KR100747151B1 - 곰팡이 유래 델타-6 불포화효소 유전자 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 Delta-6 불포화효소 유전자의 분리 및 기능분석으로 감마-리놀렌산 생산 유지작물 육종소재 개발에 이용하고자한다.
감마-리놀렌산을 생성하는 곰팡이(Phytophtora citrophthora, KACC No.40188) 속에서 total RNA를 분리하여 cDNA를 작성하였다. 이 cDNA를 이용하여 감마리놀렌산 생성에 관여하는 delta 6 desaturase유전자의 프로브를 PCR을 이용하여 클로닝하여 염기서열을 결정하였다. 확보된 염기서열을 바탕으로 5'- 및 3‘-RACE PCR 방법을 이용하여 완전한 크기의 유전자를 분리하였다. 이 유전자를 효모 발현용 운반체인 pYES2 운반체에 삽입하고 효모에 형질전환하여 유전자발현 산물을 가스크로마토그라피를 이용하여 분석하여 유전자의 기능을 검정하였다.
감마-리놀렌산은 혈중콜레스테롤 수치를 낮춰주며 혈행을 개선하는 생리활성 기능이 많이 알려져 있으며 건강보조식품으로 현재 많이 시판되고 있으며, 본 발명에 따라 감마-리놀렌산 생성에 관여하는 delta-6 불포화효소 유전자를 분리하여 효모에서 기능 확인하고 이를 들깨 등 유지작물에 형질전환할 경우 기존의 유지작물에서는 생성되지 않는 고부가의 기능성 감마-리놀렌산을 생산하는 작물을 육성하여 농가소득 제고에 기여할 수 있다.
곰팡이균(Phytophtoora), Delta-6 desaturase, pYes2. Saccharomyces cervisiae
Description
도 1은 RACE PCR에 의한 delta 6 desaturase 유전자의 클로닝 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 완전한 크기의 delta 6 desaturase 유전자 클로닝 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 곰팡이에서 분리한 delta-6 불포화효소 유전자의 염기서열 및 추정 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 4는 Delta 6 desaturase 유전자 발현 효모 운반체 확인결과를 나타낸 것이다.
도 5는 Delta-6 불포화 효소 유전자 형질전환 효모의 지방산 분석을 나타낸 것이다.
도 6은 pYES2와 pYES2-D6 형질전환 효모의 지방산 분석 크로마토그램을 나타낸 것이다.
본 발명은 기능성 유전자를 분리하고 유전자의 기능을 확인하는 기술이다. 지금까지 동물, 미생물에서 분리된 delta-6 불포화효소 유전자는 phythium 속, Mucor속 및 Phyzopus 속 등에서 기능 분석이 다수 있으나, 대부분의 곰팡이는 동물에서도 병을 일으키는 원인균이 되었으며, 식물에서 병을 일으키는 원인균으로 형질전환 작물 개발시 잠재적 위험성이 기존의 다른 곰팡이보다 낮은 Phytophthora속에서는 보고된 바가 없다.
본 발명은 기존의 phythium속에서 분리한 유전자와 64%만 아미노산 수준에서 동일성을 갖고, 다른 식물 및 곰팡이 등에서 분리한 유전자와 50%미만의 상동성을 가지는 것으로 기존에 보고된 것과는 상이하므로, 이로부터 Delta-6 불포화효소 유전자를 분리하여 그 기능을 확인하고, 이를 이용하여 들깨, 콩 등의 유지작물에 형질전환하여 기능성 작물을 육성하는데 이용하고자 한다.
본 발명의 유전자는 Phytophthora에서는 처음 분리된 유전자로 기타 기존에 보고된 유전자와 상동성이 60%이하로, 기능은 유사하나 구조가 상이한 것이이다.
곰팡이(Phytophthora)에서 RACE PCR방법을 이용하여 delta-6 불포화효소 유전자 클론을 선발하여 유전자의 염기서열을 결정하였다. 분리된 유전자를 효모 발현운반체인 pYES2 운반체에 삽입하고 효모에 형질전환하여 유전자발현 산물의 기능을 검정하였다.
이하 실시예를 통해 본 발명을 자세히 설명하지만, 본 발명의 보호범위가 하 기 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예
1: 곰팡이(
Phytophthora
) 유래
delta
-6 불포화효소 유전자 분리 및 염기서열분석
곰팡이(Phytophthora)에서 감마리롤렌산의 생성에 관여하는 delta 6 desaturase 유전자를 5‘-RACE, 3-RACE방법(SMART RACE cDNA Amplification kit)을 이용(도 1)하여 full length clone을 확보(도 2)하고 서열번호 1에 나타낸 염기서열을 결정하였다(도 3).
실시예
2:
Delta
-6 불포화효소 유전자의 효모 발현 형질전환 운반체 제작 및 형질전환 확인
Delta-6 불포화효소 유전자의 기능을 확인하기 위하여 분리된 유전자를 효모 형질전환용 운반체 pYES2/CT에 삽입하였다. pYES2/CT는 대장균 및 효모에서 선발 마커로 각각 ampicillin 저항성 유전자와 uracil 생합성 유전자를 가지고 있다.
Delta-6 불포화효소 유전자를 GAL1 promoter와 CYC1 terminator 사이의 multicloning site의 HindIII와 BamHI site에 삽입하여 제작하였다. 운반체작성은 대장균에서 delta 6 desaturase 유전자를 삽입후 HindIII/BamHI 으로 절단 후 확인하고 염기서열의 연결부위는 sequencing으로 확인하였다(도 4). 효모발현용 운반체는 lithium acetate법을 이용하여 Saccharomyces cerevisiae에 형질전환하고 uracil이 결핍된 최소배지를 이용하여 선발하였으며 신규한 균주로서 농업생명공학 연구원에 기탁하였다(KACC 93044P).
실시예
3:
Delta
-6 불포화효소 유전자 형질전환 효모의 감마-리놀렌산 생합성 검정
Delta-6 desaturase 유전자가 삽입된 효모를 이용하여 유전자의 기능을 확인하기 위하여 uracil 결핍최소배지에 raffinose와 tergitol NP-40을 첨가한 배지에 형질전환 효모를 30℃에서 시드 배양(seed culture)하였다. 시드 배양한 효모를 새로운 배지에 접종한 후 OD 600 = 0.5-0.6까지 배양하고 기질로 리놀렌산(18:2, Δ9,12)및 알파-리놀렌산(18:3, Δ9,12,15)을 첨가하고 inducer로 갈락토스(galactose)를 첨가하여 25℃에서 2일간 배양하면서 유전자의 발현을 유도하였다. 대조구는 pYES2 운반체만 형질전환된 효모를 이용하였다. 갈락토스에 의해서 유도되는 delta-6 불포화효소 유전자 산물의 활성이 효모가 흡수한 기질인 리놀렌산(18:2, Δ9,12)과 알파-리놀렌산(18:3, Δ9,12,15)의 6번째 탄소에 이중결합을 형성할 수 있는지를 여부를 가스크로마토그라피를 이용하여 확인하였다.
시험결과 첨가된 리놀렌산(18:2, Δ9,12)은 감마-리놀렌산(18:3, Δ,6,9,12)으로 변환하였으며 알파-리놀렌산(18:3, Δ9,12,15)은 스테아리돈산(stearidonic acid) (18:4, Δ6,9,,12,15)으로 변환됨을 확인하였다. 또한, 효모에 내재되어 있는 16:1(Δ 9) 지방산은 16:2(Δ6,9) 지방산으로 변환되었음을 확인하였다(도 5 및 도 6). 상기의 결과로 곰팡이에서 분리된 delta-6 불포화효소 유전자 산물은 감마-리놀렌산(18:3, Δ6,9,12)을 생합성하는데 관여함을 확인하였다.
Delta-6 불포화효소 유전자를 효모발현 운반체인 pYES2의 갈락토스 유도 프로모터(promoter)의 조절을 받도록 운반체를 제작하여 효모에 형질전환하고, 기질인 리놀산을 투여하여 배양했을 때 대조구에서는 생합성되지 않는 감마-리놀렌산이 합성됨을 확인하였다. 감마-리놀렌산은 생리활성 기능이 많이 알려져 있고 현재 고부가 건강식품으로 시판되고 있다. 따라서 본 발명에 의해 분리된 delta-6 불포화효소 유전자의 기능을 확인하여 들깨 등 유지작물에 이용할 경우 고부가의 기능성 감마-리놀렌산을 생산하는 유지작물들이 개발되어 농가소득 제고에 기여하게 될 것이다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (3)
- 곰팡이(Phytophthora)에서 유래한 서열번호 1에 기재된 delta-6 불포화효소 유전자.
- 청구항 1의 유전자를 포함하는 서열번호 2에 기재된 감마-리놀렌산 생산 운반체.
- 청구항 1의 유전자를 삽입하여 제작된 감마-리놀렌산 생산을 위한 효모(Saccharomyces cerevisiae) 형질전환체(KACC 93044P).
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20020073580A (ko) * | 2000-02-09 | 2002-09-27 | 바스프 악티엔게젤샤프트 | 신규 연장효소 유전자 및 다가불포화 지방산의 제조 방법 |
| KR20060079397A (ko) * | 2004-12-31 | 2006-07-06 | 대한민국(관리부서:농촌진흥청) | 녹차 어린잎 유래 델타-6 불포화효소 유전자, 이 유전자를포함하는 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 형질전환체및 이 형질전환체의 제조방법 |
-
2007
- 2007-01-11 KR KR1020070003115A patent/KR100747151B1/ko active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20020073580A (ko) * | 2000-02-09 | 2002-09-27 | 바스프 악티엔게젤샤프트 | 신규 연장효소 유전자 및 다가불포화 지방산의 제조 방법 |
| KR20060079397A (ko) * | 2004-12-31 | 2006-07-06 | 대한민국(관리부서:농촌진흥청) | 녹차 어린잎 유래 델타-6 불포화효소 유전자, 이 유전자를포함하는 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 형질전환체및 이 형질전환체의 제조방법 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 대한민국공개특허공보 제2002-0073580호(2002.09.27.) |
| 대한민국공개특허공보 제2006-0079397호(2006.07.06.) |
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