4일 동안 배양 후 균체를 수확하여 수소생산효소를 정제하는 것이 좋다.
본 발명에 의하면 티오캅사 로세오페르시키나 배양액을 초음파 분쇄하여 세포질 분획을 얻고 분획물로부터 수소생산효소를 정제할 수 있다.
본 발명에 의하면 수소생산효소는 상기 분획물을 초원심분리(ultracentrifuge)하여 하이드로게나아제 분획을 얻는 단계; 세포질 분획을 암모늄 설페이트 분획하여 비활성의 하이드로게나아제 분획을 얻는 단계; 60±5℃에서 20±5분 동안 열처리하여 비활성 수소생산효소를 얻는 단계; 큐 세팔로스(Q sepharose) 크로마토그래피 단계; 페닐 수퍼로즈 (Phenyl Superose) 크로마토그래피 단계; 모노(Mono)-Q 크로마토그래피 단계; 수퍼덱스 200(superdex 200) 크로마토그래피 단계; 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동 하는 단계를 통하여 수소생산효소의 정제할 수 있다.
먼저, 티오캅사 로세오페르시키나 배양액을 초음파 분쇄하여 얻은 세포질 분획을 80,000rpm(400,000g)으로 1시간 동안 초원심분리(ultracentrifuge)하여 하이드로게나아제 분획을 얻고, 암모늄 설페이트 분획을 하여 수소생산효소를 분리정제 한다. 암모늄 설페이트 35-60% 농도에서 가장 높은 비활성의 수소생산효소 분획을 얻을 수 있다.
상기 수소생산효소를 60±5℃에서 20±5분간 열처리하여 비활성 수소생산효소를 얻는다. 수소생산효소는 열처리 시 수소생산효소의 비활성이 약 2배 정도 증가하므로 더욱 안정화된다.
상기 단계에서 얻은 비활성 수소생산효소를 큐 세팔로스(Q sepharose) 크로 마토그래피, 페닐 수퍼로즈 (Phenyl Superose) 크로마토그래피, 모노(Mono)-Q 크로마토그래피, 수퍼덱스 200(superdex 200) 크로마토그래피 단계, 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동을 단계적으로 실시하여 정제도를 증가시키고 수소생산효소의 비활성도를 높일 수 있다.
이하 본 발명의 내용을 실시 예에 의해 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 다만, 이들 실시 예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시 예에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다.
[실시예 1] 티오캅사 로세오페르시키나 NCIB 8347의 배양
홍색 유황 세균인 티오캅사 로세오페르시키나 NCIB 8347은 최소배지인 페니그 배지(ℓ당CaCl2·2H2O 0.25g, NH4Cl 0.34g, KCl 0.34g, MgSO4·7H2O 1.025g, KH2PO4 0.34g, Vitamin B12 0.00002g, Na2·EDTA 0.003g, FeSO4·7H2O 0.0011g, CoCl2·6H2O 0.00019g, MnCl2·2H2O 0.00005g, ZnCl2 0.000042g, NiCl2·6H2O 0.000024g, Na2MoO4·2H2O 0.000018g, H3BO3 0.0003g, CuCl2·2H2O 0.000002g, NaHCO3 1.5g, Na2S·9H2O 0.4g, Mg-acetate 0.125g, Ammonium-acetate 0.125g)에서 2%의 이산화탄소를 함유한 질소를 공급하며 26℃에서 광합성 독립영양 배양 시 세포질 내에 수소발생 효소인 하이드로게나아제(hydrogenase)를 발현한다. 그러나 상기의 조건에서는 균 체의 생장속도가 매우 느려 일주일 배양 시 0.3g 건조균체량/L-배양액이 생성된다. 따라서 본 발명에서는 균체의 생장을 촉진하기 위해 페니그 배지에 0.05% 아세테이트를 탄소원으로 추가하여 배양시간의 경과에 따른 균체 성장과 이때 균체에서 분리한 하이드로게나아제의 활성 변화를 도 1a에서와 같이 측정하였다. 배양 20시간까지 지수성장기가 계속되었으며, 0.33g(건조균체량/L 배양액)의 균체 성장을 보였다. 균체의 성장에 따라 하이드로게나아제의 비활성은 증가하여 배양 18시간이 경과한 지수성장기 후반에 가장 높은 수소생산 효소 비활성을 보였다. 배양 초기 4시간은 하이드로게나아제 활성이 나타나지 않았지만, 이후에 균체 대수성장기에는 하이드로게나아제 비활성의 급격한 상승을 보였고, 이후 배양 시간 경과에 따라 효소의 활성은 급격히 감소하여서, 배양 20시간 후에는 비활성의 60%만이 남아 있었다. 이와 같은 현상은 티오캅사 로세오페르시키나가 젖산과 글루타믹산을 각각 탄소원 전자 공여체 및 질소원으로 공급하는 광합성 종속 영양조건으로 배양할 때와 상이하였다. 광합성 종속 영양 배양에서는 수소가 균체의 지수성장기 후반부터 생성되어 균체 성장이 끝난 후에도 지속되었다. 이와 같은 현상은 수소를 발생하는데 주로 나이트로게나아제(nitrogenase)가 관여하기 때문이며, 균체가 최대로 성장한 후 질소원이 고갈될 때, 나이트로게나아제가 양성자를 수소로 환원하여 발생한다.
정리하면 탄소원으로 아세테이트의 첨가는 균체의 최대 생장속도를 7일에서 1일로 7배 증가시켰고, 이로부터 얻어진 하이드로게나아제의 비활성역가(specific activity)는 유사한 것으로 미루어 7배 많은 하이드로게나아제 양을 확보하였다.
또한, 균체의 생장속도와 비례적으로 높은 농도 및 활성의 하이드로게나아제 를 얻기 위해 균체의 생장과 효소의 발현에 필요한 3가지 필수 영양소인 아세테이트 (0.5g/ℓ), 암모늄 클로라이드 (0.34g/ℓ), 미량원소 (Na2S·9H2O 1.5g/ℓ, Na2·EDTA 0.003g/ℓ, FeSO4·7H2O 0.0011g/ℓ, CoCl2·6H2O 0.00019g/ℓ, MnCl2·2H2O 0.00005g/ℓ, ZnCl2 0.000042g/ℓ, NiCl2·6H2O 0.000024g/ℓ, Na2MoO4·2H2O 0.000018g/ℓ, H3BO3 0.0003g/ℓ, CuCl2·2H2O 0.000002g/ℓ)를 24시간 간격으로 첨가하면서 3주 동안 균체의 생장과 하이드로게나아제의 활성을 측정하였다(도 1b). 그 결과 균체의 성장은 16일간 지속적으로 증가하여 4.5g(건조균체량/ℓ 배양액)의 균체 농도를 보였고 이후 정체기에 이르렀다. 이에 반해 하이드로게나아제의 활성은 배양 3-5일 (72-120 시간)일 때 가장 높은 활성을 보이고, 이후 감소하여 7일째부터는 최대 활성의 60% 정도를 계속 유지하였다. 이상의 결과로부터 균체는 3-4일간의 배양 후 수확하여 이용하였다.
[실시예 2] 하이드로게나아제의 정제
(1) 세포 추출액
T. roseopersicina NCIB 8347 배양액을 5,000×g에서 20 분간 원심분리하여 균체를 모은 후, 균체를 50mM K-phosphate 완충액 (pH 7.0)에 현탁하여 초음파로 세포벽을 파쇄하였다. 파쇄액을 16,000rpm에서 20분간 원심분리 하여 상등액(세포 추출액)을 얻었고, 이를 다시 80,000rpm(400,000g)으로 1시간 동안 초 원심분리하여 상등액(세포질 분획)을 준비하였다. 균체의 파쇄 및 원심분리는 모두 4℃와 혐 기 상태에서 이루어졌다.
(2) 암모늄 설페이트 분획
상기에서 얻어진 세포질 분획으로부터 수소생산효소를 분리정제하기 위해 암모늄 설페이트 농도를 0-20%, 20-35%, 35-60%, 및 60% 이상으로 4가지로 나누어 단백질을 분획하였다. 그 결과 암모늄 설페이트 35-60% 농도에서 가장 높은 비활성의 하이드로게나아제 분획을 얻을 수 있었다.
(3) 열처리
T. roseopersicina NCIB 8347의 배양 최적 온도는 25℃이지만 이에서 유래한 하이드로게나아제의 수소생산 활성 최적 온도가 65℃로 내열성이 높았다. 이 효소의 수소생산 활성은 60℃에서 1시간 경과 후에도 초기의 활성을 유지하였으며, 5시간 동안은 10%만이 감소하였다. 또한, 70℃에서 5시간 열처리했을 때도 40% 활성을 유지하였다.
상기의 결과로부터 내열성이 우수한 하이드로게나아제의 특성을 이용하여 효소를 정제하고자 60℃에서 10분-60분 동안 열처리하여 각각의 단백질 변성도와 잔존 효소활성을 분석하였다(표 1). 각각의 시료는 열처리 후 질소로 치환하며 얼음에서 식힌 후 16,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 변성된 단백질을 제거하고 상등액만을 취하였다. 그 결과 하이드로게나아제는 60℃에서 20분간 열처리 시 수소생산효소의 비활성이 2배 정도 증가하였고, 이후 열처리 시간이 길어짐에 따라 효소 의 불활성화가 진행되었다. 이로부터 열처리 조건은 60℃에서 20분으로 결정하여 향후 정제에 적용하였다.
<표 1> 열처리에 의한 잔존 T. roseopersicina NCIB 8347 하이드로게나아제 역가
| 열처리 시간 (min) | 단백질 (㎎/㎖) | 총 역가 (U/㎖) | 비활성 역가 (U/㎎) | 상대역가 (%) |
| 0 min | 1.61 | 0.257 | 0.160 | 43.24 |
| 10 min | 0.83 | 0.229 | 0.277 | 74.86 |
| 20 min | 0.88 | 0.326 | 0.370 | 100.00 |
| 30 min | 0.81 | 0.265 | 0.327 | 88.38 |
| 60 min | 0.72 | 0.205 | 0.285 | 77.57 |
(4) Q-sepharose 이용 분리
열처리로 얻어진 시료는 음이온 교환 크로마토그라피 Q-sepharose HiLoad 컬럼(2.6×15cm)을 이용하여 FPLC로 정제하였다. Q-sepharose 단계에서는 2개의 부분에서 하이드로게나아제의 활성이 측정되었다. 첫 번째 분획(H-I)은 KCl 0.2- 0.25M 농도에서 용출되었고, 두 번째 분획(H-II)은 KCl 0.4 - 0.45M 농도에서 용출되었다. Q-sepharose 단계에서 H-Ⅰ과 H-Ⅱ의 비활성도가 각각 2.95 U/㎎ 와 2.19 U/㎎ 이었고 정제도는 각각 4배 및 3배 증가하였다(도 2).
(5) Phenyl superose 이용 분리
Q-sepharose로 얻어진 시료는 2M 암모늄 설페이트를 첨가한 K-phosphate 완충액(50mM, pH 7.0)를 0.5㎖/min의 속도로 흘려 평형에 이르게 하였고, Phenyl Superose(0.5×5cm) 컬럼을 이용하여 정제하였다. H-Ⅰ의 비활성도는 4.35U/㎎이었 고 정제도는 약 6배 증가하였으며, H-Ⅱ의 비활성도는 2.5 U/㎎이었고 정제도는 약 3.4배 증가하였다(도 3a, 3b).
(6) Mono-Q를 이용한 정제
페닐 수퍼로즈(Phenyl superose)에서 얻어진 활성 분획은 Mono-Q (0.5x5cm) 컬럼을 이용하여 정제하였다(도 4a, 4b). 컬럼의 경우 H-I은 Tris-HCl 완충액 (20mM, pH 7.5)을 H-Ⅱ는 Tris-HCl 완충액 (20mM, pH 8.0)을 1 ㎖/min의 속도로 흘려 평형에 이르게 하였다. H-Ⅰ의 비활성도는 7.47 U/㎎이었고 정제도는 약 10배 증가하였다. H-Ⅱ 비활성도는 4.02 U/㎎이었고 정제도는 약 5.5배 증가하였다.
(7) Gel filtration chromatography (superdex 200) 이용 농축
하이드로게나아제 활성을 함유한 분획을 모아 농축한 후 150mM KCl을 함유한 인산완충액 (50mM, pH 7.0)으로 평형에 이른 Superdex 200 (1×30cm) 컬럼에 적용하였다(도 5a, 5b). H-Ⅰ의 비활성도는 9.17 U/㎎이었고 정제도는 약 12.6배 증가하였으며, H-Ⅱ의 비활성도는 7.26 U/㎎이었고 정제도는 약 10배 증가하였다.
(8) 전기영동에 의한 정제
상기에서 얻어진 H-Ⅰ과 H-Ⅱ는 10% 폴리아크릴아마이드 젤(polyacrylamide gel)에서 전기영동에 의한 정제(preparative electrophoresis)를 이용하여 순수분리되었다.
각 단계에서 얻은 물질을 Native PAGE로 분석한 결과를 도 6a(Lane 1, phenyl superose; lane 2, mono Q; lane 3, superdex 200; lane 4, prep electrophoresis), 6b(Lane 1, phenyl superose; lane 2, mono Q; lane 3, superdex 200; lane 4, prep electrophoresis)에 나타내었다. 도 6a, 6b에 나타난 바와 같이 마지막 전기영동에 의한 정제에서 순수한 하이드로게나아제가 분리되었다.
위의 효소 분리 정제과정을 모두 정리하면 표 2와 같다.
<표 2> T. roseopersicina로부터 수소생산효소 분리정제 과정 및 활성 비교
| 정제 단계 | 총 부피 (㎖) | 총 활성도 (U) | 총 단백질 (㎎) | specific 활성도 (U/㎎) | 정제배수 (purification fold) | 정제효율 (Yield) | |
| 초음파 처리 | 1437 | 8547 | 11699 | 0.73 | 1 | 100 | |
| 초원심분리 (Ultracentrifuge) | 1360 | 3703 | 3584 | 1.03 | 1.41 | 43.33 | |
| 암모늄 설페이트 분획 | 100 | 1892 | 1639 | 1.15 | 1.58 | 14.0 | |
| 열처리 | 80 | 507.74 | 664 | 1.41 | 1.93 | 8.14 | |
| Q-sepharose | Ⅰ | 40 | 210.25 | 71.23 | 2.95 | 4.04 | 2.46 |
| Ⅱ | 40 | 225.64 | 103.2 | 2.19 | 3.00 | 2.64 | |
| Phenyl superose | Ⅰ | 20 | 102.3 | 23.53 | 4.35 | 5.96 | 1.2 |
| Ⅱ | 20 | 98.2 | 39.19 | 2.50 | 3.42 | 0.82 | |
| Mono Q | Ⅰ | 10 | 36.5 | 4.89 | 7.47 | 10.23 | 0.43 |
| Ⅱ | 6 | 32.23 | 8.01 | 4.02 | 5.51 | 0.38 | |
| Superdex 200 | Ⅰ | 2.5 | 13.32 | 1.45 | 9.17 | 12.56 | 0.16 |
| Ⅱ | 2 | 21.75 | 2.99 | 7.26 | 9.95 | 0.25 | |
본 발명에 의하면 광합성세균인 티오캅사 로세오페르시키나를 탄소원으로 아 세테이트를 첨가한 배지에 배양함으로써 수소생산효소를 고농도로 생산할 수 있다. 또한, 본 발명의 수소생산 효소를 정제하는 방법에 의해 티오캅사 로세오페르시키나 배양물로부터 활성이 안정한 수소생산효소를 정제할 수 있다.
Claims (3)
- 삭제
- 광합성세균인 티오캅사 로세오페르시키나를 광합성 독립영양 배양한 배양액을 원심분리하여 얻은 균체에 초음파 처리하여 균체를 파쇄하는 단계;상기 균체 파쇄액을 암모늄 설페이트 60%에 침전하여 비활성 수소생산효소 분획을 얻는 염용해도 분획 단계;상기 염용해도 분획 단계를 거쳐 얻어진 분획을 55-65oC에서 15-25분 동안 열처리하는 단계;상기 열처리 단계를 거쳐 얻어진 분획을 KCl을 용매로 사용한 음이온 교환 크로마토그래피하는 단계;상기 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 거쳐 얻어진 분획을 2M 암모늄 설페이트를 첨가한 인산칼륨 완충액 (50 mM, pH 7.0)을 용매로 사용한 소수성 상호반응 크로마토그래피하는 단계;상기 소수성 상호반응 크로마토그래피 단계를 거쳐 얻어진 분획을 20 mM Tris-HCl 완충액을 용매로 사용한 음이온 교환 크로마토그래피하는 단계;상기 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 거쳐 얻어진 분획을 150 mM KCl을 함유한 인산완충액 (50 mM, pH 7.0)을 용매로 사용한 겔여과 크로마토그래피하는 단계;상기 겔여과 크로마토그래피하는 단계를 거쳐 얻어진 분획을 10% 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동하는 단계; 를 포함하는 수소생산효소의 정제방법.
- 삭제
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2006
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