KR100717900B1 - 캄프토테신 유사체 및 그 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
화합물은 라세미 형(racemic form), 거울상 이성질체 풍부형 (enantiomerically enriched form) 또는 거울상 이성질체 순수형(enantiomerically pure form)의, 구조식(1)을 가진다. R6는 -Si(R8R9R10) 또는 -(R7)Si(R8R9R10)인 것이 바람직하며, 여기서 R7는 알킬렌기, 알케닐렌기, 또는 알키닐렌기이고 R8, R9 및 R10은 독립적으로 C1-10 알킬기, C2-10 알케닐기, C2-10 알키닐기, 아릴기 또는 -(CH2)NR11기(여기서 N은 1 내지 10의 정수이고 R11은 히드록시기, 알콕시기, 아미노기, 알킬아미노기, 디알킬아미노기, 할로겐 원자, 시아노기, -SRc 또는 니트로기임)이다. R1-R4는 폭넓게 치환될 수 있다. R5는 C1-10 알킬기, 알케닐기, 알키닐기 또는 벤질기가 바람직하다. 바람직하게, R13은 H, F 또는 -CH3이다. R16은 -C(O)Rf 또는 H이다. E-고리(락톤 고리)는 열릴 수 있다. 화합물 (1) 합성 방법 및 그 합성에 있어서의 중간체를 제공한다.
Description
본 발명은 신규한 화합물 및 그 제조 방법에 관한 것으로, 특히 E-고리가 확장된(expanded) 캄프토테신 유도체(derivative) 또는 유사체(analog) 및 상기 캄프토테신 유사체의 제조 방법에 관한 것이다.
캄프토테신(camptothecin)은 현재 항암제로서 사용되고 있으며, DNA 토포이소머라제 I 저해제이다. 토포테칸(topotecan, tpt)과 CPT-11은 캄프토테신 계통(family)으로는 최초로 미국연방 식품의약국(Food and Drug Administration)의 완전한 승인을 얻은 두 약제이다 (1996년 토포테칸은 진행성 상피 난소암의 2차 요법에 사용되었고, 다시 1998년에는 소세포 폐암 치료에 사용되었으며, CPT-11은 1998년에 결장암의 1차 요법에 사용되었다). 캄프토테신의 몇몇 다른 유사체, 예컨대 GI-147211C, DX8951f, 9-아미노캄프토테신(9-aminocamptothecin, 9-AC) 및 9-니트로캄프토테신(9-nitrocamptothecin) 등은 여러 공정의 전임상 및 임상 평가상에 있다. 임상적인 이용에 있어 각각의 캄프토테신은 혈류 내에서 상대적으로 빠르게 가수분해되어 항암 활성의 두드러진 손상을 가져온다. 생리적 pH에서 가수분해되어 생물학적으로 불활성이며 잠재적으로 독성 있는 히드록시 카르복실레이트 형태를 얻는 것이 바로 임상적으로 적절한 캄프토테신 내의 주요 α-히드록시락톤 약물작용 발생단(pharmacophore)이다. Fassberg, J. and Stella, V.J., " A Kinetic and Mechanistic Study of the Hydrolysis of Camptothecin and Some Analogues", J. Pharm. Sci. 81: 676-684 (1992); Hertzberg, R.P., Caranfa, M.J., and Hecht, S.M., "On the Mechanism of Topoisomerase I Inhibition by Camptothecin: Evidence for Binding to an Enzyme-DNA Complex", Biochemistry 28: 4629-4638 (1989); Hsiang, Y-H., and Liu, L.F., "Identification of Mammalian DNA Topoisomerase I as an Intracellular Target of the Anticancer Drug Camptothecin", Cancer Res. 48: 1722-1726 (1988); and Jaxel, C., Kohn, K.W., Wani, M.C., Wall, M.E., and Pommier, Y., "Structure-Activity Study of Camptothecin Derivatives on Mammalian Topoisomerase I: Evidence for a Specific Receptor Site and a Relation to Antitumor Activity", Cancer Res. 49: 5077-5082 (1989). 상기 열거된 참고문헌을 포함하여 본원에 열거되어 있는 참고문헌은 본 발명의 이해를 촉진시킬 수 있다. 본 명세서에 상기 참고문헌을 포함시켰다 해서, 상기 참고문헌이 본 발명의 선행기술이라는 것을 인정하는 것은 아니다.
캄프토테신 및 그에 관한 몇몇 중요한 유사체의 구조가 하기에 도시되어 있다.
9-아미노캄프토테신 및 캄프토테신(cpt) 등의 제제는 그것의 카르복실레이트 형과 사람의 혈청 알부민(human serum albumin, HSA) 간의 강한 친화 결합 상호작용으로 인하여 사람의 혈액 내에서 매우 낮은 안정성을 나타낸다는 것이 최근의 연구 노력의 결과 밝혀졌다. Burke, T.G, Mi, Z., Jiang, Y., and Munshi, C.B. "The Important Role of Albumin in Determining the Relative Human Blood Stabilities of the Camptothecin Anticancer Drugs", Journal of Pharmaceutical Sciences, 84: 518-519 (1995); Burke, T.G. and Mi, Z. "The Structural Basis of Camptothecin Interactions with Human Serum Albumin: Impact on Drug Stability", Journal of Medicinal Chemistry, 37: 40-46 (1994); Mi, Z. and Burke, T.G., "Differential interactions of Camptothecin Lactone and Carboxylate Forms with Human Blood Components", Biochemistry, 33: 10325-10336 (1994); and Mi, Z., Malak, H., and Burke, T.G. "Reduced Albumin Binding Promotes the Stability and Activity of Topotecan in Human Blood", Biochemistry, 34: 13722-13728 (1995)는 본원에 참고문헌으로 첨부되어 있다. 주파-도메인 수명 형광법(frequency-domain lifetime fluorometry) 실험은 사람의 혈청 알부민(HSA)이 캄프토테신 락톤에 비해 100배 이상의 찬화력을 가지고 캄프토테신 카르복실레이트와 결합한다는 것을 보여주었다. Mi, Z. and Burke, T.G. "Marked Interspecies Variations Concerning the Interactions of Camptothecin with Serum Albumins: A Frequency-Domain Fluorescence Spectroscopic Study", Biochemistry, 33: 12540-12545 (1994)는 본원에 참고문헌으로 첨부되어 있다. 락톤을 능가하는 카르복실레이트의 이러한 구별되는(differential) 결합으로 인하여 캄프토테신 및 9-AC은 단백질 부재시 보다 HSA 존재시에 더욱 빠르면서도 완전하게 개환된다(open). pH 7.4, 37℃인 사람의 혈장에서, 캄프토테신 및 9-AC는 평형에서 거의 없다시피한(negligible) 0.2%의 락톤 농도에 대해서 빠르면서도 완전하게 개환된다. HSA의 존재로 캄프토테신 및 9-AC의 락톤 개환(ring opening)이 촉진되는 동안, 적혈구 및 지질 이중층(bilayer)은 일반적으로 캄프토테신의 각기 음전하를 띤 카르복실레이트 락톤 형을 능가하여 전기 중성을 띤 락톤 형과 우선적으로 결합한다. Burke, T.G., Staubus, A.E., Mishra, A.K., and Malak, H., "Liposomal Stabilization of Camptothecin's Lactone Ring", J. Am. Chem. Soc. 114: 8318-8319 (1992); and Burke, T.G., Mishra, A.K., Wani, M., and Wall, M., "Lipid Bilayer Partitioning and Stability of Camptothecin Drugs", Biochemistry, 32: 5352-5364 (1993)는 본원에 참고문헌으로 첨부되어 있다. 적혈구와 약제의 상호작용은 따라서 혈액 내 활성 락톤의 정도를 높힌다.
최근, Lavergne 등은 "호모캄프토테신(homocampthecin)"을 생산하기 위한 캄프토테신의 E-고리 팽창(expansion)이 항암 활성을 유지하면서 캄프토테신의 용액 안정성을 증강시킴을 보여왔다. Lavergne, O., Lesueur-Ginot, L., Rodas, F. P., Kasprzyk, P. G., Pommier, J., Demarquay, D., Prevost, G., Ulibarri, G., Rolland, A., Schiano-Liberatore, A.-M., Harnett, J., Pons, D., Camara, J., Bigg, D., "Homocamptothecins: Synthesis and Antitumor Activity of Novel E-Ring Modified Camptothecin Analogs", J. Med. Chem., 41, 5410-5419 (1998); and Lavergne, O., Lesueur-Ginot, L., Rodas, F. P.,and Bigg, D.,"An E-Ring Modified Camptothecin With Potent Antiproliferative and Topoisomerase I inhibitory Activities. Bioorg. Med. Chem. Lett. 7, 2235-2238 (1997). Lavergne 등의 연구에서 E-고리에 대한 변형은 캄프토테신의 자연적으로 발생하는 6각형(6-membered) α-히드록시락톤의 20-OH 작용기(functionality)와 카르복실기 간에 메틸렌 스페이서(spacer)를 삽입(insertion)시키는 것과 연관이 있다. 캄프토테신 내로 신규한 7각형 β-히드록시락톤 고리를 혼입(incorporation)시키는 것이 제제의 용액 및 혈장 안정성을 개선시킨다고 밝혀졌다.
Lavergne 등이 합성한 호모캄프토테신의 구조와 그러한 화합물을 기술하기 위해 사용했던 넘버링 체계(numbering system)가 하기에 도시되어 있다.
캄프토테신 부류 약제의 개발에 있어 실질적인 진전이 있어 왔다 할지라도, 이러한 약제 부류에서 개선된 화합물을 개발하고 그러한 약제를 생산하는 개선된 합성 경로를 개발하는 것이 여전히 남아 있는 목적하는 바이다.
발명의 요약
본 발명은, 일반적으로 라세미 형(racemic form), 거울상 이성질체 풍부형 (enantiomerically enriched form) 또는 거울상 이성질체 순수형(enantiomerically pure form)의, 다음 구조식(1)을 가진 화합물 및 약제학적으로 허용가능한 그의 염을 제공한다.
상기 식 중, R1과 R2는 독립적으로 동일 또는 상이하며 수소, -C(O)Rf(여기서 Rf는 알킬기, 알콕시기, 아미노기 또는 히드록시기임), 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 알콕시기, 아릴옥시기, 아실옥시기, -OC(O)ORd(여기서 Rd는 알킬기임), -OC(O)NRaRb(여기서 Ra 및 Rb는 독립적으로 동일 또는 상이하며, -H, -C(O)Rf, 알킬기 또는 아릴기임), 할로겐, 히드록시기, 니트로기, 시아노기, 아지도기, 포르밀기, 히드라지노기, 아미노기, -SRc(여기서 Rc는 수소, -C(O)Rf, 알킬기 또는 아릴기임)이고; 또는 R1 및 R2는 함께 CH, CH2, O, S, NH, 또는 NR15(여기서 R15는 C1-C6 알킬기임)로 이루어진 군으로부터 선택된 3 또는 4 원(member)의 사슬을 형성하고;
R3는 H, 할로겐 원자, 니트로기, 아미노기, 히드록시기, 또는 시아노기이고; 또는 R2 및 R3가 함께 CH, CH2, O, S, NH, 또는 NR15(여기서 R15는 C1-C6 알킬기임)로 이루어진 군으로부터 선택된 3 또는 4 원(member)의 사슬을 형성하고;
R4는 H, F, 아미노기, C1-3 알킬기, C2-3 알케닐기, C2-3 알키닐기, 트리알킬실릴기 또는 C1-3 알콕시기이고;
R5는 C1-10 알킬기, 알케닐기, 알키닐기 또는 벤질기이고;
R6는 -Si(R8R9R10) 또는 -(R7)Si(R8R9R10)(여기서 R7는 알킬렌기, 알케닐렌기, 또는 알키닐렌기이고 R8, R9 및 R10은 독립적으로 C1-10 알킬기, C2-10 알케닐기, C2-10 알키닐기, 아릴기 또는 -(CH2)NR11기(여기서 N은 1 내지 10의 정수이고 R11은 히드록시기, 알콕시기, 아미노기, 알킬아미노기, 디알킬아미노기, 할로겐 원자, 시아노기, -SRc 또는 니트로기임)이고;
R13은 H, F 또는 -CH3이고;
R16은 -C(O)Rf 또는 H이다.
R1 및 R2는 함께, 예컨대, -O(CH2)nO-기 (여기서 n은 정수 1 또는 2를 나타냄)를 형성할 수 있다. 마찬가지로, R2 및 R3는 함께, 예컨대, -O(CH2)nO-기(여기서 n은 정수 1 또는 2를 나타냄)를 형성할 수 있다.
R5는 에틸기, 알릴기, 벤질기 또는 프로파질기가 바람직하다. 가장 바람직하게는, R5는 에틸기이다. R4는 H가 바람직하다.
하나의 구체예에서, R8 및 R9는 메틸기, R10은 tert-부틸기 또는 메틸기, R1은 H이고 R3은 H이다. 상기 구체예에서, R2는 예컨대 H, NH2, 또는 OH일 수 있다.
R13은 H가 바람직하다. R16은 H 또는 알킬기가 바람직하다. 가장 바람직하게는, R16은 H 또는 -C(O)Rf(여기서 Rf는 알킬기임)이다. R16은 H가 가장 바람직하다.
또한 본 발명은, 연쇄 라디칼 4+1 고리화(cascade radical 4+1 annulation)를 통하여, 다음의 구조식을 가지는 화합물의 합성 방법을 제공하다.
여기서, 전구체
또는 전구체
는 다음의 구조식을 가지는 아릴이소니트릴과 반응한다.
상기 식 중, X는 연쇄 라디칼 반응 또는 비연쇄 라디칼 반응에서 라디칼이 발생되도록 분해시키는 기능기를 포함하는 라디칼 전구체이다. X는 Cl, Br 또는 I가 바람직하다. 가장 바람직하게는, X는 Br 또는 I이다.
또한 본 발명은, 라세미 형(racemic form), 거울상 이성질체 풍부형 (enantiomerically enriched form) 또는 거울상 이성질체 순수형(enantiomerically pure form)의, 다음 구조식을 가지는 화합물 및 약제학적으로 허용가능한 그의 염을 제공한다.
상기 식 중, R12는 H 또는 -C(O)Rf, -C(O)ORd 또는 -C(O)NRaRb가 바람직하다.
추가로 본 발명은, 라세미 형(racemic form), 거울상 이성질체 풍부형 (enantiomerically enriched form) 또는 거울상 이성질체 순수형(enantiomerically pure form)의, 다음 구조식을 가지는 화합물을 제공한다.
및
추가로 본 발명은, 라세미 형(racemic form), 거울상 이성질체 풍부형 (enantiomerically enriched form) 또는 거울상 이성질체 순수형(enantiomerically pure form)의, 다음 구조식을 가지는 화합물을 제공한다.
또한 본 발명은 다음의 구조식을 가지는 화합물을 제공한다.
또한 본 발명은 다음의 구조식을 가지는 화합물을 제공한다.
상기 식 중, R15는 C1-C6 알킬기이다.
추가로 본 발명은, 라세미 형(racemic form), 거울상 이성질체 풍부형 (enantiomerically enriched form) 또는 거울상 이성질체 순수형(enantiomerically pure form)의, 다음 구조식을 가지는 화합물을 제공한다.
상기 식 중, R14는 SiMe3, I, 또는 Br이다.
추가로 본 발명은, 다음의 구조식을 가지는 화합물(하기 식 중, Y는 염소, 브롬, 또는 요오드임)의 합성 방법을 제공하며;
여기서, 상기 화합물의 합성 방법은:
(a) 적절한 산화 분해 조건 하에서, 다음 구조의 에놀 에테르를 처리하여
다음 구조를 가지는 화합물을 형성하는 공정;
(b) 적절한 조건 하에서, 공정 (a)에서 형성된 화합물을 다음 구조를 가지는 유기금속 시약(하기 식 중, M은 Li, Na, K, MgY, 또는 ZnY임)으로 처리하여
MC(R13)(R13)CO2R15
다음 구조를 가지는 화합물을 형성하는 공정
(c) 적절한 조건 하에서, 공정 (b)에서 형성된 화합물을 산으로 처리하여 다음 구조를 가지는 화합물을 형성하는 공정;
(d) 할로겐 탈실릴화의 적절한 조건 하에서, 공정 (c)에서 형성된 화합물을 처리하여 다음 구조를 가지는 화합물을 형성하는 공정;
(e) 탈메틸화를 위한 적절한 조건 하에서, 공정 (d)의 화합물을 산 또는 요오도트리메틸실란으로 처리하여 다음 구조의 화합물을 제공하는 공정;
(f) 무기 리튬 염의 존재 하에, 공정 (e)의 화합물을 리튬 염기 또는 나트륨 염기로 처리하여 질소 원자를 탈양성자화(deprotonation)시키는 공정;
(g) 적절한 조건 하에서, 공정 (f)에서 생성된 탈양성자화된 종(種)을 다음 구조의 화합물(하기 식 중, Z는 I, Br, Cl, 메실레이트기 또는 토실레이트기임)과 반응시켜
다음 구조의 화합물을 형성시키는 공정을 포함하여 이루어진다.
이상 나타낸 바와 같이, β-히드록시락톤기를 포함하는 본 발명의 모든 화합물은 라세미 형, 거울상 이성질체 풍부형 또는 거울상 이성질체 순수형으로 존재한다. 본원에서 열거한 바와 같이 상기 화합물의 구조식은 그러한 형태 각각을 망라하고 또는 포함한다.
본 명세서에서 사용되고 있으며 당업자에게 널리 알려져 있는 용어인 "라디칼 전구체(들)"이라 함은, 분해되어, 연쇄 또는 비연쇄 라디칼 반응의 표준 조건 하에서 라디칼을 생성시키는 관능기를 일반적으로 의미한다. 보통의 라디칼 전구체는 할로겐류(불소 제외), 카르복실산류 및 그 유도체(예컨대 티오히드록사메이트 (thiohydroxamate)), 셀레노페닐(selenophenyl)기, 디아조늄 염(diazonium salt) 등이다. 예컨대, Giese, B. Radicals in Organic Synthesis: Formation of Carbon-Carbon Bonds; Pergamon, Oxford (1986) 참조, 상기 문헌은 참고문헌으로 본원에 첨부되어 있다.
용어 "알킬", "아릴" 및 기타 기들은 달리 명시하지 않으면, 비치환 (unsubstituted)기와 치환(substituted)기 모두를 의미한다. 달리 명시하지 않은 경우, 알킬기는 탄화수소기, 바람직하게는 C1-C15(즉, 1 내지 15 탄소 원자를 가진) 알킬기, 더욱 바람직하게는 C1-C10 알킬기이며 분지(branched)이거나 비분지(unbranched)일 수 있고, 비고리(acyclic) 또는 고리(cyclic)일 수 있다. 또한 상기 알킬기의 정의 및 기타 정의는 상기 기가 또다른 기 상의 치환체인 경우에도 적용된다(예를 들어, 알킬아미노기 또는 디알킬아미노기의 치환체로서의 알킬기). 용어 "아릴"은 페닐 또는 나프틸을 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "할로겐" 또는 "할로"는 플루오로, 클로로, 브로모 또는 요오도를 의미한다.
용어 "알콕시"는 -ORd(여기서 Rd는 알킬기임)를 의미한다. 용어 "아릴옥시"는 -ORe(여기서 Re는 아릴기임)를 의미한다. 용어 아실은 -C(O)Rf를 의미한다. 용어 "알케닐"은 적어도 한 개의 이중 결합, 바람직하게는 2-15개의 탄소 원자, 더욱 바람직하게는 2-10개의 탄소 원자(예컨대, -CH=CHRg 또는 -CH2CH=CHRg)를 함유하는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소기를 의미한다. 용어 "알키닐"은 적어도 하나의 삼중 결합, 바람직하게는 2-15개의 탄소 원자, 더욱 바람직하게는 2-10개의 탄소 원자(예컨대, -C
CRh 또는 -CH2-C
CRh)를 함유하는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소기를 의미한다. 용어 "알킬렌", "알케닐렌", "알키닐렌"은 각각 알킬, 알케닐 및 알키닐기의 이가 형(bivalent form)을 의미한다.
상기 열거한 기들은 여러 종류의 치환체로 치환되어 활성을 보유한 호모캄프토테신 유사체를 합성할 수 있다. 예를 들어, 바람직하게는 알킬기는 벤질기, 페닐기, 알콕시기, 히드록시기, 아미노기(예컨대, 유리 아미노기, 알킬아미노기, 디알킬아미노기 및 아릴아미노기 포함), 알케닐기, 알키닐기 및 아실옥시기 등을 포함하여 하나 이상의 기로 치환될 수 있다. 아미노기(-NRaRb)의 경우에 있어, Ra 및 Rb는 독립적으로 수소, 아실기, 알킬기, 또는 아릴기인 것이 바람직하다. 바람직하게도, 아실기는 알킬기, 할로알킬기(예컨대, 퍼플루오로알킬(perfluoroalkyl)기), 알콕시기, 아미노기 및 히드록시기로 치환될 수 있다(즉, Rf는 알킬기, 할로알킬기(예컨대, 퍼플루오로알킬기), 알콕시기, 아미노기 및 히드록시기이다). 바람직하게도, 알키닐기 및 알케닐기는 알킬기, 알콕시알킬기, 아미노알킬기 및 벤질기 등을 포함하여 하나 이상의 기로 치환될 수 있다(즉, Rg 및 Rh는 알킬기, 알콕시알킬기, 아미노알킬기 및 벤질기 등을 포함하여 하나 이상의 기인 것이 바람직하다).
본원에 사용된 용어 "아실옥시"는 -OC(O)Rd기를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "알콕시카르보닐옥시"는 -OC(O)ORd기를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "카르바모일옥시(carbamoyloxy)"는 -OC(O)NRaRb기를 의미한다.
아미노기 및 히드록시기는 당해 기술 분야에 알려져 있는 보호기(protective group)를 포함할 수 있다. 아미노기의 바람직한 보호기는 tert-부틸옥시카르보닐, 포르밀, 아세틸, 벤질, p-메톡시벤질옥시카르보닐, 트리틸이다. 기타 당업자에게 공지된 적절한 보호기는 Greene, T., Wuts, P.G.M., Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley (1991)에 공표되어 있으며, 상기 문헌은 참고문헌으로 본원에 첨부되어 있다.
일반적으로, R1, R2, R3, R6, R7 및 R8은 생성 캄프토테신 유사체의 활성을 유지하기 위하여 지나치게 부피가 크지 않는 것이 바람직하다. 따라서, R1, R2, R3, R6, R7 및 R8는 독립적으로 약 250 미만의 분자량을 가지는 것이 바람직하다. R1, R2, R3, R6, R7 및 R8는 독립적으로 약 200 미만의 분자량을 가지는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 몇몇 캄프토테신 유사체는 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 술페이트, 포스페이트, 및 니트레이트 등과 같은 무기산을 함유한 염으로서 약제학적 용도로 제조될 수 있다. 또한 캄프토테신 유사체는 아세테이트, 타르트레이트 (tartrate), 푸마레이트, 석시네이트, 시트레이트, 메탄술포네티트, p-톨루엔술포네이트 및 스테아레이트 등과 같은 유기산을 함유한 염으로서 제조될 수 있다. 기타 산은 본 발명의 화합물 및 그 약제학적으로 허용가능한 염의 제조에 있어 중간체로서 사용될 수 있다.
정제, 투여 및 기타 목적으로, E-고리(락톤 고리)는 수산화나트륨 또는 수산화칼슘 등과 같은 알칼리성 금속으로 인하여 개환(open)되어 구조식 (2) 화합물로 나타나는 구조식 (1) 화합물의 개환 E-고리 유사체를 형성할 수 있다. 이렇게 얻어진 중간체는 물에 더욱 잘 녹으며, 산 처리 후에 이를 정제시킴으로써 본 발명의 캄프토테신 유사체의 정제 형(purified form)을 얻을 수 있다.
또한 E-고리를 변형시켜 물 또는 기타 용매에서 상이한 용해도 양상 (profile)을 가지는 구조식 (1) 화합물의 유사체를 생산할 수 있다. 상기 목적을 달성하기 위한 방법은, 히드록사이드 또는 수용성 아미노기로 E-고리를 개환시키거나 수용성기, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜기 또는 아실기와 같은 수용성기로 E-고리의 20번 위치에 히드록시기를 관능화(functionalization)시키는 것을 포함한다. 그러한 기를 호모캄프토테신 유도체 상에 도입하거나 합성의 초기 공정에서 도입할 수 있다. 따라서 제조된 상기 유사체는 전구 약제(pro-drug)로서 작용한다. 즉, 상기 유사체를 살아 있는 생물체에 투여하는 경우, 구조식 (1) 화합물(폐환된 E-고리 구조를 함유하는)을 재생성한다. Greenwald, R.B. et al., J. Med. Chem., 39, 1938 (1996) 참조. 예를 들어, C20의 아실화에서 생기는 알킬 에스테르로 인하여 알킬기가 효소 분해되기 전까지 가수분해되지 않는 보다 친유적인(lipophilic) 전구 약제가 생겨날 것이다.
또한 본 발명은, 구조식 (1) 및/또는 (2) 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 약제학적 유효량으로 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자 치료 방법을 제공한다. 예를 들어, 상기 화합물을 암 및/또는 백혈병으로 고통받는 환자에게 투여할 수 있다. 또한 본 발명의 화합물은 항바이러스(예컨대, 항-HIV)제제 및 구충제로 작용할 수 있다. 구조식 (1) 및/또는 (2) 화합물을 정맥내, 근육내, 경구, 피하, 종양내, (진)피내, 및 비경구 투여 등을 포함하여 통상적인 임의 경로로 투여할 수 있다. 약제학적 유효량 또는 투여량(dosage)은 kg 체중 당 구조식 (1)과 (2) 화합물 중 하나를 0.01 내지 60 mg으로 투여하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 약제학적 유효량 또는 투여량(dosage)은 kg 체중 당 구조식 (1)과 (2) 화합물 중 하나를 0.1 내지 40 mg으로 투여하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 약제학적 유효량 또는 투여량은 항백혈병, 항종양(항암), 항바이러스 및/또는 구충 작용에 효과 있는 구조식 (1) 및/또는 (2) 화합물 중 한가지 양을 함유한다. 활성 성분으로서 구조식 (1) 및/또는 (2) 화합물 중 하나 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 약제학적으로 허용가능한 담체(carrier) 또는 희석제(diluent)와 함께 함유하는 약제학적 조성물 또한 본 발명의 범위에 속한다.
또한 본 발명은 구조식 (1) 및 (2) 중 어느 하나의 화합물과 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물을 제공한다. 예를 들어, 상기 조성물은 0.1 mg 내지 3 g, 바람직하게는 약 0.1 mg 내지 500 mg의 구조식 (1) 및/또는 (2) 화합물을 함유할 수 있으며, 이를 투여하기에 적절한 임의의 형태로 구성할 수 있다.
본 발명의 구조적 변형이 적혈구와 락톤의 상호작용을 촉진시키면서 동시에 캄프토테신 유사체의 카르복실레이트 형과 HSA 간의 강한 친화 결합을 방지하는 것으로 밝혀졌다. 혈장과 혈액에 안정한 캄프토테신을 고안하는데 있어서의 부가적인 고려는 E-고리 구조에 관계되는 것이다. 본 발명의 A, B, E- 또는 B, E-고리 변형된 캄프토테신은 1) 락톤 형을 능가하여 카르복실레이트에 대한 HSA의 매우 우선적인 결합의 제거 또는 이의 최소화를 통하여 HSA 존재시에 증강된 안정성을 나타내고; 2) 적혈구와 약제 중 락톤 형과의 가역적(reversible) 결합을 촉진시킴으로써약제의 가수분해 정도를 늦추거나(slow) 제한하는(restrict), 고도의 친유성을 나 타내며; 3) 수용액에서 개선된 안정성을 나타낸다.
본 발명자는 추가로 혈액에 안정한 실릴-치환된 호모캄프토테신(본원에서 β-히드록시락톤 실라테칸 또는 호모실라테칸(homosilatecan, hST)을 의미함)을 새로이 발견하였다. 본 발명의 유도체는 발명의 명칭이 Camptothecin ANALOGS AND METHODS OF PREPARATION THEREOF이며, 1998년 12월 15일에 출원된, 미국 특허출원 제 09/212,178호 및 발명의 명칭이 NOVEL INTERMEDIATES IN THE SYNTHESIS OF CAMPTOTHECIN AND RELATED COMPOUNDS AND SYNTHESIS THEREOF이며, 1998년 1월 15일에 출원된 미국 특허출원 제 09/007,872호에 열거된 전합성(total synthesis) 접근을 현저하게 변형시켜 제조할 수 있다. 상기 문헌은 참고문헌으로 본원에 첨부되어 있다. 신규한 중간체를 합성하여 본 발명의 연쇄 라디칼 고리화를 수행한다.
아래 구조식에 기술된 바와 같은, 본 발명의 몇가지 모델 화합물은 광범위하게 연구되었다.
본 발명의 신규한 호모캄프토테신은 A, B- 또는 B-고리 변형을 함유하는데, 이 변형은 락톤을 능가하여 카르복실레이트와 사람의 알부민이 우선적으로 결합되는 것을 감소시킨다. 또한 A, B-고리에서의 이러한 변형은 친유성을 두드러지게 증강시키고 혈액 내 존재하는 지질 이중층과 락톤의 결합을 촉진시킨다. 또한 새로운 화 합물은 효능의 손실 없이 제제의 총괄적인 안정성을 향상시키는 확장(expanded) β-히드록시락톤 E-고리를 함유한다. MDA-MB-435 유방암 세포를 사용한 세포독성 분석(assay)에 있어, 본 발명의 E-고리 확장 β-히드록시락톤 실라테칸은 2 내지 115 nM 범위의 IC50값을 나타낸다. 본 발명의 화합물(상기 구조식에 기술되어 있는 몇가지)은, 그 신규한 구조 치환의 결과로서, Lavergne 등이 기재한 제제보다 우수한 사람의 혈장 및 혈액에 대한 안정성을 가진다.
본 발명의 신규한 A, B, E-고리 변형 및 B, E-고리 변형 캄프토테신 합성은 지금껏 확인된 고유 효능(intrinsic potency)을 보이며, 혈액에 가장 안정한, 캄프토테신의 확인을 이끌어 냈다. 상기 새로운 제제의 부가적인 잇점은 이들이 Mi, Z. and Burke, T.G. "Marked Interspecies Variations Concerning the Interactions of Camptothecin with Serum Albumins: A Frequency-Domain Fluorescence Spectroscopic Study", Biochemistry, 33: 12540-12545 (1994)에 기술되어 있는 9-AC 및 캄프토테신과 달리, 혈액 안정성에 있어 임의의 종 간(interspecies)에 현저한 변화를 보이지 않는다는 점이다. 이러한 대단히 매력적인 특징은 동물 모델에서 개발된 투여 일정과 실험 관찰의 임상으로의 이동 및 약물 개발 공정을 촉진시켜야 한다.
제조 방법
본 발명의 구조식 1 화합물은 도 1 및 2에 개괄된 합성도에 따라 제조할 수 있다. 도 1은 구조식 1 화합물을 제조하는데 사용될 수 있는, 주요(key) 요오도피리돈(iodopyridone) 9의 합성을 나타낸다. 9의 합성은 캄프토테신 및 유사체 합성의 중간체인 에놀 에테르 3으로부터 출발한다. 본원에 참고문헌으로 첨부되어 있는 미국 특허출원 제 09/007,872호를 참조한다. 탈히드록실화에 이은 산화 분해로 케토 포르메이트 5를 얻고, 다음으로 레포마트스키(Reformatsky) 반응에 의하여 이를 연장시켜(extend) 6을 얻는다. 편리하게도, 포르밀기가 이 반응에서 분해되고, 산이 t-부틸 에스테르의 분해를 직접적으로 촉진시켜 β-히드록시락톤 7이 생긴다. 그런 다음, 상기 화합물은 1)요오드화 탈실릴화, 및 2)탈메틸화 순서에 의하여 요오도피리돈 9로 전환(conversion)된다.
도 2a는 요오도피리돈 9가 몇가지 모델 AB 변형 호모캄프토테신 유도체로 전환되는 것을 보여준다. 최적의 조건 하에서 진행된 9의 N-프로파질화는 라디칼 전구체 10a, b를 제공한다. 표시된 이소니트릴을 함유한 상기 전구체의 연쇄 라디칼 고리화로 인하여 산물 1a, c, e, g, h를 얻는다. 그런 다음 산물 1a, c, e를 표준 방법에 의하여 비보호시켜 표시된 총괄 수율로 표적 약제 후보(candidate)인 1b, d, f를 얻는다. 화합물 1g 및 1h는 비보호를 필요로 하지 않는다. 본 발명의 추가 신규 화합물의 합성은 본 적용의 실시예 편에 기술되어 있다.
Lavergne과 그 연구자들은 호모실라테칸 유도체를 제조하는 두 가지 방법을 공표하였으나, 양자 모두 심각한 제약을 가진다. 첫 번째 제약은 정상 락톤의 비집합(disassembly)과 동족화된(homologated) 락톤의 재집합(reassembly)과 관련된 일련의 공정에 의하여 표준 캄프토테신 유도체를 호모캄프토테신 유도체로 전환시키는 것과 연관이 있다. 이러한 경로는 현존 캄프토테신을 출발물질로 요하기 때문에 제약이 따른다. 게다가, 다수의 현존 캄프토테신 유도체는 락톤 개조(refashioning)의 모진(harsh) 조건에서 잔존할 것으로 기대되지 않는 치환체에 영향을 미친다. 상기 과정은 환원, 산화, 강산, 및 강염기 공정을 요한다. 두 번째 경로는 팔라듐 촉매 사이클화(palladium catalyzed cyclization)로 고리 C를 형성하는 전 합성(total synthesis)과 연관이 있다. 이러한 경로는 A-고리 전구체의 이용가능성 및 그 전구체 상의 치환체가 합성의 많은 부수 공정에서 잔존하는 능력에 의하여 제약을 받는다. 게다가, 그 합성은 본원에 기술된 치환체를 포함한, 다수의 B 고리 치환체의 도입 가능성을 제공하는 것으로 보이지 않는다.
대조적으로, 본 발명의 라디칼 연쇄 합성도는 보다 더욱 허용 오차가 있고(tolerant) 가동적이며(flexible), 예컨대 도 2b에 도시된 바와 같이, 많은 A-, B-, 또는 A/B 치환 형태를 함유한 호모캄프토테신 유도체를 제조하는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, 여러 가지 시약을 헥사메틸디틴(hexamethylditin), 헥사메틸디실란(hexamethylsilane), 또는 테트라키스(트리메틸실릴)실란(tetrakis (trimethylsilyl)silane) 등을 포함하여 라디칼 연쇄에 사용할 수 있다. 상기 반응의 에너지원은 태양 램프 또는 자외선 램프일 수 있다. 온도는 대략 25에서 150℃로 정하는(set) 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 온도는 약 70℃로 정하는 것이 바람직하다. 일반적으로 라디칼 연쇄에 대한 비활성(inertness) 이외에 사용 용매를 선택하는 데 제한은 없다. 바람직한 용매에는 벤젠, 톨루엔, 벤조트리플루오라이드, 아세토니트릴, THF 및 tert-부탄올 등이 있다. 또한, 본 발명의 합성도에 서 알킨(R6)과 이소니트릴(R1-R4) 상의 치환체를 선택하는 데 있어서는 매우 폭넓은 허용범위(latitude)가 있는데, 이는 반응 조건의 온화함(mildness) 때문이다. 또한, 적절한 프로파질 유도체가 쉽사리(readily) 제조되지 않는 드문 경우에 있어서는, 알릴 유도체를 대신 치환시킬 수 있고, 비록 낮은 수율이지만, 동일한 최종 산물을 형성한다.
또한 C20(R5) 상의 치환체는 쉽게 이용가능한 알릴 알코올류로부터 유래하므로 넓게 변화시킬 수 있다. 또한 치환된 에스테르류는 라포마스키 반응에 사용하여 C20a(R13) 상에 치환체를 함유하는 화합물을 제공할 수 있다. 본 발명의 화합물을 화학요법(chemotherapy)용으로 라세미 형태로 사용할 수 있는 동안에는, C20에 배타적으로(exclusively) 또는 우세하게(predominately) 생물학적으로 활성 있는 거울상 이성질체인 시료를 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 절대적인 배치 지정(configuration assignment)을 위한 Cahn-Ingold-Prelogs Rule의 우선사항(priorities)의 변화 때문에, 일반적으로 표준 캄프토테신의 C20S 거울상 이성질체는 대응 호모캄프토테신의 C20 R 거울상 이성질체와 같은 상대 구조를 가진다. 호모캄프토테신 유도체의 라세미 시료 또는 강화 거울상 이성질체 시료는 상업적으로 입수 가능한 키랄 컬럼(chiral column)을 사용한 액체 크로마토그래피 표준 방법에 의하여 그 개별 성분으로 분리시킬 수 있다. Lavergne, O.; et al., "Homocamptothecins: Synthesis and Antitumor Activity of Novel E-Ring Modified Camptothecin Analogs," J. Med. Chem., 41, 5410-5419 (1998) 참조.
캄프토테신의 사람 혈액에 대한 안정성 및 높은 효능을 가진 혈액에 안정한 호모실라테칸의 이론적인 설계(rational design)의 기본원리
최근, 사람 혈액 성분과 그들의 현저히 상이한 상호작용을 설명하기 위하여 캄프토테신 및 관련 유사체의 락톤 형 및 카르복실레이트 형의 고유 형광 방출에 대하여 연구되어 왔다. Burke, T. G. and Mi, Z., Ethyl substitution at the 7 position extends the half-life of 10-hydroxycamptothecin in the presence of human serum albumin, J. Med. Chem. 36: 2580-2582 (1993); Burke, T. G., Mishra, A. K., Wani, M. C. and Wall, M. E., Lipid bilayer partitioning and stability of camptothecin drugs, Biochemistry. 32: 5352-5364 (1993); Burke, T.G. and Mi, Z.: Preferential Binding of the Carboxylate Form of Camptothecin by Human Serum Albumin, (1993a) Anal. Biochem. 212, 285-287; Burke, T.G. and Mi, Z., The Structural Basis of Camptothecin Interactions with Human Serum Albumin: Impact on Drug Stability, (1994) J. Med. Chem. 37, 40-46; Burke, T.G. Munshi, C.B., Mi, Z., and Jiang, Y., The Important Role of Albumin in Determining the Relative Human Blood Stabilities of the Camptothecin Anticancer Drugs, (1995) J. Pharma. Sci. 84, 518-519; Mi, Z. and Burke, T.G., Differential Interactions of Camptothecin Lactone and Carboxylate Forms with Human Blood Components, (1994a) Biochemistry, 33, 10325-10336; Mi, Z. and Burke, T.G., Marked Interspecies Variations Concerning the Interactions of Camptothecin with Serum Albumins: A Frequency-Domain Fluorescence Spectroscopic Study, (1994b) Biochemistry 33, 12540-12545; and Mi, Z., Malak, H., and Burke, T.G., Reduced Albumin Binding Promotes the Stability and Activity of Topotecan in Human Blood, (1995) Biochemistry, 34, 13722-13728가 본원에 참고문헌으로 첨부되어 있다.
pH 7.4의 인산 완충 식염수(PBS)에서, 주파-도메인 형광 수명 분광법 (frequency-domain fluorescence lifetime spectroscopy)은 사람의 혈청 알부민 (HSA)이 캄프토테신의 락톤 형보다 200배 이상의 친화력으로 캄프토테신의 카르복실레이트 형과 우선적으로 결합한다는 점을 보여준다. 이러한 상호작용으로 인하여 단백질 부재시보다 HSA 존재시에 캄프토테신이 보다 빠르고 완벽하게 열리게 된다. pH 7.4, 37℃, 사람의 혈장에서, 캄프토테신 락톤은 카르복실레이트 형으로 빠르고 완벽하게 열리는데, 이 때 평형값에서의 락톤 백분율은 거의 없다시피한 (negligible) 0.2%이고, t1/2 값은 11분이다. 전 혈액(whole blood) 대 혈장 (plasma)에 있어서, 캄프토테신은 증강된 안정성(t1/2값 22분 및 평형값에서의 락톤 백분율 5.3%)을 나타낸다. 사람의 혈액 내의 캄프토테신 락톤의 증강된 안정성은 약제가 적혈구의 지질 이중층과 결합(association)한 결과인 것으로 밝혀졌다. 캄프토테신이 적혈구 막에 결합하여, 약제가 아실쇄 영역 내에 위치하고, 그 결과 가수분해로부터 보호된다.
또한 임상 목적의 몇가지 캄프토테신 유사체의 사람의 혈액 안정성을 비교하여 왔다. 캄프토테신의 경우에 관찰한 바와 같이, 9-아미노캄프토테신(9-AC)는 HSA를 함유한 PBS 용액 내에서 거의 완전하게(> 99%) 가수분해되는 것이 관찰되었다. 락톤 형 및 카르복실레이트 형의 9-아미노 동종체(congener)의 상대적인 결합 친화도를 분광학적으로 측정할 어떠한 시도도 없긴 하였지만(이는 캄프토테신에 대하여 9-AC 락톤 및 카르복실레이트 종(種)의 형광 양자(quantum) 수율이 현저하게 감소하기 때문이다), HPLC 데이터는 이 제제의 락톤 형을 능가하여 카르복실레이트 형과 우선적으로 결합하는 HSA와 일치하였다. 혈장에서는, 캄프토테신의 9-아미노 유사체의 > 99.5%가 카르복실레이트로 전환되는 것이 관찰되었고, 이는 캄프토테신을 사용하여 얻어진 안정성 데이터에 다시 밀접하여 나란히 나타난다. 전 혈액에서, 9-아미노캄프토테신 및 캄프토테신의 분율(fraction)은 각각 < 0.5% 및 5.3%이고, 이는 평형에서 락톤 형으로 남아 있었다. 9-아미노캄프토테신에 대하여 캄프토테신의 평형에서 잔존하는 대략 10배 이상의 락톤 수준은 증강된 친유성 및 수성 환경으로부터의 전이 그리고 전 혈액에 존재하는 적혈구막 내로의 전이에 대한 캄프토테신의 보다 큰 능력에 의하여 부분적으로 설명할 수 있다.
캄프토테신 및 9-아미노캄프토테신(각각 < 0.5% 및 5.3%)의 사람의 전 혈액 내 평형에서 잔존하는 낮은 락톤의 수준과 달리, 토포테칸(11.9%), CPT-11(21.0%), 및 SN-38(19.5%) 모두는 개선된 혈액 안정성을 나타낸다. 토포테칸의 평형에서 락톤 수준이 9-아미노캄프토테신 경우보다 20배 더 높은 반면, CPT-11 및 SN-38의 대응하는 락톤 수준은 9-아미노캄프토테신의 경우보다 40배 더 높다. 토포테칸, CPT-11 및 SN-38의 상대적인 안정성에 있어서의 현저한 이득(gain)은 HSA와의 유리한 (favorable) 상호작용과 서로 관계가 있다(correlate). 7- 및 9- 위치의 구조 치환 체는 HSA에 의하여 카르복실레이트 약제 형의 우선적인 결합을 방해하고 방지하는 것으로 여겨진다. 최근에는, 시간 분해 형광 비등방성(time-resolved fluorescence anisotropy) 기술이, 캄프토테신 카르복실레이트가 HSA와 결합하고(associate) 단백질과 밀접하게 결합된 용액 내에서 텀블(tumble)하는 실험 조건 하에서, 토포테칸 및 CPT-11의 카르복실레이트 형은 HSA와 결합하지 않는다는 점을 설명하는 데 사용되어 왔다. SN-38의 경우, HSA가 이 제제의 락톤 형과 우선적으로 결합함을 나타내는 직접적인 분광학적 증거를 수득하였고, 따라서 락톤-카르복실레이트 평형을 락톤으로 이동시켰다(shift).
이러한 관찰로부터 HSA가 캄프토테신의 상대적인 사람 혈액 안정성을 결정하는 데 중요한 역할을 한다는 것이 나타난다. 캄프토테신 및 9-아미노캄프토테신의 경우에 있어, 단백질은 카르복실레이트 약제 형의 싱크(sink)로서 작용하여, 열린 고리 종과 결합하며, 따라서 락톤-카르복실레이트 평형을 오른쪽으로 이동시킨다. 그러나, 토포테칸, CPT-11 및 SN-38의 경우, HSA에 의한 카르복실레이트 약제 형의 그러한 우선적인 결합은 조금도 관찰되지 않는다. 캄프토테신 및 그의 9-아미노 유사체의 경우와는 반대로, HSA는 우선적으로 SN-38의 락톤 형과 결합하여 그 결과 이 생물학적으로 활성 있는 종의 순환(circulatory) 수준을 보다 높이 촉진시킨다.
임상적으로 적절한 캄프토테신과 함께 일어나는 활성 약제의 빠르고 광범위한 손실은 개선된 사람의 혈액 안정성을 가지는 캄프토테신을 확인하는 것이 아주 유리하다는 것을 나타낸다.
본 연구에 있어, 본 발명자들은 1) 단백질 결합을 감소시키는 효과; 2) 친유 성을 증강시키는 효과; 3)친유성 또한 증강시키면서 사람의 알부민에 대한 카르복실레이트 결합에 있어 동시 감소(concomitant reduction)를 만드는 효과를 가지는 A 및 B 고리의 캄프토테신을 변형시켰다. 또한 본 발명자들은 본 화합물을 고안하는 데 있어 팽창 E-고리를 포함하였다. 본 연구는 지금껏 확인된 최대의 혈액 안정성 및 고유 효능을 가지는 캄프토테신 유사체인 신규 A, B, E-고리 변형 캄프토테신의 고안을 유도하였는데, 이 때 혈액 안정성 변수(parameter)는 통상적인 α-히드록시락톤 작용기를 함유하는 A, B-고리 변형 캄프토테신 유사체 이외에 종래 화합물 호모캄프토테신보다 우세하다 (outcompete). 본 발명의 신규 캄프토테신 유사체는 높은 항암 활성과 함께 우수한 사람의 혈액 안정성 등의 독특한 성질을 나타낸다.
형광 비등방성 역가측정(fluorescence anisotropy titration)은 본 발명의 신규 호모실라테칸이 지질 소낭(lipid vesicle)의 폭넓은 범위의 평형 결합 상수(equilibrium association constant)를 보여준다는 점과 E-고리 팽창(expansion)이 실라테칸의 친유성(lipophilicity)을 증강시킨다는 점을 설명한다.
도 3은 인산 완충 식염수(PBS) 및 지질 이중층에서 1 μM DB-38의 형광 방출 스펙트럼을 나타낸다. 상기 데이터는 지질 이중층을 시료 내로 도입하면 약제와 막 간의 상호작용을 나타내는, 화합물의 형광 방출이 증가한다는 것을 보여준다. 용매를 에탄올로 바꾸어도 또한 형광도가 변한다. 막을 함유하는 각 경우에 있어, 지질 이중층의 미세 환경(microenvironment) 내로의 약제 분배로서 형광 세기가 두드러지게 증가한다. 각 경우에 있어, 또한 방출 스펙트럼에서의 현저한 청색 이동(blue-shifting) 또는 이동(shift)이 일어나 막과 약제의 상호작용에 따라 파장을 낮춘다(표 1 참조). 도 3의 스펙트럼 데이터는 호모실라테칸이 형광성임을 보여준 고 지질 이중층막을 시료로 첨가함에 따라 약제의 스펙트럼 변수가 변화함을 보여준다. 하기 표 1은 새로운 호모실라테칸 유사체의 최대 여기(excitation) 및 방출(emission) 파장을 비교하고 있다. 또한 본 발명자들은 DB-90 및 DB-91의 개환 형(ring-opened form)의 막 상호 작용을 시험하였고, 그 시험 결과로부터 개환 종(ring-opened species)에 대한 스펙트럼 이동이 유사함을 알 수 있다.
락톤 형 및 카르복실레이트 형 호모실라테칸의 고유 형광 성질은 지질 이중층을 함유한 각종 유사체의 결합 상호 작용의 강도를 결정하기 위하여 사용되는, 민감한 정상 상태(steady-state) 형광 비등방성 적정화(fluorescence anisotropy titration)법을 참작한다.
정상 상태 형광 비등방성(a)의 측정은 페린 방정식(Perrin Equation)을 통한 형광 분자의 회전 속도와 관계가 있다.
a0 / a = 1 + (τ/ φ)
상기 식 중, a0는 감극 회전(depolarizing rotation) 부재시의 한계(limiting) 형광 비등방성이고, τ는 여기 상태 수명(excited-state lifetime)이며, φ는 형광단 (fluorophere)의 회전 상관 시간(rotational correlation time)이다. 상기 방정식은 형광 화합물의 τ 또는 φ값의 변화가 정상 상태 비등방성을 조절할 수 있다는 점을 보여준다.
PBS, 글리세롤, 및 메탄올 내의 캄프토테신의 여기 상태 수명값을 37℃에서 시험하였다. 상기 수명값을 각각 4.7 ns, 3.8 ns, 및 3.5 ns에서 결정하였다. 비슷하게, DMPC 이중층과 결합하는 경우 캄프토테신의 수명값을 37℃에서 측정하였으며, 막-결합 약제의 평균값은 3.7 ns라는 것을 알았다.
따라서 상기 기술된 수명 측정으로부터 캄프토테신의 여기 상태 수명이 미세환경의 변화(예를 들어, 수성 환경에서 인지질막까지 형광단의 재배치 또는 용매에서의 변화)에 대해 상대적으로 덜 민감하다는 것을 알 수 있다. 그 회전 운동에 강력한 충격을 주는 전이(transition)(예컨대, 리포솜 입자와 같은 커다란 거대 분자 집합에 결합된 형광단 또는 용매 점성에서의 변화) 동안 상대적으로 일정한 τ값을 가지는 형광단에 대하여, 페린(Perrin) 방정식은 a와 φ값 사이에 직접적인 관계가 있음을 보여준다(즉, 형광 화합물의 φ값이 증가함에 따라, 정상 상태 비등방성값 또한 증가한다).
캄프토테신 유사체 및 신규 호모실라테칸의 정상 상태 형광 비등방성값은 용매 점성에 고도로 민감하고 작은 단일판상 지질 소낭(unilamellar lipid vesicle)와의 결합에 고도로 민감함을 보여주고 있다. 예를 들어, 토포테칸은 PBS 내에서 0.008의 a값을 가지나, 상기 a값은 점성 용매 옥탄올 및 글리세롤에서 각각 9배 및 40배로 증가한다. DMPC 또는 DMPG로 이루어진 소낭(vesicle)에 약제가 결합함에 의거하여 캄프토테신의 a값이 21배 증강하는 것을 관찰하였다. 막 결합에 대한 캄프토테신 약제의 a 감도 때문에, 형광 비등방성 적정화법을 지질 이중층을 함유한 캄프토테신 유사체의 평형 결합을 연구하는데 사용하였다. 상기 실험은 한 세트의 구성원 사이에 지질 농도가 0에서 0.29 M로 변화하는 동안, 그 각각에서 약제 농도가 상수(통상 1 또는 2 μM)를 유지하는 시료 세트에 대하여 a값을 결정하는 것을 포함한다.
새로이 합성된 호모실라테칸(스펙트럼 변수 일람이 표 1에 나타나 있다)의 브릴리안트(brillant) 형광 방출 결과, 표 4에 요약되어 있는 지질 이중층 흡수 등온선(adsorption isotherm)은 상대적으로 임의의 바탕 신호(background signal)가 없었다. 흡수 등온선을 작제하기 위하여 형광 비등방성 적정화법을 사용하였다. 상기 실험은 PBS 완충액 내에서 1 μM의 약제 농도로 실시하였다(37℃). DB-38, DB-90 및 DB-91의 비등방성값은 캄프토테신 또는 토포테칸의 값보다 더욱 더 빠르게 적정하였으며(titrate), 이는 신규 호모실라테칸이 캄프토테신 및 토포테칸보다 더 강력한 막과의 상호작용을 가짐을 보여준다. 카르복실레이트 형으로의 임의 전환 가능성을 최소화하기 위하여 리포솜 현탁액에 각 제제의 락톤 형을 첨가한 다음, 각 지질 농도에서의 비등방성값을 즉시(약 1분) 측정하였다. 이 때, 즉시 측정하는 것은 PBS 내에서 가수분해되는 호모실라테칸과 캄프토테신의 락톤 고리의 잠재능 때문이다. 1 μM의 약제 농도와 긴 통과 필터(long pass filter)를 사용하여 바탕 신호(즉, 가능한 불순물의 존재시에 생기는 산란 여기광(scattered exciting light) 및 외래성(extraneous) 형광 신호)로부터 방출광을 분리한 결과, PBS 완충액에 용해되어 있는 약제로부터의 신호 수준은 통상 막 부재시에 99.97%이었고, 막 존재시에는 98%보다 컸다. 호모실라테칸, 실라테칸, 및 캄프토테신 약제의 총괄 결합 상수를 결정하는 데 흡수 등온선을 사용하였다. 총괄 결합 상수는 다음과 같이 정의된다:
K = [AB] / [AF][L]
상기 식 중, [AB]는 결합 약제의 농도를 나타내고, [AF]는 유리 약제의 농도를 나타내며, [L]는 소낭 현탁액 내의 전 지질 농도를 나타낸다. 유리 지질 농도가 전 지질 농도와 대략 같은 경우(즉, 유리 지질 농도가 결합 약제 농도를 능가하여 현저히 초과하는 경우), 상기 방정식은 유효하다. 상기 조건을 만족하는 경우라면, K는 이중 역수 플롯(double reciprocal plot)의 기울기의 역수로부터 확정할 수 있다. 그러한 이중 역수 플롯에 있어서, 총 결합 약제의 1/분율은 1을 y절편값으로 가지는 1/지질 농도에 대하여 도시된다(결합 부위 균일성을 보이는 시스템에 대하여). DMPC 및 DMPG의 작은 단일판상 소낭(small unilamellar vesicle, SUV) 제조물을 함유한 새로운 호모실라테칸 유사체(락톤 형과 카르복실레이트 형 모두) 결합에 대한 상기 이중 역수 플롯은 양호한(good) 상관 계수를 갖는 선형이었다. 그밖의 형태의 막 제조물과 약제의 결합에 대한 대응 플롯 뿐 아니라, 이러한 플롯의 선형성 (linearity)은 상기 지질 농도에서의 형광 결합이 상기 방정식에 의하여 적당하게 기술되었음을 보여준다.
표 2에 요약되어 있는 연구는 지질 이중층에 대한 호모실라테칸 결합의 구조적 기저(basis)를 보여준다. 두 형태의 막은 생리 조건에 가까운 pH와 온도 하에서실시되는 본 연구에 포함된다; 상기 막은 유체-상(fluid-phase)이고 전기 중성을 띠는 L-α-디미리스토일포스파티딜-콜린(L-α-dimyristoylphosphatidyl-choline, DMPC)과 유체-상이며 음전하를 띠는 L-α-디미리스토일포스파티딜-글리세롤(L-α-dimyristoylphosphatidyl-glycerol, DMPG)을 포함한다. DMPC 및 DMPG는 동일한 사슬 길이를 가지지만 그 머리기(head group) 상의 전하는 상이하다.
표 2의 연구에 있어, 상기 고찰한 바와 같이 형광 비등방성 적정화법을 사용하여 결합 등온선을 작제하였고, 이중 역수 플롯 기울기로부터 K값을 결정하였다. K값은 10% 불확정성(uncertainty)을 조건으로 한다. 표 2에 함유된 데이터의 가장 현저한 특징 중 하나는 A, B, E-고리 변형 캄프토테신(예컨대, DB-38, DB-90, 및 DB-91이라고 알려져 있는 호모실라테칸) 또는 B, E-고리 변형 캄프토테신(예컨대, DB-81이라고 알려져 있는 호모실라테칸)의 생성(creation)을 통하여 달성될 수 있는 강력한 조절(modulation)이다. 7 위치에 단일 치환이나 7 및 10 위치에 이중 치환을 함유하는 호모실라테칸을 생성하였고 이 호모실라테칸은 아주 고도의 친유성 을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 표 2는 캄프토테신 화합물(토포테칸과 캄프토테신)을 포함한다. DB-81에 대한 DMPC 막의 친유성은, 토포테칸에 대한 대응 값에 대하여 1400배 이상으로 증가한다. 토포테칸과 캄프토테신 등의 화합물에 대하여 새로운 호모캄프토테신의 고도의 친유성 성질을 보여주기 위하여 이러한 약제에 대한 데이터를 포함하였다. 표 2로부터, 본 발명의 화합물이 캄프토테신 또는 토포테칸보다 더 친유성이 크다는 것은 분명하다.
표 2에 함유된 데이터의 조사에 의거하여 흥미 있고 예기치 않은 사항이 명백히 드러난다. 두 호모실라테칸의 KDMPC값과 그 대응 실라테칸 유사체(E-고리 시스템이 각각 β-히드록시락톤 대 α-히드록시락톤 부분임)와의 비교는 호모실라테칸이 더 큰 친유성을 보인다는 것을 나타낸다. 예를 들어, DB-38(CHJ-792, KDMPC=820 M-1) 및 DB-91(DB-67, KDMPC=2,500 M-1)의 실라테칸 대응부(counterpart)의 KDMPC값은 대응 호모실라테칸에 대해서보다 적은 대략 2배 내지 3배 정도이다. 따라서, DB-38 및 DB-91에 대하여, 팽창 E-고리는 차례로 사람의 혈액에서의 약제 안정성을 촉진시키는 막 결합에 대한 적절한 고찰의 대상이다.
약제의 카르복실레이트 형을 연구하면서, 호모실라테칸에 대하여 또 다른 놀라운 경향(trend)을 관찰하였다. 종래에는, 캄프토테신의 락톤 고리의 열림(opening)에 따라 DMPC의 친화력이 3배 감소됨이 관찰되어 왔다. Burke, T. G., Mishra, A. K., Wani, M. C. and Wall, M. E., "Lipid bilayer partitioning and stability of camptothecin drugs", Biochemistry, 32: 5352-5364 (1993). DB-90 및 DB-91 호모캄프토테신에 대하여도, 본 발명가들은 고리 열림(ring opening)에 따라 DMPC 결합이 10배 감소함을 관찰하였다. 따라서, 호모실라테칸은 현저히 증강된 친유성을 보여줄 뿐 아니라 락톤 형 및 카르복실레이트 형 간의 시차(differential) 결합 수준은 α-히드록시락톤 고리 체계를 함유하는 캄프토테신에 대하여 현저하게 높은(10배 대 3배) 것으로 보인다. 상기 기술한 두 가지 고찰(카르복실레이트 형을 능가하는 락톤의 고도의 시차(differential) 결합 및 높은 친유성)은 호모실라테칸이 캄프토테신 및 호모캄프토테신을 능가하여 보여주는 최적의 혈액 안정성에 대한 기여 인자이다.
DB-91 호모실라테칸과 적혈구와의 광범위한 막 상호작용의 직접적인 형광 스펙트럼 평가.
도 5는 pH 7.4의 인산-완충 식염수(PBS) 용액, 에탄올 및 첨가혼합물에서의 1 μM 7-t-부틸디메틸실릴-10-히드록시-호모캄프토테신(DB-91)의 형광 방출 스펙트럼을 나타낸다. 모든 스펙트럼은 37 ℃에서 394 nm 여기광을 사용하여 기록하였다. PBS 에서의 DB-91의 방출 최대값은 554 nm이고, 이 값은 무수 에탄올에서는 λmax는 약 410 nm으로 상당히 변한다. DB-91은 10-히드록시 작용기를 포함하기 때문에, 두 구별된 종으로부터 형광이 발생할 가능성이 존재한다. 물과 같은 양성자성 용매에서 탈양성자화된 여기-상태 착화합물(complex)이 우세한 반면, 비양성자성 용매 또는 비-수성 미세 환경에서는 양성자화된(10-히드록시 작용기에 대하여) 종이 우세하다. 약 410 nm의 λmax는 양성자화된 여기-상태 착화합물과 상관 관계가 있는 반 면, 554 nm 피크는 탈양성자화된 여기-상태 착화합물과 상관 관계가 있다. 물의 존재하에서 탈양성자화된 여기-상태 착화합물의 형성이 촉진된다; 1 %와 같이 소량의 물에서도 약 550 nm 부근에서 피크가 나타나며, 이는 탈양성자화된 여기-상태 착화합물의 수분-촉진 형성과 상관 관계가 있다. DB-91 및 10-히드록시 작용기를 포함하는 다른 캄프토테신들의 스펙트럼 민감도에 의하여, 약물을 수성 환경에서 적혈구 표면에서와 같은 소수성 환경으로 분배하는 것에 대한 연구에 유용하게 접근할 수 있도록 한다.
도 6은 pH 7.4의 인산-완충 식염수(PBS) 용액 및 알부민-비함유(free) 적혈구를 (10 ±1) ×106 세포/㎕ 농도로 함유하는 pH 7.4의 PBS에서의 1 μM 7-t-부틸디메틸실릴-10-히드록시-호모캄프토테신(DB-91)의 형광 방출 스펙트럼을 나타내며, 호모실라테칸과 적혈구와의 광범위한 상호작용의 직접적인 증거를 제공한다. 스펙트럼은 10 μM 농도의 DB-91 및 370 nm의 여기광을 사용하여 37 ℃에서 큐벳 전면(front-face cuvettes)에 기록하였다 (형광 대 산란수준을 최적화하기 위하여).
PBS에서의 DB-91의 방출 최대값은 554 nm 이다. 적혈구의 존재시, 상당히 낮은 λmax 를 갖는 피크가 관찰되는데 이는 상기 제제가 적혈구 세포막으로 분배할 수 있음을 나타내는 것이다. 적혈구막은 양성자화된 여기상태 착화합물이 형성될 수 있고 그로부터 형광이 방출될 수 있는 소수성 미세 환경을 제공한다. 도 7에 도시된 바와 같이, 임상적으로 적절한 7-에틸-10-히드록시캄프토테신(SN-38)을 함유하는 사람의 적혈구 존재시, DB-91의 방출 스펙트럼의 비교에 의하여, DB-91 경우보다 광범위한 양성자화된 여기상태 착화합물의 형성을 알 수 있다. 도 6의 연구와 유사하게, 도 7의 스펙트럼은 10 μM 농도의 SN-38 및 370 nm의 여기광을 사용하여 37 ℃에서 큐벳 전면에 기록하였다. 이들 조사 결과는 SN-38의 막 결합이 DB-91에 나타난 광범위한 상호작용보다 상당히 약하다는 것을 보여주는 모델 막(model membrane) 연구를 확인시켜 준다(DB-91은 8,000 M-1의 KDMPC 값을 나타내는 반면, SN-38은 300 M-1의 KDMPC 값을 나타낸다). 이러한 스펙트럼 연구로부터 신규한 호모실라테칸 DB-91은 FDA가 승인한 SN-38보다 더 친유적이고, 적혈구-상호반응적인 제제이다.
호모실라테칸은 α-히드록시락톤 약물작용 발생단(phamecophores)을 함유하는 캄프토테신과 비교하여 수용액 중에서 개선된 안정성을 나타낸다.
도 8 내지 11은 pH 값 5.0, 7.4, 8.0 및 9.0에서 인산-완충 식염수(PBS) 용액에서의 1 μM의 DB-38, DB-81, DB-90 및 DB-91 용액의 안정성의 pH 의존성을 보여준다. 각 약제의 안정성 매개변수를 HPLC 방법을 사용하여 측정하였다. 모든 실험을 37 ℃에서 수행하였다. pH 값이 7.4, 8.0 및 9.0일 때 가수분해가 관찰되었고, 높은 pH 값에서 보다 광범위한 가수분해가 관찰되었다.
pH 값이 7.4, 8.0 및 9.0일 때 가수분해가 관찰되었음에도 불구하고, 이들 데이터는 호모실라테칸의 락톤 고리가 통상적인 α-히드록시락톤 고리 부분을 포함하는 실라데칸 및 캄프토테신 모두와 비교하여 반응성이 적다는 것을 보여준다 (즉, 가수분해 진행에 있어 상당히 더 느리다.).
도 12는 본 발명의 신규한 네 종류의 호모실라테칸의 개선된 안정성을 이들에 상응하는 α-히드록시락톤 작용기를 함유하는 실라테칸 구조와 대비한다. 도 12의 모든 실험은 37 ℃의 PBS 용액에서 수행하였다. 패널(panel) A 내지 D는 각각 신규한 호모실라테칸(개환(open circle)) 및 이의 상응하는, 캄프토테신 및 토포테칸, SN-38, CPT-11 및 9-아미노캄프토테신과 같은 임상적으로 적합한 캄프토테신 유사체에서 발견되는 통상적인 α-히드록시락톤 고리 부분을 포함하는 실라테칸(고형환(solid circle))의 안정성 양상(profile)을 포함한다.
모든 경우에 있어서, 확장된 E-고리 또는 호모실라테칸 구조를 포함하는 제제는 현저하게 증진된 안정성을 나타내었다. 호모실라테칸의 안정성 매개변수를 표 3에 요약하였다. 데이터는 호모실라테칸의 락톤 고리가 실라데칸 및 캄프토테신 모두에 포함된 α-히드록시락톤 고리 부분과 비교하여 반응성이 적다는 것을 보여준다(즉, 가수분해 진행에 있어 상당히 더 느리다.). 실라테칸계 및 토포테칸, 캄프토테신과 같은 캄프토테신계에 있어서, 동일한 배양 조건하에서 각 호모실라테칸의 경우 80%를 초과하는 락톤이 남아있는 것에 반하여, 약 12 %의 락톤이 3 시간 후 평형에서 잔존한다.
인간 혈청 알부민 존재시 호모실라테칸의 우수한 안정성의 측정.
도 13은 37 ℃, 30 mg/ml 인간 혈청 알부민을 함유하는 PBS 에서의 배양 후의 본 발명에 따른 신규한 네종류의 호모실라테칸의 개선된 안정성을 나타낸다. 패널 A 내지 D는 각각 신규한 호모실라테칸 및 이의 상응하는, 캄프토테신 및 토포테칸, SN-38, CPT-11 및 9-아미노캄프토테신과 같은 그밖의 임상적으로 적합한 캄프토테신 유사체에서 발견되는 통상적인 α-히드록시락톤 고리 부분을 포함하는 실라테칸의 안정성 양상을 포함한다. 모든 경우에 있어서, 확장된 E-고리를 포함하는 제제는 HSA 존재시 현저하게 증진된 안정성을 나타내었다. 호모실라테칸의 안정성 매개변수를 포 3에 요약하였다. 도 14에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 호모실라테칸은 인간 혈장에서 토포테칸, SN-38, CPT-11과 같은 캄프토테신보다 우수한 안정성을 보여주었다. 호모실라테칸 중에서, DB-81은 인간 혈장에서 가장 높은 안정성을 나타냈으며, 그 다음으로 DB-90과 DB-91이었으며, DB-38(연구한 호모실라테칸 중 가장 낮은 친유성을 가짐)이 인간 혈장에서 가장 낮은 안정성을 나타내었다. 표 14의 모든 실험은 37 ℃의 인간 혈장에서 수행하였다. pH가 7.5 ±0.1 값으로 유지된 혈액 가스류에 의하여 혈장 샘플을 지속적으로 공급하였다. 모든 경우에 있어서, 확장된 E-고리 또는 호모실라테칸 구조를 포함하는 제제는 통상적인 α-히드록시락톤 고리 부분을 함유하는 모(parent) 약제 캄프토테신과 비교하여 현저하게 증진된 안정성을 나타내었다. 호모실라테칸의 안정성 매개변수를 표 3에 요약하였다.
본 연구는 보다 수용성일 뿐 아니라 친유성이 있는 호모실라테칸이 A 및 B 고리에 치환기를 갖지 않는 호모캄프토테신보다 개선된 안정성을 나타낸다는 것을 보여준다. Lavergne et al. Homocamptothecins: Synthesis and Antitumor Activity of Novel E-Ring-Modified Camptothecin Analogues J. Med. Chem. 41: 5410-5419 (1998) 참조. 따라서, 본 발명은 호모캄프토테신의 A 및 B 고리의 치환이 혈액 안정성에 있어서 유리한 요소라는 것을 보여준다. 치환되지 않은 호모캄프토테신 카르복실레이트는, 캄프토테신 카르복실레이트와 유사하게, 카르복실레이트 형태로 HSA에 우선적으로 결합하고 락톤-카르복실레이트 평형을 오른쪽으로 효과적으로 이동시킨다.
본 결과는 β-히드록시락톤 약물작용 발생단의 결합에 의하여 극적으로 개선된 인간 혈장 안정성을 나타내고 있는데, 상기 β-히드록시락톤 약물작용 발생단은 다음과 같은 구조적 변화를 수반한다: 1) 7번 위치에서의 실릴 또는 실릴알킬 작용기와 같은 B-고리 변형(예컨대, DB-81); 2) 토포테칸에 포함되는 구조적 변형과 같은 A-고리 변형( 9-디메틸아미노메틸 및 10-히드록시 작용기의 함유와 같은 수용성화 변화는 카르복실레이트가 HSA와 결합하는 것을 방해한다.); 및 3) 예컨대, 7번 위치에서의 실릴 또는 실릴알킬 치환기를 포함하는 A 및 B 고리 모두에 있어서의 결합적 치환(예컨대, DB-90 및 DB-91). 또한 Mi, Z., Malak, H., and Burke, T.G., Reduced Albumin Binding Promotes the Stability and Activity of Topotecan in Human Blood, Biochemistry, 34, 13722-13728 (1995) 참조. 후자의 실례에 의한 화합물은 높은 친유성 및 카르복실레이트 약제형 및 HSA 간의 감소된 특이 상호반응을 나타내며, 상기 두 요소는 개선된 혈장 안정성에 기여한다.
인간 혈장에서의 신규한 호모실라테칸의 현저하게 증진된 안정성.
도 15는 본 발명의 신규한 네 종류의 호모실라테칸의 생리적-적합 농도 [(5 ±1) ×106 세포/㎕]의 알부민-비함유(free) 적혈구를 함유하는 PBS 현탁액에서의 안정성을 보여준다. 안정성 특성은 37 ℃에서 HPLC 방법을 사용하여 측정하였다. 모든 경우에 있어서, 확장된 E-고리 또는 호모실라테칸 구조를 갖는 제제는, 적혈구 존재하에서, 통상적인 α-히드록시락톤 고리 부분을 함유하는 캄프토테신 유사체(예컨대, 임상적으로 적합한 SN-38, 9-아미노캄프토테신, 9-니트로캄프토테신, GI-147211C, 토포테칸, 등)에 대한 공지된 문헌의 평가값에 비하여 현저하게 증진된 안정성을 나타낸다. 호모실라테칸에 대한 안정성 매개변수를 표 3에 요약하였다.
도 16 및 도 17은 본 발명의 신규한 네 종류의 호모실라테칸의 개선된 인간 혈액 안정성을 나타낸다. 모든 실험을 pH 7.4 및 37 ℃에서 수행하였다. 도 16에 있어서, 패널 A 내지 D는 각각 신규한 호모실라테칸(개환) 및 이의 상응하는, 캄프토테신 및 토포테칸, SN-38, CPT-11 및 9-아미노캄프토테신과 같은 임상적으로 적합한 캄프토테신 유사체 및 실험 제제에서 또한 발견되는 통상적인 α-히드록시락톤 고리 부분을 포함하는 실라테칸(고형환)의 안정성 양상을 포함한다. 모든 경우에 있어서, 확장된 E-고리 또는 호모실라테칸 구조를 포함하는 제제는 토포테칸 및 SN-38 과 같은 캄프토테신 유사체와 비교하여 현저하게 증진된 인간 혈액 안정성을 나타내었다. 도 17은 9-아미노캄프토테신(9AC), 캄프토테신(CPT), 토포테칸(TPT) 및 SN-38(SN38)을 포함하는 통상적인 임상적-적합 제제와 비교하여 본 발명에 따른 신규한 호모실라테칸의 개선된 인간 혈액 안정성을 보여준다. 도 16 및 17의 안정성 매개변수를 표 3에 요약하였다.
DB-81, DB-90 및 DB-91에 나타난 인간 혈액 안정성값은 본질적으로 유력한 캄프토테신 유사체에 대하여 측정된 중에서 가장 높다. 3 시간 배양 후, 80 % 이상의 락톤 값이, 인간 전체 혈액에서의 9-아미노캄프토테신(약 0.3%), 캄프토테신(약 6%), 토포테칸(약 15%), CPT-11(약 21.0%) 및 SN-38(약 30%)에 대한 해당 퍼센트 락톤 농도와 관련하여 매우 유리하게 비교된다.
본 발명의 신규한 호모실라테칸은 9-아미노캄프토테신, 9-니트로캄프토테신 및 캄프토테신과 같은 임상적으로 적합한 캄프토테신에 대하여 지금까지 관찰된 혈액 안정성에 있어서 현저한 종간 변화를 극복한다.
작용 메카니즘 및 우수한 쥐(mouse) 생체내(in vivo) 활성으로 유명한 항암제인 캄프토테신 및 9-아미노캄프토테신은 인간 암에 대하여 단지 적당한 치료적 유용성만을 보여준다. 상기 약제는 pH 7.4에서 가수분해되어, 생물학적으로 불활성인 카르복실레이트 형을 수득하는 락톤 고리 부분을 포함한다. 9-아미노캄프토테신에 대한 약제 안정성의 비교는 고리 열림이 쥐 혈액보다 인간 혈액에서 보다 광범위하게 발생한다는 것을 나타낸다(표 4 참조). 캄프토테신이 유사한 방법으로 거동한다는 것이 이미 나타나 있다. Burke, T.G. Munshi, C.B., Mi, Z., and Jiang, Y., The Important Role of Albumin in Determining the Relative Human Blood Stabilities of the Camptothecin Anticancer Drugs, J. Pharma. Sci. 84, 518-519 (1995); and Mi, Z. and Burke, T.G., Marked Interspecies Variations Concerning the Interactions of Camptothecin with Serum Albumins: A Frequency-Domain Fluorescence Spectroscopic Study, Biochemistry 33, 12540-12545 (1994). 인간 혈청 알부민(HSA)의 존재시 캄프토테신 및 9-아미노캄프토테신에 대하여 관찰되는 광범위한 고리 열림을 생리적으로 설명하기 위하여 캄프토테신 락톤 및 카르복실레이트의 고유 형광 방출의 다주파 위상 조절 분광학적 분석(multifrequency phase- modulation spectroscopic analysis) 기술을 사용하였다. HSA는 락톤(K 
5.5 ×103 M-1)과 비교하여 카르복실레이트(K = 1.2 ×106 M-1)에 대하여 200 배의 결합 선호도를 나타낸다. 다른 종의 혈청 알부민은 캄프토테신 카르복실레이트와 HSA만큼 단단하게 결합하지 않는 것으로 나타났다. 약제의 생물학적으로 불활성인 형태로의 광범위한 전환을 초래하는 캄프토테신 카르복실레이트 및 9-아미노캄토테신 카르복실레이트와 결합하는 인간 알부민의 독특한 능력 때문에, 이들 제제의 동물 모델에서의 암 근절의 성공이 인간에게서 이와 동일하게 나타나기가 본질적으로 보다 더 어렵게 된다.
본 발명의 신규한 호모실라테칸에 대한 데이터는 쥐 혈액과 인간 혈액의 락톤 농도 간의 본질적으로 근소한 변화를 보여준다. 나타난 쥐 대 동물 혈액의 변화는 9-아미노캄프토테신에 대하여 관찰되는 락톤 농도에 있어서 100 배 차이를 보이는 것과 비교하여 매우 소량이다. DB-81 및 DB-91에 대한 쥐 혈액 실험에 있어서, 인간 혈액에서 실제로 관찰되는 락톤 농도는 각각 6 % 및 20 % 정도 낮게 평가된다. 그러나, 9-아미노캄프토테신에 대하여, 쥐 혈액은 인간에서 실제로 관찰되는 락톤 농도보다 100 배 높게 평가된다. 이러한 결과는 동물 모델에서의 본 발명의 신규한 호모실라테칸의 성공은 캄프토테신 및 9-아미노캄프토테신과 같은 제제와 비교하여 인간에게 보다 용이하게 전용될 수 있다고 사료하는 데에는 근본적인 생리적 이유가 있다는 것을 보여준다.
| 화합물 | 3 시간 배양 후 쥐 혈액에서의 락톤 퍼센트 | 3 시간 배양 후 인간 혈액에서의 락톤 퍼센트 | 쥐/인간의 락톤 농도 비율 |
| 9-아미노캄프토테신 | 38 | 0.4 | 100 |
| 캄프토테신 | 20 | 7 | 3 |
| DB-38 | 72 | 56 | 1.3 |
| DB-81 | 80 | 87 | 0.9 |
| DB-90 | 61 | 85 | 0.7 |
| DB-91 | 70 | 85 | 0.8 |
a pH 7.4 및 37 ℃에서 실험을 수행하였고, HPLC 방법을 사용하여 락톤 농도를 측정하였다. 실험 시작 전에 혈액 샘플을 5 ℃ 에 두었다.
매우 친유성인 캄프토테신은 인간 혈청 알부민 존재시 높은 항암 효능을 보여준다.
다양한 캄프토테신의 MDA-MB-435 종양형성(tumorigenic) 전이(metastatic) 인간 유방암 세포에 대한 세포 독성을 표 5에 요약하였다. 세포 독성 값은 72 시간 동안의 노출 시간에 대한 것이다. 전체적으로, 다른 호모실라테칸은 IC50 값의 범위가 20 nM 에서 115 nM인 반면, DB-38의 IC50 값은 20 nM로, DB-38이 본 발명의 신규한 네 종류의 호모실라테칸 중에서 가장 효과적이라는 것을 밝혀내었다. 본 결과는 신규한 호모실라테칸의 개발을 통하여 이러한 중요한 종류의 항암 제제의 높은 본질적 효능 및 세포 독성의 손상없이 인간 및 동물 혈액에서의 제제의 안정성을 현저하게 개선시키고 균형화시킬 수 있다는 것을 분명하게 보여준다.
본 발명의 신규한 호모실라테칸의 락톤 고리 안정성 및 지질 이중층 분배의 정성적 및 정량적 측정(예컨대, 친유성도)을 위한 실험적 방법.
화학물. 캄프토테신 및 토포테칸은 그들의 20(S)-배열(configuration)로 되어 있고 형광 탐지를 사용하는 HPLC 검사에 의하여 측정된 바와 같이 고 순도(> 98%)를 갖는다. 호모실라테칸의 제조는 본 출원 명세서의 다른 곳에 기재되어 있다. 다른 모든 제제는 시약 등급이었으며 더 이상의 정제 없이 사용하였다. 고순도 의 물을 Milli-Q UV PLUS 정제 시스템(Bedford, MA)로부터 공급받았으며, 이를 모든 실험에 사용하였다.
약제 모액(stock solution) 제조. 약제 모액을 2 ×10-3 M 농도의 디메틸술폭사이드(A.C.S. 분광 측량 등급, Aldrich, Milwaukee, WI)에서 제조하고 4 ℃ 어두운 곳에 보관하였다. L-α-디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC) 및 L-α-디미리 스토일포스패티딜글리세롤(DMPG)를 Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL로부터 입수하였고, 다른 정제 없이 사용하였다. 그 밖의 모든 화학물은 시약 등급이며 다른 정제 없이 사용하였다.
소낭(vesicle) 제조. 작은 단일판상 소낭(small unilamellar vesicle, SUV) 현탁액을 이미 Burke and Tritton, Biochemistry 24 5972-5980 (1985); and Burke, T. G., Mishra, A. K., Wani, M. C. and Wall, M. E. Lipid bilayer partitioning and stability of camptothecin drugs, Biochemistry. 32: 5352-5364 (1993)에 기록된 방법으로 실험 당일에 제조하였으며, 이를 본 명세서에 참고문헌으로 첨부하였다. 요컨대, 인산 완충 식염수(PBS, pH 7.4)에 공지된 양의 지질(200 mg/ml 또는 그 이하)을 함유하는 모(stock) 지질 현탁액을 지질의 TM 이상 5 ~ 10 분 동안 볼텍스 혼합(Vortex mixing)시킴으로써 제조하였다. 그리고 나서, 지질 분산액을 중탕형 초음파처리기(bath-type sonicator)(Laboratory Supplies Co., Hicksville, NY)를 사용하여 광학적으로 투명해질 때까지 3 ~ 4 시간 동안 초음파 처리하였다. DMPG의 SUV 제조 동안에 pH가 7.4에서 6.8로 감소하였으며; 따라서, PBS에서 소량의 2.5 M NaOH를 사용하여 이들 SUV 현탁액의 pH를 7.4 로 조절한 후, 추가적인 초음파 처리를 하였다. 각 유형의 소낭 현탁액을 37 ℃에서 30 분 동안 소환(annealing)시킨 후 실험에 사용하였다.
형광 계기화. 항온 큐벳 격실(cuvette compartment)을 사용하여 SLM 모델 9850 분광형광계 상에서 정상 상태 형광 수치를 측정하였다. 이 계기를 IBM PS/2 모델 55 SX 컴퓨터에 접속하였다. 8 nm의 여기 분할(resolution) 및 4 nm의 방출 분할로 여기 및 방출 스펙트럼을 기록하였다. 모든 경우에서 바탕값(blank)의 스펙트럼을 뺌(subtraction)으로써 비표지(unlabeled) 지질 또는 용매로부터의 자연(background) 형광 및 산란에 대한 스펙트럼을 취하였다. 편광자(polarizer) 없이 정상 상태 형광 세기를 측정하였다. 두 편광 세기의 동시 측정을 위하여 "T-포맷(format)"의 계기를 사용하여 정상 상태 비등방성(a) 수치를 측정하였다. 편광자의 정렬을 물 속의 0.25 ㎛ 폴리스티렌 미소구체(microsphere)(Polysciences, Inc., Warrington, PA) 희석 현탁액을 사용하여 통상적으로 조사하여 > 0.99의 비등방성 값을 얻었다. 게다가, 편광자 방향을 물 속의 글리코겐 희석 용액을 사용하여 조사하였다. a = (I VV - GI VH )/(I VV + GI VH )로부터 비등방성을 계산하였고, 여기서, G = I VH /I HH 이고 아래첨자들은 여기 및 방출 편광자의 수직 및 수평 방향을 각각 의미한다.
호모실라테칸 및 캄프토테신의 비등방성 측정은 370 ~ 400 nm의 여기광 및 자연 산란 및/또는 잔여 형광으로부터 약물의 형광 신호를 분리하기 위한 각 방출 채널상의 긴 통과 필터(long pass filter)를 사용하여 수행하였다. 모든 방출 필터는 Oriel Corp (Stamford, CT)로부터 입수하였다. 여기광과 방출 필터의 조합으로 자연 신호로부터의 형광의 적절한 분리를 가능하게 하였다. 산란광과 함께, 자연 형광의 기여는 통상적으로 총 강도의 1 %보다 적었다. 캄프토테신 및 관련 동종체(congener)의 락톤 고리는 수성 매질에서 약 20분의 반감기로 가수분해되기 때문에, 가수분해 산물 생성 없이 실험을 수행하기 위하여 모든 측정은 약제 모액을 열적으로 미리-평형화된 용액과 혼합 후 가능한 짧은 시간(ca. 0.5 내지 1 분) 내에 완결되어야 한다. 호모실라테칸 및 캄프토테신과 적혈구와의 상호작용과 관련된 정보를 제공하기 위하여 고안된 형광 분광 실험에 있어서, 10 μM 농도의 약제를 사용하였다. 형광 신호를 최적화하고 산란광을 최소화하기 위하여 프런트 페이스(front-face) 석영 큐벳에서 적혈구를 사용하는 실험을 수행하였다.
평형 결합 상수(equilibrium binding constant)의 측정. 총 농도 1 ×10-6 M 의 약제를 함유하고 지질 농도를 변화시킨 리포좀 현탁액에서의 유리 약제 종 및 결합 약제 종의 농도를 측정하기 위하여, 본 명세서에 참고문헌으로 첨부된, Burke, T. G., Mishra, A. K., Wani, M. C. and Wall, M. E. Lipid bilayer partitioning and stability of camptothecin drugs, Biochemistry. 32: 5352-5364 (1993)에 기록된 바와 같은 형광 비등방성 적정법을 사용하였다. 모든 실험을 유리관에서 수행하였다. 전체적인 결합 상수를 K = [AB]/[AF][L]로 정의하였고, 여기서, [AB]는 결합 약제 농도를 나타내고 [AF]는 유리 약제의 농도를 나타내며 [L]는 샘플의 총 지질 농도를 나타낸다. 결합 등온선의 이중-역수 플롯{1/(약제의 결합 분율) vs. 1/[지질]}은 선형이었고, K 값은 선형 최소 제곱근 분석법을 사용하여 그들의 기울기로부터 측정하였다. 총 약제 및 특정 K 값에 대한 결합 약제 수준을 예측하기 위하여 K = [AB]/[AF][L] 관계에 기초한 컴퓨터 프로그램을 작성하였다.
호모실라테칸, 실라테칸 및 캄프토테신의 락톤 고리 열림의 반응속도론. 상이한 혈액 성분의 존재하에서의 캄프토테신의 가수분해 반응속도론을 상기 인용된 문헌에 이미 기재된 방법론들로부터 변형된 정량적 C18 역상(reversed-phase) 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 검사에 의하여 측정하였다. 전혈 및 부분적 혈액 샘플의 제조를 상기한 바와 같이 수행하였다. Sigma Chemical(St. Louis, MO)에서 입수한 고순도( > 97%)의 결정화된 HSA를 사용하였다. HSA 모액을 최종 pH 7.4 ±0.05 인 PBS 완충액에서 제조하였다. 39,800 M-1cm-1(Porter, 1992) 흡광계수를 사용한 278 nm에서의 UV 흡광도에 의하여 HSA 농도를 측정하였다. 다른 모든 제제는 시약 등급이었으며 더 이상의 정제 없이 사용하였다. Milli-Q UV PLUS 정제 시스템(Bedford, MA)로부터 공급받은 고순도의 물을 모든 실험에 사용하였다. HPLC 용매는 Fisher Scientific으로부터 공급받았다. 인간 혈장 및 적혈구는 중앙 켄터키 혈액 센터(Central Kentucky Blood Center)에서 입수하였다. 전혈은 남성 기증자로부터 헤파린첨가(heparinized) 튜브 내에 얻었으며, 5 ~ 10 ℃에 보관하고 가능한한 조속하게 사용하였다(통상적으로 1 주일 이내). 쥐로부터 얻은 혈액을 헤파린첨가 튜브 내 수집였으며, 사용할 때까지 5 ~ 10 ℃에서 보관하였다.
온도 조절 오토샘플러(autosampler)가 장착된 Waters Alliance 2690 HPLC 시스템과 Water 474 스캐닝 형광 탐지기 중 한 가지 상에서 HPLC 검사를 실시하였다. 두 번째 HPLC 시스템은 501 HPLC 펌프, 717 플러스 온도 조절 오토샘플러 및 470 스캐닝 형광 탐지기로 구성된 Waters HPLC 시스템으로 구성되었다. 호모실라테칸에 사용되는 HPLC 검사 과정을 아래에 요약하였다. 아세토니트릴로 구성된 용매 A 및 용매 B는 pH 5.5, 유출 속도 1 ml/분의 2 % 트리에틸암모늄 아세테이트였다. DB-38에 대하여 등용매 용리(isocratic elution)를 사용하였다: 용매 A 33 %; 용매 B 67 %; λex : 345 nm 및 λem : 518 nm이었다. DB-81에 대하여 등용매 용리를 사용하였다: 용매 A 56 %; 용매 B 44 %; λex : 375 nm 및 λem : 444 nm이었다. DB-90에 대하여 등용매 용리를 사용하였다: 용매 A 41 %; 용매 B 59 %; λex : 412 nm 및 λem : 526 nm이었다. DB-91에 대하여 등용매 용리를 사용하였다: 용매 A 42 %; 용매 B 58 %; λex : 392 nm 및 λem : 562 nm이었다.
PBS에서의 호모실라테칸의 안정성을 측정하기 위하여, DMSO 내의 각 호모실라테칸의 분액(aliquot)을 물 중탕조에서 37 ℃로 유지된 HPLC 오토샘플러 바이얼 (viral) 내의 pH 7.4의 인산 완충 식염수(PBS)에 첨가하여 최종 약제 농도가 1 μM이 되도록 하였다. 약제를 포함하는 바이얼을 신속하게 37 ℃로 유지시킨 오토샘플러로 옮기고 다양한 시간점(time point)에서 분액을 분석하였다. 모든 측정은 3 번씩 수행되었다. Waters Millenium 소프트웨어를 사용하여 데이터를 수집하고 분석하였다. 락톤 부분을 락톤 및 카르복실레이트 피크의 피크 면적 및 락톤/카르복실레이트 비율을 사용하여 계산하였다.
전혈에서의 약제 안정성을 측정하기 위하여 전혈을 37 ℃에서 30 분 동안 배양하고 pH를 측정하였다. 0.1 M KOH 또는 0.1 M HCl을 사용하여 혈액 pH를 7.4 +/- 0.5로 조절하였다. 혈액 샘플을 37 ℃에서 30 분 동안 배양하고 pH를 재측정하여 pH가 개별적 검사를 시작하기 전의 범위내라는 것을 확인하였다. 혈액의 분액(각 2 ml)을 제거하여 3 개의 일회용 유리 시험관에 넣고 관을 37 ℃에서 배양하였다. 그리고 나서, DMSO 내의 약제 분액을 혈액에 첨가하여 최종 약제 농도를 1 μM이 되도록 하였다. 37 ℃에서 계속 배양하고, 150 ㎕ 분액을 상이한 시간점에서 제거하여 에펜도르프 튜브(eppendorf tube) 내의 600 ㎕의 차가운 메탄올(-20℃)에 첨가하였다. 그리고 나서, 튜브를 10 초 동안 회전시키고 8000 rpm에서 45 초 동안 테이블 탑 마이크로원심분리기(tabletop microcentrifuge)에서 원심분리시켰다. 상등액을 취하여 오토샘플러 바이얼에 넣고 바이얼을 4 ℃로 유지한 오토샘플러에 신속하게 첨가하였다. 샘플을 HPLC 장치상에서 즉시 분석하였다. 데이터 분석은 샘플 PBS 내 약제에 대하여 기술된 바와 같다.
인간 혈청 알부민(HSA)를 함유하는 PBS에서의 호모실라테칸의 안정성을 연구하기 위하여, HSA를 pH 7.4의 PBS에 30 mg/ml 농도로 용해시키고, 37 ℃에서 배양하였다. pH를 측정하였고 0.1 M KOH 또는 0.1 M HCl을 사용하여 7.4 +/- 0.5로 조절하였다. pH가 목표(target) 범위 내로 안정화될 때까지 배양을 계속하였다. PBS/HSA의 분액을 제거하여 오토샘플러 바이얼에 넣고 37℃에서 10 분동안 두었다. DMSO 내의 약제 분액을 샘플에 첨가하여 최종 약제 농도가 1 μM이 되도록 하였다. 바이얼을 신속하게 37 ℃로 유지시킨 HPLC 오토샘플러에 첨가하고 분액을 주입하고 상이한 시간점에서 HPLC로 분석하였다. 데이터 분석은 샘플 PBS 내 약제에 대하여 상기된 바와 같다.
인간 혈장에 관한 신규한 실라테칸의 안정성을 특성화하기 위하여, 동결 혈장을 해동시키기 위하여 37 ℃에서 배양하였다. 혈장을 통하여 혈액 가스를 버블(bubbling)시켜 pH를 7.5에 근접하게 조절하였다. 플라즈마 분액(5ml)을 일회용 유리 시험관에 넣고 37 ℃에서 배양하였고, 약제 DMSO 모액을 첨가하여 최종 약제 농도를 1 μM이 되도록 하였다. 그리고 나서, 샘플을 37 ℃에서 더 배양하였다. 분액(150 ㎕)을 상이한 시간점에서 제거하여 에펜도르프 튜브 내의 600 ㎕의 차가운 메탄올(-20℃)에 첨가하였다. 튜브를 10 초 동안 회전시키고 8000 rpm에서 45 초 동안 테이블 탑 마이크로원심분리기에서 원심분리시켰다. 상등액을 제거하여 오토샘플러 바이얼에 넣고 바이얼을 4 ℃로 유지한 오토샘플러에 신속하게 첨가하였다. 샘플을 HPLC로 가능한한 신속하게 분석하였다. 데이터 분석은 상기 샘플 PBS 내 약제에 대하여 기술된 바와 같다. 혈장 샘플을 통하여 혈액 가스를 연속적으로 버블시켜(bubble) pH를 7.5 +/- 1.0으로 하였다.
생리적으로 적합한 농도의 적혈구(red blood cell, RBC)의 존재하에서의 신규한 호모실라테칸의 안정성을 연구하기 위하여, 다음의 실험을 수행하였다. 중앙 켄터키 적십자(Central Kentucky Red Cross)로부터 포장된 적혈구를 공급받았으며쿨터 세포 계수기(Coulter Cell Counter)를 사용하여 계수하였다. pH 7.4의 PBS를 사용하여 세포의 수를 5 ×1012 세포/L로 조절하였고 37 ℃에서 30분 동안 배양하였다. 샘플의 pH를 측정하였고 0.1 M KOH 또는 0.1 M HCl을 사용하여 7.4 +/- 0.5로 조절하였다. RBCs를 37 ℃에서 30 분 동안 배양하고 pH를 재측정하여 pH가 검사를 시작하기 전과 같은 범위 내라는 것을 확인하였다. RBC의 분액(각 2 ml)을 제거하여 3 개의 일회용 유리 시험관에 넣고 관을 37 ℃에서 배양하였다. DMSO 내의 약제 분액을 PBS 내 RBC 현탁액에 첨가하여 최종 약제 농도를 1 μM이 되도록 하였다. 37 ℃에서 계속 배양하고, 150 ㎕ 분액을 상이한 시간점에서 제거하여 에펜도르프 튜브 내의 600 ㎕의 차가운 메탄올(-20℃)에 첨가하였다. 관을 10 초 동안 회전시키고 8000 rpm에서 45 초 동안 테이블 탑 마이크로원심분리기에서 원심분리시켰다. 상등액을 제거하여 오토샘플러 바이얼에 넣고 바이얼을 4 ℃로 유지시킨 오토샘플러에 신속하게 첨가하였다. 샘플을 HPLC 장치 상에서 즉시 분석하였다. 데이터 분석은 상기 샘플 PBS 내 약제에 대하여 기술된 바와 같다.
호모실라테칸의 지질 이중충막과의 상호작용에 대한 형광 스펙트럼 변화. 형광 방출 데이터를 pH 7.4의 인산 완충 식염수(PBS) 및 에탄올 용액 내의 호모실라테칸에 대하여 기록하였다. 또한, PBS 내 전기적 중성을 띤 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC) 또는 PBS 내 음전하를 띤 디미리스토일포스파티딜글리세롤(DMPG)로 구성된 작은 단일판상 소낭(SUVs)의 현탁액 존재하에서의 신규한 제제에 대하여 데이터를 얻었다. 5 mM 농도의 지질을 사용하였다. DB-38에 대하여 410 nm 여기광을 사용하여 37 ℃에서 모든 스펙트럼을 기록하였다. PBS에서의 DB-38에 대한 방출 최대값은 531 nm이고 이 값은 막의 존재시에 낮은 값으로 변하였다(DMPC 소낭의 존재시 λmax는 515 nm이고 DMPG 소낭의 존재시 λmax는 517 nm임). 막 존재시에 발생하는 DB-38의 스펙트럼 변화는 제제가 전기적으로 중성인 막 및 음전하를 띤 막 모두에 결합할 수 있다는 것을 나타낸다. 제제의 락톤 형태를 용액 또는 현탁액에 첨가한 직후에 스펙트럼 기록을 시작하여 완성하였고, 이에 의하여 탐지된 신호가 주로 제제의 락톤 형태(고리 열림 형태가 아님)로부터 생긴다는 것을 확인하였다.
또한, 7-t-부틸디메틸실릴호모캄프토테신(DB-81) 1 μM의 형광 방출 스펙트럼을 조사하였다. 10 mM 농도의 지질을 사용하였다. 380 nm의 여기광을 사용하여 37 ℃에서 모든 스펙트럼을 기록하였다. PBS 완충액에서의 DB-81에 대한 방출 최대값은 452 nm이고 이 값은 막의 존재시에 낮은 값으로 변하였다(DMPC 소낭의 존재시 λmax는 443 nm 이고 DMPG 소낭의 존재시 λmax는 442 nm임). 막 존재시에 발생하는 DB-81의 스펙트럼 변화는 제제가 전기적으로 중성인 막 및 음전하를 띤 막 모두에 결합할 수 있다는 것을 나타낸다.
또한, 7-t-부틸디메틸실릴-10-아미노호모캄프토테신(DB-90) 1 μM의 형광 방출 스펙트럼을 조사하였다. 430 nm의 여기광을 사용하여 37 ℃에서 모든 스펙트럼을 기록하였다. PBS 완충액에서의 DB-90에 대한 방출 최대값은 535 nm이고 이 값은 막의 존재시에 낮은 값으로 변하였다(DMPC 소낭의 존재시 λmax는 513 nm이고 DMPG 소낭의 존재시 λmax는 512 nm임).
또한, 7-t-부틸디메틸실릴-10-히이드록시-호모캄프토테신(DB-91) 1 μM의 형광 방출 스펙트럼을 조사하였다. 10 mM 농도의 지질을 사용하였다. 394 nm의 여기광을 사용하여 37 ℃에서 모든 스펙트럼을 기록하였다. PBS 완충액에서의 DB-91에 대한 방출 최대값은 554 nm이고 이 값은 낮은 값으로 변하였다(DMPC 소낭의 존재시 λmax는 441 nm 이고 DMPG 소낭의 존재시 λmax는 434 nm임).
또한, 7-t-부틸-디메틸실릴-10-아미노호모캄프토테신의 카르복실레이트 형태(DB90 카르복실레이트) 1 μM의 형광 방출 스펙트럼을 조사하였다. 0.15 mM 농도의 지질을 사용하였다. 이들 실험에 있어서 사용된 지질의 농도는 DB-90의 대응 락톤 형태를 사용하여 수행한 실험에서 보다 높았고; 제제의 닫힌 고리 락톤 형태와 비교하여 제제의 열린 고리 형태의 감소된 막결합 때문에 높은 지질 농도를 사용하였다. 430 nm의 여기광을 사용하여 37 ℃에서 모든 스펙트럼을 기록하였다. PBS 완충액에서의 DB-90 카르복실레이트에 대한 방출 최대값은 529 nm이고 이 값은 막의 존재시에 낮은 값으로 변하였다(DMPC 소낭의 존재시 λmax는 512 nm이고 DMPG 소낭의 존재시 λmax는 512 nm임).
또한, 7-t-부틸디메틸실릴-10-히드록시호모캄프토테신의 고리 열린 형태 또는 카르복실레이트 형태(DB-91 카르복실레이트) 1 μM의 형광 방출 스펙트럼을 얻었다. 0.15 M 농도의 지질을 사용하였다(결합을 증진시키는 이들 실험에 필요한 지질의 최고 농도는 제제의 닫힌 고리 락톤 형태와 비교하여 제제의 열린 고리 형태의 감소된 막결합에 의하여 요구된다). PBS 완충액에서의 DB-91 카르복실레이트에 대한 방출 최대값은 549 nm이고 이 값은 막의 존재시에 낮은 값으로 변하였다(DMPC 소낭의 존재시 λmax는 450 nm이고 DMPG 소낭의 존재시 λmax는 446 nm임).
7-t-부틸디메틸실릴-10-아미노호모캄프토테신의 락톤 대 카르복실레이트 형태(각각, DB-90 및 DB-90 카르복실레이트) 1 μM의 정규화된(normalized) 형광 방출 스펙트럼을 37 ℃ PBS에서 조사하였다. 형광 방출 스펙트럼 데이터는 고리 열림에 대하여 스펙트럼이 보다 단파장 범위로 약간 변한다는 것(또는 보다 청색광 영 역으로의 스펙트럼의 이동)을 보여준다. 402 nm의 여기광을 사용하여 두 스펙트럼을 기록하였다.
7-t-부틸디메틸실릴-10-히드록시호모캄프토테신의 락톤 대 카르복실레이트 형태(각각, DB-91 및 DB-91 카르복실레이트) 1 μM의 정규화된 형광 방출 스펙트럼을 37 ℃ PBS에서 조사하였다. 형광 방출 스펙트럼 데이터는 고리 열림에 대하여 스펙트럼이 보다 단파장 범위로 약간 변한다는 것(또는 보다 청색광 영역으로의 스펙트럼의 이동)을 보여준다. 394 nm의 여기광을 사용하여 두 스펙트럼을 기록하였다.
적혈구 중의 호모실라테칸 분배 후의 형광 스펙트럼 변화의 직접적 관찰. 제제의 락톤 형태를 용액에 첨가한 직후 스펙트럼 기록을 시작하여 완성하였고, 이로 인하여, 탐지된 신호가 주로 제제의 락톤 형태(열린 고리 형태가 아님)로부터 생긴다는 것을 확인하였다. PBS에서의 DB-91에 대한 방출 최대값은 554 nm이지만 이 값은 무수 에탄올에서는 λmax가 약 410 nm로 상당히 변화한다. DB-91이 10-히드록시 작용기를 포함하기 때문에, 형광이 두 구별된 종에서 발생할 수 있다는 가능성이 존재한다. 비양성자성 용매 또는 비-수성 미세 환경에서 양성자화된(10-히드록시 작용기에 관하여) 종이 우세한 반면, 물과 같은 양성자성 용매에서는 탈양성자화된 여기상태 착화합물이 우세하다. 약 410 nm의 λmax가 양성자화된 여기상태 착화합물과 상관이 있는 반면 554 nm 피크는 탈양성자화된 여기상태 착화합물과 상관 있다. 탈양성자화된 여기상태 착화합물의 형성이 물의 존재에 의하여 매우 촉진된다; 1 %와 같이 소량의 물에서도 탈양성자화된 여기상태 착화합물의 물-촉진 형성과 상관있는 550 nm 주위에 피크가 나타난다. 도 6 및 7에 있어서, 양성자화된 여기상태 착화합물 형성의 확대 및 이들 매개변수의 각각 10-히드록시 작용기를 포함하는 두 7-변형 캄프토테신(DB-91 및 SN-38)에 대한 친유성도의 상대적 측정으로서의 사용을 연구하였다. 제제의 락톤 형태를 용액에 첨가한 직후 스펙트럼 기록을 시작하여 완성하였고, 이로 인하여, 탐지된 신호가 주로 제제의 락톤 형태(열린 고리 형태가 아님)로부터 생긴다는 것을 확인하였다. PBS 에서의 DB-91의 방출 최대값은 554 nm 이다. 적혈구의 존재시, 상당히 더 낮은 λmax 값을 갖는 피크가 관찰되며, 이는 제제가 적혈구 막을 분할할 수 있다는 것을 나타낸다. 적혈구 막은 양성자화된 여기상태 착화합물이 형성되고 형광이 방출되는 소수성 미세 환경을 제공한다. 사람의 적혈구의 존재시의 DB-91의 방출 스펙트럼과 임상적으로 적합한 7-에틸-10-히드록시캄프토테신(도 7)과의 비교는 DB-91의 경우에 있어서 보다 광범위한 양성자화된 여기상태 착화합물 형성이 있다는 것을 보여준다. 이러한 조사 결과는 SN-38의 막결합이 DB-91에서 나타난 광범위한 상호작용보다 상당히 약하다는 것(DB-91은 8,000 M-1의 KDMPC 값을 나타내는 반면, SN-38은 300 M-1의 KDMPC 값을 나타낸다.)을 나타내는 모델 막 연구를 확인시켜준다. 상기 신규한 호모실라테칸 DB-91은 공지의 화합물 7-에틸-10-히드록시캄프토테신(SN-38)과 비교하여 보다 친유성이고, 적혈구-상호작용성 제제이다. PBS에서의 SN-38의 방출 최대값은 약 550 nm이다. 또한, DB-91과 같이, SN-38 제제는 10-히드록시 작용기를 포함하고, 그 결과로, SN-38 또한 수분의 존재에 민감한 형광 스펙트럼 특성을 나타낸다. 적혈구의 존재시, 상당히 더 낮은 λmax 값(약 440 nm)을 갖는 피크가 SN-38에 대하여 관찰되며, 이는 제제가 적혈구 세포막을 분배할 수 있다는 것을 나타낸다. 그러나, SN-38에 대한 더 낮은 λmax 값에서의 피크는 DB-91에 대하여 관찰되는 상황과 비교하여 감소된다(도 6 참조). 이들 결과는 DB-91의 경우에 보다 광범위한 양성자화된 여기상태 착화합물 형성이 있다는 것을 나타내며, 신규한 호모실라테칸 DB-91이 공지의 화합물 7-에틸-10-히드록시캄프토테신(SN-38)과 비교하여 보다 친유성이고, 적혈구-상호작용성인 제제라는 것을 확인시켜 준다.
In vitro 세포 배양 실험에 의하여 측정된 호모실라테칸의 항암 활성.
MDA-MB-435 종양 발생 인간 유방암 세포를 사용하여 세포 독성 실험을 수행하였다. 세포를 약제 농도 범위에 72 시간동안 노출시킨 후, 술포로다민 B (sulphorrhodamine B, SRB)) 검사를 이용하여 생존률을 평가하였다. SRB로 생존 세포내의 총 단백질 농도를 측정하였다. TCA 고정 전에 세척 공정에서 죽은 세포의 단백질을 분해시키고 제거하였다. 그러나, 사멸 초기 공정의 세포는 아직 막 본래의 모습을 가지고 있기 때문에 내부에 단백질 함유량을 유지하고 있다는 것이 가능하다. 결과적으로, 490 nm에서의 광학 밀도는 종종 과대 평가되고 세포 독성은 과소 평가된다. SRB 검사를 확인하기 위하여, 종양 세포주의 다중 패널에 걸쳐서 화학적 치료 제제의 다양한 범위를 시험하였고, 표준 테트라졸륨(tetrazolium, MIT) 검사(assay) 및 클론생성(clonogenic) 검사에 의하여 밀접한 상관관계를 밝혀내었다. SRB는 현재 매우 중요시되는 검사이며, 최근 항암제 선별을 위한 표준적 검사로서 NCI에 의하여 승인받았다. SRB 검사를 사용하여, 본 발명의 신규한 호모실라테칸에 72 시간 동안 노출시킨 세포에 대한 세포 독성값을 측정하였다. 인간 혈청 알부민의 부재 및 존재시의 MDA-MB-435 종양 발생 전이 인간 유방암 세포에 대한 호모실라테칸 및 캄프토테신의 세포독성을 측정하였고, 표 5에 요약하였다. 각 IC50 값은 3 번씩 조사된 각 투여량 수준으로 개별적으로 3 번 시행한 평균을 나타낸다.
MDA-MB-435 종양 발생 인간 유방암 세포를 사용하여 세포 독성 실험을 수행하였다. 세포를 약제 농도 범위에 72 시간동안 노출시킨 후, 술포로다민 B (sulphorrhodamine B, SRB)) 검사를 이용하여 생존률을 평가하였다. SRB로 생존 세포내의 총 단백질 농도를 측정하였다. TCA 고정 전에 세척 공정에서 죽은 세포의 단백질을 분해시키고 제거하였다. 그러나, 사멸 초기 공정의 세포는 아직 막 본래의 모습을 가지고 있기 때문에 내부에 단백질 함유량을 유지하고 있다는 것이 가능하다. 결과적으로, 490 nm에서의 광학 밀도는 종종 과대 평가되고 세포 독성은 과소 평가된다. SRB 검사를 확인하기 위하여, 종양 세포주의 다중 패널에 걸쳐서 화학적 치료 제제의 다양한 범위를 시험하였고, 표준 테트라졸륨(tetrazolium, MIT) 검사(assay) 및 클론생성(clonogenic) 검사에 의하여 밀접한 상관관계를 밝혀내었다. SRB는 현재 매우 중요시되는 검사이며, 최근 항암제 선별을 위한 표준적 검사로서 NCI에 의하여 승인받았다. SRB 검사를 사용하여, 본 발명의 신규한 호모실라테칸에 72 시간 동안 노출시킨 세포에 대한 세포 독성값을 측정하였다. 인간 혈청 알부민의 부재 및 존재시의 MDA-MB-435 종양 발생 전이 인간 유방암 세포에 대한 호모실라테칸 및 캄프토테신의 세포독성을 측정하였고, 표 5에 요약하였다. 각 IC50 값은 3 번씩 조사된 각 투여량 수준으로 개별적으로 3 번 시행한 평균을 나타낸다.
(+/-) 4-에틸-8-메톡시-6-트리메틸실라닐-3,4-디히드로-1
H
-피라노[3,4-c]피리딘-3,4-디올 (4)
둥근바닥 플라스크에 N-메틸모르폴린 N-옥사이드( 0.89 g, 7.6 mmol)를 넣은 후, H2O(10 mL) 및 t-BuOH(10 mL)를 첨가하였다. t-BuOH(0.5 mL) 내 OsO4 용액 2.5 중량%를 첨가한 후, 에놀 에테르 (3)(0.5 g, 1.9 mmol)을 첨가하였다. 12 시간 후, 22 ℃에서, Na2SO3(1.0 g)를 혼합물에 첨가하였다. 30 분 후, 혼합물을 H2O(100 mL)로 희석시키고, CH2Cl2 (2 ×100 mL)로 추출시켰다. 유기층을 건조시키고(MgSO4), 원 잔유물을 크로마토그래피(헥산:EtOAc 3:1)시켜 백색 고체의 락톨 (4) 0.55 g(98 %)을 얻었다: IR (CHCl3, cm-1) 3602, 3569, 3398, 3022, 2950, 1579, 1456, 1351; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.22 (s, 9 H), 0.83 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1.71-1.79 (m, J = 7 Hz, 2 H), 2.91 (s, 1 H), 3.90 (s,3 H), 4.19 (d, J = 5 Hz, 1 H), 4.53 (d, J = 16 Hz, 1 H), 4.70 (d, J = 16 Hz, 1 H), 5.06 (d, J = 5 Hz, 1 H), 7.25 (s, 1 H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ -1.7, 7.8, 31.5, 53.1, 58.8, 70.9, 93.8, 115.1, 119.7, 145.8, 158.0, 162.8; HRMS (EI) m/z calcd for C14H23NO4Si (M+) 473.0519, found 473.0507 LRMS (EI) m/z 473 (M+), 458, 386, 360, 346, 139, 73, 57.
포름산 2-메톡시-4-프로피오닐-6-트리메틸실라닐-피리딘-3-일 메틸 에스테르 (5)
둥근바닥 플라스크에 락톨 (4)(0.100 g, 0.34 mmol)을 첨가한 후, AcOH(9 mL) 및 납 테트라아세테이트(0.18 g, 0.406 mmol)을 첨가하였다. 3 시간 후 50 ℃에서 혼합물을 아이스 콜드 포화(ice cold sat.) NaHCO3 에 따르고, 에테르(3 ×75 mL)로 추출시켰다. 유기층을 건조시키고(MgSO4), 크로마토그래피(헥산:EtOAc 95:5)시켜 투명한 오일상의 케토-포르메이트 에스테르 (5) 91 mg(91 %)을 얻었다: IR (neat, cm-1) 2963, 2902, 1733, 1556, 1455, 1345; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.30 (s, 9 H), 1.21 (t, J = 7 Hz,3 H), 2.75-2.95 (m, J = 7 Hz, 2 H), 4.02 (s, 3 H), 5.28 (s, 2 H), 7.07 (s, 1 H), 8.05 (s, 1 H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ -1.8, 7.9, 35.9, 54.0, 57.6, 112.9, 118.7, 148.5, 160.8, 162.2, 167.6, 205.6; HRMS (EI) m/z calcd for C14H21NO4Si (M+) 295.1240, found 295.1239 LRMS (EI) m/z 295 (M+), 280, 267, 250, 234, 222, 206, 176, 162, 103, 89, 79, 73, 57.
(+/-) 3-히드록시-3-(3-히드록시메틸-2-메톡시-6-트리메틸실라닐-피리딘-4-일)-펜탄산 3차-부틸-에스테르 (6)
화염 건조시킨(flame dried) 플라스크에 케토-포르메이트 에스테르 (5)(0.5 g, 1.69 mmol)을 첨가한 후, 디옥산(20 mL)을 첨가하였다. α-브로모-3차-부틸아세테이트(0.9 mL, 6.08 mmol)을 첨가한 후, 활성화된 Zn(0.59 g, 9.1 mmol)을 첨가하였다. Zn은, 참고문헌으로서 본 명세서에 첨부된, J. Organic Chem., 47, p.5030 (1982)에 기재된 Cava법으로 활성화시켰다. 그 다음에, I2(0.16 g, 0.63 mmol)을 첨가하고 혼합물을 3.2 시간 동안 초음파 처리하였다. 초음파 처리 후, 혼합물을 H2O (100 mL) 및 에테르(100 mL)로 희석시킨다. 얻어진 에멀젼(emulsion)을 셀라이트 패드(celite pad)를 통하여 여과시켜서 상을 분리시켰고, 에테르(2 ×100 mL)로 수성층을 추출하였다. 결합한 에테르 추출물을 건조시키고(MgSO4), 크로마토그래피(헥산:EtOAc 85:15)시켜 투명한 오일상의 베타-히드록시 에스테르 (6) 0.50 g(78 %)을 얻었다: IR (neat, cm-1) 3469, 2980, 1705, 1575, 1545, 1447, 1342, 1248, 1153; 1H NMR (300 MHz, C6D6) δ 0.38 (s, 9 H), 0.79 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1.15 (s, 9 H), 1.75-1.92 (m, J = 7 Hz, 2 H), 2.52 (d, J = 16 Hz, 1 H), 2.79 (d, J = 16 Hz, 1 H), 3.03 (t, J = 7 Hz, 2 H), 3.74 (s, 3 H), 5.18 (d, J = 7 Hz, 2 H), 5.19 (s, 1 H), 7.18 (s, 1 H); 13C NMR (75 MHz, C6D6) δ -1.9, 8.1, 27.6, 35.5, 45.6, 53.0, 57.0, 77.3, 81.5, 120.9, 121.8, 152.3, 162.6, 163.3, 172.3; HRMS (EI) m/z calcd for C19H31NO4Si (M-H2O) 365.2022, found 365.2028 LRMS (EI) m/z 383 (M+), 365, 336, 309, 280, 262, 250, 208, 89, 73, 57.
(+/-) 5-에틸-4,5-디히드로-5-히드록시-7-트리메틸실릴-9-메톡시옥세피노 [3,4-c]피리딘-3(1
H
)-온 (7)
100 mL 플라스크에 베타 히드록시 에스테르 (6)(0.75 g, 1.9 mmol)을 첨가한 후 트리플루오로아세트산(150 mL)을 첨가하였다. 24 시간 후, 혼합물을 포화 NaHCO3 (pH 8)에 따르고, 에테르(3 ×100 mL)로 추출하였다. 유기상을 건조시키고(MgSO4), 크로마토그래피(헥산:EtOAc 2:1)시켜 백색 고체의 베타-히드록시 락톤 (7) 0.48 g(79 %)을 얻었다: IR (CHCl3, cm-1) 3020, 2978, 2873, 1742, 1561, 1448, 1384, 1348, 1110, 909, 842; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.22 (s, 9 H), 0.83 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1.81-1.88 (m, J = 7 Hz, 2 H), 1.37 (br s, 1 H), 3.00 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.32 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.91 (s, 3 H), 5.18.(d, J = 15 Hz, 1 H), 5.42 (d, J = 15 Hz, 1 H), 7.26 (s, 1 H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ -1.9, 8.4, 33.9, 42.9, 53.8, 62.2, 73.8, 114.7, 121.2, 151.6, 159.8, 165.9, 172.3; HRMS (EI) m/z calcd for C15H23NO4Si (M+) 309.1396, found 309.1399 LRMS (EI) m/z 309 (M+), 294, 266, 252, 238, 89.
(+/-)5-에틸-4,5-디히드로-5-히드록시-7-요오드-9-메톡시옥세피노[3,4-c]피리딘-3(1
H
)-온 (8)
0 ℃의 화염 건조시킨 플라스크에 베타 히드록시 락톤 (7)(0.94 g, 3.0 mmol)을 첨가한 후, 건조 CH2Cl2(25 mL)을 첨가하였다. ICl (3.2 g, 19.7 mmol)을 -78 ℃의 화염 건조시킨 플라스크에 첨가하였다. 플라스크를 중탕조 밖으로 꺼내고, 약간 따뜻하게 하고, 과량의 수분을 외부로부터 닦아낸 다음, 질소 하에서 신속하게 무게를 측정하였다. 무게 측정 후, - 78 ℃의 중탕조로 다시 옮겨서 아이스 콜드 CCl4(16 mL)로 희석시켜서 1.2 M의 ICl 용액을 얻었다. 얻어진 ICl 용액을 아이스 중탕조로 옮기고 0 ℃로 평형화시킨다. ICl 용액의 일부(10.1 ml)를 어두운 곳에서 혼합물에 적상(dropwise) 이동시킨다. 어두운 곳에서 16 시간 방치 후, 혼합물을 5 % Na2SO3 와 포화 브라인(Brine)의 1:1 용액(100 mL)에 따르고, EtOAc(3 ×100 mL)로 추출하였다. 유기층을 건조시키고(MgSO4), 크로마토그래피(헥산:EtOAc 3:1)시켜 베타-히드록시 락톤 (7) 0.43 g(46 %) 및 요오도락톤 (8) 0.41 g(37 %)을 얻었다: IR (CHCl3, cm-1) 2974, 2951, 1747, 1573, 1554, 1359, 1278, 1212, 1054, 870; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.84 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1.78-1.85 (m, J = 7 Hz, 2 H), 2.98 (br d, J = 14 Hz, 2 H), 3.30 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.90 (s, 3 H), 5.10 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.35 (d, J = 15 Hz, 1 H), 7.51 (s, 1 H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 8.4, 37.4, 42.7, 55.0, 61.8, 73.4, 114.0, 114.9, 127.3, 155.3, 159.8, 171.9; HRMS (EI) m/z calcd for C12H14INO4 (M+) 362.9967, found 362.9955 LRMS (EI) m/z 363 (M+), 334, 326, 317, 302, 292, 262, 234, 162, 137, 120, 57.
(+/-) 5-에틸-1,4,5,8-테트라히드로-5-히드록시-7-요오도옥세피노[3,4-c]피리딘-3,9-디온 (9)
화염 건조시킨 플라스크에 요오도락톤 (8)(0.33 g, 0.90 mmol)을 첨가한 후 건조 아세토니트릴(12 mL)를 첨가하였다. 요오드화 나트륨(0.22 g, 1.44 mmol)을 첨가한 후 클로로트리메틸실란(0.18 mL, 1,44 mmol)을 첨가하였다. 얻어진 혼합물에 H2O(7.6 μL, 0.42 mmol)를 첨가하고 22 ℃에서 15 분 동안 교반시킨 다음, 혼합물을 60 ℃로 가열하였다. 5 시간 후 60 ℃에서 혼합물을 5 % Na2SO3/브라인의 1:1 용액(75 mL)에 따르고, EtOAc(6 ×75 mL)로 신속하게 추출하였다. 유기층을 건조시키고(MgSO4), 크로마토그래피(CH2Cl2:MeOH 95:5)시켜 백색 고체의 요오도피리돈 (9) 0.19 g(61 %)를 얻었다: 1H NMR (300 MHz, CDCl3/CD3OD) δ 0.62 (t, J= 7 Hz, 3 H), 1.45-1.54 (m, J = 7 Hz, 2 H), 2.80 (d, J = 14 Hz, 1 H), 2.97 (d, J = 14 Hz, 1 H), 4.93 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.06 (d, J = 15 Hz, 1 H), 6.66 (s, 1 H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 7.5, 35.6, 41.9, 61.6, 72.5, 94.4, 118.3, 121.1, 156.5, 162.6, 172.7; HRMS (EI) m/z calcd for C11H12INO4 (M+) 348.9811, found 348.9815 LRMS (EI) m/z 349 (M+), 331, 320, 303, 289, 278, 264, 250, 162, 150, 122, 94, 57.
N-알킬화된 요오도피리돈의 제조
(+/-) 5-에틸-1,4,5-트리히드로-5-히드록시-7-요오드-8-(3-트리메틸실릴-2-프로피닐)-옥세피노[3,4-c]피리딘-3,9-디온 (10a)
화염 건조시킨 플라스크에 요오도피리돈(9)(0.16 g, 0.46 mmol)을 첨가한 후 건조 DME (3.8 mL) 및 DMF (0.95 mL)를 첨가하였다. 이 용액을 0 ℃로 낮추고 오일 내 60 % NaH 분산액(19.3 mg, 0.483 mmol)을 조금씩 넣었다. 15 분 후, 2 eq의 진공 화염 건조시킨 LiBr(81 mg, 0.92 mmol)을 첨가하고 혼합물을 22 ℃로 증가시켰다. 22 ℃에서 25 분간 유지한 후, 트리메틸실릴프로파질 브로마이드(0.130 mL, 0.92 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 65 ℃에서 가열하였다. 16 시간 후, 혼합물을 브라인(50 mL)에 따르고, EtOAc(8 ×30 mL)로 추출하였다. EtOAc층을 건조시키고 (MgSO4), 크로마토그래피(CH2Cl2:EtOAc 80:20)시켜 하얀 거품 형태의 목적하는 N-알킬화 피리돈 (10a) 134 mg(63 %)를 얻었다: 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.005 (s, 9 H), 0.80 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1.60-1.74 (m, J = 7 Hz, 2 H), 2.94 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.11 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.60 (br s, 1 H), 4.82 (d, J = 17 Hz, 1 H), 5.01 (d, J = 17 Hz, 1 H), 5.09 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.26 (d, J = 15 Hz, 1 H), 7.01 (s, 1 H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3/CD3OD) δ -0.44, 7.9, 35.7, 42.2, 45.2, 62.3, 72.6, 90.7, 98.1, 99.2, 119.9, 122.3, 155.1, 160.6, 172.6; HRMS (EI) m/z calcd for C17H22INO4Si (M+) 459.0363, found 459.0366 LRMS (EI) m/z 459 (M+), 444, 388, 306, 111, 96, 83, 73, 57.
(+/-) 5-에틸-1,4,5-트리히드로-5-히드록시-7-요오드-8-(3-
tert
-부틸디메틸실릴-2-프로피닐)-옥세피노[3,4-c]피리딘-3,9-디온 (10b)
상기에 개괄된 과정에 따라 요오도피리돈 (7)(0.16 g, 0.46 mmol)을 TBDMS 프로파질 브로마이드(0.21 g, 0.92 mmol)로 N-알킬화시켰다. 속성(flash) 크로마토그래피(CH2Cl2:EtOAc 9:1)시켜 하얀 거품 형태의 요오도피리돈 (8a) 134 mg(58 %)를 얻었다: 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.097 (s, 6 H), 0.92 (br s, 12 H), 1.82-1.89 (br m, 2 H), 3.01 (d, J= 14 Hz, 1 H), 3.33 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.48 (br s, 1 H), 5.07 (s, 2 H), 5.12 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.47 (d, J = 15 Hz, 1 H), 7.10 (s, 1 H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ -4.7, 8.3, 16.6, 26.3, 36.0, 42.6, 45.3, 62.8, 73.5, 89.4, 98.6, 99.5, 119.5, 122.9, 154.1, 160.4, 172.0; HRMS (EI) m/z calcd for C20H28INO4Si (M+) 501.0832, found 501.0843 LRMS (EI) m/z 501 (M+), 444, 402, 335, 318, 169, 121, 96, 57.
(+/-) 5-에틸-1,4,5,13-테트라히드로-5-히드록시-12-트리메틸실릴-3
H
,15
H
-옥세피노[3´,4´:6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-3,15-디온(1h)(7-트리메틸실릴호모캄프토테신)
Ar 하의 오븐 건조 압력관에 요오도피리돈(10a)(15 mg, 0.033 mmol)을 첨가한 후 벤젠(0.25 mL) 및 t-BuOH(0.5 mL)를 첨가하였다. 그 다음에 페닐이소니트릴 (13.6 mg, 0.13 mmol) 및 헥사메틸디틴(16.0 mg, 0.049 mmol)을 첨가하고 관을 Ar으로 분출(flush)시키고, 밀봉하여, 275 W GE 태양램프 앞에 위치시켰다. 12 시간 동안 빛을 조사시킨 후, 혼합물을 농축시키고 크로마토그래피(CH2Cl2:아세톤 5:1)시켜 황갈색 고체의 호모캄프토테신 (1h) 5.2 mg(36 %)를 얻었다: 1H NMR (300 MHz, CDCl3/CD3OD) δ 0.64 (s, 9 H), 0.96 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1.96-2.05 (m, J = 7 Hz, 2 H), 3.19 (d, J = 14 Hz, 2 H), 3.46 (d, J = 14 Hz, 1 H), 5.34 (s, 2 H), 5.44 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.63 (d, J = 15 Hz, 1 H), 7.65-7.71 (m, 2 H), 7.78- 7.84 (m, 1 H), 8.18 (d, J = 8 Hz, 1 H), 8.27 (d, J = 8 Hz, 1 H); HRMS (EI) m/z calcd for C24H26N2O4Si (M+) 434.1662, found 434.1679 LRMS (EI) m/z 434 (M+), 419, 388, 374, 363, 347, 335, 320, 303, 289, 275, 261, 247, 231, 219, 174, 149, 73.
(+/-) 5-에틸-1,4,5,13-테트라히드로-5-히드록시-10-(
tert
-부틸옥시카르보닐아미노)-12-트리메틸실릴-3
H
,15
H
-옥세피노[3´,4´:6,7]인돌리지노[1,2-b ]퀴놀린-3,15-디온(1c)(10-
tert
-부틸옥시카르보닐아미노-7-트리메틸실릴호모캄프토테신)
상기 개괄된 과정에 따라, 요오도피리돈 (10a)(30 mg, 0.065 mmol)을 벤젠(0.5 mL) 및 t-BuOH(1 mL) 중에서 파라-boc-아미노페닐이소니트릴(57 mg, 0.26 mmol) 및 헥사메틸디틴 (32.2 mg, 0.1 mmol)과 반응시켰다. 크로마토그래피(CH2Cl2:아세톤 7:1)시켜 갈색 고체의 화합물 (1c) 18.8 mg(53 %)를 얻었다: IR (CHCl3, cm-1) 3022, 3007, 1736, 1655, 1594, 1528, 1155, 1062; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 0.70 (s, 9 H), 0.96 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1.61 (s, 9 H), 1.85-2.10 (m, J = 7 Hz, 2 H), 3.31 (d, J = 13 Hz, 1 H), 3.41 (d, J = 13 Hz, 1 H), 5.11 (d, J = 19 Hz, 1 H), 5.34-5.41 (m, 2 H), 5.61 (d, J = 15 Hz, 1 H), 6.96 (s, 1 H), 7.19-7.40 (m, 1 H), 7.62 (s, 1 H), 8.37 (s, 1 H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 1.43, 8.3, 28.4, 35.8, 42.6, 52.4, 62.3, 73.9, 81.2, 100.3, 115.1, 122.2, 123.0, 130.7, 132.6, 134.8, 137.1, 143.4, 143.6, 145.1, 148.2, 152.6, 156.5, 159.8, 171.8; HRMS (EI) m/z calcd for C29H35N3O6Si (M+) 549.2295, found 549.2274 LRMS (EI) m/z 549 (M+), 493, 475, 449, 433, 415, 404, 389, 378, 350, 304, 260, 195, 182, 73.
(+/-) 5-에틸-1,4,5,13-테트라히드로-5-히드록시-10-아세톡시-12-트리메틸실릴-3
H
,15
H
-옥세피노[3´,4´:6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-3,15-디온 (10-아세톡시-7-트리메틸실릴호모캄프토테신)
상기 개괄된 과정에 따라, 요오도피리돈 (10a)(30 mg, 0.065 mmol)을 벤젠(0.5 mL) 및 t-BuOH(1 mL) 중에서 파라-아세톡시페닐이소니트릴(42 mg, 0.26 mmol) 및 헥사메틸디틴 (32.2 mg, 0.1 mmol)과 반응시켰다. 크로마토그래피(CH2Cl2:아세톤 5:1)시켜 황갈색 고체의 산물 6.6 mg(21 %)를 얻었다: IR (CHCl3, cm-1) 3025, 2992, 2953, 1753, 1657, 1600, 1504, 1193; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.67 (s, 9 H), 0.98 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1.99-2.07 (m, 2 H), 2.42 (s, 3 H), 3.26 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.45 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.66 (br s, 1 H), 5.18 (d, J = 19 Hz, 1 H), 5.35 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.39 (d, J = 19 Hz, 1 H), 5.66 (d, J = 15 Hz, 1 H), 7.38 (dd, J 1 = 9 Hz, J 2 = 2 Hz, 1 H), 7.40 (s, 1H), 7.88 (d, J = 9 Hz, 1 H), 7.92 (d, J = 2 Hz, 1 H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 1.6, 8.3, 21.5, 35.9, 42.6, 52.2, 62.2, 74.0, 100.5, 118.9, 122.9, 124.7, 131.3, 132.2, 135.0, 144.1, 144.8, 145.0, 148.9, 150.0, 156.0, 159.7, 169.1, 171.5; HRMS (EI) m/z calcd for C26H28N2O6Si (M+) 492.1717, found 492.1707 LRMS (EI) m/z 492 (M+), 477, 459, 450, 432, 421, 403, 393, 379, 365, 351, 336, 147.
(+/-) 5-에틸-1,4,5,13-테트라히드로-5-히드록시-12- tert -부틸디메틸실릴-3H,15H-옥세피노[3´,4´:6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-3,15-디온(1g)(7-tert-부틸디메틸실릴호모캄프토테신)
상기 개괄된 과정에 따라, 요오도피리돈 (10b)(25 mg, 0.05 mmol)을 벤젠(0.75 mL) 중에서 페닐이소니트릴(15.5 mg, 0.15 mmol) 및 헥사메틸디틴(25 mg, 0.075 mmol)과 반응시켰다. 크로마토그래피(CH2Cl2:아세톤 7:1)시켜 황갈색 고체의 화합물 (1g) 6.4 mg(27 %)를 얻었다: IR (CHCl3, cm-1) 3027, 2958, 2932, 2859, 1745, 1655, 1600, 1269, 1065; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.69 (s, 3 H), 0.70 (s, 3 H), 0.92 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1.00 (s, 9 H), 1.92-2.02 (m, J = 7 Hz, 2 H), 3.23 (d, J = 13 Hz, 1 H), 3.39 (d, J = 13 Hz, 1 H), 3.90(br s, 1 H), 5.11 (d, J = 19 Hz, 1 H), 5.31 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.40 (d, J = 19 Hz, 1 H), 5.60 (d, J = 15 Hz, 1 H), 7.35 (s, 1 H), 7.39-7.49 (m, 2 H), 7.70 (d, J = 8 Hz, 1 H), 8.07 (d, J = 8 Hz, 1 H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ -0.5, -0.3, 8.3, 19.4, 27.3, 35.9, 42.7, 52.9, 62.3, 74.0, 100.3, 122.8, 126.9, 129.4, 130.3, 132.7, 136.0, 143.3, 145.3, 147.6, 150.1, 156.1, 159.9, 171.5; HRMS (EI) m/z calcd for C27H32N2O4Si (M+) 476.2131, found 476.2118 LRMS (EI) m/z 476 (M+), 458, 430, 419, 405, 389, 377, 361, 345, 319, 304, 275, 149, 117, 91, 73, 56.
(+/-)5-에틸-1,4,5,13-테트라히드로-5-히드록시-10-(
tert
-부틸옥시카르보닐아미노)-12-
tert-
부틸디메틸실릴-3
H
,15
H
-옥세피노[3´,4´:6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-3,15-디온 (1a)(10-
tert
-부틸옥시카르보닐아미노-7-
tert
-부틸디메틸 실릴호모캄프토테신)
상기 개괄된 과정에 따라, 요오도피리돈 (10b)(45 mg, 0.089 mmol)을 벤젠(1.3 mL) 중에서 파라-boc-아미노페닐이소니트릴(58 mg, 0.27 mmol) 및 헥사메틸디틴(45 mg, 0.13 mmol)과 반응시켰다. 크로마토그래피(CH2Cl2:아세톤 10:1)시켜 황갈색 고체의 화합물 (1a) 7.8 mg(15 %)를 얻었다: IR (CHCl3, cm-1) 3435, 3022, 2931, 2859, 1738, 1654, 1563, 1528, 1156; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.76 (s, 3 H), 0.77 (s, 3 H), 0.96 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1.10 (s, 9 H), 1.62 (s, 9 H), 1.91-2.07 (m, J = 7 Hz, 2 H), 3.34 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.41 (d, J = 14 Hz, 1 H), 4.42 (br s, 1 H), 5.09 (d, J = 19 Hz, 1 H), 5.38 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.47 (d, J = 19 Hz, 1 H), 5.62 (d, J = 15 Hz, 1 H), 6.99 (br s, 1 H), 7.21-7.25 (m, 2 H), 7.45 (d, J = 9 Hz, 1 H), 8.37 (d, J = 2 Hz, 1 H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ -0.9, -0.5, 8.3, 19.6, 27.4, 28.4, 35.5, 42.7, 53.0, 62.2, 73.8, 81.1, 100.0, 116.2, 122.2, 123.0, 130.3, 133.5, 136.3, 136.9, 144.4, 145.2, 148.2, 152.6, 156.4, 160.0, 171.5; HRMS (EI) m/z calcd for C32H41N3O6Si (M+) 591.2765, found 591.2751 LRMS (EI) m/z 534 (M-57), 516, 488, 477, 459, 435, 417, 393, 375, 111, 97, 83, 69, 57.
(+/-) 5-에틸-1,4,5,13-테트라히드로-5-히드록시-10-아세톡시-12-
tert
-부틸디메틸실릴-3
H
,15
H
-옥세피노[3´,4´:6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-3,15-디온 (1e) (10-아세톡시-7-
tert
-부틸디메틸실릴호모캄프토테신)
상기 개괄된 과정에 따라, 요오도피리돈 (10b)(45 mg, 0.089 mmol)을 벤젠(1.3 mL) 중에서 파라-아세톡시페닐이소니트릴(43 mg, 0.27 mmol) 및 헥사메틸디틴(45 mg, 0.13 mmol)과 반응시켰다. 크로마토그래피(CH2Cl2:아세톤 10:1)시켜 황갈색 고체의 화합물 1(e) 9.6 mg(20 %)를 얻었다: 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.73 (s, 3 H), 0.74 (s, 3 H), 0.97 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1.07 (s, 9 H), 1.94-2.08 (m, J = 7 Hz, 2 H), 2.42 (s, 3 H), 3.29 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.44 (d, J = 14 Hz, 1 H), 4.05 (br s, 1 H), 5.16 (d, J = 19 Hz, 1 H), 5.37 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.48 (d, J = 19 Hz, 1 H), 5.65 (d, J = 15 Hz, 1 H), 7.31 (dd, J 1 = 9 Hz, J 2 = 2 Hz, 1 H), 7.36 (s, 1 H), 7.70 (d, J = 9 Hz, 1 H), 7.97 (d, J = 2 Hz, 1 H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ -0.7, -0.5, 8.3, 19.3, 21.5, 27.2, 35.8, 42.7, 52.9, 62.2, 73.9, 100.4, 120.1, 122.8, 124.7, 131.1, 133.0, 136.5, 143.0, 145.0, 145.4, 148.9, 149.9, 156.2, 159.9, 169.0, 171.5; HRMS (EI) m/z calcd for C29H34N2O6Si (M+) 534.2186, found 534.2188 LRMS (EI) m/z 534 (M+), 516, 488, 477, 459, 435, 417, 393, 375, 335, 320, 291, 275, 234, 164, 137, 125, 111, 97, 83, 69, 57.
(+/-) 5-에틸-1,4,5,13-테트라히드로-5-히드록시-10-히드록시-12-
tert
-부틸디메틸실릴-3
H
,15
H
-옥세피노[3´,4´:6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-3,15-디온 (1f)(10-히드록시-7-
tert
-부틸디메틸실릴호모캄프토테신)
화합물 (1e)(11.9 mg, 0.022 mmol)을 H2O(0.3 mL) 및 MeOH(0.3 mL)에 용해시켰다. 그 다음에, K2CO3(7.5 mg, 0.054 mmol)을 첨가하고 혼합물을 22 ℃에서 교반시켰다. 4 시간 후 용매를 증발시키고, 잔유물을 CH2Cl2(2 mL) 및 TFA(2 mL)에 용해시켰다. 22 ℃에서 16시간 교반시킨 후 포화 NaHCO3를 pH 5가 될 때까지 조심스럽게 첨가하였다. 이 시점에서 EtOAc(3 ×10 mL)로 용액을 추출하고 유기층을 건조시키고(Na2SO4) 농축시켰다. 잔유물을 두 차례 크로마토그래피(1:CH2Cl2:MeOH:AcOH 94:5:1)(2:CH2Cl2:아세톤 5:1)시켜 황색 고체의 화합물 (1f) 8.6 mg(79 %)를 얻었다: 1H NMR (300 MHz, CDCl3/CD3OD) δ 0.65 (s, 6 H), 0.90-0.99 (m, 12 H), 1.89-2.05 (m, 2 H), 3.14 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.34 (d, J = 14 Hz, 1 H), 5.23 (s, 2 H), 5.35 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.57 (d, J = 15 Hz, 1 H), 7.42 (dd, J 1 = 9 Hz, J 2 = 2 Hz, 1 H), 7.58 (d, J = 2 Hz, 1 H), 7.70 (s, 1 H), 8.16 (d, J = 9 Hz, 1 H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3/CD3OD) δ -1.1, 8.1, 19.2, 26.9, 36.1, 42.1, 52.8, 62.1, 73.5, 101.8, 111.5, 122.7, 123.6, 127.5, 129.0, 135.0, 136.6, 139.8, 143.1, 145.5, 156.7, 156.9, 159.6, 172.8; HRMS (EI) m/z calcd for C27H32N2O5Si (M+) 492.2080, found 492.2087 LRMS (EI) m/z 492 (M+), 474, 446, 435, 421, 393, 375, 346, 335, 315, 291, 273, 259, 231, 183, 155.
(+/-) 5-에틸-1,4,5,13-테트라히드로-5-히드록시-10-아미노-12-
tert
-부틸디메틸실릴-3
H
,15
H
-옥세피노[3´,4´:6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-3, 15-디온 (1b)(10-아미노-7-
tert
-부틸디메틸실릴호모캄프토테신)
트리플루오로아세트산(0.1 mL)를 CH2Cl2(0.5 mL) 및 화합물(1a)(8.1 mg, 0.014 mmol)을 포함하는 용액에 첨가하고 내용물을 22 ℃에서 교반하였다. 5 시간 후 혼합물을 포화 NaHCO3(2 mL)에 첨가하고 EtOAc(6 ×2 mL)로 추출하였다. EtOAc를 건조(Na2SO4), 농축시키고, 크로마토그래피(CH2Cl2:MeOH 96:4)시켜 황색 고체의 화합물 (1b) 6 mg(89 %)를 얻었다: 1H NMR (300 MHz, CDCl3/CD3OD) δ 0.28 (s, 6 H), 0.78-0.88 (m, 12 H), 1.78-1.90 (m, 2 H), 3.04 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.24 (d, J = 14 Hz, 1 H), 5.02-5.11 (m, 2 H), 5.24 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.46 (d, J = 15 Hz, 1 H), 7.20 (s, 1 H), 7.26 (dd, J 1 = 9 Hz, J 2 = 2 Hz, 1 H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3/CD3OD) δ -1.0, 8.0, 19.1, 26.9, 36.1, 42.1, 52.7, 62.1, 73.4, 100.7, 122.0, 123.2, 130.5, 134.3, 136.8, 141.8, 144.2, 147.1, 156.7, 159.7, 172.8; HRMS (EI) m/z calcd for C27H33N3O4Si (M+) 491.2240, found 491.2242 LRMS (EI) m/z 491 (M+), 434, 392, 376, 319, 279, 262, 223, 178, 167, 149, 136, 121, 107, 91, 77, 57.
(+/-) 5-에틸-1,4,5,13-테트라히드로-5-히드록시-10-아미노-12-트리메틸실릴-3
H
,15
H
-옥세피노[3´,4´:6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-3,15-디온 (1d)(10-아미노-7-트리메틸실릴호모캄프토테신)
트리플루오로아세트산(0.1 mL)를 CH2Cl2(0.5 mL) 및 화합물(1c)(6.6 mg, 0.012 mmol)을 포함하는 용액에 첨가하고 내용물을 22 ℃에서 교반하였다. 5 시간 후 혼합물을 포화 NaHCO3(2 mL)에 첨가하고 EtOAc(6 ×2 mL)로 추출하였다. EtOAc를 건조(Na2SO4), 농축시키고, 크로마토그래피(CH2Cl2:MeOH 95:5)시켜 오렌지-레드 고체의 화합물 (1d) 2.5 mg(45 %)를 얻었다: 1H NMR (300 MHz, CDCl3/CD3OD) δ 0.60 (s, 9 H), 0.94 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1.92-2.05 (m, 2 H), 3.16 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.46 (d, J = 14 Hz, 1 H), 5.24 (s, 2 H), 5.40 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.61 (d, J = 15 Hz, 1 H), 7.25-7.32 (m, 2 H), 7.52 (s, 1 H), 7.89 (d, J = 9 Hz, 1 H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3/CD3OD) δ -0.12, 7.1, 35.7, 41.5, 51.6, 61.3, 72.8, 99.3, 107.0, 120.4, 121.7, 129.9, 133.6, 134.4, 139.5, 141.0, 144.7, 145.2, 146.4, 156.2, 159.3, 172.6; HRMS (EI) m/z calcd for C24H27N3O4Si (M+) 449.1771, found 449.1791 LRMS (EI) m/z 449 (M+), 434, 402, 389, 374, 350, 335, 304, 178, 73. (+/-).
5-에틸-1,4,5-트리히드로-5-히드록시-7-요오드-8-(5-트리메틸실릴-2-펜티닐)옥세피노[3,4-c]피리딘-3,9-디온 (10c)
상기 개시된 과정에 따라 요오도피리돈 (9)(0.106 g, 0.92 mmol)을 2-트리메틸실릴에틸 프로파질 브로마이드(0.43 g, 1.84 mmol)로 N-알킬화시켰다. 속성 크로마토그래피(CH2Cl2:EtOAc 10:1)시켜 밝은 황색 거품 형태의 요오도피리돈 (10c) 68 mg(46 %)를 얻었다: 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ -0.069 (s, 9 H), 0.72 (t, J = 8 Hz, 2 H), 0.87 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1.70-1.88 (m, 2 H), 2.10-2.20 (m, 2 H), 2.96 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.15 (br s, 1 H), 3.27 (d, J = 14 Hz, 1 H), 4.90-5.00 (m, 2 H), 5.07 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.41 (d, J = 15 Hz, 1 H), 7.02 (s, 1 H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ -1.6, 8.2, 13.5, 15.7, 35.9, 42.5, 45.3, 62.7, 72.5, 73.4, 88.0, 99.7, 119.2, 122.8, 153.9, 160.4, 171.8; HRMS (EI) m/z calcd for C19H26INO4Si (M+) 487.0676, found 487.0676 LRMS (EI) m/z 487 (M+), 472, 400, 374, 346, 96, 73.
(+/-) 5-에틸-1,4,5,13-테트라히드로-5-히드록시-12-(2-트리메틸실릴에틸)-3
H
,15
H
-옥세피노[3´,4´:6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-3,15-디온 (1i)( 7-(2-트리메틸실릴에틸)호모캄프토테신)
Ar 하의 오븐 건조 압력관에 요오도피리돈(10c)(16 mg, 0.033 mmol)을 첨가한 후 벤젠(0.5 mL)를 첨가하였다. 그 다음에 페닐이소니트릴(10.2 mg, 0.1 mmol) 및 헥사메틸디틴(16.7 mg, 0.051 mmol)을 첨가하고 관을 Ar으로 분출시키고, 밀봉한 다음, 275 W GE 태양램프 앞에 위치시켰다. 12 시간 동안 조사시킨 후, 혼합물을 농축시키고 크로마토그래피(CH2Cl2:아세톤 4:1)시켜 황갈색 고체의 목적하는 호모캄프토테신(1i) 3.6 mg(24 %)를 얻었다: 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.184 (s, 9 H), 0.85-1.05 (m, 5 H), 1.98-2.10 (m, 2 H), 3.00-3.12 (m, 2 H), 3.18 (d, J= 14 Hz, 2 H), 3.48 (d, J = 13 Hz, 1 H), 5.14 (d, J = 19 Hz, 1 H), 5.24 (d, J = 19 Hz, 1 H), 5.34 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.71 (d, J = 15 Hz, 1 H), 7.53 (s, 1 H), 7.57-7.63 (m, 1 H), 7.70-7.77 (m, 1 H), 7.94 (d, J = 8 Hz, 1 H), 8.10 (d, J = 8 Hz, 1 H); HRMS (EI) m/z calcd for C26H30N2O4Si (M+) 462.1975, found 462.1976 LRMS (EI) m/z 462 (M+), 447, 415, 402, 391, 377, 363, 348, 317, 289, 243, 231, 73, 59.
(+/-) 5-에틸-1,4,5,13-테트라히드로-5-히드록시-10-(
tert
-부틸옥시카르보닐아미노)-12-(2-트리메틸실릴에틸)-3
H
,15
H
-옥세피노[3´,4´:6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-3,15-디온 (1j)(10-
tert
-부틸옥시카르보닐아미노-7-(2-트리메틸실릴에틸)호모캄프토테신)
상기 개괄된 과정에 따라, 요오도피리돈 (10c)(16 mg, 0.033 mmol)을 벤젠 중에서 파라-boc아미노페닐이소니트릴(21.6 mg, 0.1 mmol) 및 헥사메틸디틴 (16.7 mg, 0.051 mmol)과 반응시켰다. 크로마토그래피(CH2Cl2:아세톤 7:1)시켜 갈색 고체의 화합물 (1j) 10.7 mg(56 %)를 얻었다: 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.20 (s, 9 H), 0.83-0.93 (m, 2 H), 0.99 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1.60 (s, 9 H), 1.93-2.10 (m, 2 H), 2.90-3.05 (m, 2 H), 3.24 (d, J= 14 Hz, 1 H), 3.44 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.74 (br s, 1 H), 5.03 (d, J = 19 Hz, 1 H), 5.20 (d, J = 19 Hz, 1 H), 5.33 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.67 (d, J = 15 Hz, 1 H), 6.85 (s, 1 H), 7.35-7.44 (m, 2 H), 7.85 (d, J = 9 Hz, 1 H), 8.11 (br s, 1 H); HRMS (EI) m/z calcd for C31H39N3O6Si (M+) 577.2608, found 577.2611 LRMS (EI) m/z 577 (M+), 521, 477, 462, 434, 417, 378, 304, 260, 178, 108, 73.
(+/-) 5-에틸-1,4,5,13-테트라히드로-5-히드록시-10-아세톡시-12-(2-트리메틸실릴에틸)-3
H
,15
H
-옥세피노[3´,4´:6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-3,15-디온 (1k)(10-아세톡시-7-(2-트리메틸실릴에틸)호모캄프토테신)
상기 개괄된 과정에 따라, 요오도피리돈 (10c)(16 mg, 0.033 mmol)을 벤젠(0.5 mL) 중에서 파라-아세톡시페닐이소니트릴(16 mg, 0.1 mmol) 및 헥사메틸디틴 (16.7 mg, 0.051 mmol)과 반응시켰다. 크로마토그래피(CH2Cl2:아세톤 5:1)시켜 황갈색 고체의 화합물 (1k) 7.1 mg(41 %)를 얻었다: 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.19 (s, 9 H), 0.82-0.89 (m, 2 H), 0.99 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1.95-2.06 (m, 2 H), 2.42 (s, 3 H), 2.94-2.98 (m, 2 H), 3.23 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.46 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.59 (br s, 1 H), 5.08 (d, J = 19 Hz, 1 H), 5.24 (d, J = 19 Hz, 1 H), 5.35 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.68 (d, J = 15 Hz, 1 H), 7.41-7.49 (m, 2 H), 7.60 (d, J = 2 Hz, 1 H), 7.96 (d, J = 9 Hz, 1 H); HRMS (EI) m/z calcd for C28H32N2O6Si (M+) 520.2030, found 520.2017 LRMS (EI) m/z 520 (M+), 491, 478, 463, 449, 431, 421, 406, 393, 379, 333, 305, 261, 178, 109, 73.
(+/-) 5-에틸-1,4,5,13-테트라히드로-5-히드록시-10-히드록시-12(2-트리메틸실릴에틸)-3
H
,15
H
-옥세피노[3´,4´:6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-3, 15-디온 (1l)(10-히드록시-7-(2-트리메틸실릴에틸)호모캄프토테신)
상기 개괄된 과정에 따라, 화합물(1k)(7.1 mg, 0.014 mmol)을 MeOH/H2O 용액에서 K2CO3(4 mg, 0.028 mmol)과 반응시켰다. 잔유물을 크로마토그래피(CH2Cl2:아세톤 7:1)시켜 황색 고체의 화합물 (1l) 2.6 mg(39 %)를 얻었다: 1H NMR (300 MHz, CDCl3/CD3OD) δ 0.042 (s, 9 H), 0.68-0.92 (m, 5 H), 1.80-1.95 (m, 2 H), 2.83-2.95 (m, 2 H), 3.07 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.28 (d, J= 14 Hz, 1 H), 5.05 (s, 2 H), 5.29 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.51 (d, J = 15 Hz, 1 H), 7.22 (d, J = 2 Hz, 1 H), 7.26-7.34 (m, 1 H), 7.40 (s, 1 H), 7.89 (d, J = 9 Hz, 1 H); HRMS (EI) m/z calcd for C26H30N2O5Si (M+) 478.1924, found 478.1915 LRMS (EI) m/z 478 (M+), 463, 431, 418, 393, 379, 364, 305, 261, 153, 117, 105, 91, 73, 59.
(+/-) 5-에틸-1,4,5,13-테트라히드로-5-히드록시-10-아미노-12(2-트리메틸실릴에틸)-3
H,
15
H
-옥세피노[3´,4´:6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-3,15-디온 (1m)(10-아미노-7-(2-트리메틸실릴에틸)호모캄프토테신)
트리플루오로아세트산(0.1 mL)를 CH2Cl2(0.5 mL) 및 화합물 (1i)(10.7 mg, 0.018 mmol)을 포함하는 용액에 첨가하고 내용물을 22 ℃에서 교반하였다. 5 시간 후 혼합물을 포화 NaHCO3(2 mL)에 첨가하고 EtOAc(6 ×2 mL)로 추출하였다. EtOAc를 건조(Na2SO4), 농축시키고, 크로마토그래피(CH2Cl2:MeOH 96:4)시켜 황색 고체의 화합물(1m) 6.7 mg(78 %)를 얻었다: 1H NMR (300 MHz, CDCl3/CD3OD) δ 0.059 (s, 9 H), 0.70-0.92 (m, 5 H), 1.82-1.98 (m, 2 H), 2.80-2.92 (m, 2 H), 3.08 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.29 (d, J = 14 Hz, 1 H), 5.00 (s, 2 H), 5.29 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.52 (d, J = 15 Hz, 1 H), 6.95 (d, J = 2 Hz, 1 H), 7.18 (dd, J
1 = 9 Hz, J
2 = 2 Hz, 1 H), 7.38 (s, 1 H), 7.83 (d, J = 9 Hz, 1 H).
비록 상기 실시예와 관련하여 본 발명을 상세히 설명하였으나, 이러한 상세한 설명은 단지 그 목적을 위한 것일 뿐이고, 다음의 청구항에 의하여 한정되는 것을 제외하고는 본 발명의 정신에서 벗어나지 않고 당해 기술분야의 당업자에 의하여 변형이 있을 수 있다는 것을 이해하여야 한다.
도 1은 연쇄(cascade) 라디칼 반응을 위한 전구체 합성을 나타낸다.
도 2a 및 2b는 새로운 AB-고리 변형 호모캄프토테신/호모실라테칸 유도체의 합성을 나타낸다.
도 3은 지질 이중층막(bilayer membrane)의 존재 및 부재시, 호모실라테칸(1 μM 7-트리메틸실릴-10-아미노호모캄프토테신 (DB-38))의 전형적인 형광 방출 스펙 트럼을 나타낸다.
도 4는 PBS 내 전기중성을 띤 디미리스토일포스파티딜클로린 (dimyristoylphosphatidylcholine, DMPC)으로 이루어진 SUVs에 대한 4개의 신규한 호모실라테칸의 평형 결합과 캄프토테신(CPT) 및 토포테칸(TPT)에 대해 얻어진 데이터의 비교를 나타낸다.
도 5는 물 존재시, 1 μM 7-t-부틸디메틸실릴-10-히드록시호모캄프토테신 (DB-91)의 형광 방출 스펙트럼의 두드러진 의존도를 나타낸다.
도 6은 pH 7.4의 인산 완충 식염수(phosphate-buffered saline, PBS) 용액 내 그리고 (10±1)×106 세포/μL 농도의 알부민-유리 적혈구를 함유하는 pH 7.4의 PBS 내에서 1 μM 7-t-부틸디메틸실릴-10-히드록시호모캄프토테신 (DB-91)의 형광 방출 스펙트럼을 나타낸다.
도 7은 pH 7.4의 인산 완충 식염수(PBS) 용액 내 그리고 (10±1)×106 세포/μL 농도의 알부민-유리 적혈구를 함유하는 pH 7.4의 PBS 내에서 종래 화합물인 7-에틸-10-히드록시캄프토테신(SN-38)의 형광 방출 스펙트럼을 나타낸다.
도 8은 HPLC 방법으로 측정된 pH값 5.0, 7.4, 8.0 및 9.0의 인산 완충 식염수(PBS) 용액 내에서 1 μM 7-트리메틸실릴-10-아미노호모캄프토테신 (DB38) 안정성의 pH 의존도를 나타낸다.
도 9는 HPLC 방법으로 측정된 pH값 5.0, 7.4, 8.0 및 9.0의 인산 완충 식염수(PBS) 용액 내에서 1 μM 7-t-부틸디메틸실릴호모캄프토테신 (DB81) 안정성의 pH 의존도를 나타낸다.
도 10은 HPLC 방법으로 측정된 pH값 5.0, 7.4, 8.0 및 9.0의 인산 완충 식염수(PBS) 용액 내에서 1 μM 7-t-부틸디메틸실릴-10--아미노호모캄프토테신 (DB90) 안정성의 pH 의존도를 나타낸다.
도 11은 HPLC 방법으로 측정된 pH값 5.0, 7.4, 8.0 및 9.0의 인산 완충 식염수(PBS) 용액 내에서 1 μM 7-t-부틸디메틸실릴-10-히드록시호모캄프토테신 (DB91) 안정성의 pH 의존도를 나타낸다.
도 12는 HPLC 방법으로 측정된 PBS 용액 내에서 본 발명의 4가지 신규 호모실라테칸의 개선된 안정성을 나타낸다.
도 13은 HPLC 방법으로 측정된 PBS/HSA 내에서 본 발명의 4가지 신규 호모실라테칸의 개선된 안정성을 나타낸다.
도 14는 HPLC 방법으로 측정된 본 발명의 4가지 신규 호모실라테칸의 사람 혈장에 대한 안정성을 나타낸다.
도 15는 생리적으로 적절한(physiologically-relevant) [(5±1)×106 세포/μL] 농도의 알부민-유리 적혈구를 함유하는 PBS 현탁액 내에서 본 발명의 4가지 신규 호모실라테칸의 안정성을 나타낸다.
도 16은 HPLC 방법으로 측정된 본 발명의 4가지 신규 호모실라테칸의 사람 혈액에 대한 개선된 안정성을 나타낸다.
도 17은 9-아미노캄프토테신(9AC), 캄프토테신(CPT), 토포테칸(TPT) 및 SN- 38을 포함하는 종래 임상적으로 적절한(clinically-relevant) 약제에 관계되는 본 발명의 4가지 신규 호모실라테칸의 사람 혈액에 대한 개선된 안정성을 나타낸다.
Claims (57)
- 라세미 형(racemic form), 거울상 이성질체 풍부형(enantiomerically enriched form) 또는 거울상 이성질체 순수형(enantiomerically pure form)의, 다음 구조식(1)로 나타내는 화합물 및 약제학적으로 허용 가능한 그의 염.
상기 식 중,R1과 R2는 독립적으로 동일 또는 상이하며 수소, -C(O)Rf(여기서, Rf는 C1-C15 알킬기, C1-C15 알콕시기, 아미노기 또는 히드록시기임), C1-C15 알킬기, C2-C15 알케닐기, C2-C15 알키닐기, C1-C15 알콕시기, 펜옥시기, 나프틸옥시기, C2-C15 아실옥시기, -OC(O)ORd(여기서, Rd는 C1-C15 알킬기임), -OC(O)NRaRb(여기서, Ra 및 Rb는 독립적으로 동일 또는 상이하며, H, -C(O)Rf, C1-C15 알킬기, 펜옥시기 또는 나프틸옥시기임), 할로겐, 히드록시기, 니트로기, 시아노기, 아지도기, 포르밀기, 히드라지노기, 아미노기, -SRc(여기서, Rc는 수소, -C(O)Rf, C1-C15 알킬기, 펜옥시기 또는 나프틸옥시기임)이고; 또는 R1 및 R2가 함께 CH, CH2, O, S, NH, 또는 NR15(여기서, R15는 C1-C6 알킬기임)로 이루어진 군으로부터 선택되는 3 원(member) 또는 4 원의 사슬을 형성하고;R3는 H, 할로겐 원자, 니트로기, 아미노기, 히드록시기, 또는 시아노기이고; 또는 R2 및 R3가 함께 CH, CH2, O, S, NH, 또는 NR15로 이루어진 군으로부터 선택되는 3 원(member) 또는 4 원의 사슬을 형성하고;R4는 H, F, 아미노기, C1-3 알킬기, C2-3 알케닐기, C2-3 알키닐기, 트리알킬실릴기(여기서, 트리알킬실릴기의 알킬기는 각각 독립적으로 C1-C15 알킬기임) 또는 C1-3 알콕시기이고;R5는 C1-10 알킬기, C2-C15 알케닐기, C2-C15 알키닐기 또는 벤질기이고;R6는 -Si(R8R9R10) 또는 -(R7)Si(R8R9R10)(여기서, R7는 C1-C15 알킬렌기, C2-C15 알케닐렌기, 또는 C2-C15 알키닐렌기이고 R8, R9 및 R10은 독립적으로 C1-10 알킬기, C2-10 알케닐기, C2-10 알키닐기, 페닐기, 나프틸기 또는 -(CH2)NR11기(여기서, N은 1 내지 10의 정수이고 R11은 히드록시기, C1-C15 알콕시기, 아미노기, C1-C15 알킬아미노기, 디알킬아미노기(여기서, 디알킬아미노기의 알킬기는 각각 독립적으로 1 내지 15개의 탄소 원자를 가짐), 할로겐 원자, 시아노기, -SRc (여기서, Rc는 수소, -C(O)Rf, C1-C15 알킬기, 페닐기 또는 나프틸기임) 또는 니트로기임)이고;R13은 H, F 또는 -CH3이고;R16은 -C(O)Rf 또는 H이다. - 제 1항에 있어서, R16이 H인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 2항에 있어서, R2 및 R3가 함께 구조식 -O(CH2)nO-(여기서 n은 정수 1 또는 2를 나타냄)로 이루어진 군을 형성하는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 2항에 있어서, R5가 에틸기, 알릴기, 벤질기 또는 프로파질기인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 2항에 있어서, R13이 H인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 5항에 있어서, R5가 에틸기인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 6항에 있어서, R4가 H인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 7항에 있어서, R8 및 R9가 메틸기, R10이 tert-부틸기 또는 메틸기, R1이 H이고 R3가 H인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 8항에 있어서, R2가 H, NH2 또는 OH인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 전구체
또는 전구체
를 다음의 구조식의 아릴이소니트릴
과 반응시키는 것을 포함하여 이루어지는, 연쇄 라디칼 4+1 고리화(cascade radical 4+1 annulation)를 통하여, 다음 구조식의 화합물을 합성하는 방법.
상기 식 들 중,X는 연쇄 라디칼 반응 또는 비연쇄 라디칼 반응에서 라디칼이 발생되도록 분해시키는 기능기를 포함하는 라디칼 전구체;R1과 R2는 독립적으로 동일 또는 상이하며 수소, -C(O)Rf(여기서, Rf는 C1-C15 알킬기, C1-C15 알콕시기, 아미노기 또는 히드록시기임), C1-C15 알킬기, C2-C15 알케닐기, C2-C15 알키닐기, C1-C15 알콕시기, 펜옥시기, 나프틸옥시기, C2-C15 아실옥시기, -OC(O)ORd(여기서, Rd는 C1-C15 알킬기임), -OC(O)NRaRb(여기서, Ra 및 Rb는 독립적으로 동일 또는 상이하며, H, -C(O)Rf, C1-C15 알킬기, 펜옥시기 또는 나프틸옥시기임), 할로겐, 히드록시기, 니트로기, 시아노기, 아지도기, 포르밀기, 히드라지노기, 아미노기, -SRc(여기서, Rc는 수소, -C(O)Rf, C1-C15 알킬기, 펜옥시기 또는 나프틸옥시기임)이거나 또는 R1 및 R2가 함께 CH, CH2, O, S, NH, 또는 NR15(여기서, R15는 C1-C6 알킬기임)로 이루어진 군으로부터 선택되는 3 원(member) 또는 4 원의 사슬을 형성하고;R3는 H, 할로겐 원자, 니트로기, 아미노기, 히드록시기, 또는 시아노기이거나 또는 R2 및 R3가 함께 CH, CH2, O, S, NH, 또는 NR15로 이루어진 군으로부터 선택되는 3 원(member) 또는 4 원의 사슬을 형성하고;R4는 H, F, 아미노기, C1-3 알킬기, C2-3 알케닐기, C2-3 알키닐기, 트리알킬실릴기(여기서, 트리알킬실릴기의 알킬기는 각각 독립적으로 C1-C15 알킬기임) 또는 C1-3 알콕시기이고;R5는 C1-10 알킬기, C2-C15 알케닐기, C2-C15 알키닐기 또는 벤질기이고;R13은 H, F 또는 -CH3이고;R6는 H, 알킬기, -Si(R8R9R10) 또는 -(R7)Si(R8R9R10)(여기서, R7는 C1-C15 알킬렌기, C2-C15 알케닐렌기, 또는 C2-C15 알키닐렌기이고 R8, R9 및 R10은 독립적으로 C1-10 알킬기, C2-10 알케닐기, C2-10 알키닐기, 페닐기, 나프틸기 또는 -(CH2)NR11기 (여기서, N은 1 내지 10의 정수이고 R11은 히드록시기, C1-C15 알콕시기, 아미노기, C1-C15 알킬아미노기, 디알킬아미노기(여기서, 디알킬아미노기의 알킬기는 각각 독립적으로 C1-C15 알킬기임), 할로겐 원자, 시아노기, -SRc (여기서, Rc는 수소, -C(O)Rf, C1-C15 알킬기, 페닐기 또는 나프틸기임) 또는 니트로기임)이다. - 제 10항에 있어서, R2 및 R3가 함께 구조식 -O(CH2)nO-(여기서 n은 정수 1 또는 2를 나타냄)로 이루어진 군을 형성하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 10항에 있어서, R5가 에틸기, 알릴기, 벤질기 또는 프로파질기인 것을 특징으로 방법.
- 제 10항에 있어서, X가 Br 또는 I인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 13항에 있어서, R13이 H인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 14항에 있어서, R5가 에틸기인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 15항에 있어서, R4가 H인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 16항에 있어서, R8 및 R9가 메틸기, R10이 tert-부틸기 또는 메틸기, R1이 H이고 R3가 H인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 17항에 있어서, R2가 H, NH2 또는 OH인 것을 특징으로 하는 방법.
- 라세미 형, 거울상 이성질체 풍부형 또는 거울상 이성질체 순수형의, 다음 구조식(2)을 갖는 화합물 및 약제학적으로 허용 가능한 그의 염.
상기 식 중, R1과 R2는 독립적으로 동일 또는 상이하며 수소, -C(O)Rf(여기서, Rf는 C1-C15 알킬기, C1-C15 알콕시기, 아미노기 또는 히드록시기임), C1-C15 알킬기, C2-C15 알케닐기, C2-C15 알키닐기, C1-C15 알콕시기, 펜옥시기, 나프틸옥시기, C2-C15 아실옥시기, -OC(O)ORd(여기서, Rd는 C1-C15 알킬기임), -OC(O)NRaRb(여기서, Ra 및 Rb는 독립적으로 동일 또는 상이하며, H, -C(O)Rf, C1-C15 알킬기, 펜옥시기 또는 나프틸옥시기임), 할로겐, 히드록시기, 니트로기, 시아노기, 아지도기, 포르밀기, 히드라지노기, 아미노기, -SRc(여기서, Rc는 수소, -C(O)Rf, C1-C15 알킬기, 펜옥시기 또는 나프틸옥시기임)이거나 또는 R1 및 R2가 함께 CH, CH2, O, S, NH, 또는 NR15(여기서, R15는 C1-C6 알킬기임)로 이루어진 군으로부터 선택되는 3 원(member) 또는 4 원의 사슬을 형성하고;R3는 H, 할로겐 원자, 니트로기, 아미노기, 히드록시기, 또는 시아노기이거나 또는 R2 및 R3가 함께 CH, CH2, O, S, NH, 또는 NR15(여기서, R15는 C1-C6 알킬기임)로 이루어진 군으로부터 선택되는 3 원(member) 또는 4 원의 사슬을 형성하고;R4는 H, F, 아미노기, C1-3 알킬기, C2-3 알케닐기, C2-3 알키닐기, 트리알킬실릴기(여기서, 트리알킬실릴기의 알킬기는 각각 독립적으로 C1-C15 알킬기임) 또는 C1-3 알콕시기이고;R5는 C1-10 알킬기, C2-C15 알케닐기, C2-C15 알키닐기 또는 벤질기이고;R6는 -Si(R8R9R10) 또는 -(R7)Si(R8R9R10)(여기서, R7는 C1-C15 알킬렌기, C2-C15 알케닐렌기, 또는 C2-C15 알키닐렌기이고, R8, R9 및 R10은 독립적으로 C1-10 알킬기, C2-10 알케닐기, C2-10 알키닐기, 페닐기, 나프틸기 또는 -(CH2)NR11기(여기서, N은 1 내지 10의 정수이고 R11은 히드록시기, C1-C15 알콕시기, 아미노기, C1-C15 알킬아미노기, 디알킬아미노기(여기서, 디알킬아미노기의 알킬기는 각각 독립적으로 C1-C15 알킬기임), 할로겐 원자, 시아노기, SRc (여기서, Rc는 수소, -C(O)Rf, C1-C15 알킬기, 페닐기 또는 나프틸기임) 또는 니트로기임)이고;R12는 H 또는 -C(O)Rf, -C(O)ORd 또는 -C(O)NRaRb이고;R13은 H, F 또는 -CH3이다. - 제 19항에 있어서, R2 및 R3가 함께 -O(CH2)nO- (여기서 n은 정수 1 또는 2를 나타냄)의 구조를 갖는 기를 형성하는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 19항에 있어서, R5가 에틸기, 알릴기, 벤질기 또는 프로파질기인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 19항에 있어서, R13이 H인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 22항에 있어서, R5가 에틸기인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 23항에 있어서, R4가 H인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 24항에 있어서, R8 및 R9가 메틸기, R10이 tert-부틸기 또는 메틸기, R1이 H이고 R3가 H인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 25항에 있어서, R2가 H, NH2 또는 OH인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 라세미 형, 거울상 이성질체 풍부형 또는 거울상 이성질체 순수형의, 다음 구조식을 갖는 화합물.
상기 식 중,X는 연쇄 라디칼 반응 또는 비연쇄 라디칼 반응에서 라디칼이 발생되도록 분해시키는 기능기를 포함하는 라디칼 전구체이고;R5는 C1-10 알킬기, C2-C15 알케닐기, C2-C15 알키닐기 또는 벤질기이고;R6는 알킬기, -Si(R8R9R10) 또는 -(R7)Si(R8R9R10)(여기서, R7는 C1-C15 알킬렌기, C2-C15 알케닐렌기, 또는 C2-C15 알키닐렌기이고, R8, R9 및 R10은 독립적으로 C1-10 알킬기, C2-10 알케닐기, C2-10 알키닐기, 페닐기, 나프틸기 또는 -(CH2)NR11기(여기서, N은 1 내지 10의 정수이고 R11은 히드록시기, C1-C15 알콕시기, 아미노기, C1-C15 알킬아미노기, 디알킬아미노기(여기서, 디알킬아미노기의 알킬기는 각각 독립적으로 C1-C15 알킬기임), 할로겐 원자, 시아노기, -SRc (여기서, Rc는 수소, -C(O)Rf, C1-C15 알킬기, 페닐기 또는 나프틸기임) 또는 니트로기임)이고;R13은 H, F 또는 -CH3이다. - 제 27항에 있어서, R5가 에틸기, 알릴기, 벤질기 또는 프로파질기인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 27항에 있어서, X가 Br 또는 I인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 29항에 있어서, R13이 H인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 30항에 있어서, R5가 에틸기인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 라세미 형, 거울상 이성질체 풍부형 또는 거울상 이성질체 순수형의, 다음 구조식을 갖는 화합물.
상기 식 중, X는 연쇄 라디칼 반응 또는 비연쇄 라디칼 반응에서 라디칼이 발생되도록 분해시키는 기능기를 포함하는 라디칼 전구체이고; R5는 C1-10 알킬기, C2-C15 알케닐기, C2-C15 알키닐기 또는 벤질기이고; R13은 H, F 또는 -CH3이다. - 제 32항에 있어서, R5가 에틸기, 알릴기, 벤질기 또는 프로파질기인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 33항에 있어서, X가 Br 또는 I인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 32항에 있어서, R13이 H인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 35항에 있어서, R5가 에틸기인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 다음 구조식으로 나타내는 화합물.
상기 식 중, R5는 C1-10 알킬기, C2-C15 알케닐기, C2-C15 알키닐기 또는 벤질기이고;R12는 H 또는 -C(O)Rf, -C(O)ORd 또는 -C(O)NRaRb(여기서, Rf는 C1-C15 알킬기, C1-C15 알콕시기, 아미노기 또는 히드록시기이고; Rd는 C1-C15 알킬기이고; Ra 및 Rb는 독립적으로 동일 또는 상이하며, H, -C(O)Rf, C1-C15 알킬기, 페닐기 또는 나프틸기임)이다. - 제 37항에 있어서, R5가 에틸기, 알릴기, 벤질기 또는 프로파질기인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 38항에 있어서, R5가 에틸기인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 다음 구조식으로 나타내는 화합물.
상기 식 중, R5는 C1-10 알킬기, C2-C15 알케닐기, C2-C15 알키닐기 또는 벤질기이고;R13은 H, F 또는 -CH3이고;R15는 C1-C6 알킬기이다. - 제 40항에 있어서, R5가 에틸기, 알릴기, 벤질기 또는 프로파질기인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 41항에 있어서, R13이 H인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 42항에 있어서, R5가 에틸기인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 라세미 형, 거울상 이성질체 풍부형 또는 거울상 이성질체 순수형의, 다음 구조식을 갖는 화합물.
상기 식 중, R5는 C1-10 알킬기, C2-C15 알케닐기, C2-C15 알키닐기 또는 벤질기이고;R13은 H, F 또는 -CH3이고;R14는 SiMe3, I, 또는 Br이다. - (a) 다음 구조의 에놀 에테르를 처리하여
다음 구조의 화합물을 형성하는 공정;
(b) 공정 (a)에서 형성된 화합물을 다음 구조의 유기 금속 시약(하기 식 중, M은 Li, Na, K, MgY, 또는 ZnY이고 R15는 C1-6 알킬기)으로 처리하여MC(R13)(R13)CO2R15다음 구조의 화합물을 형성하는 공정
(c) 공정 (b)에서 형성된 화합물을 산으로 처리하여 다음 구조를 가지는 화합물을 형성하는 공정;
(d) 할로겐 탈실릴화에 의하여 공정 (c)에서 형성된 화합물을 처리하여 다음 구조를 가지는 화합물을 형성하는 공정;
(e) 탈메틸화에 영향을 주도록, 공정 (d)의 화합물을 산 또는 요오도트리메틸실란으로 처리하고 다음 구조의 화합물을 제공하는 공정;
(f) 무기 리튬염의 존재하에, 공정 (e)의 화합물을 리튬 염기 또는 나트륨 염기로 처리하여 질소 원자를 탈양성자화(deprotonation)시키는 공정;(g) 공정 (f)에서 생성된 탈양성자화 종(種)을 다음 구조의 화합물(하기 식 중, Z는 I, Br, Cl, 메실레이트기 또는 토실레이트기임)과 반응시켜
다음 구조의 화합물을 형성시키는 공정을 포함하여 이루어지는,
다음의 구조식으로 나타내는 화합물의 합성 방법.
상기 식 중, Y는 Cl, Br 또는 I이고;R5는 C1-10 알킬기, C2-C15 알케닐기, C2-C15 알키닐기 또는 벤질기이고;R6는 알킬기, -Si(R8R9R10) 또는 -(R7)Si(R8R9R10)(여기서, R7는 C1-C15 알킬렌기, C2-C15 알케닐렌기, 또는 C2-C15 알키닐렌기이고, R8, R9 및 R10은 독립적으로 C1-10 알킬기, C2-10 알케닐기, C2-10 알키닐기, 페닐기, 나프틸기 또는 -(CH2)NR11(여기서, N은 1 내지 10의 정수이고 R11은 히드록시기, C1-C15 알콕시기, 아미노기, C1-C15 알킬아미노기, 디알킬아미노기(여기서, 디알킬아미노기의 알킬기는 각각 독립적으로 C1-C15 알킬기임), 할로겐 원자, 시아노기, SRc (여기서, Rc는 수소, -C(O)Rf, C1-C15 알킬기, 페닐기 또는 나프틸기임) 또는 니트로기임)이고;R13은 H, F 또는 -CH3이다. - 제 45항에 있어서, R5가 에틸기, 알릴기, 벤질기 또는 프로파질기인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 46항에 있어서, R13이 H인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 47항에 있어서, R5가 에틸기인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항의 화합물 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염의 유효량을 함유하는, 암 또는 백혈병 치료용 약학 조성물.
- 제 49항에 있어서, 암은 뇌암 또는 유방암인 것인 약학 조성물.
- 제 18항의 화합물 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염의 유효량을 함유하는, 암 또는 백혈병 치료용 약학 조성물.
- 제 51항에 있어서, 암은 뇌암 또는 유방암인 것인 약학 조성물.
- 라세미 형, 거울상 이성질체 풍부형 또는 거울상 이성질체 순수형의, 다음 구조식을 갖는 화합물.
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- 제 54항에 있어서, X가 Br 또는 I인 것을 특징으로 하는 화합물.
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