JP4866505B2 - カンプトセシン類似体及びその調製方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
関連出願
発明の分野
本発明は、新規な化合物及びその調製方法、詳しくはＥ−環拡張カンプトセシン誘導体又は類似体及びこのようなカンプトセシン類似体の調製方法に関する。
【０００２】
発明の背景
カンプトセシンは、現在抗癌薬として使用されているDNAトポイソメラーゼＩインヒビターである。トポテカン（tpt）及びCPT-11は、食品医薬品局の完全な承認状態を得るためのカンプトセシン系統群の最初の２メンバーである（進行性上皮卵巣癌の第２ライン療法として1998年にトポテカン、再び小細胞肺癌の治療のため1998年にトポテカン、大腸癌の第１ライン療法として1998年にCPT-11）。GI-147211C、DX8951f、9-アミノカンプトセシン（9-AC）及び9-ニトロカンプトセシンのようなカンプトセシン系統群のいくつかの他の類似体が、臨床前及び臨床評価のいろいろな段階にある。臨床用途の各カンプトセシンは、血流中で比較的速く加水分解して、著しく抗癌活性を喪失してしまう。生物学的に不活性かつ潜在的に毒性のヒドロキシカルボキシレート型を生じることが、生理的ｐＨで加水分解する臨床関連のカンプトセシン内でキーとなるα−ヒドロキシラクトンファルマコフォアである。Fassberg,J.及びStella,V.A.,“カンプトセシンといくつかの類似体の動力学及び機構研究”,J.Pharm.Sci.81:676-684(1992)；Hertzberg,R.P.,Caranfa,M.J.及びHecht,S.M.,“カンプトセシンによるトポイソメラーゼＩ阻害の機序について：酵素−DNA複合体に結合する証拠”,Biochemistry 28:4629-4638(1989)；Hsiang,Y-H.及びLiu,L.F.,“抗癌薬カンプトセシンの分子内標的としての哺乳類DNAトポイソメラーゼＩの同定”，Cancer Res. 48:1722-1726(1988)；及び Jaxel,C.,Kohn,K.W.,Wani,M.C.,Wall,M.E.,及びPommier,Y.,“哺乳類トポイソメラーゼＩに関するカンプトセシン誘導体の構造活性研究：特異的レセプター部位及び抗癌活性に対する関係”,Cancer Res. 49:5077-5082(1989)。上述のものも含め、本明細書で述べる参照文献は本発明の理解を容易にしうる。本明細書に参照文献を含めることは、その参照文献が本発明についての先行技術であるとの承認を構成することを意図するものではない。
【０００３】
カンプトセシン及びその重要ないくつかの類似体の構造は以下に示される：
【化２２】
【０００４】
最近の研究努力により、9-アミノカンプトセシン及びカンプトセシン（cpt）のような薬剤が、それらのカルボキシレート型とヒト血清アルブミン（HSA）との間の高い親和性の結合相互作用のためにヒト血液内で非常に乏しい安定性を示すことがわかった。Burke,T.G.、Mi,Z.、Jiang,Y.、及びMunshi,C.B.“カンプトセシン抗癌薬の相対的なヒト血液安定性の決定におけるアルブミンの重要な役割”,Journal of Pharmaceutical Science,84:518-519(1995)；Burke,T.G.及びMi,Z.“ヒト血清アルブミンとのカンプトセシン相互作用の構造的基準：薬物安定性に及ぼす影響”，Jouranal of Medicinal Chemistry,37:40-46(1994)；Mi,Z.及びBurke,T.G.,“カンプトセシンラクトン及びカルボキシレート型のヒト血液成分との差次的相互作用”,Biochemistry ,33:10325-10336(1994)；及びMi,Z.、Malak,H.、及びBurke,T.G.“低減されたアルブミン結合性がヒト血液中におけるトポテカンの安定性及び活性を促進する”,Biochemistry ,34:13722-13728(1995)、これら開示は参照によって本明細書に取り込まれる。周波数領域寿命蛍光定量実験は、ヒト血清アルブミン（HSA）が、カンプトセシンラクトンと比べて100倍を超える高い親和性で優先的にカンプトセシンカルボキシレートを結合することを明かにした。Mi,Z.及びBurke,T.G.“カンプトセシンの血清アルブミンとの相互作用に関連する顕著な種間変異：周波数領域蛍光分光研究”，Biochemistry,33:12540-12545(1994)、この開示は参照によって本明細書に取り込まれる。このラクトンを超えるカルボキシレートの差次的な結合性の結果、HSAの存在下で、該タンパク質が不在の場合よりも速くかつ完全にカンプトセシン及び9-ACが開くことになる。ヒト血漿、ｐＨ7.4かつ37℃では、カンプトセシン及び9-ACは両方とも速くかつ完全に開いて、平衡ではほとんど無視できる0.2％ラクトン濃度になる。HSAの存在は、カンプトセシン及び9-ACについてはラクトン開環を促進するが、一般的に赤血球及び脂質二重層は、カンプトセシンの電気的に中性なラクトン型を、それらのそれぞれ負に荷電したカルボキシレートラクトン型を超えて優先的に結合する。Burke,T.G.、Staubus,A.E.、Mishra,A.K.、及びMalak,H.,“カンプトセシンのラクトン環のリポソーム安定化”，J.Am.Chem.Soc. 114:8318-8319(1992)；及びBurke,T.G.、Mishra,A.K.、Wani,M.、及びWall,W.，“カンプトセシン薬の脂質二重層分配性及び安定性”,Biochemistry ,32:5352-5364(1993)、これら開示は参照によって本明細書に取り込まれる。それによって、赤血球は血中の活性ラクトン濃度を高める。
【０００５】
【化２３】
【０００６】
最近、Lavergneらは、カンプトセシンの“ホモカンプトセシン”を生成するためのＥ−環の拡張が、抗癌活性を維持しながらカンプトセシンの溶液安定性を高めることを示した。Lavergne,O.、Lesueur-Ginot,L.、Rodas,F.P.、Kasprzyk,P.G.、Pommier,J.、Demarquay,D.、Prevost,G.、Ulibarri,G.、Rolland,A.、Schiano-Liberatore,A.-M.、Harnett,J.、Pons,D.、Camara,J.、Bigg,D.，“ホモカンプトセシン：新規なＥ−環修正カンプトセシン類似体の合成及び抗腫瘍活性”，J.Med.Chem.,41,5410-5419(1998)；及びLavergne,O.、Lesueur-Ginot,L.、Rodas,F.P.、及びBigg,D.，“強力な抗増殖性及びトポイソメラーゼＩ阻害活性を有するＥ−環修正カンプトセシン”,Bioorg. Med. Chem. Lett. 7,2235-2238(1997)。Lavergneらの研究におけるＥ−環に対する修正は、天然に存在する６員環のカンプトセシンのα−ヒドロキシラクトンの20-OH官能性とカルボキシル基との間にメチレンスペーサーを挿入することを含む。新しい７員環β−ヒドロキシラクトン環をカンプトセシン中に取り込むと、該薬剤の溶液及び血漿安定性を高めることがわかった。
【０００７】
Lavergneらのホモカンプトセシンの構造及びこのような化合物を記述するのに用いられるナンバリング系は以下に示される。
【化２４】
カンプトセシン系統群の薬物の開発にかなりの進歩が為されてきたが、この系統群の薬物の改良された化合物を開発すること、及びこのような薬物を製造するための改良された合成経路を開発することが非常に望まれているままである。
【０００８】
発明の概要
本発明は、一般的に下記式（１）を有するラセミ形態、エナンチオマー富化形態又はエナンチオマー純粋形態の化合物であって、
【化２５】
式中、Ｒ1及びＲ2は他と関係なく同一又は異なり、かつ水素、−Ｃ(Ｏ)Ｒf(式中Ｒfがアルキル基、アルコキシ基、アミノ基若しくはヒドロキシ基である)、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アシルオキシ基、−ＯＣ(Ｏ)ＯＲd（式中Ｒdがアルキル基である）、−ＯＣ(Ｏ)ＮＲaＲb（式中Ｒa及びＲbは独立に、同一又は異なり、Ｈ、−Ｃ(Ｏ)Ｒf、アルキル基若しくはアリール基である基、ハロゲン、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、アジド基、ホルミル基、ヒドラジノ基、アミノ基、−ＳＲc（式中Ｒcが水素、−Ｃ(Ｏ)Ｒf、アルキル基若しくはアリール基である）であり；又はＲ1及びＲ2が一緒になって、ＣＨ、ＣＨ2、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、若しくはＮＲ15（式中Ｒ15がＣ1-Ｃ6アルキル基）の群から選択される３若しくは４員環の鎖を形成し；
Ｒ3は、Ｈ、ハロゲン原子、ニトロ基、アミノ基、ヒドロキシ基、若しくはシアノ基であり；又はＲ2及びＲ3が一緒になって、ＣＨ、ＣＨ2、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、若しくはＮＲ15の群から選択される３若しくは４員環の鎖を形成し；
Ｒ4は、Ｈ、Ｆ、アミノ基、Ｃ1-3アルキル基、Ｃ2-3アルケニル基、Ｃ2-3アルキニル基、トリアルキルシリル基又はＣ1-3アルコキシ基であり；
Ｒ5は、Ｃ1-10アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、又はベンジル基であり；
Ｒ6は、−Ｓｉ(Ｒ8Ｒ9Ｒ10)又は−(Ｒ7)Ｓｉ(Ｒ8Ｒ9Ｒ10)（式中Ｒ7がアルキレン基、アルケニレン基、又はアルキニレン基）であり；かつＲ8、Ｒ9及びＲ10は、独立に、Ｃ1-10アルキル基、Ｃ2-10アルケニル基、Ｃ2-10アルキニル基、アリール基又は−(ＣＨ2)NＲ11基（式中Ｎが１〜10の範囲の整数であり、かつＲ11がヒドロキシ基、アルコキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、ハロゲン原子、シアノ基、−ＳＲC若しくはニトロ基）であり；
Ｒ13は、Ｈ、Ｆ、又は−ＣＨ3であり；
Ｒ16は、−Ｃ(Ｏ)Ｒf又はＨである化合物；及び
その製薬的に許容性の塩を提供する。
【０００９】
Ｒ1とＲ2が一緒に、例えば式−Ｏ(ＣＨ2)nＯ−であって、式中ｎが整数１又は２を表す基を形成しうる。同様に、Ｒ2とＲ3が一緒に、例えば式−Ｏ(ＣＨ2)nＯ−であって、式中ｎが整数１又は２を表す基を形成しうる。
Ｒ5は、好ましくはエチル基、アリル基、ベンジル基又はプロパギル基である。最も好ましくは、Ｒ5はエチル基である。好ましくは、Ｒ4はＨである。
一実施形態では、Ｒ8及びＲ9はメチル基であり、Ｒ10はtert-ブチル基又はメチル基であり、Ｒ1がＨかつＲ3がＨである。この実施形態では、Ｒ2は、例えばＨ、ＮＨ2又はＯＨでありうる。
Ｒ13は、好ましくはＨである。Ｒ16は、好ましくはＨ又はアルキル基である。最も好ましくは、Ｒ16はＨ又は−Ｃ(Ｏ)Ｒfであって式中Ｒfがアルキル基である。最も好ましくは、Ｒ16はＨである。
【００１０】
本発明は、下記式を有する化合物のカスケードラジカル４＋１体環形成を経由する合成方法をも提供する。
【化２６】
ここで、前駆体
【化２７】
又は前駆体
【化２８】
が、下記式を有するアリールイソニトリルと反応する。
【化２９】
式中、Ｘはラジカル前駆体である。好ましくは、ＸはＣｌ、Ｂｒ又はＩである。最も好ましくは、ＸはＢｒ又はＩである。
【００１１】
本発明は、下記式を有するラセミ形態、エナンチオマー富化形態又はエナンチオマー純粋形態の化合物であって、
【化３０】
式中、Ｒ12が、好ましくはＨ又は−Ｃ(Ｏ)Ｒf、−Ｃ(Ｏ)Ｒd、−Ｃ(Ｏ)ＮＲaＲbである化合物；及び
その製薬的に許容性の塩をも提供する。
【００１２】
さらに、本発明は、下記式を有するラセミ形態、エナンチオマー富化形態又はエナンチオマー純粋形態の化合物を提供する。
【化３１】
及び
【化３２】
【００１３】
なおさらに、本発明は、下記式を有するラセミ形態、エナンチオマー富化形態又はエナンチオマー純粋形態の化合物を提供する。
【化３３】
【００１４】
本発明は、下記式を有する化合物をも提供する。
【化３４】
【００１５】
本発明は、下記式を有する化合物をも提供する。
【化３５】
式中、Ｒ15はＣ1−Ｃ6アルキル基である。
【００１６】
さらに、本発明は、下記式を有するラセミ形態、エナンチオマー富化形態又はエナンチオマー純粋形態の化合物を提供する。
【化３６】
式中、Ｒ14はＳｉＭｅ3、Ｉ、又はＢｒである。
【００１７】
なおさらに、本発明は、下記式を有する化合物の合成方法を提供する。
【化３７】
式中、Ｙは塩素、臭素又はヨウ素であり；
以下の工程を包含する。
（ａ）適切な酸化的開裂条件下、下記構造のエノールエーテルを処理し：
【化３８】
下記構造を有する化合物を生成する工程：
【化３９】
（ｂ）工程（ａ）で生成された化合物を、適切な条件下、下記構造を有し：
ＭＣ(Ｒ13)(Ｒ13)ＣＯ2Ｒ15
式中、ＭがＬｉ、Ｎａ、Ｋ、ＭｇＹ、又はＺｎＹである有機金属試薬で処理し、下記構造を有する化合物を生成する工程：
【化４０】
（ｃ）工程（ｂ）で生成された化合物を、適切な条件下、酸で処理し、下記構造を有する化合物を生成する工程：
【化４１】
（ｄ）工程（ｃ）で生成された化合物を、ハロゲンによる脱シリルの適切な条件下で処理し、下記構造を有する化合物を生成する工程：
【化４２】
（ｅ）工程（ｄ）で生成された化合物を、脱メチルのための適切な条件下、酸又はヨードトリメチルシランで処理し、下記構造を有する化合物を与える工程：
【化４３】
（ｆ）工程（ｅ）の化合物を、無機リチウム塩の存在下、リチウム塩基又はナトリウム塩基で処理し、窒素原子を脱プロトンする工程、
（ｇ）工程（ｆ）の結果脱プロトンされた種を、下記構造を有し：
【化４４】
式中、ＺがＩ、Ｂｒ、Ｃｌ、メシレート基又はトシレート基である化合物と適切な条件下で反応させ、下記構造を有する化合物を生成させる工程。
【化４５】
【００１８】
上述したように、β−ヒドロキシラクトン基を含有する本発明のすべての化合物は、ラセミ形態、エナンチオマー富化形態、又はエナンチオマー純粋形態で存在することができる。ここに述べられるこのような化合物の式は、このような各形態をカバーし、及び／又は包含する。
用語“ラジカル前駆体”は、ここで使用され、かつ当業者に周知のように、一般に、鎖又は非鎖ラジカル反応の標準的な条件下で開裂してラジカルを生成するそれらの官能基を意味する。通常のラジカル前駆体は、ハロゲン（フッ素以外）、カルボン酸及びその誘導体（チオヒドロキサメートのような）、セレノフェニル基、ジアゾニウム塩等である。例えば、その開示は参照によって本明細書に取り込まれている、Giese,B. 有機合成におけるラジカル：炭素−炭素結合の形成；Pergamon,Oxford(1986)を参照せよ。
【００１９】
用語“アルキル”、“アリール”及び他の基は、その反対であると言及しない限り、一般に無置換の及び置換された基の両方を意味する。特に言及しない限り、アルキル基は炭化水素基であり、かつ好ましくはＣ1−Ｃ15（すなわち、１〜15個の炭素原子を有する）アルキル基、さらに好ましくはＣ1−Ｃ10アルキル基であり、かつ分岐し又は分岐せず、非環式又は環式でありうる。アルキル基の上記定義及び他の定義は、その基が他の基上の置換基である場合にも当てはまる（例えば、アルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基の置換基としてのアルキル基）。用語“アリール”は、フェニル又はナフチルを意味する。本明細書で用いられる場合、用語“ハロゲン”又は“ハロ”は、フルオロ、クロロ、ブロモ及びヨードを意味する。
【００２０】
用語“アルコキシ”は、−ＯＲdを意味し、式中Ｒdはアルキル基である。用語“アルコキシ”は、−ＯＲeを意味し、式中Ｒeはアリール基である。用語アシルは、−Ｃ(Ｏ)Ｒfを意味する。用語“アルケニル”は、少なくとも１個の二重結合を有し、好ましくは２〜15個の炭素原子、さらに好ましくは２〜10個の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖炭化水素基を意味する（例えば、−ＣＨ＝ＣＨＲg又は−ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨＲg）。用語“アルキニル”は、少なくとも１個の三重結合を有し、好ましくは２〜15個の炭素原子、さらに好ましくは２〜10個の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖炭化水素基を意味する（例えば、−Ｃ≡ＣＲh又は−ＣＨ2−Ｃ≡ＣＲh）。用語“アルキレン”、“アルケニレン”及び“アルキニレン”は、それぞれアルキル、アルケニル及びアルキニル基の二価形態を意味する。
【００２１】
上述の基は、多種多様な置換基で置換されて、活性を保持したホモカンプトセシン類似体を合成することができる。例えば、アルキル基は、好ましくは、限定するものではないが、ベンジル基、フェニル基、アルコキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基（例えば、遊離のアミノ基、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ基及びアリールアミノ基を含む）、アルケニル基、アルキニル基及びアシルオキシ基を含む１個又は複数の基で置換されうる。アミノ基（−ＮＲaＲb）の場合、Ｒa及びＲbは、好ましくは他と関係なく水素、アシル基、アルキル基、又はアリール基である。アシル基は、好ましくは（すなわち、Ｒfが）アルキル基、ハロアルキル基（例えば、ペルフルオロアルキル基）、アルコキシ基、アミノ基及びヒドロキシ基で置換されうる。アルキニル基及びアルケニル基は、好ましくは（すなわち、Ｒg及びＲhが、好ましくは）限定するものではないが、アルキル基、アルコキシアルキル基、アミノアルキル基及びベンジル基を含む１個の基又は複数の基で置換されうる。
【００２２】
ここで用いられる場合、用語“アシルオキシ”は、基−ＯＣ(Ｏ)Ｒdを意味する。
ここで用いられる場合、用語“アルコキシカルボニルオキシ”は、基−ＯＣ(Ｏ)ＯＲdを意味する。
ここで用いられる場合、用語“カルバモイルオキシ”は、基−ＯＣ(Ｏ)ＮＲaＲbを意味する。
アミノ及びヒドロキシ基は、技術的に公知の保護基としての基を包含しうる。アミノ基の好ましい保護基としては、tert−ブチルオキシカルボニル、ホルミル、アセチル、ベンジル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル、トリチルが挙げられる。当業者に公知の他の好適な保護基は、Greene,T.，Wuts,P.G.M.，有機合成における保護基，Wiley(1991)に開示されており、この開示は参照によって本明細書に取り込まれる。
【００２３】
一般に、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は、好ましくは結果として生成するカンプトセシン類似体の活性を維持するために過度にかさ高くない。従って、好ましくは、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は、他と関係なく約250未満の分子量を有する。さらに好ましくは、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は、他と関係なく約200未満の分子量を有する。
本発明のカンプトセシン類似体のいくつかは、限定するものではないが、塩化水素、臭化水素、硫酸塩、リン酸塩、及び硝酸塩のような無機酸との塩として製薬的用途のために調製することができる。カンプトセシン類似体は、限定するものではないが、酢酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、及びステアリン酸塩のような有機酸との塩として調製することもできる。他の酸は、本発明の化合物及びそれらの製薬的に許容性の塩の調製における中間体として使用することができる。
【００２４】
精製、投薬又は他の目的のため、Ｅ−環（ラクトン環）は、限定するものではないが、水酸化ナトリウム又は水酸化カルシウムのようなアルカリ金属で開環され、式（２）の化合物で上述したように、式（１）の化合物の開いたＥ−環類似体が生成する。このように得られた中間体は水によく溶け、かつ酸による処理後精製されて、本発明のカンプトセシン類似体の精製形態が生じうる。
【００２５】
また、Ｅ環を修正して、水又は他の溶媒中で異なる溶解プロフィルを持つ式（１）の化合物の類似体を生成することもできる。この目標を達成する方法としては、限定するものではないが、Ｅ−環を水酸化物若しくは水溶性アミノ基で開環するか、又はＥ−環の20位のヒドロキシ基をポリエチレングリコール基若しくはアシル基のような水溶性基で官能化することが挙げられる。このような基は、ホモカンプトセシン誘導体上に、又は合成の早い段階で導入することができる。このようにして調製された類似体は、プロドラッグとして作用する。他言すれば、これら類似体は、生体に投与されると、式（１）の化合物（閉じたＥ−環構造を有する）を再生する。Greenwald,R.B.ら,J. Med. Chem., 39,1938(1996)を参照せよ。例えば、Ｃ20でのアシル化によって生じるアルキルエステルは、より親油性のプロドラッグを生じ、アルキル基が酵素的に開裂されるまで加水分解しえない。
【００２６】
本発明は、患者を治療する方法をも提供し、式（１）及び／又は（２）の化合物又はそれらの製薬的に許容性の塩を製薬的に有効量投与することを含む。化合物は、例えば、癌及び／又は白血病に冒された患者に投与することができる。本発明の化合物は、抗ウイルス（例えば抗−ＨＩＶ）剤及び抗寄生虫剤としも作用しうる。式（１）及び／又は（２）の化合物は、いずれの従来の投与経路によっても、限定するものではないが、静脈内、筋肉内、経口的、皮下内、腫瘍内、皮内、及び非経口的に投与することができる。製薬的に有効な量又は投与量は、好ましくは体重１kgに対して式（１）及び（２）の１化合物が0.01〜60mgである。さらに好ましくは、製薬的に有効な量又は投与量は、体重１kgに対して式（１）及び（２）の１化合物が0.1〜40mgである。一般に、製薬的に有効な量又は投与量は、式（１）及び／又は（２）の１化合物の抗白血病性、抗腫瘍性（抗癌性）、抗ウィルス性及び／又は抗寄生虫性挙動を示すのに有効な量を含む。活性成分として式（１）及び／又は（２）の１化合物又はその製薬的に許容性の塩を、製薬的に許容性のキャリヤー又は希釈剤と共に含有する製薬組成物も、本発明の範囲内である。
【００２７】
本発明は、式（１）及び（２）のいずれの化合物と、製薬的に許容性のキャリヤーとを含む製薬組成物をも提供する。本組成物は、例えば、0.1mg〜３ｇ、好ましくは約0.1mg〜500mgの式（１）及び／又は（２）の化合物を含み、かつ投与形態として好適ないずれの形態にも構成されうる。
本発明の構造的な修正が、カンプトセシン類似体のカルボキシレート型HSAとの間の高い親和結合性を妨げ、同時に赤血球とのラクトン相互作用を促進することがわかった。血漿及び血液安定性カンプトセシンの設計でさらに考慮すべき事柄は、Ｅ−環の構造に関係する。本発明のＡ、Ｂ、Ｅ−又はＢ、Ｅ−環修正されたカンプトセシンは：１）ラクトン型を超えるカルボキシレートのHSAによる高度に優先的な結合性の除去又は最小化を通じて、HSAの存在下で向上された安定性を示し；２）該薬物のラクトン型の赤血球との可逆的会合を促し、ひいては薬物の加水分解の程度を遅くしまた制限する高レベルの親油性を示し；かつ３）水溶液中での改良された安定性を示す。
【００２８】
さらに、我々は、本発明の新規な血液安定性シリル置換ホモカンプトセシン（本明細書では、β−ヒドロキシラクトンシラテカン(silatecans)又はホモシラテカン(homosilatecans)(hST)と呼ばれる）誘導体が、「カンプトセシン類似体及びそれらの調製方法」という題名で1998年12月15日に出願された米国特許出願第09/212,178号及び「カンプトセシンの合成における新規な中間体及び関連化合物及びそれらの合成」という題名で1998年１月15日に出願された米国特許出願第09/007,872号に述べられている全合成アプローチの有意な修正によって合成できることことを発見した。これら開示は参照によって本明細書に取り込まれる。新規な中間体が合成され、本発明のカスケードラジカル体環形成を果たした。
【００２９】
本発明のいくつかのモデル化合物は、下記式に示されるように、広範に研究された。
【化４６】
【００３０】
本発明の新規なホモカンプトセシンは、ヒトアルブミンによるラクトンより多い優先的なカルボキシレートの結合性を低減するＡ、Ｂ−又はＢ−環修正を含む。Ａ、Ｂ−環におけるこれらの修正は、親油性をも著しく高め、かつ血中に存在する脂質二重層とのラクトン会合を促進する。この新しい化合物は、拡張されたβ−ヒドロキシラクトンＥ−環をも含み、効能を損失せずに薬剤の全体的な安定性を改良した。MDA-MB-435乳癌細胞を用いた細胞毒性検定では、本発明のＥ−環拡張β−ヒドロキシラクトンシラテカンは、２〜115nMの範囲のＩＣ50値を示す。本発明の化合物は（上記式で示されるいくつかの）、それらの新規な構造的な置換の結果として、Lavergneらによって記述された薬剤よりも優れたヒト血漿及びヒト血液安定性を有する。
【００３１】
本発明の新規なＡ、Ｂ、Ｅ−環修正及びＢ、Ｅ−環修正カンプトセシンの合成は、今までに同定された固有の効能を示す最も血液安定性のカンプトセシンの同定を導いた。これら新しい薬剤のさらなる利益は、それらが、Mi,Z.及びBurke,T.G.“カンプトセシンの血清アルブミンとの相互作用に関係する顕著な種間変異：周波数領域蛍光分光研究”，Biochemistry ,33:12540-12545(1994)に記載されている9-AC及びカンプトセシンの変異のような血液安定性においていずれの有意な種間変異をも示さないことである。この非常に魅力的な特徴は、薬物開発プロセスや実験的な観察の翻訳及び臨床に向けた動物モデルで開発される投与スケジュールを非常に容易にするだろう。
【００３２】
発明の詳細な説明
（調製方法）
本発明の式１の化合物は、図１及び２に描かれた合成スキームに従って調製することができる。図１は、キーとなるヨードピリドン９の合成を示し、式１の化合物を合成するのに使用できる。９の合成は、カンプトセシン及び類似体の合成における中間体であるエノールエーテル３から始まる。その開示が参照によって本明細書に取り込まれている米国特許出願第09/007,872号を参照せよ。ジヒドロキシル化に次ぐ酸化的開裂がケトホルメート５を与え、それからレフォルマトスキー反応によって伸長されて６を与える。好都合なことに、この反応でホルミル基が開裂され、かつ酸促進されたｔ−ブチルエステルの開裂が直接β−ヒドロキシラクトン７を生成する。そして、この化合物が、１）ヨウ素化脱シリル、及び２）脱メチルの順序でヨードピリドン９に転換される。
【００３３】
図２ａはヨードピリドン９のいくつかのモデルＡＢ修正ホモカンプトセシン誘導体への転換を示す。最適条件下における９のＮ−プロパルギル化がラジカル前駆体１０ａ、ｂを与える。これら前駆体の指示イソニトリルとのカスケードラジカル体環形成が生成物１ａ、ｃ、ｅ、ｇ、ｈを与える。そして、生成物１ａ、ｃ、ｅは、標準的な手段で脱保護され、指示された全体的な収率で標的薬物候補１ｂ、ｄ、ｆを与えた。化合物１ｇ及び１ｈは脱保護の必要がない。本発明のさらなる新規化合物の合成は、本出願の実施例のセクションで記載される。
【００３４】
Lavergne及び共同研究者らは、ホモシラテカン誘導体を製造する２つの方法を開示しているが、両方とも厳しい制限がある。一番目は、通常のラクトンの分解と同族体型ラクトンの再構成を含む一連の工程によって、標準的なカンプトセシン誘導体をホモカンプトセシン誘導体に転換することを包含する。この経路は、開始するためにカンプトセシンの存在が必要なので制限される。さらに、多くの存在するカンプトセシン誘導体は置換基を持っており、ラクトンを再形成するという過酷な条件を生き残るとは期待されない。このプロセスは、還元、酸化、強酸、及び強塩基工程を必要とする。第２の経路は、環Ｃを生成するためのパラジウム触媒環化を用いた全合成に関与する。この経路は、Ａ−環前駆体のアベイラビリティ及びその上にある置換基の多くの引き続く合成工程を生き残る能力によって制限される。さらに、この合成は、ここに記載された置換基を含む多くのＢ環置換基の導入に対する可能性を提供しないようである。
【００３５】
対照的に、本発明のラジカルカスケード合成スキームは、ずっと寛容性かつフレキシブルであり、例えば、図２ｂに示されるように、多くのＡ−、Ｂ−、又はＡ／Ｂ置換パターンでホモカンプトセシン誘導体を作るのに使用できる。一般に、ラジカルカスケードでは種々の試薬を使用でき、限定するものではないが、ヘキサメチルジチン、ヘキサメチルジシラン、又はテトラキス(トリメチルシリル)シランが挙げられる。この反応のエネルギー源は太陽ランプ又は紫外線ランプでよい。温度は、好ましくは約25〜150℃に設定される。さらに好ましくは、温度は約70℃に設定される。一般的に、ラジカルカスケードに対する不活性性以外は、使用する溶媒の選択に何ら制限はない。好ましい溶媒としては、ベンゼン、トルエン、ベンゾトリフルオライド、アセトニトリル、ＴＨＦ及びtert−ブタノールが挙げられる。また、本発明の合成スキームでは、その反応条件が温和なので、アルキン（Ｒ6）及びイソニトリル（Ｒ1−Ｒ4）上の置換基の選択も非常に広範な許容範囲がある。さらに、適切なプロパルギル誘導体が容易に調製されないというまれなケースでも、低収率ではあるが、代わりにアリル誘導体が置換されて、同一の最終生成物を調製することができる。
【００３６】
Ｃ20（Ｒ5）上の置換基は、それが容易に入手可能なアリルアルコール由来なので広範に変えることができる。レフォルマトスキー反応では置換エステルを使用してＣ20a（Ｒ13）上に置換基を有する化合物を与えることもできる。この発明の化合物は化学療法用のラセミ形態で使用しうるが、Ｃ20で排他的に又は優位に生理学的に活性なエナンチオマーである試料を使用することがより好ましい。絶対配置の割当てについてのカーン-インゴールド-プレローグ則における優先度の変化のため、標準的なカンプトセシンのＣ20 Ｓエナンチオマーは、一般に対応するホモカンプトセシンのＣ20 Ｒエナンチオマーと同一の相対配置を有する。ホモカンプトセシン誘導体のラセミ又はエナンチオマーが富化された試料は、市販されているキラルカラムを用いた液体クロマトグラフィーの標準的な方法によって、それらの個々の成分に分離することができる。Lavergne,O.ら，“ホモカンプトセシン：新規なＥ−環修正カンプトセシン類似体の合成及び抗腫瘍活性”,J. Med. Chem.，41,5410-5419(1998)を参照せよ。
【００３７】
カンプトセシンのヒト血液安定性及び高い効能を有する血液安定性ホモシラテカンの合理的な設計基準
最近、カンプトセシン及び関連類似体のラクトン及びカルボキシレート型由来の固有の蛍光発光が研究され、それらのヒト血液成分との顕著に異なる相互作用が明かにされた。Burke,T.G.及びMi,Z.,“７位におけるエチル置換が、ヒト血清アルブミンの存在下で10-ヒドロキシカンプトセシンの半減期を延長する”，J. Med. Chem.，36,2580-2582(1993)；Burke,T.G.、Mishra,A.K.、Wani,M.C.及びWall,M.E.，“カンプトセシン薬の脂質二重層分配性及び安定性”，Biochemistry 32:5352-5364(1993)；Burke,T.G.及びMi,Z.:“カンプトセシンのカルボキシレート型のヒト血清アルブミンによる優先的な結合性”（1993a）Anal. Biochem. 212,285-287；Burke,T.G.及びMi,Z.,“ヒト血清アルブミンとのカンプトセシン相互作用の構造的基準：薬物安定性に及ぼす影響”，(1994) J. Med. Chem.，37,40-46；Burke,T.G.、Munshi,C.B.、Mi,Z.、及びJiang,Y.，“カンプトセシン抗癌薬の相対的なヒト血液安定性の決定におけるアルブミンの重要な役割”(1995) J. Pharma. Sci. 84,518-519；Mi,Z.及びBurke,T.G.，“カンプトセシンラクトン及びカルボキシレート型のヒト血液成分との差次的相互作用”,Biochemistry ,33:10325-10336(1994a)；Mi,Z.及びBurke,T.G.，“血清アルブミンとカンプトセシンの相互作用に関係する顕著な種間変異”(1994b) Biochemistry 33,12540-12545；及びMi,Z.、Malak,H.、及びBurke,T.G.，“低減されたアルブミン結合性がヒト血液中におけるトポテカンの安定性及び活性を促進する”(1995) Biochemistry 34,13722-13728、これら開示は、参照によって本明細書に取り込まれる。
【００３８】
ｐＨ7.4のリン酸緩衝食塩水（PBS）中における周波数領域蛍光の寿命分光法は、ヒト血清アルブミン（HSA）が、優先的にカンプトセシンのカルボキシレート型をラクトン型より200倍高い親和性で結合することを明らかにしている。これら相互作用は、HSAの存在下で、該タンパク質がない場合よりカンプトセシンをより速くかつ完全に開くことになる。ｐＨ7.4及び37℃のヒト血漿では、カンプトセシンラクトンは、迅速くかつ完全に、11分のｔ1/2値かつ平衡値0.2％というほとんど無視できるパーセンテージのラクトンを有してカルボキシレート型に開環する。全血対血漿では、カンプトセシンは向上された安定性を示した（22分のｔ1/2値及び平衡値5.3％のラクトンのパーセンテージ）。ヒト血液中におけるカンプトセシンラクトンの向上された安定性は、赤血球の脂質二重層との薬剤会合の結果であることがわかった。カンプトセシンは、赤血球膜を結合し、そのアシル鎖領域内に薬剤が局所化し、結果的に加水分解から保護されて残存する。
【００３９】
また、臨床的に関心のあるいくつかのカンプトセシン類似体のヒト血液安定性が比較された。カンプトセシンの場合に観察されたように、9-アミノカンプトセシン（9-AC）が観察され、HSA含有PBS溶液中でほとんど完全に（＞99％）加水分解された。9-アミノ同属種のラクトン及びカルボキシレート型の相対的な結合親和性を分光学的に定量化するために何も試さなかったが（9-ACラクトン及びカルボキシレート種の蛍光量子収率がカンプトセシンと比較してかなり低減されたので）、HPLCデータは、HSAがこの薬剤のカルボキシレート型と、そのラクトン型よりも優先的に結合性することと一致した。血漿内では、99.5％より多くのカンプトセシンの9-アミノ類似体がカルボキシレートに転換され、この場合もやはりカンプトセシンを用いて得られた安定性データに親密に類似した実験値が観測された。全血内では、0.5％未満及び5.3％が、それぞれ平衡時にラクトン型で残った9-アミンカンプトセシン及びカンプトセシンのフラクションである。カンプトセシンの平衡状態で9-アミノカンプトセシンと比較して約10倍高濃度のラクトンが残存することは、部分的には、カンプトセシンの親油性が高められたこと及び水性環境から全血中に存在する赤血球膜中へ移行する能力がより大きいことによって説明できる。
【００４０】
カンプトセシン及び9-アミノカンプトセシンについてヒト全血中に平衡時残存する低濃度のラクトン（それぞれ、＜0.5％及び5.3％）と対照的に、トポテカン（11.9％）、CPT-11（21.0％）、及びSN-38（19.5％）は、すべて改良された血液安定性を示す。トポテカンの平衡時ラクトン濃度は9-アミノカンプトセシンより20倍高いが、CPT-11及びSN-38についてラクトンの対応する濃度は、9-アミノカンプトセシンの場合より約40倍高い。トポテカン、CPT-11、及びSN-38の相対的な安定性の有意な増加は、それらのHSAとの好ましい相互作用に関連づけできる。7-及び9-位の構造的置換基がHSAによるカルボキシレート薬剤形態の優先的な結合性を妨げ、また防止すると考えられる。最近、時間分解蛍光異方性の技法を使用して、カンプトセシンカルボキシレートがHSAと会合し、かつ該タンパク質と密接に会合された溶液内でタンブルする実験条件下で、トポテカン及びCPT-11のカルボキシレート型はHSAと会合しないことが示された。SN-38の場合、直接分光的な証拠が得られ、HSAがこの薬剤のラクトン型を優先的に結合し、それによってラクトン−カルボキシレート平衡をラクトンの方にシフトすることを示している。
【００４１】
これら観察は、HSAがカンプトセシンの相対的なヒト血液安定性の決定に重要な役割を演じることを示している。カンプトセシン及び9-アミノカンプトセシンの場合、このタンパク質は、カルボキシレート薬剤形態が開環された種を結合し、それによってラクトン−カルボキシレート平衡を右にシフトするシンクとして作用する。しかし、トポテカン、CPT-11、及びSN-38の場合、HSAによるカルボキシレート薬剤形態のこのような優先的な結合性は観察されない。カンプトセシン及びその9-アミノ類似体による状態と反対に、HSAは優先的にSN-38のラクトン型と結合し、それによってこの生物学的に活性な種のより高い循環濃度を助長する。
臨床関連のカンプトセシンで起こる活性薬剤の急速かつ広範な損失は、改良されたヒト血液安定性を有するカンプトセシンを同定することが非常に有利であることを示している。
【００４２】
本研究では、我々は以下の効果を有するＡ及びＢ環でカンプトセシンを修正した：１）タンパク質結合性を低減すること；２）親油性を高めること；及び３）ヒトアルブミンに対するカルボキシレートの結合性を減少させ、親油性をも高めることを両立させること。我々は、本化合物の設計に拡張されたＥ−環をも含めた。我々の研究は、従来のα−ヒドロキシラクトン官能性を含有するＡ、Ｂ−環修正カンプトセシン類似体と同様の先行技術の化合物ホモカンプトセシンより勝る血液安定性パラメータを有する、今までに同定された最も血液安定性かつ本質的に強力なカンプトセシン類似体である新規なＡ、Ｂ、Ｅ−環修正カンプトセシンの設計を導いた。本発明の新規なカンプトセシン類似体は、優れたヒト血液安定性と高い抗癌活性を併せもつというような新奇な特性を示す。
【００４３】
蛍光異方性滴定は、本発明の新規なホモシラテカンが脂質ベシクルの広範な平衡会合定数を示し、かつＥ−環拡張がシラテカンの親油性を高めることを実証する。
図３は、リン酸緩衝食塩水（PBS）及び脂質二重層中における１μMのDB-38の蛍光発光スペクトルを示す。このデータは、試料中に脂質二重層を導入すると、該薬剤と膜との間の相互作用を表わしている化合物の蛍光発光が増加することを示している。溶媒をエタノールに変えると、蛍光も変化する。膜を有する各場合に、薬剤が脂質二重層微小環境中に分配するにつれて蛍光強度が顕著に増加する。それぞれの場合、発光スペクトルに目立ったブルーシフト性又はシフトがあり、薬剤の膜との相互作用に基づく波長を低下させる（表１参照）。図３に示されるスペクトルデータは、ホモシラテカンは蛍光性であり、かつ試料に脂質二重層の添加すると、薬剤のスペクトルパラメータが変化することを示している。下表１では、新しいホモシラテカン類似体の最高励起及び発光波長を比較する。また、我々は、DB-90及びDB-91の開環型の膜相互作用をも調べ、我々の結果は、開環種について同様のスペクトルシフトを示している。
【００４４】
【表１】
表１．溶液中及びDMPC及びDMPG SUVsに結合されたホモシラテカン（DB-38、DB-81 、 DB-90 、 DB-91 ）の蛍光スペクトルパラメータ
【００４５】
ホモシラテカンのラクトン及びカルボキシレート型の固有な蛍光特質は、定常状態蛍光異方性滴定の高感度法を使用して種々の類似体の脂質二重層との結合相互作用の強さを決定するのを可能にする。
定常状態蛍光異方性（ａ）の測定値は、以下のペロン(Perrin)方程式によって蛍光分子の回転速度と関係づけられ：
ａ0／ａ＝１＋（τ／φ）
式中、ａ0は脱分極性回転がない場合の極限の蛍光異方性であり、τは励起状態の寿命であり、かつφは発蛍光団の回転相関時間である。上記方程式は、蛍光性化合物のτ又はφ値のいずれかの変化が、その定常状態異方性を調節できることを述べている。
【００４６】
PBS、グリセロール、及びメタノール中におけるカンプトセシン励起状態寿命値
を37℃で調べた。寿命値は、それぞれ4.7ns、3.8ns、及び3.5nsと測定された。同様に、カンプトセシンがDMPC二重層と会合されたときの寿命値が37℃で測定され、膜結合された薬剤の平均値が3.7nsであることがわかった。
このように、上述の寿命の測定は、カンプトセシンの励起状態の寿命が微小環境の変化（例えば、水性環境から親油性膜への溶媒又は発蛍光団再配置における変化）に比較的感受性であることを示している。その回転運動に強く影響する遷移（溶媒粘度又はリポソーム粒子のような大きな巨大分子集合に対する発蛍光団の結合性の変化のような）の間比較的安定しているτ値を有する発蛍光団については、ペロン方程式はａ及びφ値との間に直接的な関係が存在することを示している（すなわち、蛍光性化合物のφ値が増加するにつれ、その定常状態異方性値も増加する）。
【００４７】
カンプトセシン類似体及び新規なホモシラテカンの定常状態蛍光異方性値が溶媒粘度及び小さい単層脂質ベシクルとの会合に非常に感受性であることがわかった。例えば、トポテカンはPBS中で0.008というａ値を有するが、そのａ値は粘性溶媒のオクタノール及びグリセロール中では、それぞれ９倍及び40倍増加する。カンプトセシンのａ値では、薬剤がDMPC又はDMPGのどちらかで構成されたベシクルに結合すると、21倍の増加が観測される。膜会合に対するカンプトセシン薬のａが高感度なので、蛍光異方性滴定の方法を利用してカンプトセシン類似体の脂質二重層との平衡結合性を研究した。この実験は、１セットの試料に対して、それぞれの薬剤濃度が一定に保たれるが（典型的には１又は２μM）、１セットの膜についての脂質濃度は０〜0.29Ｍに変化する場合のａ値を決定することを含む。
【００４８】
新しく合成されたホモシラテカン由来の光り輝く蛍光発光の結果として（スペクトルパラメータの概要は表１に示される）、図４に要約されている脂質二重層吸着等温線は、いずれのバックグランドシグナルも比較的無かった。蛍光異方性滴定の方法を使用して吸着等温線を作成した。実験は、PBS緩衝液中（37℃）１μMの薬剤濃度で行われた。DB-38、DB-90及びDB-91の異方性値は、カンプトセシン又はトポテカンの異方性値よりずっと速く滴定し、新規なホモシラテカンがカンプトセシン及びトポテカンよりもずっとこれら膜との強い相互作用を有することを示している。PBS中でホモシラテカン及びカンプトセシンのラクトン環が加水分解する可能性があるので、各薬剤のラクトン型をリポソーム懸濁液に添加後即座に（約１分）各脂質濃度における異方性値を測定して、カルボキシレート型への転換のいずれの可能性をも最少にした。１μMの薬剤濃度と、バックグラウンドシグナル由来の発光（すなわち、存在する可能性のある不純物から生じる散乱励起光及び無関係な蛍光シグナル）を分離するために長い流路フィルタを使用すると、PBS緩衝液中に溶解された薬剤由来のシグナルレベルは、膜が無い場合に通常99.97％で、膜が存在する場合は98％より大きかった。吸着等温線を使用して、ホモシラテカン、シラテカン、及びカンプトセシン薬の全体的な会合定数を決定した。全体的な会合定数は、以下のように定義され：
Ｋ＝[ＡB]／[ＡF][Ｌ]
式中、[ＡB]は結合された薬剤の濃度を表し、[ＡF]は遊離薬剤の濃度を表し、かつ[Ｌ]はベシクル懸濁液中の全脂質濃度を表している。この方程式は、遊離脂質の濃度が全脂質の濃度にほぼ等しい（すなわち、遊離脂質の濃度が結合されている薬剤の濃度よりかなり過剰である）場合に有効である。この条件のときに、Ｋは２重逆数プロットの勾配の逆から決定されうる。このような２重逆数プロットでは、１／結合されたすべての薬剤のフラクションが、１／脂質濃度に対してプロットされ、１というｙ切片値を有する（結合部分の均一性を示す系に対して）。新しいホモシラテカン類似体（ラクトンとカルボキシレート型の両方）のDMPC及びDMPG小単層ベシクル（SUV）調製品との会合についてのこのような２重逆数プロットは、良い相関係数を有する直線だった。これらプロットの直線性、並びに他のタイプの膜調製品との薬剤会合についての対応プロットは、これらの脂質濃度における発蛍光団の結合性が上記方程式によって適切に述べられることを示している。
【００４９】
表２に要約されている研究は、脂質二重層のホモシラテカン会合の構造的基準を調べている。これら研究には２つのタイプの膜が含まれ、生理的条件に近いｐＨ及び温度で行われ；これら膜は、液層と電気的に中性なＬ-α-ジミリストイルホスファチジル-コリン（DMPC）；及び液層と負に荷電されたＬ-α-ジミリストイルホスファチジルグリセロール（DMPG）を含む。DMPC及びDMPGは同一の鎖長を有するが、それらの先端基上の電荷が異なる。
【００５０】
【表２】
表２．ｐＨ7.4及び37℃のPBS中における電気的に中性のDMPC及び負に荷電されたDMPGの単層ベシクルと相互作用するホモシラテカン及びカンプトセシン類似体の全体的な会合定数
【００５１】
表２の研究で、上述したような蛍光異方性滴定の方法を用いて結合性等温線が作成され、Ｋ値がその２重逆数プロットの勾配から決定された。Ｋ値は、10％の不確実性を受ける。表２に含まれるデータの最も目立つ特徴の１つは、Ａ、Ｂ、Ｅ−環修正カンプトセシン（例えば、DB-38、DB-90、及びDB-91として知られるホモシラテカン）又はＢ、Ｅ−環修正カンプトセシン（例えば、DB-81として知られるホモシラテカン）の創製によって達成しうる強い調節である。７位に単一の置換基又は７位と10位に２つの置換基を含有するホモシラテカンが創製され、非常に高い親油性を示すことがわかった。表２に含まれるのはカンプトセシン化合物（トポテカン及びカンプトセシン）である。DB-81については、DMPC膜の親油性がトポテカンの対応値と比較して1,400倍より多く増加している。これら薬剤についてのデータは、トポテカン及びカンプトセシンのような化合物と比較して新しいホモシラテカンの高い親油性を示している。表２から、本発明の化合物は、カンプトセシン又はトポテカンよりもずっと親油性であるこが明かである。
【００５２】
表２に含まれるデータの検査に基づき、他の興味深いまた予想外の発見が明かになる。２つのホモシラテカンについてのＫDMPC値を対応するシラテカン類似体（Ｅ−環系が、それぞれβ-ヒドロキシラクトン対α-ヒドロキシラクトン部分である）と比較すると、ホモカンプトセシンがより高い親油性を示すことがわかる。例えば、DB-38（CHJ-792、ＫDMPC＝820Ｍ-1）及びDB-91（DB-67、ＫDMPC＝2,500Ｍ-1）のシラテカン対応物のＫDMPC値は、対応するホモシラテカンよりも約２倍〜３倍小さい。このように、DB-38及びDB-91については、拡張されたＥ−環が膜結合性にとって好ましい理由であり、ひいてはヒト血液中での薬剤安定性を促進する。
【００５３】
薬剤のカルボキシレート型を研究したとき、他の驚くべき傾向が観察された。カンプトセシンのラクトン環の開環によってDMPCの親和性が３倍減少することは、以前に観察されている。Burke,T.G.、Mishra,A.K.、Wani,M.C.及びWall,M.E.，“カンプトセシン薬の脂質二重層分配性及び安定性”，Biochemistry 32:5352-5364(1993)。DB-90及びDB-91ホモカンプトセシンについて、我々は、開環によってDMPC結合性が10倍減少することを観察した。それゆえに、ホモシラテカンは顕著に向上された親油性を示すばかりでなく、ラクトンとカルボキシレート型との間の差次的結合性のレベルも、α−ヒドロキシラクトン環系を含有するカンプトセシンと比較してかなり高い（10倍対３倍）ようである。上述した２つの理由（高い親油性及びラクトンのカルボキシレート型よりも高い差次的結合性）が、ホモシラテカンがカンプトセシン及びホモカンプトセシンを超えて示す最適化された血液安定性に寄与する因子である。
【００５４】
DB-91 ホモシラテカンの赤血球との広範な膜相互作用の直接的な蛍光スペクトルの評価
図５は、ｐＨ7.4のリン酸緩衝食塩水（PBS）、エタノール、及びそれらの混合物の溶液中における１μMの7-t-ブチルジメチルシリル-10-ヒドロキシホモカンプトセシン（DB-91）の蛍光発光スペクトルを示す。すべてのスペクトルは、37℃で394nmの励起光を用いて記録された。PBS中のDB-91の発光最大値は554nmであるが、この値は無水エタノール中で約410nmのλmaxにかなりシフトする。DB-91は10-ヒドロキシ官能性を含むので、蛍光が２つの別の種から生じる可能性が存在する。非プロトン性溶媒又は非水性微小環境中では、プロトン化された（10-ヒドロキシ官能性について）種が優勢であり、水のようなプロトン性溶媒中では、脱プロトンされた励起状態複合体が優勢である。554nmピークは脱プロトンされた励起状態複合体と関係づけられ、約410nmのλmaxはプロトン化励起状態複合体と関係する。脱プロトンされた励起状態複合体の形成は、水の存在によって非常に促進され；１％のような少量の水でさえ、脱プロトンされた励起状態複合体の水促進型形成と関係する550nm周辺にピークが現れる。DB-91、及び10-ヒドロキシ官能性を含有するカンプトセシン系統群の他のメンバーのスペクトル感度は、薬剤を水性環境から赤血球の表面のような疎水性環境に分配することを研究する有用なアプローチを提供する。
【００５５】
図６は、ｐＨ7.4のリン酸緩衝食塩水（PBS）溶液中及び（10±1）×106細胞／μL濃度のアルブミン−フリー赤血球を含有するｐＨ7.4のPBS中における１μMの7-t-ブチルジメチルシリル-10-ヒドロキシ-ホモカンプトセシン（DB-91）の蛍光発光スペクトルを示し、かつホモシラテカンの赤血球との広範な相互作用の直接的な証拠を与えている。スペクトルは、10μMのDB-91濃度と370nmの励起光を用いて37℃で（散乱レベルに対する蛍光を最適化するため）前面キュベット内で記録された。
【００５６】
PBS中のDB-91の発光最大値は554nmである。赤血球が存在する場合、かなり低いλmax値を有するピークが観察され、この薬剤が赤血球膜中に分配可能であることを示している。赤血球の膜は、プロトン化された励起状態の複合体が生成できる疎水性の微小環境及び蛍光を与える。ヒト赤血球の存在下でのDB-91の発光スペクトルと、臨床関連の7-エチル-10-ヒドロキシカンプトセシン（SN-38）の発光スペクトルを比較すると、図７に示されるように、DB-91の場合、さらに広範なプロトン化された励起状態の複合体形成があることがわかる。図６の研究と同様に、図７のスペクトルは、10μMのSN-38濃度と370nmの励起光を用いて37℃で、前面キュベット内で記録された。これら実測値は、SN-38の膜結合性がDB-91について記録された広範な相互作用よりもかなり少ないことを示している（DB-91が8,000Ｍ-1のＫDMPC値を示すのに対して、SN-38は、300Ｍ-1のＫDMPC値を示す）モデル膜研究を実証している。スペクトルの研究から、我々は、新規なホモシラテカンDB-91が、FDA承認されているSN-38よりも親油性で、赤血球相互作用的薬剤であると結論する。
【００５７】
ホモシラテカンは、α - ヒドロキシラクトンファルマコフォアを含有するカンプトセシンと比較して水溶液中で改良された安定性を示す
図８〜１１は、ｐＨ値5.0、7.4、8.0、及び9.0のリン酸緩衝食塩水（PBS）の溶液中におけるDB-38、DB-81、DB-90、及びDB-91の１μM溶液の安定性のｐＨ依存性を示す。各薬剤の安定性パラメータは、HPLC法で決定された。すべての実験は37℃で行った。加水分解は、7.4、8.0、及び9.0のｐＨ値で観察され、より高いｐＨ値では、さらに広範な加水分解が観察される。
7.4、8.0、及び9.0のｐＨ値で加水分解が観察されるが、我々のデータは、ホモシラテカンのラクトン環は、従来のα-ヒドロキシラクトン環部分を含有するシラテカン及びカンプトセシンよりも不安定性が低い（すなわち、かなりゆっくり加水分解を受ける）ことを示している。
【００５８】
図１２は、本発明の４種の新規なホモシラテカンの改良された安定性を、それらの対応するα-ヒドロキシラクトン官能性を含有するシラテカン構造と対比している。図１２のすべての実験は、PBS中、37℃で行った。パネルＡ〜Ｄは、それぞれ新規なホモシラテカン（オープン環）と、トポテカン、SN-38、CPT-11及び9-アミノカンプトセシンのようなカンプトセシン及び他の臨床関連のカンプトセシン類似体に見られる従来のα-ヒドロキシラクトン環部分を含有する対応シラテカン（ソリッド環）の安定性プロフィルを含む。
【００５９】
すべての場合に、拡張されたＥ−環又はホモシラテカン構造を含有する薬剤が顕著に改良された安定性を示した。ホモシラテカンについての安定性パラメータは、表３にまとめられている。データは、ホモシラテカンのラクトン環は、シラテカン及びカンプトセシンの両者に含まれるα-ヒドロキシラクトン環部分と比較して不安定性が低い（すなわち、かなりゆっくり加水分解を受ける）ことを示している。トポテカン及びカンプトセシンのようなシラテカン類及びカンプトセシン類については、約12％のラクトンが３時間後の平衡状態で残存しているのに対して、同一のインキュベーション条件下の各ホモシラテカンについては80％より多いラクトンが残存している。
【００６０】
ヒト血清アルブミン存在下におけるホモシラテカンの優れた安定性の決定
図１３は、本発明の４種の新規なホモシラテカンの37℃で30mg/mlのヒト血清アルブミンを含有するPBS中でインキュベーション後の改良された安定性を示す。パネルＡ〜Ｄは、それぞれ新規なホモシラテカンと、トポテカン、SN-38、CPT-11及び9-アミノカンプトセシンのようなカンプトセシン及び他の臨床関連のカンプトセシン類似体に見られる従来のα-ヒドロキシラクトン環部分を含有する対応シラテカンの安定性プロフィルを含む。すべての場合に、拡張されたＥ−環構造を含有する薬剤が、HSAの存在下で顕著に改良された安定性を示した。ホモシラテカンについての安定性パラメータは、表３にまとめられている。図１４に示されるように、本発明のホモシラテカンは、トポテカン、SN-38、及びCPT-119のようなカンプトセシンより、ヒト血漿中でも優れた安定性を示した。ホモシラテカンのうち、DB-81は、ヒト血漿中で最高の安定性を示し、次いでDB-90及びDB-91であり、DB-38は（研究したホモシラテカンのうち最低の親油性）ヒト血漿中で最低の安定性を示した。図１４のすべての実験は、ヒト血漿中37℃で行われた。血漿試料は、持続的に血液ガス流によって通気して、ｐＨを7.5±0.1の値に維持した。すべての場合、拡張されたＥ−環又はホモシラテカン構造を含有する薬剤が、従来のα-ヒドロキシラクトン環部分を含有する元の薬剤カンプトセシンと比較して顕著に改良された安定性を示した。ホモシラテカンについての安定性パラメータは、表３にまとめられている。
【００６１】
我々の研究は、親油性のみならずより水溶性のホモシラテカンの両者が、Ａ及びＢ環に置換基を含まないホモカンプトセシンよりも改良された安定性を示すことを実証している。Lavergneら，“ホモカンプトセシン：新規なＥ−環−修正カンプトセシン類似体の合成及び抗腫瘍活性”J. Med. Chem. 41:5410-5419(1998)を参照せよ。従って、本発明は、ホモカンプトセシンのＡ及びＢ環の置換が血液安定性に関して好ましい因子であることを示している。有望な説明は、無置換ホモカンプトセシンカルボキシレートは、カンプトセシンカルボキシレートと同様に、優先的にカルボキシレート型でHSAを結合し、ラクトン−カルボキシレート平衡を有効に右にシフトするということである。
【００６２】
我々の結果は、β-ヒドロキシラクトンファルマコフォアと、以下の同時に生じる構造的な変化を組み合わせることによって、劇的に改良されたヒト血漿安定性が認められることを示している。：１）７位でのシリル又はシリルアルキル官能性のようなＢ−環修正（例えば、DB-81）；２）トポテカンに含まれる構造修正のようなＡ−環修正（9-ジメチルアミノメチル及び10-ヒドロキシ官能性の包含のような水可溶性の変化はHSAに対するカルボキシレートの結合性をきらう）；及び３）Ａ及びＢ環の両方で置換を併用し、例えば、７位でのシリル又はシリルアルキル置換基（例えば、DB-90及びDB-91）が挙げられる。また、Mi,Z.、Malak,H.、及びBurke,T.G.，“低減されたアルブミン結合性がヒト血液中におけるトポテカンの安定性及び活性を促進する”，Biochemistry,34,13722-13728(1995)を参照せよ。後者の例の化合物は、高い親油性及びカルボキシレート薬剤形態とHSAとの低減された特異的相互作用を示し、両因子は改良された血漿安定性に寄与する。
【００６３】
ヒト血液中における新規なホモシラテカンの顕著に改良された安定性
図１５は、生理的に適切な濃度[(５±１)×106細胞／μL]のアルブミンフリー赤血球を含有するPBS懸濁液中における本発明の４種の新規なホモシラテカンの安定性を示す。安定特性は、HPLS法を用いて37℃で測定された。すべての場合に、拡張されたＥ−環又はホモシラテカン構造を含有する薬剤が、従来のα-ヒドロキシラクトン環部分を含有するカンプトセシン類似体（臨床関連の薬剤SN-38、9-アミノカンプトセシン、9-ニトロカンプトセシン、GI-147211C、トポテカン等のような）についての公開文献の値と比較して、赤血球存在下で顕著に改良された安定性を示した。ホモシラテカンについての安定性パラメータは、表３にまとめられている。
【００６４】
図１６及び図１７は、本発明の４種の新規なホモシラテカンの改良されたヒト血液安定性を示す。すべての実験はｐＨ7.4かつ37℃で行われた。図１６では、パネルＡ〜Ｄは、それぞれ新規なホモシラテカン（オープン環）と、カンプトセシン及びトポテカン、SN-38、CPT-11及び9-アミノカンプトセシンのような他の臨床関連のカンプトセシン類似体に見られる従来のα-ヒドロキシラクトン環部分を含有する対応シラテカン（ソリッド環）の安定性プロフィル及びさらに実験試薬を含む。すべての場合に、拡張されたＥ−環又はホモシラテカン構造を含有する薬剤が、トポテカン及びSN-38のようなカンプトセシン類似体と比較して顕著に改良されたヒト血液安定性を示した。図１７は、9-アミノカンプトセシン（9AC）、カンプトセシン（CPT）、トポテカン（TPT）及びSN-38（SN38）を含む現在臨床的に関連する薬剤と比較した、本発明の新規なホモシラテカンの改良されたヒト血液安定性を示す。図１６及び図１７の安定性パラメータは、表３にまとめられている。
【００６５】
DB-81、DB-90及びDB-91について記述されたヒト血液安定性の値は、本質的に強力なカンプトセシン類似体について今までに測定された最大値である。３時間のインキュベーション後の80％より高いラクトン値は、9-アミノカンプトセシン（約0.3％）、カンプトセシン（約６％）、トポテカン（約15％）、CPT-11（約21.0）、及びSN-38（約30％）についてのヒト全血中での対応するラクトンのパーセント濃度に比べて非常に優れている。
【００６６】
【表３】
ホモシラテカンに関するヒト血液安定性パラメーターの要約
【００６７】
【表４】
表３続き
【００６８】
本発明の新規ホモシラテカンは過去に臨床上妥当なカンプトテシン、例えば、9-アミノカンプトテシン、9-ニトロカンプトテシン及びカンプトテシンについて観察された血液安定性に関する顕著な種間変化を解消する。
作用及び顕著なマウスin vivo活性のそれらの新規メカニズムについて有名な抗癌剤であるカンプトテシン及び9-アミノカンプトテシンは現在までヒトの癌に対する適度の治療実用性のみを示していた。これらの医薬品は、pH 7.4で、加水分解して生物学的に不活性なカルボキシレート形態を生じるラクトン環部分を含む。9-アミノカンプトテシンに関する医薬品安定性の比較は開環がマウス血液よりもヒト血液中で極めて大きい程度で起こったことを明らかにする（表４を参照のこと）。カンプトテシンは同様に挙動することが既に示されていた。Burke, T.G. Munshi, C.B., Mi, Z., 及びJiang, Y., “The Important Role of Albumin in Determining the Relative Human Blood Stabilities of the Camptothecin Anticancer Drugs”, J. Pharma. Sci. 84, 518-519 (1995); 並びにMi, Z. 及びBurke, T.G., “Marked Interspecies Variations Concerning the Interactions of Camptothecin with Serum Albumins: A Frequency-Domain Fluorescence Spectroscopic Study”, Biochemistry 33, 12540-12545 (1994)。本発明者らはカンプトテシンラクトン及びカルボキシレートの固有の蛍光放出の多頻度相モジュレーション分光分析の技術を使用してヒト血清アルブミン(HSA)の存在下でカンプトテシン及び9-アミノカンプトテシンについて観察された広範な開環についての物理的説明を得た。HSAはラクトン（Ｋ＝約5.5 x 103 M-1）に対しカルボキシレート（Ｋ＝1.2 x 106 M-1）について著しい200倍の結合選択性を示す。その他の種からの血清アルブミンはおよそHSA程にしっかりとではなくカンプトテシンカルボキシレートを結合することがわかった。カンプトテシンカルボキシレート及び9-アミノカンプトテシンカルボキシレートに結合してその医薬品からその生物学的に不活性な形態への広範な変換をもたらすヒトアルブミンの特異な能力のために、癌を動物モデルで撲滅することにおけるこれらの薬剤の成功はヒトで繰り返すのに本来難しいかもしれないことが明らかである。
【００６９】
本発明の新規ホモシラテカンに関するデータはマウス血液対ヒト血液中のラクトンレベルの実質的にわずかに小さい変化を示す。マウス対動物の血液中で観察された変化は9-アミノカンプトテシンについて観察されたラクトンレベルの100倍の差に対し非常に小さい。DB-81及びDB-91に関するマウス血液実験において、ヒト血液中で実際に観察されたラクトンレベルは夫々６％及び20％の値だけ控えめに過小評価される。しかしながら、9-アミノカンプトテシンについて、マウス血液はヒト血液中で実際に観察されたラクトンレベルを100倍だけ過大評価する。これらの結果は動物モデルにおける本発明者らの新規ホモシラテカンの成功がカンプトテシン及び9-アミノカンプトテシンの如き薬剤に対しヒトに容易に転換し得ると考えるのに基礎的な生理学的理由があることを示す。
【００７０】
【表５】
表４ カンプトテシン及び9-アミノカンプトテシンに関する血液安定性の著しい種間変化対新規な高度に親油性のカンプトテシン類似体に関して観察された比較的小さい差の比較a
a 実験をpH 7.4及び37℃で行ない、HPLC方法を使用してラクトンレベルを測定した。血液サンプルを抜き取り、実験の開始の前に５℃で保存した。
【００７１】
高度に親油性のカンプトテシンはヒト血清アルブミンの存在下でさえも高い抗癌効力を示す。
MDA-MB-435催腫瘍性転移性ヒト乳癌細胞に対する種々のカンプトテシンの細胞傷害を表５に要約する。細胞傷害値は72時間の暴露時間に関するものである。総合して、本発明者らはDB-38が20nMのIC50値を有して、本発明者らが試験した４種の新規ホモシラテカンの中で最も強力であることを見出し、一方、その他のホモシラテカンに関するIC50値は20nMから115nMまでの範囲であった。本発明者らの結果は、新規ホモシラテカン開発により、ヒト及び動物の血液中の薬剤の安定性が抗癌医薬品のこの重要なクラスの高い固有の効力及び細胞傷害を悪化しないで著しく改良でき、均等化し得ることを明らかに示す。
【００７２】
【表６】
表５ ヒト血清アルミンの不在下及び存在下におけるMDA-MB-435催腫瘍性転移性ヒト乳癌細胞に対するホモシラテカン及びカンプトテシン類似体のIC50値
【００７３】
（実施例）
本発明の新規ホモシラテカンの脂質２層分配（即ち、親油性）及びラクトン環安定性の定性的測定及び定量的測定のための実験方法
薬品 カンプトテシン及びトポテカンはそれらの20(S)-配置であり、蛍光検出によるHPLCアッセイにより測定して高純度（>98％）であった。ホモシラテカンの調製はこの出願のいずれかに記載される。全てのその他の薬剤は試薬等級であり、更に精製しないで使用した。高純度の水がMilli-Q UV PLUS精製システム（ベッドフォード、MA）により提供され、これを全ての実験に使用した。
医薬品原液調製 医薬品の原液を2 x 10-3 Mの濃度でジメチルスルホキシド（A.C.S.スペクトロフォトメトリー等級、アルドリッチ、ミルウォーキー、WI）中で調製し、暗所中で４℃で貯蔵した。L-α-ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)及びL-α-ジミリストイルホスファチジルグリセロール(DMPG)をアバンチ・ポーラー・リピッズ（アラバスター、AL）から入手し、更に精製しないで使用した。全てのその他の薬品は試薬等級であり、これらを更に精製しないで使用した。
【００７４】
小胞調製 小さい単ラメラ小胞(SUV)懸濁液をBurke及びTritton, Biochemistry 24 5972-5980 (1985);並びにBurke, T.G., Mishra, A.K., Wani, M.C.及びWall, M.E. “Lipid bilayer partitioning and stability of camptothecin drugs”, Biochemistry 32: 5352-5364 (1993)（これらの開示が参考として本明細書に含まれる）に既に報告された方法により実験の日に調製した。簡単に言えば、食塩加リン酸緩衝液（PBS、pH 7.4）中に既知の量の脂質（200mg/ml以下の脂質）を含む脂質懸濁原液を脂質のTMより上で5-10分間にわたってボルテックス混合により調製した。次いで脂質分散液をそれらが光学的に透明になるまで3-4時間にわたって浴型ソニケーター（ラボラトリィ・サプライズ社、ヒックスビル、NY）を使用して音波処理した。7.4から6.8までのpHの低下をDMPGのSUV製剤について観察した。それ故、PBS中の少量の2.5 M NaOH、続いて付加的な音波処理を使用して、これらのSUV懸濁液のpHを7.4に調節した。小胞懸濁液の夫々の型を37℃で30分間アニールし、次いで実験に使用した。
【００７５】
蛍光計測 定常状態の蛍光測定を恒温キュベット区画を備えたSLMモデル9850スペクトロフルオロメーターで得た。この装置はIBM PS/2モデル55 SXコンピュータとインターフェースされていた。励起スペクトル及び放出スペクトルを8nmの励起解像度及び4nmの放出解像度で記録した。全ての場合に、スペクトルをブランクのスペクトルの減法により未標識脂質又は溶媒からのバックグラウンド蛍光及び散乱について修正した。定常状態の蛍光強さ測定を偏光子の不在下で行なった。定常状態異方性(a)測定を二つの偏光強さの同時測定のための“T-フォーマット”でその装置で測定した。水中の0.25μmのポリスチレン微小球体（ポリサイエンシズ社、ワリントン、PA）の希薄な懸濁液を使用して、偏光子のアラインメントをルーチンでチェックし、>0.99の異方性値を得た。又、水中のグリコーゲンの希薄な溶液を使用して、偏光子配向をチェックした。異方性をａ＝（Ivv GIVH）/(Ivv + GIVH)（式中、G = IVH/IHH）から計算し、添え字は夫々励起偏光子及び放出偏光子の垂直配向及び水平配向を表す。
【００７６】
370〜400nmの励起光及びバックグラウンド散乱及び／又は残留蛍光から医薬品の蛍光シグナルを分離するための夫々の放出チャンネルの上の長いパスフィルターを使用して、ホモシラテラン及びカンプトテシンに関する異方性測定を行なった。全ての放出フィルターをオリエル・コープ（スタンフォード、CT）から入手した。励起光及び放出フィルターの組み合わせがバックグラウンドシグナルからの蛍光の適切な分離を可能にした。散乱光と一緒の、バックグラウンド蛍光の寄与は典型的には合計の強さの１％未満であった。カンプトテシン及び関連同族体のラクトン環は約20分の半減期で水性媒体中で加水分解を受けるので、全ての測定は実験が加水分解生成物を含まないように医薬品原液を熱的に前平衡にされた溶液と混合した後に可能な最短時間（約0.5〜１分）以内に完結された。赤血球とのホモシラテカン及びカンプトテシンの相互作用に関する情報を得るように設計された蛍光分光分析実験において、10μMの医薬品濃度を使用した。赤血球を用いる実験を前面石英キュベット中で行なって蛍光シグナルを最適化し、散乱光を最小にした。
【００７７】
平衡結合定数の測定 Burke, T.G., Mishra, A.K., Wani, M.C.及びWall, M.E. “Lipid bilayer partitioning and stability of camptothecin drugs”, Biochemistry 32: 5352-5364 (1993)（この開示が参考として本明細書に含まれる）により報告された蛍光異方性滴定の方法を使用して、1 x 10-6 Mの合計医薬品濃度及び種々の脂質濃度を含むリポソーム懸濁液中の医薬品の遊離種及び結合種の濃度を測定した。全ての実験をガラス管中で行なった。全会合定数をＫ＝〔AB〕／〔AF〕〔Ｌ〕と定義し、式中、〔AB〕は結合医薬品の濃度を表し、〔AF〕は遊離医薬品の濃度を表し、〔Ｌ〕はサンプルの合計脂質濃度を表す。結合等温線{１／（医薬品の結合フラクション）vs１／〔脂質〕}の二重反復プロットは線形であり、Ｋ値を線形最小自乗分析の方法によりそれらの傾斜から測定した。Ｋ＝〔AB〕／〔AF〕〔Ｌ〕関係に基づくコンピュータプログラムを書いてＫの特定値及び合計医薬品に関する結合医薬品レベルを予想した。
【００７８】
ホモシラテカン、シラテカン、及びカンプトテシンのラクトン開環の速度論 異なる血液成分の存在下のカンプトテシンの加水分解速度論を上記文献に既に記載された方法から改良された定量的C18逆相高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)アッセイにより測定した。全血及び分別血液サンプルの調製を既に記載されたようにして行なった。シグマ・ケミカル（セントルイス、MO）からの高純度（>97％）の結晶化HSAを使用した。HSA原液を7.40±0.05の最終pHでPBS緩衝液中で調製した。39,800 M-1cm-1の吸光係数を使用してHSA濃度を278nmでUV吸収により測定した（Porter, 1992）。全てのその他の薬剤は試薬等級であり、これらを更に精製しないで使用した。Milli-Q UV PLUS精製システム（ベッドフォード、MA）により提供された高純度の水を全ての実験に使用した。HPLC溶媒はフィッシャー・サイエンティフィックからのものであった。ヒト血漿及び赤血球をセントラル・ケンタッキー血液センターから入手した。全血をヘパリン処理管中で男性ドナーから得、5-10℃で貯蔵し、できるだけ早く使用した（典型的には１週間以内）。マウスからの血液をヘパリン処理管中に回収し、使用まで5-10℃で貯蔵した。
【００７９】
HPLCアッセイを温度制御オートサンプラー及びウォーターズ474走査蛍光検出器を備えたウォーターズ・アライアンス2690HPLCシステムで行なった。第二HPLCシステムは501 HPLCポンプ、717プラス温度制御オートサンプラー及び470走査蛍光検出器を含むウォーターズHPLCシステムを含んでいた。ホモシラテカンに使用したHPLCアッセイ操作を以下に要約する。溶媒Ａはアセトニトリルからなり、溶媒Ｂは１ml/分の流量を有する２％のトリエチルアンモニウムアセテート、pH 5.5であった。DB-38について、イソクラチック溶離を使用した：33％の溶媒Ａ；67％の溶媒Ｂ；λex：345nmかつλem：518nm。DB-81について、イソクラチック溶離を使用した：56％の溶媒Ａ；44％の溶媒Ｂ；λex：375nmかつλem：444nm。DB-90について、イソクラチック溶離を使用した：41％の溶媒Ａ；59％の溶媒Ｂ；λex：412nmかつλem：526nm。DB-91について、イソクラチック溶離を使用した：42％の溶媒Ａ；58％の溶媒Ｂ；λex：392nmかつλem：562nm。
【００８０】
PBS中のホモシラテカンの安定性を測定するために、DMSO中のホモシラテカンの夫々のアリコートを水浴中で37℃に維持されたHPLCオートサンプラーバイアル中の食塩加リン酸緩衝液(PBS)、pH 7.4に添加して１μMの最終医薬品濃度を得た。医薬品を含むバイアルを37℃に維持されたオートサンプラーに迅速に移し、アリコートを種々の時点で分析した。全ての測定を３回反復で行なった。データを集め、ウォーターズ・ミレニアム・ソフトウェアを使用して分析した。ラクトン及びカルボキシレートのピークのピーク面積を使用し、ラクトン／カルボキシレート比を使用して、ラクトンのフラクションを計算した。
全血中の医薬品安定性を測定するために、全血を37℃で30分間インキュベートし、pHを測定した。0.1 M KOH又は0.1 M HClを使用して、血液pHを7.4±0.5に調節した。血液サンプルを37℃で30分間インキュベートし、pHを測定して個々のアッセイが開始される前にそれがその範囲にあることを確実にした。血液のアリコート（夫々2ml）を除去し、三つの使い捨てガラス試験管に入れ、管を37℃でインキュベートした。次いでDMSO中の医薬品のアリコートを血液に添加して１μMの最終医薬品濃度を得た。37℃のインキュベーションを続け、150μlのアリコートを異なる時点で除去し、エッペンドルフ管中の冷メタノール（-20℃）600μlに添加した。次いで管を10秒撹拌し、卓上小型遠心分離機中で8000rpmで45秒遠心分離した。上澄みを除去し、オートサンプラーバイアルに入れ、そのバイアルを４℃に維持されたオートサンプラーに迅速に添加した。サンプルをHPLCセットアップで直ちに分析した。データ分析はPBSのみのサンプル中の医薬品について記載されたとおりであった。
【００８１】
ヒト血清アルブミン(HSA)を含むPBS中のホモシラテカンの安定性を研究するために、HSAを30 mg/mlの濃度でPBS、pH 7.4に溶解し、37℃でインキュベートした。pHを測定し、0.1 M KOH又は0.1 M HClを使用して7.4±0.5に調節した。pHが標的範囲内で安定化するまで、インキュベーションを続けた。PBS/HSAのアリコートを除去し、オートサンプラーバイアルに入れ、10分間にわたって37℃に保った。DMSO中の医薬品のアリコートをサンプルに添加して１μMの最終医薬品濃度を得た。バイアルを37℃に維持されたHPLCオートサンプラーに迅速に添加し、アリコートを注入し、異なる時点でHPLCにより分析した。データ分析はPBSのみのサンプル中の医薬品について上記されたとおりであった。
ヒト血漿中の関係する新規シラテカンの安定性を特性決定するために、解凍するために凍結血漿を37℃でインキュベートした。血液ガスを血漿に吹き込んでpHを7.5付近に調節した。血漿のアリコート（5ml）を使い捨てガラス試験管中で37℃でインキュベートし、医薬品DMSO原液を添加して１μMの最終医薬品濃度を得た。次いでこれらのサンプルを37℃で更にインキュベートした。アリコート（150μl）を異なる時点で除去し、エッペンドルフ管中の冷メタノール（-20℃）600μlに添加した。これらの管を10秒撹拌し、卓上小型遠心分離機中で8000rpmで45秒間遠心分離した。上澄みを除去し、オートサンプラーバイアルに入れ、そのバイアルを４℃に維持されたオートサンプラーに迅速に添加した。サンプルをHPLCによりできるだけ早く分析した。データ分析は上記のPBSのみのサンプル中の医薬品について記載されたとおりであった。血液ガスを血漿サンプル中に連続的に吹き込んで7.5±1.0のpHにした。
【００８２】
生理学的に妥当な濃度の赤血球(RBC)の存在下で新規ホモシラテカンの安定性を研究するために、以下の実験を行なった。コウルター細胞カウンターを使用して、セントラル・ケンタッキー・レッド・クロスから入手した濃縮赤血球をカウントした。PBS、pH 7.4を使用して細胞の数を5 x 1012細胞/Lに調節し、37℃で30分間インキュベートした。サンプルのpHを測定し、0.1 M KOH又は0.1 M HClを使用して7.4±0.5に調節した。RBCを37℃で30分間インキュベートし、pHを再度測定して、それがアッセイを開始する前と同じ範囲内にあることを確かめた。RBCのアリコート（夫々2ml）を除去し、三つの使い捨てガラス試験管に入れ、管を37℃でインキュベートした。DMSO中の医薬品のアリコートをPBS中のRBC懸濁液に添加して１μMの最終医薬品濃度を得た。37℃のインキュベーションを続け、150μlのアリコートを異なる時点で除去し、エッペンドルフ管中に存在する冷メタノール（-20℃）600μlに添加した。管を10秒撹拌し、卓上小型遠心分離機中で8000rpmで45秒遠心分離した。上澄みを除去し、オートサンプラーバイアルに入れ、そのバイアルを４℃に維持されたオートサンプラーに迅速に添加した。サンプルをHPLCでできるだけ早く分析した。データ分析は上記のPBSのみのサンプル中の医薬品について記載されたとおりであった。
【００８３】
脂質２層膜とのホモシラテカン相互作用後の蛍光スペクトル変化 蛍光放出データをpH 7.4の食塩加リン酸緩衝液(PBS)及びエタノールの溶液中のホモシラテカンについて記録した。又、データをPBS中の電気中性ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)又はPBS中の負に荷電したジミリストイルホスファチジルグリセロール(DMPG)を含む小さい単ラメラ小胞(SUV)の懸濁液の存在下で新規薬剤について獲得した。5mMの脂質濃度を使用した。DB-38について、37℃で410nmの励起光を使用して、全てのスペクトルを記録した。PBS中のDB-38に関する放出最大は531nmであり、この値は膜の存在下で更に低い値にシフトする（DMPC小胞の存在下では515nmのλmax、又DMPG小胞の存在下では517nmのλmax）。膜の存在下で起こるDB-38のスペクトルシフトはその薬剤が電気中性膜及び負に荷電した膜の両方を結合することができることを示す。スペクトル記録を開始し、溶液又は懸濁液への薬剤のラクトン形態の添加直後に完結し、それにより検出されたシグナルが主として薬剤のラクトン形態（その開環形態ではない）に由来することを確実にした。
【００８４】
又、１μＭの7-t-ブチルジメチルシリルホモカンプトテシン(DB-81)の蛍光放出スペクトルを調べた。10mMの脂質濃度を使用した。37℃で380nmの励起光を使用して、全てのスペクトルを記録した。PBS緩衝液中のDB-81に関する放出最大は452nmであり、この値は膜の存在下で更に低い値にシフトする（DMPC小胞の存在下では443nmのλmax、又DMPG小胞の存在下では442nmのλmax）。膜の存在下で起こるDB-81のスペクトルシフトはその薬剤が電気中性膜及び負に荷電した膜の両方を結合することができることを示す。
又、１μＭの7-t-ブチルジメチルシリル-10-アミノホモカンプトテシン(DB-90)の蛍光放出スペクトルを調べた。37℃で430nmの励起光を使用して、全てのスペクトルを記録した。PBS中のDB-90に関する放出最大は535nmであり、この値は膜の存在下で更に低い値にシフトする（DMPC小胞の存在下では513nmのλmax、又DMPG小胞の存在下では512nmのλmax）。
【００８５】
又、１μＭの7-t-ブチルジメチルシリル-10-ヒドロキシ-ホモカンプトテシン(DB-91)の蛍光放出スペクトルを研究した。10mMの脂質濃度を使用した。37℃で394nmの励起光を使用して、全てのスペクトルを記録した。PBS中のDB-91に関する放出最大は554nmであり、この値は膜の存在下で更に低い値にシフトする（DMPC小胞の存在下では441nmのλmax、又DMPG小胞の存在下では434nmのλmax）。
又、１μＭの7-t-ブチル-ジメチルシリル-10-アミノホモカンプトテシンのカルボキシレート形態（DB90カルボキシレート）の蛍光放出スペクトルを研究した。0.15mMの脂質濃度を使用した。これらの実験に使用した脂質の濃度はDB-90の相当するラクトン形態を使用して行なった実験よりも大きかった。更に高い脂質濃度を医薬品の閉環ラクトン形態に対し医薬品の開環形態の減少された膜会合のために使用した。37℃で430nmの励起光を使用して、全てのスペクトルを記録した。PBS中のDB-90カルボキシレートに関する放出最大は529nmであり、この値は膜の存在下で更に低い値にシフトする（DMPC小胞の存在下では512nmのλmax、又DMPG小胞の存在下では512nmのλmax）。
【００８６】
又、１μＭの7-t-ブチルジメチルシリル-10-ヒドロキシホモカンプトテシンの開環形態即ちカルボキシレート形態（DB-91カルボキシレート）の蛍光放出スペクトルを獲得した。0.15Mの脂質濃度を使用した（結合を促進するためにこれらの実験で必要とされた高濃度の脂質はその薬剤の閉環ラクトン形態に対しその薬剤の開環形態の減少された膜会合により必要とされた）。PBS中のDB-91カルボキシレートに関する放出最大は549nmであり、この値は更に低い値にシフトする（DMPC小胞の存在下では450nmのλmax、又DMPG小胞の存在下では446nmのλmax）。
【００８７】
37℃のPBS中の１μＭの7-t-ブチルジメチルシリル-10-アミノホモカンプトテシンのラクトン形態対カルボキシレート形態（夫々DB-90及びDB-90カルボキシレート）の標準化蛍光放出スペクトルを研究した。蛍光放出スペクトルデータは開環後に更に短い波長領域へのスペクトルのわずかなシフト（即ち、光の青色領域に向かってのスペクトルの更なるシフト）があることを示す。402nmの励起光を使用して、二つのスペクトルを記録した。
37℃のPBS中の１μＭの7-t-ブチルジメチルシリル-10-ヒドロキシホモカンプトテシンのラクトン形態対カルボキシレート形態（夫々DB-91及びDB-91カルボキシレート）の標準化蛍光放出スペクトルを獲得した。蛍光放出スペクトルデータは開環後に更に短い波長領域へのスペクトルのわずかなシフト（即ち、光の青色領域に向かってのスペクトルの更なるシフト）があることを示す。二つのスペクトルを394nmで記録した。
【００８８】
赤血球中のホモシラテカン分配後の蛍光スペクトル変化の直接観察 スペクトル記録を開始し、溶液へのその薬剤のラクトン形態の添加直後に完結し、それにより検出シグナルが主として薬剤のラクトン形態（開環形態ではない）に由来することを確実にした。PBS中のDB-91に関する放出最大は554nmであるが、この値は無水エタノール中で約410nmのλmaxに有意にシフトする。DB-91は10-ヒドロキシ官能基を含むので、蛍光が二つの異なる種から生じ得る可能性が存する。非プロトン性溶媒又は非水性微小環境中で、プロトン化された（10-ヒドロキシ官能基に関して）種が優勢であり、一方、水の如きプロトン性溶媒中では、脱プロトン化された励起状態錯体が優勢である。554nmピークは脱プロトン化された励起状態錯体に相関関係があり、一方、約410nmのλmaxはプロトン化された励起状態錯体と相関関係がある。脱プロトン化された励起状態錯体の生成は水の存在により大いに促進される。１％の如き少量の水でさえも、ピークが550nm付近に現れ、これは脱プロトン化された励起状態錯体の水促進生成と相関関係がある。図６及び７において、本発明者らはプロトン化された励起状態錯体生成の程度を研究し、このパラメーターを夫々が10-ヒドロキシ官能基を含む２種の7-修飾カンプトテシン（DB-91及びSN-38）に関する親油性の相対目安として使用する。
【００８９】
スペクトル記録を開始し、溶液へのその薬剤のラクトン形態の添加直後に完結し、それにより検出シグナルが主として薬剤のラクトン形態（開環形態ではない）に由来することを確実にした。PBS中のDB-91に関する放出最大は554nmである。赤血球の存在下では、かなり低いλmax値を有するピークが観察され、その薬剤が赤血球膜に分配することができることを示す。赤血球の膜はプロトン化された励起状態錯体が生成され、蛍光を発する疎水性微小環境を与える。臨床上妥当な7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンの放出スペクトルとのヒト赤血球の存在下のDB-91の放出スペクトルの比較（図７）はDB-91の場合に広範なプロトン化された励起状態錯体生成があることを示す。これらの知見はモデル膜研究を確証し、SN-38の膜結合がDB-91について観察された広範な相互作用より有意に小さいことを示す（SN-38は300M-1のKDMPC値を示し、一方、DB-91は8,000M-1のKDMPC値を示す）。
【００９０】
新規ホモシラテカンDB-91は既知化合物7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン(SN-38)に対し更に親油性の赤血球相互作用性薬剤である。PBS中のSN-38に関する放出最大は約550nmである。又、SN-38薬剤は、DB-91のように、10-ヒドロキシ官能基を含み、その結果として、SN-38は又水の存在に感受性である蛍光スペクトル特性を示す。赤血球の存在下で、かなり低いλmax値（約440nm）を有するピークがSN-38について観察され、その薬剤が赤血球膜に分配することができることを示す。しかしながら、更に低いλmax値におけるピークがDB-91について観察された状況に対しSN-38について減少される（図６を参照のこと）。これらの結果はDB-91の場合に広範なプロトン化された励起状態錯体生成があることを示し、新規ホモシラテカンDB-91が既知化合物7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン(SN-38)に対し更に親油性の赤血球相互作用性薬剤であることを確証する。
【００９１】
in vitro細胞培養実験により測定されるようなホモシラテカンの抗癌活性 MDA-MB-435催腫瘍性ヒト乳癌細胞を使用して、細胞傷害測定を行なった。細胞を72時間の暴露期間にわたって或る範囲の医薬品濃度に暴露し、次いでスルホローダミンＢ(SRB)アッセイを使用して生存度を評価した。SRBは生細胞中の合計タンパク質レベルを測定する。死滅細胞からのタンパク質を溶解し、TCA固定の前に洗浄工程で除去する。しかしながら、死滅の早期段階の細胞は依然としてそれらの膜保全性を有し、それ故、内部にタンパク質含量を保持することが可能である。結果として、490nmにおける光学密度が時として過大評価され、細胞傷害が過小評価され得る。SRBアッセイを実証するために、異なる範囲の化学療法薬剤を腫瘍細胞系の多重パネルにわたって試験し、密接な相関関係が標準テトラゾリウム(MIT)アッセイ及びクローン化可能アッセイについて見られた。SRBアッセイは現在良く注目されているアッセイであり、抗癌医薬品スクリーニングの標準アッセイとしてNCIにより最近認可された。SRBアッセイを使用して、72時間にわたって本発明者らの新規ホモシラテカンに暴露された細胞に関する細胞傷害値を測定した。ヒト血清アルブミンの不在下及び存在下のMDA-MB-435催腫瘍性の転移性ヒト乳癌細胞に対するホモシラテカン及びカンプトテシンの細胞傷害を測定し、表５に要約する。夫々のIC50値は３回反復で研究された夫々の用量レベルでの三つの別々の試験の平均を表す。
【００９２】
(+/-) 4-エチル-8-メトキシ-6-トリメチルシラニル-3,4-ジヒドロ-1H-ピラノ〔3,4-c〕ピリジン-3,4-ジオール(4)
丸底フラスコに、N-メチルモルホリンN-オキサイド（0.89g、7.6ミリモル）、続いてH2O（10ml）及びt-BuOH（10ml）を添加した。t-BuOH（0.5ml）中のOsO4の2.5重量％溶液を添加し、続いてエノールエーテル(3)（0.5g、1.9ミリモル）を添加した。12時間後に、22℃で、Na2SO3（1.0g）をその混合物に添加した。30分後に、混合物をH2O（100ml）で希釈し、CH2Cl2（2x100ml）で抽出した。有機層を乾燥させ（MgSO4）、粗残渣をクロマトグラフィー（ヘキサン：EtOAc 3:1）にかけてラクトール(4)0.55g（98％）を白色の固体として得た。IR (CHCl3, cm-1) 3602, 3569, 3398, 3022, 2950, 1579, 1456, 1351; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.22 (s, 9 H), 0.83 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1.71-1.79 (m, J = 7 Hz, 2 H), 2.91 (s, 1 H), 3.90 (s, 3 H), 4.19 (d, J = 5 Hz, 1 H), 4.53 (d, J = 16 Hz, 1 H), 4.70 (d, J = 16 Hz, 1 H), 5.06 (d, J = 5 Hz, 1 H), 7.25 (s, 1 H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ -1.7, 7.8, 31.5, 53.1, 58.8, 70.9, 93.8, 115.1, 119.7, 145.8, 158.0, 162.8; HRMS (EI) m/z C14H23NO4Si (M+)としての計算値 473.0519, 実測値 473.0507 LRMS (EI) m/z 473 (M+), 458, 386, 360, 346, 139, 73, 57
【００９３】
ギ酸2-メトキシ-4-プロピオニル-6-トリメチルシラニル-ピリジン-3-イルメチルエステル(5)
丸底フラスコに、ラクトール(4)（0.100g、0.34ミリモル）、続いてAcOH（9ml）及びテトラ酢酸鉛（0.18g、0.406ミリモル）を添加した。50℃で３時間後に、混合物を氷冷飽和NaHCO3溶液に注ぎ、エーテル(3x75 ml)で抽出した。有機層を乾燥させ（MgSO4）、クロマトグラフィー（ヘキサン：EtOAc 95:5）にかけてケト-ホルメートエステル(5) 91mg (91％)を透明な油として得た。IR（ニート, cm-1） 2963, 2902, 1733, 1556, 1455, 1345; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.30 (s, 9 H), 1.21 (t, J = 7 Hz, 3 H), 2.75-2.95 (m, J = 7 Hz, 2 H), 4.02 (s, 3 H), 5.28 (s, 2 H), 7.07 (s, 1 H), 8.05 (s, 1 H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 1.8, 7.9, 35.9, 54.0, 57.6, 112.9, 118.7, 148.5, 160.8, 162.2, 167.6, 205.6; HRMS (EI) m/z C14H21NO4Si (M+) としての計算値 295.1240, 実測値 295.1239 LRMS (EI) m/z 295 (M+), 280, 267, 250, 234, 222, 206, 176, 162, 103, 89, 79, 73, 57
【００９４】
(+/-) 3-ヒドロキシ-3-(3-ヒドロキシメチル-2-メトキシ-6-トリメチルシラニル-ピリジン-4-イル)-ペンタン酸tert-ブチルエステル(6)
フレーム乾燥フラスコに、ケト-ホルメートエステル(5)（0.5g、1.69ミリモル）、続いてジオキサン(20ml)を添加した。α-ブロモ-tert-ブチルアセテート（0.9ml、6.08ミリモル）、続いて活性化Zn（0.59g、9.1ミリモル）を添加した。ZnをJ. Organic. Chem., 47, 5030頁(1982)（その開示が参考として本明細書に含まれる）に示されたカバ方法により活性化した。次にI2（0.16g、0.63ミリモル）を添加し、その混合物を3.2時間にわたって音波処理した。音波処理後に、混合物をH2O（100ml）及びエーテル（100ml）で希釈した。得られるエマルションをセライトのパッドで濾過し、相を分離し、水層をエーテル（2x100ml）で抽出した。合わせたエーテル抽出液を乾燥させ（MgSO4）、クロマトグラフィー（ヘキサン：EtOAc 85:15）にかけてβ-ヒドロキシエステル(6)0.50g（78％）を透明な油として得た。IR (ニート, cm-1) 3469, 2980, 1705, 1575, 1545, 1447, 1342, 1248, 1153; 1H NMR (300 MHz, C6D6) δ 0.38 (s, 9 H), 0.79 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1.15 (s, 9 H), 1.75-1.92 (m, J = 7 Hz, 2 H), 2.52 (d, J = 16 Hz, 1 H), 2.79 (d, J = 16 Hz, 1 H), 3.03 (t, J = 7 Hz, 2 H), 3.74 (s, 3 H), 5.18 (d, J = 7 Hz, 2 H), 5.19 (s, 1 H), 7.18 (s, 1 H); 13C NMR (75 MHz, C6D6) δ -1.9, 8.1, 27.6, 35.5, 45.6, 53.0, 57.0, 77.3, 81.5, 120.9, 121.8, 152.3, 162.6, 163.3, 172.3; HRMS (EI) m/z C19H31NO4Si (M-H2O)としての計算値 365.2022, 実測値 365.2028 LRMS (EI) m/z 383 (M+), 365, 336, 309, 280, 262, 250, 208, 89, 73, 57
【００９５】
(+/-) 5-エチル-4,5-ジヒドロ-5-ヒドロキシ-7-トリメチルシリル-9-メトキシオキセピノ〔3,4-c〕ピリジン-3(1H)-オン(7)
100mlのフラスコに、β-ヒドロキシエステル(6)（0.75g、1.9ミリモル）、続いてトリフルオロ酢酸(150ml)を添加した。24時間後に、その混合物を飽和NaHCO3溶液（pH 8）に注ぎ、エーテル(3x100ml)で抽出した。有機相を乾燥させ（MgSO4）、クロマトグラフィー（ヘキサン：EtOAc 2:1）にかけてβ-ヒドロキシラクトン(7)0.48g（79％）を白色の固体として得た。IR (CHCl3, cm-1) 3020, 2978, 2873, 1742, 1561, 1448, 1384, 1348, 1110, 909, 842; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.22 (s, 9 H), 0.83 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1.81-1.88 (m, J = 7 Hz, 2 H), 1.37 (br s, 1 H), 3.00 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.32 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.91 (s, 3 H), 5.18 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.42 (d, J = 15 Hz, 1 H), 7.26 (s, 1 H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ -1.9, 8.4, 33.9, 42.9, 53.8, 62.2, 73.8, 114.7, 121.2, 151.6, 159.8, 165.9, 172.3; HRMS (EI) m/z C15H23NO4Si (M+)としての計算値 309.1396, 実測値 309.1399 LRMS (EI) m/z 309 (M+), 294, 266, 252, 238, 89
【００９６】
(+/-) 5-エチル-4,5-ジヒドロ-5-ヒドロキシ-7-ヨード-9-メトキシオキセピノ〔3,4-c〕ピリジン-3(1H)-オン(8)
フレーム乾燥フラスコに、０℃でβ-ヒドロキシラクトン(7)（0.94g、3.0ミリモル）、続いて乾燥CH2Cl2 (25ml)を添加した。ICl（3.2g、19.7ミリモル）を-78℃でフレーム乾燥フラスコに添加した。フラスコを浴から取り出し、わずかに温め、過剰の水分を外部からふき取り、それを窒素雰囲気下で迅速に計量した。計量後、それを-78℃の浴に戻し、氷冷CCl4（16ml）で希釈してIClの1.2Mの溶液を得た。得られるICl溶液を氷浴に移し、０℃に平衡にした。そのICl溶液の一部(10.1ml)を暗所でその混合物に滴下して移した。暗所で16時間後に、混合物を５％のNa2SO3と飽和食塩水の1:1溶液(100ml)に注ぎ、EtOAc（3x100ml）で抽出した。有機層を乾燥させ（MgSO4）、クロマトグラフィー（ヘキサン：EtOAc 3:1）にかけてβ-ヒドロキシラクトン(7)0.43g（46％）及びヨードラクトン(8)0.41g（37％）を得た。IR (CHCl3, cm-1) 2974, 2951, 1747, 1573, 1554, 1359, 1278, 1212, 1054, 870; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.84 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1.78-1.85 (m, J = 7 Hz, 2 H), 2.98 (br d, J = 14 Hz, 2 H), 3.30 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.90 (s, 3 H), 5.10 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.35 (d, J = 15 Hz, 1 H), 7.51 (s, 1 H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 8.4, 37.4, 42.7, 55.0, 61.8, 73.4, 114.0, 114.9, 127.3, 155.3, 159.8, 171.9; HRMS (EI) m/z C12H14INO4 (M+) としての計算値 362.9967, 実測値 362.9955 LRMS (EI) m/z 363 (M+), 334, 326, 317, 302, 292, 262, 234, 162, 137, 120, 57
【００９７】
(+/-) 5-エチル-1,4,5,8-テトラヒドロ-5-ヒドロキシ-7-ヨードオキセピノ〔3,4-c〕ピリジン-3,9-ジオン(9)
フレーム乾燥フラスコに、ヨードラクトン(8)（0.33g、0.90ミリモル）、続いて乾燥アセトニトリル(12ml)を添加した。ヨウ化ナトリウム（0.22g、1.44ミリモル）、続いてクロロトリメチルシラン（0.18ml、1.44ミリモル）を添加した。得られる混合物を22℃で15分間撹拌し、その時点でH2O（7.6μl、0.42ミリモル）を添加し、その混合物を60℃で加熱した。60℃で５時間後に、混合物を５％のNa2SO3／食塩水の1:1溶液(75ml)に注ぎ、次いでEtOAc (6x75ml)で迅速に抽出した。有機層を乾燥させ（MgSO4）、クロマトグラフィー（CH2Cl2:MeOH 95:5）にかけてヨードピリドン(9)を白色の固体0.19g（61％）として得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3/CD3OD) δ 0.62 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1.45-1.54 (m, J = 7 Hz, 2 H), 2.80 (d, J = 14 Hz, 1 H), 2.97 (d, J = 14 Hz, 1 H), 4.93 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.06 (d, J = 15 Hz, 1 H), 6.66 (s, 1 H) ; 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 7.5, 35.6, 41.9, 61.6, 72.5, 94.4, 118.3, 121.1, 156.5, 162.6, 172.7; HRMS (EI) m/z C11H12INO4 (M+) としての計算値 348.9811, 実測値 348.9815 LRMS (EI) m/z 349 (M+), 331, 320, 303, 289, 278, 264, 250, 162, 150, 122, 94, 57
【００９８】
N-アルキル化ヨードピリドンの調製
(+/-) 5-エチル-1,4,5-トリヒドロ-5-ヒドロキシ-7-ヨード-8-(3-トリメチルシリル-2-プロピニル)-オキセピノ〔3,4-c〕ピリジン-3,9-ジオン(10a)
フレーム乾燥フラスコに、ヨードピリドン(9)（0.16g、0.46ミリモル）、続いて乾燥DME（3.8ml）及びDMF（0.95ml）を添加した。この溶液を０℃に低下し、NaH、油中60％の分散液（19.3mg、0.483ミリモル）を滴下して添加した。15分後に、２当量の真空フレーム乾燥LiBr（81mg、0.92ミリモル）を添加し、その混合物を22℃に上昇した。22℃で25分後に、そのトリメチルシリルプロパルギルブロミド（0.130ml、0.92ミリモル）を添加し、その混合物を65℃で加熱した。16時間後に、混合物を食塩水(50ml)に注ぎ、EtOAc (8x30ml)で抽出した。EtOAc層を乾燥させ（MgSO4）、クロマトグラフィー（CH2Cl2:EtOAc 80:20）にかけて所望のＮアルキル化ピリドン(10a)134mg（63％）を白色のフォームとして得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.005 (s, 9 H), 0.80 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1.60-1.74 (m, J = 7 Hz, 2 H), 2.94 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.11 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.60 (br s, 1 H), 4.82 (d, J = 17 Hz, 1 H), 5.01 (d, J = 17 Hz, 1 H), 5.09 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.26 (d, J = 15 Hz, 1 H), 7.01 (s, 1 H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3/CD3OD) δ -0.44, 7.9, 35.7, 42.2, 45.2, 62.3, 72.6, 90.7, 98.1, 99.2, 119.9, 122.3, 155.1, 160.6, 172.6; HRMS (EI) m/z C17H22INO4Si (M+) としての計算値 459.0363, 実測値 459.0366 LRMS (EI) m/z 459 (M+), 444, 388, 306, 111, 96, 83, 73, 57
【００９９】
(+/-) 5-エチル-1,4,5-トリヒドロ-5-ヒドロキシ-7-ヨード-8-(3-tert-ブチルジメチルシリル-2-プロピニル)-オキセピノ〔3,4-c〕ピリジン-3,9-ジオン(10b)
先に概説した操作に従って、ヨードピリドン(7)（0.16g、0.46ミリモル）をTBDMSプロパルギルブロミド（0.21g、0.92ミリモル）でＮアルキル化した。フラッシュクロマトグラフィー（CH2Cl2:EtOAc 9:1）にかけてヨードピリドン(8b) 134mg (58％)を白色のフォームとして得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.097 (s, 6 H), 0.92 (br s, 12 H), 1.82-1.89 (br m, 2 H), 3.01 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.33 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.48 (br s, 1 H), 5.07 (s, 2 H), 5.12 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.47 (d, J = 15 Hz, 1 H), 7.10 (s, 1 H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ -4.7, 8.3, 16.6, 26.3, 36.0, 42.6, 45.3, 62.8, 73.5, 89.4, 98.6, 99.5, 119.5, 122.9, 154.1, 160.4, 172.0; HRMS (EI) m/z C20H28INO4Si (M+) としての計算値 501.0832, 実測値 501.0843 LRMS (EI) m/z 501 (M+), 444, 402, 335, 318, 169, 121, 96, 57
【０１００】
(+/-) 5-エチル-1,4,5,13-テトラヒドロ-5-ヒドロキシ-12-トリメチルシリル-3H,15H-オキセピノ〔3',4':6,7〕インドリジノ〔1,2-b〕キノリン-3,15-ジオン(1h)
(7-トリメチルシリルホモカンプトテシン)
Ar雰囲気下のオーブン乾燥加圧管に、ヨードピリドン(10a)（15mg、0.033ミリモル）、続いてベンゼン(0.25ml)及びt-BuOH（0.5ml）を添加した。次にフェニルイソニトリル（13.6mg、0.13ミリモル）及びヘキサメチルジスズ（16.0mg、0.049ミリモル）を添加し、管をArでフラッシュし、シールし、275W GE太陽灯の前に置いた。照射の12時間後に、その混合物を濃縮し、クロマトグラフィー（CH2Cl2:アセトン5:1）にかけてホモカンプトテシン(1h)5.2mg（36％）を黄褐色の固体として得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3/CD3OD) δ 0.64 (s, 9 H), 0.96 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1.96-2.05 (m, J = 7 Hz, 2 H), 3.19 (d, J = 14 Hz, 2 H), 3.46 (d, J = 14 Hz, 1 H), 5.34 (s, 2 H), 5.44 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.63 (d, J = 15 Hz, 1 H), 7.65-7.71 (m, 2 H), 7.78-7.84 (m, 1 H), 8.18 (d, J = 8 Hz, 1 H), 8.27 (d, J = 8 Hz, 1 H); HRMS (EI) m/z C24H26N2O4Si (M+) としての計算値 434.1662, 実測値 434.1679 LRMS (EI) m/z 434 (M+), 419, 388, 374, 363, 347, 335, 320, 303, 289, 275, 261, 247, 231, 219, 174, 149, 73
【０１０１】
(+/-) 5-エチル-1,4,5,13-テトラヒドロ-5-ヒドロキシ-10-(tert-ブチルオキシカルボニルアミノ)-12-トリメチルシリル-3H,15H-オキセピノ〔3',4':6,7〕インドリジノ〔1,2-b〕キノリン-3,15-ジオン(1c) (10-tert-ブチルオキシカルボニルアミノ-7-トリメチルシリルホモカンプトテシン)
上記操作に従って、ヨードピリドン(10a)（30mg、0.065ミリモル）をベンゼン(0.5ml)及びt-BuOH(1ml)中でパラ-bocアミノフェニルイソニトリル（57mg、0.26ミリモル）及びヘキサメチルジスズ（32.2mg、0.1ミリモル）と反応させた。クロマトグラフィー（CH2Cl2:アセトン7:1）にかけて化合物(1c)18.8mg（53％）を褐色の固体として得た。IR (CHCl3, cm-1) 3022, 3007, 1736, 1655, 1594, 1528, 1155, 1062; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 0.70 (s, 9 H), 0.96 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1.61 (s, 9 H), 1.85-2.10 (m, J = 7 Hz, 2 H), 3.31 (d, J = 13 Hz, 1 H), 3.41 (d, J = 13 Hz, 1 H), 5.11 (d, J = 19 Hz, 1 H), 5.34-5.41 (m, 2 H), 5.61 (d, J = 15 Hz, 1 H), 6.96 (s, 1 H), 7.19-7.40 (m, 1 H), 7.62 (s, 1 H), 8.37 (s, 1 H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 1.43, 8.3, 28.4, 35.8, 42.6, 52.4, 62.3, 73.9, 81.2, 100.3, 115.1, 122.2, 123.0, 130.7, 132.6, 134.8, 137.1, 143.4, 143.6, 145.1, 148.2, 152.6, 156.5, 159.8, 171.8; HRMS (EI) m/z C29H35N3O6Si (M+) としての計算値 549.2295, 実測値 549.2274 LRMS (EI) m/z 549 (M+), 493, 475, 449, 433, 415, 404, 389, 378, 350, 304, 260, 195, 182, 73
【０１０２】
(+/-) 5-エチル-1,4,5,13-テトラヒドロ-5-ヒドロキシ-10-アセトキシ-12-トリメチルシリル-3H,15H-オキセピノ〔3',4':6,7〕インドリジノ〔1,2-b〕キノリン-3,15-ジオン (10-アセトキシ-7-トリメチルシリルホモカンプトテシン)
上記操作に従って、ヨードピリドン(10a)（30mg、0.065ミリモル）をベンゼン(0.5ml)及びt-BuOH(1ml)中でパラ-アセトキシフェニルイソニトリル（42mg、0.26ミリモル）及びヘキサメチルジスズ（32.2mg、0.1ミリモル）と反応させた。クロマトグラフィー（CH2Cl2:アセトン5:1）にかけて生成物6.6mg（21％）を黄褐色の固体として得た。IR (CHCl3, cm-1) 3025, 2992, 2953, 1753, 1657, 1600, 1504, 1193; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.67 (s, 9 H), 0.98 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1.99-2.07 (m, 2 H), 2.42 (s, 3 H), 3.26 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.45 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.66 (br s, 1 H), 5.18 (d, J = 19 Hz, 1 H), 5.35 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.39 (d, J = 19 Hz, 1 H), 5.66 (d, J = 15 Hz, 1 H), 7.38 (dd, J1 = 9 Hz, J2 = 2 Hz, 1 H), 7.40 (s, 1 H), 7.88 (d, J = 9 Hz, 1 H), 7.92 (d, J = 2 Hz, 1 H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 1.6, 8.3, 21.5, 35.9, 42.6, 52.2, 62.2, 74.0, 100.5, 118.9, 122.9, 124.7, 131.3, 132.2, 135.0, 144.1, 144.8, 145.0, 148.9, 150.0, 156.0, 159.7, 169.1, 171.5; HRMS (EI) m/z C26H28N2O6Si (M+) としての計算値 492.1717, 実測値 492.1707 LRMS (EI) m/z 492 (M+), 477, 459, 450, 432, 421, 403, 393, 379, 365, 351, 336, 147
【０１０３】
(+/-) 5-エチル-1,4,5,13-テトラヒドロ-5-ヒドロキシ-12-tert-ブチルジメチルシリル-3H,15H-オキセピノ〔3',4':6,7〕インドリジノ〔1,2-b〕キノリン-3,15-ジオン (1g) (7-tert-ブチルジメチルシリルホモカンプトテシン)
上記操作に従って、ヨードピリドン(10b)（25mg、0.05ミリモル）をベンゼン(0.75ml)中でフェニルイソニトリル（15.5mg、0.15ミリモル）及びヘキサメチルジスズ（25mg、0.075ミリモル）と反応させた。クロマトグラフィー（CH2Cl2:アセトン7:1）にかけて化合物(1g)6.4mg（27％）を黄褐色の固体として得た。IR (CHCl3, cm-1) 3027, 2958, 2932, 2859, 1745, 1655, 1600, 1269, 1065; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.69 (s, 3 H), 0.70 (s, 3 H), 0.92 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1.00 (s, 9 H), 1.92-2.02 (m, J = 7 Hz, 2 H), 3.23 (d, J = 13 Hz, 1 H), 3.39 (d, J = 13 Hz, 1 H), 3.90 (br s, 1 H), 5.11 (d, J = 19 Hz, 1 H), 5.31 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.40 (d, J = 19 Hz, 1 H), 5.60 (d, J = 15 Hz, 1 H), 7.35 (s, 1 H), 7.39-7.49 (m, 2 H), 7.70 (d, J = 8 Hz, 1 H), 8.07 (d, J = 8 Hz, 1 H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ-0.5, -0.3, 8.3, 19.4, 27.3, 35.9, 42.7, 52.9, 62.3, 74.0, 100.3, 122.8, 126.9, 129.4, 130.3, 132.7, 136.0, 143.3, 145.3, 147.6, 150.1, 156.1, 159.9, 171.5; HRMS (EI) m/z C27H32N2O4Si (M+) としての計算値 476.2131, 実測値 476.2118 LRMS (EI) m/z 476 (M+), 458, 430, 419, 405, 389, 377, 361, 345, 319, 304, 275, 149, 117, 91, 73, 56
【０１０４】
(+/-) 5-エチル-1,4,5,13-テトラヒドロ-5-ヒドロキシ-10-(tert-ブチルオキシカルボニルアミノ)-12-tert-ブチルジメチルシリル-3H,15H-オキセピノ〔3',4':6,7〕インドリジノ〔1,2-b〕キノリン-3,15-ジオン(1a) (10-tert-ブチルオキシカルボニルアミノ-7-tert-ブチルジメチルシリルホモカンプトテシン)
上記操作に従って、ヨードピリドン(10b)（45mg、0.089ミリモル）をベンゼン(1.3ml)中でパラ-bocアミノフェニルイソニトリル(58mg、0.27ミリモル)及びヘキサメチルジスズ(45mg、0.13ミリモル)と反応させた。クロマトグラフィー（CH2Cl2:アセトン10:1）にかけて化合物(1a)7.8mg（15％）を黄褐色の固体として得た。IR (CHCl3, cm-1) 3435, 3022, 2931, 2859, 1738, 1654, 1563, 1528, 1156; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.76 (s, 3 H), 0.77 (s, 3 H), 0.96 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1.10 (s, 9 H), 1.62 (s, 9 H), 1.91-2.07 (m, J = 7 Hz, 2 H), 3.34 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.41 (d, J = 14 Hz, 1 H), 4.42 (br s, 1 H), 5.09 (d, J = 19 Hz, 1 H), 5.38 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.47 (d, J = 19 Hz, 1 H), 5.62 (d, J = 15 Hz, 1 H), 6.99 (br s, 1 H), 7.21-7.25 (m, 2 H), 7.45 (d, J = 9 Hz, 1 H), 8.37 (d, J = 2 Hz, 1 H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ -0.9, -0.5, 8.3, 19.6, 27.4, 28.4, 35.5, 42.7, 53.0, 62.2, 73.8, 81.1, 100.0, 116.2, 122.2, 123.0, 130.3, 133.5, 136.3, 136.9, 144.4, 145.2, 148.2, 152.6, 156.4, 160.0, 171.5; HRMS (EI) m/z C32H41N3O6Si (M+) としての計算値 591.2765, 実測値 591.2751 LRMS (EI) m/z 534 (M-57), 516, 488, 477, 459, 435, 417, 393, 375, 111, 97, 83, 69, 57
【０１０５】
(+/-) 5-エチル-1,4,5,13-テトラヒドロ-5-ヒドロキシ-10-アセトキシ-12-tert-ブチルジメチルシリル-3H,15H-オキセピノ〔3',4':6,7〕インドリジノ〔1,2-b〕キノリン-3,15-ジオン(1e)
(10-アセトキシ-7-tert-ブチルジメチルシリルホモカンプトテシン)
上記操作に従って、ヨードピリドン(10b)（45mg、0.089ミリモル）をベンゼン(1.3ml)中でパラ-アセトキシフェニルイソニトリル（43mg、0.27ミリモル）及びヘキサメチルジスズ（45mg、0.13ミリモル）と反応させた。クロマトグラフィー（CH2Cl2:アセトン10:1）にかけて化合物(1e)9.6mg（20％）を黄褐色の固体として得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.73 (s, 3 H), 0.74 (s, 3 H), 0.97 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1.07 (s, 9 H), 1.94-2.08 (m, J = 7 Hz, 2 H), 2.42 (s, 3 H), 3.29 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.44 (d, J = 14 Hz, 1 H), 4.05 (br s, 1 H), 5.16 (d, J = 19 Hz, 1 H), 5.37 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.48 (d, J = 19 Hz, 1 H), 5.65 (d, J = 15 Hz, 1 H), 7.31 (dd, J1 = 9 Hz, J2 = 2 Hz, 1 H), 7.36 (s, 1 H), 7.70 (d, J = 9 Hz, 1 H), 7.97 (d, J = 2 Hz, 1 H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ -0.7, -0.5, 8.3, 19.3, 21.5, 27.2, 35.8, 42.7, 52.9, 62.2, 73.9, 100.4, 120.1, 122.8, 124.7, 131.1, 133.0, 136.5, 143.0, 145.0, 145.4, 148.9, 149.9, 156.2, 159.9, 169.0, 171.5; HRMS (EI) m/z C29H34N2O6Si (M+) としての計算値 534.2186, 実測値 534.2188 LRMS (EI) m/z 534 (M+), 516, 488, 477, 459, 435, 417, 393, 375, 335, 320, 291, 275, 234, 164, 137, 125, 111, 97, 83, 69, 57
【０１０６】
(+/-) 5-エチル-1,4,5,13-テトラヒドロ-5-ヒドロキシ-10-ヒドロキシ-12-tert-ブチルジメチルシリル-3H,15H-オキセピノ〔3',4':6,7〕インドリジノ〔1,2-b〕キノリン-3,15-ジオン(1f)
(10-ヒドロキシ-7-tert-ブチルジメチルシリルホモカンプトテシン)
化合物(1e)（11.9mg、0.022ミリモル）をH2O(0.3ml)及びMeOH（0.3ml）に溶解した。次にK2CO3（7.5mg、0.054ミリモル）を添加し、その混合物を22℃で撹拌した。４時間後に、溶媒を蒸発させ、残渣をCH2Cl2(2ml)及びTFA(2ml)に溶解した。22℃で16時間撹拌した後、pH5に達するまで飽和NaHCO3溶液を慎重に添加した。この時点で、その溶液をEtOAc (3x10ml)で抽出し、有機層を乾燥させ（Na2SO4）、濃縮した。残渣を２回クロマトグラフィー（1:CH2Cl2:MeOH:AcOH 94:5:1）(2:CH2Cl2:アセトン5:1)にかけて化合物(1f)8.6mg（79％）を黄色の固体として得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3/CD3OD) δ 0.65 (s, 6 H), 0.90-0.99 (m, 12 H), 1.89-2.05 (m, 2 H), 3.14 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.34 (d, J = 14 Hz, 1 H), 5.23 (s, 2 H), 5.35 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.57 (d, J = 15 Hz, 1 H), 7.42 (dd, J1 = 9 Hz, J2 = 2 Hz, 1 H), 7.58 (d, J = 2 Hz, 1 H), 7.70 (s, 1 H), 8.16 (d, J = 9 Hz, 1 H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3/CD3OD) δ -1.1, 8.1, 19.2, 26.9, 36.1, 42.1, 52.8, 62.1, 73.5, 101.8, 111.5, 122.7, 123.6, 127.5, 129.0, 135.0, 136.6, 139.8, 143.1, 145.5, 156.7, 156.9, 159.6, 172.8; HRMS (EI) m/z C27H32N2O5Si (M+) としての計算値 492.2080, 実測値 492.2087 LRMS (EI) m/z 492 (M+), 474, 446, 435, 421, 393, 375, 346, 335, 315, 291, 273, 259, 231, 183, 155
【０１０７】
(+/-) 5-エチル-1,4,5,13-テトラヒドロ-5-ヒドロキシ-10-アミノ-12-tert-ブチルジメチルシリル-3H,15H-オキセピノ〔3',4':6,7〕インドリジノ〔1,2-b〕キノリン-3,15-ジオン(1b) (10-アミノ-7-tert-ブチルジメチルシリルホモカンプトテシン)
トリフルオロ酢酸(0.1ml)をCH2Cl2（0.5ml）及び化合物(1a)（8.1mg、0.014ミリモル）を含む溶液に添加し、内容物を22℃で撹拌した。５時間後に、その混合物を飽和NaHCO3溶液（2ml）に注ぎ、EtOAc (6x2ml)で抽出した。EtOAcを乾燥させ（Na2SO4）、濃縮し、クロマトグラフィー（CH2Cl2:MeOH 96:4）にかけて(1b)6mg（89％）を黄色の固体として得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3/CD3OD) δ 0.28 (s, 6 H), 0.78-0.88 (m, 12 H), 1.78-1.90 (m, 2 H), 3.04 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.24 (d, J = 14 Hz, 1 H), 5.02-5.11 (m, 2 H), 5.24 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.46 (d, J = 15 Hz, 1 H), 7.20 (s, 1 H), 7.26 (dd, J1 = 9 Hz, J2 = 2 Hz, 1 H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3/CD3OD) δ -1.0, 8.0, 19.1, 26.9, 36.1, 42.1, 52.7, 62.1, 73.4, 100.7, 122.0, 123.2, 130.5, 134.3, 136.8, 141.8, 144.2, 147.1, 156.7, 159.7, 172.8; HRMS (EI) m/z C27H33N3O4Si (M+) としての計算値 491.2240, 実測値 491.2242 LRMS (EI) m/z 491 (M+), 434, 392, 376, 319, 279, 262, 223, 178, 167, 149, 136, 121, 107, 91, 77, 57
【０１０８】
(+/-) 5-エチル-1,4,5,13-テトラヒドロ-5-ヒドロキシ-10-アミノ-12-トリメチルシリル-3H,15H-オキセピノ〔3',4':6,7〕インドリジノ〔1,2-b〕キノリン-3,15-ジオン(1d) 10-アミノ-7-トリメチルシリルホモカンプトテシン）
トリフルオロ酢酸(0.1ml)をCH2Cl2（0.5ml）及び化合物(1c)（6.6mg、0.012ミリモル）を含む溶液に添加し、内容物を22℃で撹拌した。５時間後に、混合物を飽和NaHCO3溶液(2ml)に注ぎ、EtOAc (6x2ml)で抽出した。EtOAcを乾燥させ（Na2SO4）、濃縮し、クロマトグラフィー（CH2Cl2:MeOH 95:5）にかけて(1d)2.5mg（45％）をオレンジ赤色の固体として得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3/CD3OD) δ 0.60 (s, 9 H), 0.94 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1.92-2.05 (m, 2 H), 3.16 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.46 (d, J = 14 Hz, 1 H), 5.24 (s, 2 H), 5.40 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.61 (d, J = 15 Hz, 1 H), 7.25-7.32 (m, 2 H), 7.52 (s, 1 H), 7.89 (d, J = 9 Hz, 1 H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3/CD3OD) δ -0.12, 7.1, 35.7, 41.5, 51.6, 61.3, 72.8, 99.3, 107.0, 120.4, 121.7, 129.9, 133.6, 134.4, 139.5, 141.0, 144.7, 145.2, 146.4, 156.2, 159.3, 172.6; HRMS (EI) m/z C24H27N3O4Si (M+) としての計算値 449.1771, 実測値 449.1791 LRMS (EI) m/z 449 (M+), 434, 402, 389, 374, 350, 335, 304, 178, 73
【０１０９】
(+/-) 5-エチル-1,4,5-トリヒドロ-5-ヒドロキシ-7-ヨード-8-(5-トリメチルシリル-2-ペンチニル)オキセピノ〔3,4-c〕ピリジン-3,9-ジオン(10c)
先に概説した操作に従って、ヨードピリドン(9)（0.106g、0.92ミリモル）を2-トリメチルシリルエチルプロパルギルブロミド（0.43g、1.84ミリモル）でN-アルキル化した。フラッシュクロマトグラフィー（CH2Cl2:EtOAc 10:1）にかけてヨードピリドン(10c)68mg（46％）を明黄色のフォームとして得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ -0.069 (s, 9 H), 0.72 (t, J = 8 Hz, 2 H), 0.87 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1.70-1.88 (m, 2 H), 2.10-2.20 (m, 2 H), 2.96 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.15 (br s, 1 H), 3.27 (d, J = 14 Hz, 1 H), 4.90-5.00 (m, 2 H), 5.07 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.41 (d, J = 15 Hz, 1 H), 7.02 (s, 1 H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ -1.6, 8.2, 13.5, 15.7, 35.9, 42.5, 45.3, 62.7, 72.5, 73.4, 88.0, 99.7, 119.2, 122.8, 153.9, 160.4, 171.8; HRMS (EI) m/z C19H26INO4Si (M+) としての計算値 487.0676, 実測値 487.0676 LRMS (EI) m/z 487 (M+), 472, 400, 374, 346, 96, 73
【０１１０】
(+/-) 5-エチル-1,4,5,13-テトラヒドロ-5-ヒドロキシ-12-(2-トリメチルシリルエチル)-3H,15H-オキセピノ〔3',4':6,7〕インドリジノ〔1,2-b〕キノリン-3,15-ジオン(1i) (7-(2-トリメチルシリルエチル)ホモカンプトテシン)
Ar雰囲気下のオーブン乾燥加圧管に、ヨードピリドン(10c)（16mg、0.033ミリモル）、続いてベンゼン(0.5ml)を添加した。次にフェニルイソニトリル（10.2mg、0.1ミリモル）及びヘキサメチルジスズ（16.7mg、0.051ミリモル）を添加し、管をArでフラッシュし、シールし、275W GE太陽灯の前に置いた。照射の12時間後に、その混合物を濃縮し、クロマトグラフィー（CH2Cl2:アセトン4:1）にかけて所望のホモカンプトテシン(1i)3.6mg（24％）を黄褐色の固体として得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.184 (s, 9 H), 0.85-1.05 (m, 5 H), 1.98-2.10 (m, 2 H), 3.00-3.12 (m, 2 H), 3.18 (d, J = 14 Hz, 2 H), 3.48 (d, J = 13 Hz, 1 H), 5.14 (d, J = 19 Hz, 1 H), 5.24 (d, J = 19 Hz, 1 H), 5.34 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.71 (d, J = 15 Hz, 1 H), 7.53 (s, 1 H), 7.57-7.63 (m, 1 H), 7.70-7.77 (m, 1 H), 7.94 (d, J = 8 Hz, 1 H), 8.10 (d, J = 8 Hz, 1 H); HRMS (EI) m/z C26H30N2O4Si (M+) としての計算値 462.1975, 実測値 462.1976 LRMS (EI) m/z 462 (M+), 447, 415, 402, 391, 377, 363, 348, 317, 289, 243, 231, 73, 59
【０１１１】
(+/-) 5-エチル-1,4,5,13-テトラヒドロ-5-ヒドロキシ-10-(tert-ブチルオキシカルボニルアミノ)-12-(2-トリメチルシリルエチル)-3H,15H-オキセピノ〔3',4':6,7〕インドリジノ〔1,2-b〕キノリン-3,15-ジオン(1j)
(10-tert-ブチルオキシカルボニルアミノ-7-(2-トリメチルシリルエチル)ホモカンプトテシン)
上記操作に従って、ヨードピリドン(10c)（16mg、0.033ミリモル）をベンゼン(0.5ml)中でパラ-Bocアミノフェニルイソニトリル（21.6mg、0.1ミリモル）及びヘキサメチルジスズ（16.7mg、0.051ミリモル）と反応させた。クロマトグラフィー（CH2Cl2:アセトン7:1）にかけて化合物(1j)10.7mg（56％）を褐色の固体として得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.20 (s, 9 H), 0.83-0.93 (m, 2 H), 0.99 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1.60 (s, 9 H), 1.93-2.10 (m, 2 H), 2.90-3.05 (m, 2 H), 3.24 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.44 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.74 (br s, 1 H), 5.03 (d, J = 19 Hz, 1 H), 5.20 (d, J = 19 Hz, 1 H), 5.33 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.67 (d, J = 15 Hz, 1 H), 6.85 (s, 1 H), 7.35-7.44 (m, 2 H), 7.85 (d, J = 9 Hz, 1 H), 8.11 (br s, 1 H); HRMS (EI) m/z C31H39N3O6Si (M+) としての計算値 577.2608, 実測値 577.2611 LRMS (EI) m/z 577 (M+), 521, 477, 462, 434, 417, 378, 304, 260, 178, 108, 73
【０１１２】
(+/-) 5-エチル-1,4,5,13-テトラヒドロ-5-ヒドロキシ-10-アセトキシ-12-(2-トリメチルシリルエチル)-3H,15H-オキセピノ〔3',4':6,7〕インドリジノ〔1,2-b〕キノリン-3,15-ジオン(1k)
(10-アセトキシ-7-(2-トリメチルシリルエチル)ホモカンプトテシン)
上記操作に従って、ヨードピリドン(10c)（16mg、0.033ミリモル）をベンゼン(0.5ml)中でパラ-アセトキシフェニルイソニトリル（16mg、0.1ミリモル）及びヘキサメチルジスズ（16.7mg、0.051ミリモル）と反応させた。クロマトグラフィー（CH2Cl2:アセトン5:1）にかけて化合物(1k)7.1mg（41％）を黄褐色の固体として得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.19 (s, 9 H), 0.82-0.89 (m, 2 H), 0.99 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1.95-2.06 (m, 2 H), 2.42 (s, 3 H), 2.94-2.98 (m, 2 H), 3.23 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.46 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.59 (br s, 1 H), 5.08 (d, J = 19 Hz, 1 H), 5.24 (d, J = 19 Hz, 1 H), 5.35 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.68 (d, J = 15 Hz, 1 H), 7.41-7.49 (m, 2 H), 7.60 (d, J = 2 Hz, 1 H), 7.96 (d, J = 9 Hz, 1 H); HRMS (EI) m/z C28H32N2O6Si (M+) としての計算値 520.2030, 実測値 520.2017 LMRS (EI) m/z 520 (M+), 491, 478, 463, 449, 431, 421, 406, 393, 379, 333, 305, 261, 178, 109, 73
【０１１３】
(+/-) 5-エチル-1,4,5,13-テトラヒドロ-5-ヒドロキシ-10-ヒドロキシ-12-(2-トリメチルシリルエチル)-3H,15H-オキセピノ〔3',4':6,7〕インドリジノ〔1,2-b〕キノリン-3,15-ジオン(1l) (10-ヒドロキシ-7-(2-トリメチルシリルエチル)ホモカンプトテシン)
先に概説した操作に従って、化合物(1k)（7.1mg、0.014ミリモル）をMeOH/H2O溶液中でK2CO3（4mg、0.028ミリモル）と反応させた。残渣をクロマトグラフィー（CH2Cl2:アセトン7:1）にかけて化合物(1l)2.6mg（39％）を黄色の固体として得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3/CD3OD) δ 0.042 (s, 9 H), 0.68-0.92 (m, 5 H), 1.80-1.95 (m, 2 H), 2.83-2.95 (m, 2 H), 3.07 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.28 (d, J = 14 Hz, 1 H), 5.05 (s, 2 H), 5.29 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.51 (d, J = 15 Hz, 1 H), 7.22 (d, J = 2 Hz, 1 H), 7.26-7.34 (m, 1 H), 7.40 (s, 1 H), 7.89 (d, J = 9 Hz, 1 H); HRMS (IE) m/z C26H30N2O5Si (M+) としての計算値 478.1924, 実測値 478.1915 LRMS (EI) m/z 478 (M+), 463, 431, 418, 393, 379, 364, 305, 261, 153, 117, 105, 91, 73, 59
【０１１４】
(+/-) 5-エチル-1,4,5,13-テトラヒドロ-5-ヒドロキシ-10-アミノ-12-(2-トリメチルシリルエチル)-3H,15H-オキセピノ〔3',4':6,7〕インドリジノ〔1,2-b〕キノリン-3,15-ジオン(1m) (10-アミノ-7-(2-トリメチルシリルエチル)ホモカンプトテシン)
トリフルオロ酢酸(0.1ml)をCH2Cl2(0.5ml)及び化合物(1i)（10.7mg、0.018ミリモル）を含む溶液に添加し、内容物を22℃で撹拌した。５時間後に、その混合物を飽和NaHCO3溶液(2ml)に注ぎ、EtOAc (6x2ml)で抽出した。EtOAcを乾燥させ（Na2SO4）、濃縮し、クロマトグラフィー（CH2Cl2:MeOH 96:4）にかけて(1m)6.7mg（78％）を黄色の固体として得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3/CD3OD) δ 0.059 (s, 9 H), 0.70-0.92 (m, 5 H), 1.82-1.98 (m, 2 H), 2.80-2.92 (m, 2 H), 3.08 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.29 (d, J = 14 Hz, 1 H), 5.00 (s, 2 H), 5.29 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.52 (d, J = 15 Hz, 1 H), 6.95 (d, J = 2 Hz, 1 H), 7.18 (dd, J1 = 9 Hz, J2 = 2 Hz, 1 H), 7.38 (s, 1 H), 7.83 (d, J = 9 Hz, 1 H)
【０１１５】
本発明が上記実施例に関して詳しく記載されたが、このような詳細はその目的のためのみであり、種々の変化が特許請求の範囲により限定される以外は本発明の精神から逸脱しないで当業者によりなし得ることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 カスケードラジカル反応用の前駆体の合成を示す。
【図２ａ】 新規なＡＢ−環修正ホモカンプトセシン／ホモシラテカン誘導体の合成を示す。
【図２ｂ】 新規なＡＢ−環修正ホモカンプトセシン／ホモシラテカン誘導体の合成を示す。
【図３】 脂質二重層の存在下及び不在下におけるホモシラテカン（１μMの7-トリメチルシリル-10-アミノホモカンプトセシン（DB-38））の典型的な蛍光発光スペクトルを示す。
【図４】 PBS中の電気的に中性のジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)で構成されたSUVsに対する４つの新規なホモシラテカンの平衡結合性の、同様にカンプトセシン（CPT）及びトポテカン（TPT）について得られたデータとの比較を示す。
【図５】 水の存在についての１μMの7-t-ブチルジメチルシリル-10-ヒドロキシホモカンプトセシン（DB-91））の蛍光発光スペクトルの顕著な依存性を示す。
【図６】 ｐＨ7.4のリン酸緩衝食塩水（PBS）溶液中及び（10±１）×106細胞／μLの濃度でアルブミンフリー赤血球を含有するｐＨ7.4のPBS中における１μMの7-t-ブチルジメチルシリル-10-ヒドロキシホモカンプトセシン（DB-91）の蛍光発光スペクトルを示す。
【図７】 ｐＨ7.4のリン酸緩衝食塩水（PBS）溶液中及び（10±１）×106細胞／μLの濃度でアルブミンフリー赤血球を含有するｐＨ7.4のPBS中における先行技術の化合物7-エチル-10-ヒドロキシカンプトセシン（SN-38）の蛍光発光スペクトルを示す。
【図８】 HPLC法を用いて決定されたｐＨ値5.0、7.4、8.0、及び9.0のリン酸緩衝食塩水（PBS）溶液中における１μMの7-トリメチルシリル-10-アミノホモカンプトセシン（DB38）の安定性のｐＨ依存性を示す。
【図９】 HPLC法を用いて決定されたｐＨ値5.0、7.4、8.0、及び9.0のリン酸緩衝食塩水（PBS）溶液中における１μMの7-t-ブチルジメチルシリルホモカンプトセシン（DB81）の安定性のｐＨ依存性を示す。
【図１０】 HPLC法を用いて決定されたｐＨ値5.0、7.4、8.0、及び9.0のリン酸緩衝食塩水（PBS）溶液中における１μMの7-t-ブチルジメチルシリル-10-アミノホモカンプトセシン（DB90）の安定性のｐＨ依存性を示す。
【図１１】 HPLC法を用いて決定されたｐＨ値5.0、7.4、8.0、及び9.0のリン酸緩衝食塩水（PBS）溶液中における１μMの7-t-ブチルジメチルシリル-10-ヒドロキシホモカンプトセシン（DB91）の安定性のｐＨ依存性を示す。
【図１２】 HPLC法を用いて決定されたPBS溶液中における本発明の４種の新規なホモシラテカンの改良された安定性を示す。
【図１３】 HPLC法を用いて決定されたPBS／HSA溶液中における本発明の４種の新規なホモシラテカンの改良された安定性を示す。
【図１４】 HPLC法を用いて決定された本発明の４種の新規なホモシラテカンのヒト血漿安定性を示す。
【図１５】 生理的に適切な濃度[(５±１)×106細胞／μL]のアルブミンフリー赤血球を含有するPBS懸濁液中における本発明の４種の新規なホモシラテカンの安定性を示す。
【図１６】 HPLC法を用いて決定された本発明の４種の新規なホモシラテカンの改良されたヒト血液安定性を示す。
【図１７】 9-アミノカンプトセシン（9AC）、カンプトセシン（CPT）、トポテカン（TPT）及びSN-38を含む先行技術の臨床関連の薬剤と比較した本発明の４種の新規なホモシラテカンの改良されたヒト血液安定性を示す。
関連出願
発明の分野
本発明は、新規な化合物及びその調製方法、詳しくはＥ−環拡張カンプトセシン誘導体又は類似体及びこのようなカンプトセシン類似体の調製方法に関する。
【０００２】
発明の背景
カンプトセシンは、現在抗癌薬として使用されているDNAトポイソメラーゼＩインヒビターである。トポテカン（tpt）及びCPT-11は、食品医薬品局の完全な承認状態を得るためのカンプトセシン系統群の最初の２メンバーである（進行性上皮卵巣癌の第２ライン療法として1998年にトポテカン、再び小細胞肺癌の治療のため1998年にトポテカン、大腸癌の第１ライン療法として1998年にCPT-11）。GI-147211C、DX8951f、9-アミノカンプトセシン（9-AC）及び9-ニトロカンプトセシンのようなカンプトセシン系統群のいくつかの他の類似体が、臨床前及び臨床評価のいろいろな段階にある。臨床用途の各カンプトセシンは、血流中で比較的速く加水分解して、著しく抗癌活性を喪失してしまう。生物学的に不活性かつ潜在的に毒性のヒドロキシカルボキシレート型を生じることが、生理的ｐＨで加水分解する臨床関連のカンプトセシン内でキーとなるα−ヒドロキシラクトンファルマコフォアである。Fassberg,J.及びStella,V.A.,“カンプトセシンといくつかの類似体の動力学及び機構研究”,J.Pharm.Sci.81:676-684(1992)；Hertzberg,R.P.,Caranfa,M.J.及びHecht,S.M.,“カンプトセシンによるトポイソメラーゼＩ阻害の機序について：酵素−DNA複合体に結合する証拠”,Biochemistry 28:4629-4638(1989)；Hsiang,Y-H.及びLiu,L.F.,“抗癌薬カンプトセシンの分子内標的としての哺乳類DNAトポイソメラーゼＩの同定”，Cancer Res. 48:1722-1726(1988)；及び Jaxel,C.,Kohn,K.W.,Wani,M.C.,Wall,M.E.,及びPommier,Y.,“哺乳類トポイソメラーゼＩに関するカンプトセシン誘導体の構造活性研究：特異的レセプター部位及び抗癌活性に対する関係”,Cancer Res. 49:5077-5082(1989)。上述のものも含め、本明細書で述べる参照文献は本発明の理解を容易にしうる。本明細書に参照文献を含めることは、その参照文献が本発明についての先行技術であるとの承認を構成することを意図するものではない。
【０００３】
カンプトセシン及びその重要ないくつかの類似体の構造は以下に示される：
【化２２】
最近の研究努力により、9-アミノカンプトセシン及びカンプトセシン（cpt）のような薬剤が、それらのカルボキシレート型とヒト血清アルブミン（HSA）との間の高い親和性の結合相互作用のためにヒト血液内で非常に乏しい安定性を示すことがわかった。Burke,T.G.、Mi,Z.、Jiang,Y.、及びMunshi,C.B.“カンプトセシン抗癌薬の相対的なヒト血液安定性の決定におけるアルブミンの重要な役割”,Journal of Pharmaceutical Science,84:518-519(1995)；Burke,T.G.及びMi,Z.“ヒト血清アルブミンとのカンプトセシン相互作用の構造的基準：薬物安定性に及ぼす影響”，Jouranal of Medicinal Chemistry,37:40-46(1994)；Mi,Z.及びBurke,T.G.,“カンプトセシンラクトン及びカルボキシレート型のヒト血液成分との差次的相互作用”,Biochemistry ,33:10325-10336(1994)；及びMi,Z.、Malak,H.、及びBurke,T.G.“低減されたアルブミン結合性がヒト血液中におけるトポテカンの安定性及び活性を促進する”,Biochemistry ,34:13722-13728(1995)、これら開示は参照によって本明細書に取り込まれる。周波数領域寿命蛍光定量実験は、ヒト血清アルブミン（HSA）が、カンプトセシンラクトンと比べて100倍を超える高い親和性で優先的にカンプトセシンカルボキシレートを結合することを明かにした。Mi,Z.及びBurke,T.G.“カンプトセシンの血清アルブミンとの相互作用に関連する顕著な種間変異：周波数領域蛍光分光研究”，Biochemistry,33:12540-12545(1994)、この開示は参照によって本明細書に取り込まれる。このラクトンを超えるカルボキシレートの差次的な結合性の結果、HSAの存在下で、該タンパク質が不在の場合よりも速くかつ完全にカンプトセシン及び9-ACが開くことになる。ヒト血漿、ｐＨ7.4かつ37℃では、カンプトセシン及び9-ACは両方とも速くかつ完全に開いて、平衡ではほとんど無視できる0.2％ラクトン濃度になる。HSAの存在は、カンプトセシン及び9-ACについてはラクトン開環を促進するが、一般的に赤血球及び脂質二重層は、カンプトセシンの電気的に中性なラクトン型を、それらのそれぞれ負に荷電したカルボキシレートラクトン型を超えて優先的に結合する。Burke,T.G.、Staubus,A.E.、Mishra,A.K.、及びMalak,H.,“カンプトセシンのラクトン環のリポソーム安定化”，J.Am.Chem.Soc. 114:8318-8319(1992)；及びBurke,T.G.、Mishra,A.K.、Wani,M.、及びWall,W.，“カンプトセシン薬の脂質二重層分配性及び安定性”,Biochemistry ,32:5352-5364(1993)、これら開示は参照によって本明細書に取り込まれる。それによって、赤血球は血中の活性ラクトン濃度を高める。
【０００５】
【化２３】
最近、Lavergneらは、カンプトセシンの“ホモカンプトセシン”を生成するためのＥ−環の拡張が、抗癌活性を維持しながらカンプトセシンの溶液安定性を高めることを示した。Lavergne,O.、Lesueur-Ginot,L.、Rodas,F.P.、Kasprzyk,P.G.、Pommier,J.、Demarquay,D.、Prevost,G.、Ulibarri,G.、Rolland,A.、Schiano-Liberatore,A.-M.、Harnett,J.、Pons,D.、Camara,J.、Bigg,D.，“ホモカンプトセシン：新規なＥ−環修正カンプトセシン類似体の合成及び抗腫瘍活性”，J.Med.Chem.,41,5410-5419(1998)；及びLavergne,O.、Lesueur-Ginot,L.、Rodas,F.P.、及びBigg,D.，“強力な抗増殖性及びトポイソメラーゼＩ阻害活性を有するＥ−環修正カンプトセシン”,Bioorg. Med. Chem. Lett. 7,2235-2238(1997)。Lavergneらの研究におけるＥ−環に対する修正は、天然に存在する６員環のカンプトセシンのα−ヒドロキシラクトンの20-OH官能性とカルボキシル基との間にメチレンスペーサーを挿入することを含む。新しい７員環β−ヒドロキシラクトン環をカンプトセシン中に取り込むと、該薬剤の溶液及び血漿安定性を高めることがわかった。
【０００７】
Lavergneらのホモカンプトセシンの構造及びこのような化合物を記述するのに用いられるナンバリング系は以下に示される。
【化２４】
【０００８】
発明の概要
本発明は、一般的に下記式（１）を有するラセミ形態、エナンチオマー富化形態又はエナンチオマー純粋形態の化合物であって、
【化２５】
Ｒ3は、Ｈ、ハロゲン原子、ニトロ基、アミノ基、ヒドロキシ基、若しくはシアノ基であり；又はＲ2及びＲ3が一緒になって、ＣＨ、ＣＨ2、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、若しくはＮＲ15の群から選択される３若しくは４員環の鎖を形成し；
Ｒ4は、Ｈ、Ｆ、アミノ基、Ｃ1-3アルキル基、Ｃ2-3アルケニル基、Ｃ2-3アルキニル基、トリアルキルシリル基又はＣ1-3アルコキシ基であり；
Ｒ5は、Ｃ1-10アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、又はベンジル基であり；
Ｒ6は、−Ｓｉ(Ｒ8Ｒ9Ｒ10)又は−(Ｒ7)Ｓｉ(Ｒ8Ｒ9Ｒ10)（式中Ｒ7がアルキレン基、アルケニレン基、又はアルキニレン基）であり；かつＲ8、Ｒ9及びＲ10は、独立に、Ｃ1-10アルキル基、Ｃ2-10アルケニル基、Ｃ2-10アルキニル基、アリール基又は−(ＣＨ2)NＲ11基（式中Ｎが１〜10の範囲の整数であり、かつＲ11がヒドロキシ基、アルコキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、ハロゲン原子、シアノ基、−ＳＲC若しくはニトロ基）であり；
Ｒ13は、Ｈ、Ｆ、又は−ＣＨ3であり；
Ｒ16は、−Ｃ(Ｏ)Ｒf又はＨである化合物；及び
その製薬的に許容性の塩を提供する。
【０００９】
Ｒ1とＲ2が一緒に、例えば式−Ｏ(ＣＨ2)nＯ−であって、式中ｎが整数１又は２を表す基を形成しうる。同様に、Ｒ2とＲ3が一緒に、例えば式−Ｏ(ＣＨ2)nＯ−であって、式中ｎが整数１又は２を表す基を形成しうる。
Ｒ5は、好ましくはエチル基、アリル基、ベンジル基又はプロパギル基である。最も好ましくは、Ｒ5はエチル基である。好ましくは、Ｒ4はＨである。
一実施形態では、Ｒ8及びＲ9はメチル基であり、Ｒ10はtert-ブチル基又はメチル基であり、Ｒ1がＨかつＲ3がＨである。この実施形態では、Ｒ2は、例えばＨ、ＮＨ2又はＯＨでありうる。
Ｒ13は、好ましくはＨである。Ｒ16は、好ましくはＨ又はアルキル基である。最も好ましくは、Ｒ16はＨ又は−Ｃ(Ｏ)Ｒfであって式中Ｒfがアルキル基である。最も好ましくは、Ｒ16はＨである。
【００１０】
本発明は、下記式を有する化合物のカスケードラジカル４＋１体環形成を経由する合成方法をも提供する。
【化２６】
【化２７】
【化２８】
【化２９】
【００１１】
本発明は、下記式を有するラセミ形態、エナンチオマー富化形態又はエナンチオマー純粋形態の化合物であって、
【化３０】
その製薬的に許容性の塩をも提供する。
【００１２】
さらに、本発明は、下記式を有するラセミ形態、エナンチオマー富化形態又はエナンチオマー純粋形態の化合物を提供する。
【化３１】
【化３２】
なおさらに、本発明は、下記式を有するラセミ形態、エナンチオマー富化形態又はエナンチオマー純粋形態の化合物を提供する。
【化３３】
本発明は、下記式を有する化合物をも提供する。
【化３４】
本発明は、下記式を有する化合物をも提供する。
【化３５】
【００１６】
さらに、本発明は、下記式を有するラセミ形態、エナンチオマー富化形態又はエナンチオマー純粋形態の化合物を提供する。
【化３６】
【００１７】
なおさらに、本発明は、下記式を有する化合物の合成方法を提供する。
【化３７】
以下の工程を包含する。
（ａ）適切な酸化的開裂条件下、下記構造のエノールエーテルを処理し：
【化３８】
【化３９】
ＭＣ(Ｒ13)(Ｒ13)ＣＯ2Ｒ15
式中、ＭがＬｉ、Ｎａ、Ｋ、ＭｇＹ、又はＺｎＹである有機金属試薬で処理し、下記構造を有する化合物を生成する工程：
【化４０】
【化４１】
【化４２】
【化４３】
（ｇ）工程（ｆ）の結果脱プロトンされた種を、下記構造を有し：
【化４４】
【化４５】
上述したように、β−ヒドロキシラクトン基を含有する本発明のすべての化合物は、ラセミ形態、エナンチオマー富化形態、又はエナンチオマー純粋形態で存在することができる。ここに述べられるこのような化合物の式は、このような各形態をカバーし、及び／又は包含する。
用語“ラジカル前駆体”は、ここで使用され、かつ当業者に周知のように、一般に、鎖又は非鎖ラジカル反応の標準的な条件下で開裂してラジカルを生成するそれらの官能基を意味する。通常のラジカル前駆体は、ハロゲン（フッ素以外）、カルボン酸及びその誘導体（チオヒドロキサメートのような）、セレノフェニル基、ジアゾニウム塩等である。例えば、その開示は参照によって本明細書に取り込まれている、Giese,B. 有機合成におけるラジカル：炭素−炭素結合の形成；Pergamon,Oxford(1986)を参照せよ。
【００１９】
用語“アルキル”、“アリール”及び他の基は、その反対であると言及しない限り、一般に無置換の及び置換された基の両方を意味する。特に言及しない限り、アルキル基は炭化水素基であり、かつ好ましくはＣ1−Ｃ15（すなわち、１〜15個の炭素原子を有する）アルキル基、さらに好ましくはＣ1−Ｃ10アルキル基であり、かつ分岐し又は分岐せず、非環式又は環式でありうる。アルキル基の上記定義及び他の定義は、その基が他の基上の置換基である場合にも当てはまる（例えば、アルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基の置換基としてのアルキル基）。用語“アリール”は、フェニル又はナフチルを意味する。本明細書で用いられる場合、用語“ハロゲン”又は“ハロ”は、フルオロ、クロロ、ブロモ及びヨードを意味する。
【００２０】
用語“アルコキシ”は、−ＯＲdを意味し、式中Ｒdはアルキル基である。用語“アルコキシ”は、−ＯＲeを意味し、式中Ｒeはアリール基である。用語アシルは、−Ｃ(Ｏ)Ｒfを意味する。用語“アルケニル”は、少なくとも１個の二重結合を有し、好ましくは２〜15個の炭素原子、さらに好ましくは２〜10個の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖炭化水素基を意味する（例えば、−ＣＨ＝ＣＨＲg又は−ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨＲg）。用語“アルキニル”は、少なくとも１個の三重結合を有し、好ましくは２〜15個の炭素原子、さらに好ましくは２〜10個の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖炭化水素基を意味する（例えば、−Ｃ≡ＣＲh又は−ＣＨ2−Ｃ≡ＣＲh）。用語“アルキレン”、“アルケニレン”及び“アルキニレン”は、それぞれアルキル、アルケニル及びアルキニル基の二価形態を意味する。
【００２１】
上述の基は、多種多様な置換基で置換されて、活性を保持したホモカンプトセシン類似体を合成することができる。例えば、アルキル基は、好ましくは、限定するものではないが、ベンジル基、フェニル基、アルコキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基（例えば、遊離のアミノ基、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ基及びアリールアミノ基を含む）、アルケニル基、アルキニル基及びアシルオキシ基を含む１個又は複数の基で置換されうる。アミノ基（−ＮＲaＲb）の場合、Ｒa及びＲbは、好ましくは他と関係なく水素、アシル基、アルキル基、又はアリール基である。アシル基は、好ましくは（すなわち、Ｒfが）アルキル基、ハロアルキル基（例えば、ペルフルオロアルキル基）、アルコキシ基、アミノ基及びヒドロキシ基で置換されうる。アルキニル基及びアルケニル基は、好ましくは（すなわち、Ｒg及びＲhが、好ましくは）限定するものではないが、アルキル基、アルコキシアルキル基、アミノアルキル基及びベンジル基を含む１個の基又は複数の基で置換されうる。
【００２２】
ここで用いられる場合、用語“アシルオキシ”は、基−ＯＣ(Ｏ)Ｒdを意味する。
ここで用いられる場合、用語“アルコキシカルボニルオキシ”は、基−ＯＣ(Ｏ)ＯＲdを意味する。
ここで用いられる場合、用語“カルバモイルオキシ”は、基−ＯＣ(Ｏ)ＮＲaＲbを意味する。
アミノ及びヒドロキシ基は、技術的に公知の保護基としての基を包含しうる。アミノ基の好ましい保護基としては、tert−ブチルオキシカルボニル、ホルミル、アセチル、ベンジル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル、トリチルが挙げられる。当業者に公知の他の好適な保護基は、Greene,T.，Wuts,P.G.M.，有機合成における保護基，Wiley(1991)に開示されており、この開示は参照によって本明細書に取り込まれる。
【００２３】
一般に、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は、好ましくは結果として生成するカンプトセシン類似体の活性を維持するために過度にかさ高くない。従って、好ましくは、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は、他と関係なく約250未満の分子量を有する。さらに好ましくは、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は、他と関係なく約200未満の分子量を有する。
本発明のカンプトセシン類似体のいくつかは、限定するものではないが、塩化水素、臭化水素、硫酸塩、リン酸塩、及び硝酸塩のような無機酸との塩として製薬的用途のために調製することができる。カンプトセシン類似体は、限定するものではないが、酢酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、及びステアリン酸塩のような有機酸との塩として調製することもできる。他の酸は、本発明の化合物及びそれらの製薬的に許容性の塩の調製における中間体として使用することができる。
【００２４】
精製、投薬又は他の目的のため、Ｅ−環（ラクトン環）は、限定するものではないが、水酸化ナトリウム又は水酸化カルシウムのようなアルカリ金属で開環され、式（２）の化合物で上述したように、式（１）の化合物の開いたＥ−環類似体が生成する。このように得られた中間体は水によく溶け、かつ酸による処理後精製されて、本発明のカンプトセシン類似体の精製形態が生じうる。
【００２５】
また、Ｅ環を修正して、水又は他の溶媒中で異なる溶解プロフィルを持つ式（１）の化合物の類似体を生成することもできる。この目標を達成する方法としては、限定するものではないが、Ｅ−環を水酸化物若しくは水溶性アミノ基で開環するか、又はＥ−環の20位のヒドロキシ基をポリエチレングリコール基若しくはアシル基のような水溶性基で官能化することが挙げられる。このような基は、ホモカンプトセシン誘導体上に、又は合成の早い段階で導入することができる。このようにして調製された類似体は、プロドラッグとして作用する。他言すれば、これら類似体は、生体に投与されると、式（１）の化合物（閉じたＥ−環構造を有する）を再生する。Greenwald,R.B.ら,J. Med. Chem., 39,1938(1996)を参照せよ。例えば、Ｃ20でのアシル化によって生じるアルキルエステルは、より親油性のプロドラッグを生じ、アルキル基が酵素的に開裂されるまで加水分解しえない。
【００２６】
本発明は、患者を治療する方法をも提供し、式（１）及び／又は（２）の化合物又はそれらの製薬的に許容性の塩を製薬的に有効量投与することを含む。化合物は、例えば、癌及び／又は白血病に冒された患者に投与することができる。本発明の化合物は、抗ウイルス（例えば抗−ＨＩＶ）剤及び抗寄生虫剤としも作用しうる。式（１）及び／又は（２）の化合物は、いずれの従来の投与経路によっても、限定するものではないが、静脈内、筋肉内、経口的、皮下内、腫瘍内、皮内、及び非経口的に投与することができる。製薬的に有効な量又は投与量は、好ましくは体重１kgに対して式（１）及び（２）の１化合物が0.01〜60mgである。さらに好ましくは、製薬的に有効な量又は投与量は、体重１kgに対して式（１）及び（２）の１化合物が0.1〜40mgである。一般に、製薬的に有効な量又は投与量は、式（１）及び／又は（２）の１化合物の抗白血病性、抗腫瘍性（抗癌性）、抗ウィルス性及び／又は抗寄生虫性挙動を示すのに有効な量を含む。活性成分として式（１）及び／又は（２）の１化合物又はその製薬的に許容性の塩を、製薬的に許容性のキャリヤー又は希釈剤と共に含有する製薬組成物も、本発明の範囲内である。
【００２７】
本発明は、式（１）及び（２）のいずれの化合物と、製薬的に許容性のキャリヤーとを含む製薬組成物をも提供する。本組成物は、例えば、0.1mg〜３ｇ、好ましくは約0.1mg〜500mgの式（１）及び／又は（２）の化合物を含み、かつ投与形態として好適ないずれの形態にも構成されうる。
本発明の構造的な修正が、カンプトセシン類似体のカルボキシレート型HSAとの間の高い親和結合性を妨げ、同時に赤血球とのラクトン相互作用を促進することがわかった。血漿及び血液安定性カンプトセシンの設計でさらに考慮すべき事柄は、Ｅ−環の構造に関係する。本発明のＡ、Ｂ、Ｅ−又はＢ、Ｅ−環修正されたカンプトセシンは：１）ラクトン型を超えるカルボキシレートのHSAによる高度に優先的な結合性の除去又は最小化を通じて、HSAの存在下で向上された安定性を示し；２）該薬物のラクトン型の赤血球との可逆的会合を促し、ひいては薬物の加水分解の程度を遅くしまた制限する高レベルの親油性を示し；かつ３）水溶液中での改良された安定性を示す。
【００２８】
さらに、我々は、本発明の新規な血液安定性シリル置換ホモカンプトセシン（本明細書では、β−ヒドロキシラクトンシラテカン(silatecans)又はホモシラテカン(homosilatecans)(hST)と呼ばれる）誘導体が、「カンプトセシン類似体及びそれらの調製方法」という題名で1998年12月15日に出願された米国特許出願第09/212,178号及び「カンプトセシンの合成における新規な中間体及び関連化合物及びそれらの合成」という題名で1998年１月15日に出願された米国特許出願第09/007,872号に述べられている全合成アプローチの有意な修正によって合成できることことを発見した。これら開示は参照によって本明細書に取り込まれる。新規な中間体が合成され、本発明のカスケードラジカル体環形成を果たした。
【００２９】
本発明のいくつかのモデル化合物は、下記式に示されるように、広範に研究された。
【化４６】
本発明の新規なホモカンプトセシンは、ヒトアルブミンによるラクトンより多い優先的なカルボキシレートの結合性を低減するＡ、Ｂ−又はＢ−環修正を含む。Ａ、Ｂ−環におけるこれらの修正は、親油性をも著しく高め、かつ血中に存在する脂質二重層とのラクトン会合を促進する。この新しい化合物は、拡張されたβ−ヒドロキシラクトンＥ−環をも含み、効能を損失せずに薬剤の全体的な安定性を改良した。MDA-MB-435乳癌細胞を用いた細胞毒性検定では、本発明のＥ−環拡張β−ヒドロキシラクトンシラテカンは、２〜115nMの範囲のＩＣ50値を示す。本発明の化合物は（上記式で示されるいくつかの）、それらの新規な構造的な置換の結果として、Lavergneらによって記述された薬剤よりも優れたヒト血漿及びヒト血液安定性を有する。
【００３１】
本発明の新規なＡ、Ｂ、Ｅ−環修正及びＢ、Ｅ−環修正カンプトセシンの合成は、今までに同定された固有の効能を示す最も血液安定性のカンプトセシンの同定を導いた。これら新しい薬剤のさらなる利益は、それらが、Mi,Z.及びBurke,T.G.“カンプトセシンの血清アルブミンとの相互作用に関係する顕著な種間変異：周波数領域蛍光分光研究”，Biochemistry ,33:12540-12545(1994)に記載されている9-AC及びカンプトセシンの変異のような血液安定性においていずれの有意な種間変異をも示さないことである。この非常に魅力的な特徴は、薬物開発プロセスや実験的な観察の翻訳及び臨床に向けた動物モデルで開発される投与スケジュールを非常に容易にするだろう。
【００３２】
発明の詳細な説明
（調製方法）
本発明の式１の化合物は、図１及び２に描かれた合成スキームに従って調製することができる。図１は、キーとなるヨードピリドン９の合成を示し、式１の化合物を合成するのに使用できる。９の合成は、カンプトセシン及び類似体の合成における中間体であるエノールエーテル３から始まる。その開示が参照によって本明細書に取り込まれている米国特許出願第09/007,872号を参照せよ。ジヒドロキシル化に次ぐ酸化的開裂がケトホルメート５を与え、それからレフォルマトスキー反応によって伸長されて６を与える。好都合なことに、この反応でホルミル基が開裂され、かつ酸促進されたｔ−ブチルエステルの開裂が直接β−ヒドロキシラクトン７を生成する。そして、この化合物が、１）ヨウ素化脱シリル、及び２）脱メチルの順序でヨードピリドン９に転換される。
【００３３】
図２ａはヨードピリドン９のいくつかのモデルＡＢ修正ホモカンプトセシン誘導体への転換を示す。最適条件下における９のＮ−プロパルギル化がラジカル前駆体１０ａ、ｂを与える。これら前駆体の指示イソニトリルとのカスケードラジカル体環形成が生成物１ａ、ｃ、ｅ、ｇ、ｈを与える。そして、生成物１ａ、ｃ、ｅは、標準的な手段で脱保護され、指示された全体的な収率で標的薬物候補１ｂ、ｄ、ｆを与えた。化合物１ｇ及び１ｈは脱保護の必要がない。本発明のさらなる新規化合物の合成は、本出願の実施例のセクションで記載される。
【００３４】
Lavergne及び共同研究者らは、ホモシラテカン誘導体を製造する２つの方法を開示しているが、両方とも厳しい制限がある。一番目は、通常のラクトンの分解と同族体型ラクトンの再構成を含む一連の工程によって、標準的なカンプトセシン誘導体をホモカンプトセシン誘導体に転換することを包含する。この経路は、開始するためにカンプトセシンの存在が必要なので制限される。さらに、多くの存在するカンプトセシン誘導体は置換基を持っており、ラクトンを再形成するという過酷な条件を生き残るとは期待されない。このプロセスは、還元、酸化、強酸、及び強塩基工程を必要とする。第２の経路は、環Ｃを生成するためのパラジウム触媒環化を用いた全合成に関与する。この経路は、Ａ−環前駆体のアベイラビリティ及びその上にある置換基の多くの引き続く合成工程を生き残る能力によって制限される。さらに、この合成は、ここに記載された置換基を含む多くのＢ環置換基の導入に対する可能性を提供しないようである。
【００３５】
対照的に、本発明のラジカルカスケード合成スキームは、ずっと寛容性かつフレキシブルであり、例えば、図２ｂに示されるように、多くのＡ−、Ｂ−、又はＡ／Ｂ置換パターンでホモカンプトセシン誘導体を作るのに使用できる。一般に、ラジカルカスケードでは種々の試薬を使用でき、限定するものではないが、ヘキサメチルジチン、ヘキサメチルジシラン、又はテトラキス(トリメチルシリル)シランが挙げられる。この反応のエネルギー源は太陽ランプ又は紫外線ランプでよい。温度は、好ましくは約25〜150℃に設定される。さらに好ましくは、温度は約70℃に設定される。一般的に、ラジカルカスケードに対する不活性性以外は、使用する溶媒の選択に何ら制限はない。好ましい溶媒としては、ベンゼン、トルエン、ベンゾトリフルオライド、アセトニトリル、ＴＨＦ及びtert−ブタノールが挙げられる。また、本発明の合成スキームでは、その反応条件が温和なので、アルキン（Ｒ6）及びイソニトリル（Ｒ1−Ｒ4）上の置換基の選択も非常に広範な許容範囲がある。さらに、適切なプロパルギル誘導体が容易に調製されないというまれなケースでも、低収率ではあるが、代わりにアリル誘導体が置換されて、同一の最終生成物を調製することができる。
【００３６】
Ｃ20（Ｒ5）上の置換基は、それが容易に入手可能なアリルアルコール由来なので広範に変えることができる。レフォルマトスキー反応では置換エステルを使用してＣ20a（Ｒ13）上に置換基を有する化合物を与えることもできる。この発明の化合物は化学療法用のラセミ形態で使用しうるが、Ｃ20で排他的に又は優位に生理学的に活性なエナンチオマーである試料を使用することがより好ましい。絶対配置の割当てについてのカーン-インゴールド-プレローグ則における優先度の変化のため、標準的なカンプトセシンのＣ20 Ｓエナンチオマーは、一般に対応するホモカンプトセシンのＣ20 Ｒエナンチオマーと同一の相対配置を有する。ホモカンプトセシン誘導体のラセミ又はエナンチオマーが富化された試料は、市販されているキラルカラムを用いた液体クロマトグラフィーの標準的な方法によって、それらの個々の成分に分離することができる。Lavergne,O.ら，“ホモカンプトセシン：新規なＥ−環修正カンプトセシン類似体の合成及び抗腫瘍活性”,J. Med. Chem.，41,5410-5419(1998)を参照せよ。
【００３７】
カンプトセシンのヒト血液安定性及び高い効能を有する血液安定性ホモシラテカンの合理的な設計基準
最近、カンプトセシン及び関連類似体のラクトン及びカルボキシレート型由来の固有の蛍光発光が研究され、それらのヒト血液成分との顕著に異なる相互作用が明かにされた。Burke,T.G.及びMi,Z.,“７位におけるエチル置換が、ヒト血清アルブミンの存在下で10-ヒドロキシカンプトセシンの半減期を延長する”，J. Med. Chem.，36,2580-2582(1993)；Burke,T.G.、Mishra,A.K.、Wani,M.C.及びWall,M.E.，“カンプトセシン薬の脂質二重層分配性及び安定性”，Biochemistry 32:5352-5364(1993)；Burke,T.G.及びMi,Z.:“カンプトセシンのカルボキシレート型のヒト血清アルブミンによる優先的な結合性”（1993a）Anal. Biochem. 212,285-287；Burke,T.G.及びMi,Z.,“ヒト血清アルブミンとのカンプトセシン相互作用の構造的基準：薬物安定性に及ぼす影響”，(1994) J. Med. Chem.，37,40-46；Burke,T.G.、Munshi,C.B.、Mi,Z.、及びJiang,Y.，“カンプトセシン抗癌薬の相対的なヒト血液安定性の決定におけるアルブミンの重要な役割”(1995) J. Pharma. Sci. 84,518-519；Mi,Z.及びBurke,T.G.，“カンプトセシンラクトン及びカルボキシレート型のヒト血液成分との差次的相互作用”,Biochemistry ,33:10325-10336(1994a)；Mi,Z.及びBurke,T.G.，“血清アルブミンとカンプトセシンの相互作用に関係する顕著な種間変異”(1994b) Biochemistry 33,12540-12545；及びMi,Z.、Malak,H.、及びBurke,T.G.，“低減されたアルブミン結合性がヒト血液中におけるトポテカンの安定性及び活性を促進する”(1995) Biochemistry 34,13722-13728、これら開示は、参照によって本明細書に取り込まれる。
【００３８】
ｐＨ7.4のリン酸緩衝食塩水（PBS）中における周波数領域蛍光の寿命分光法は、ヒト血清アルブミン（HSA）が、優先的にカンプトセシンのカルボキシレート型をラクトン型より200倍高い親和性で結合することを明らかにしている。これら相互作用は、HSAの存在下で、該タンパク質がない場合よりカンプトセシンをより速くかつ完全に開くことになる。ｐＨ7.4及び37℃のヒト血漿では、カンプトセシンラクトンは、迅速くかつ完全に、11分のｔ1/2値かつ平衡値0.2％というほとんど無視できるパーセンテージのラクトンを有してカルボキシレート型に開環する。全血対血漿では、カンプトセシンは向上された安定性を示した（22分のｔ1/2値及び平衡値5.3％のラクトンのパーセンテージ）。ヒト血液中におけるカンプトセシンラクトンの向上された安定性は、赤血球の脂質二重層との薬剤会合の結果であることがわかった。カンプトセシンは、赤血球膜を結合し、そのアシル鎖領域内に薬剤が局所化し、結果的に加水分解から保護されて残存する。
【００３９】
また、臨床的に関心のあるいくつかのカンプトセシン類似体のヒト血液安定性が比較された。カンプトセシンの場合に観察されたように、9-アミノカンプトセシン（9-AC）が観察され、HSA含有PBS溶液中でほとんど完全に（＞99％）加水分解された。9-アミノ同属種のラクトン及びカルボキシレート型の相対的な結合親和性を分光学的に定量化するために何も試さなかったが（9-ACラクトン及びカルボキシレート種の蛍光量子収率がカンプトセシンと比較してかなり低減されたので）、HPLCデータは、HSAがこの薬剤のカルボキシレート型と、そのラクトン型よりも優先的に結合性することと一致した。血漿内では、99.5％より多くのカンプトセシンの9-アミノ類似体がカルボキシレートに転換され、この場合もやはりカンプトセシンを用いて得られた安定性データに親密に類似した実験値が観測された。全血内では、0.5％未満及び5.3％が、それぞれ平衡時にラクトン型で残った9-アミンカンプトセシン及びカンプトセシンのフラクションである。カンプトセシンの平衡状態で9-アミノカンプトセシンと比較して約10倍高濃度のラクトンが残存することは、部分的には、カンプトセシンの親油性が高められたこと及び水性環境から全血中に存在する赤血球膜中へ移行する能力がより大きいことによって説明できる。
【００４０】
カンプトセシン及び9-アミノカンプトセシンについてヒト全血中に平衡時残存する低濃度のラクトン（それぞれ、＜0.5％及び5.3％）と対照的に、トポテカン（11.9％）、CPT-11（21.0％）、及びSN-38（19.5％）は、すべて改良された血液安定性を示す。トポテカンの平衡時ラクトン濃度は9-アミノカンプトセシンより20倍高いが、CPT-11及びSN-38についてラクトンの対応する濃度は、9-アミノカンプトセシンの場合より約40倍高い。トポテカン、CPT-11、及びSN-38の相対的な安定性の有意な増加は、それらのHSAとの好ましい相互作用に関連づけできる。7-及び9-位の構造的置換基がHSAによるカルボキシレート薬剤形態の優先的な結合性を妨げ、また防止すると考えられる。最近、時間分解蛍光異方性の技法を使用して、カンプトセシンカルボキシレートがHSAと会合し、かつ該タンパク質と密接に会合された溶液内でタンブルする実験条件下で、トポテカン及びCPT-11のカルボキシレート型はHSAと会合しないことが示された。SN-38の場合、直接分光的な証拠が得られ、HSAがこの薬剤のラクトン型を優先的に結合し、それによってラクトン−カルボキシレート平衡をラクトンの方にシフトすることを示している。
【００４１】
これら観察は、HSAがカンプトセシンの相対的なヒト血液安定性の決定に重要な役割を演じることを示している。カンプトセシン及び9-アミノカンプトセシンの場合、このタンパク質は、カルボキシレート薬剤形態が開環された種を結合し、それによってラクトン−カルボキシレート平衡を右にシフトするシンクとして作用する。しかし、トポテカン、CPT-11、及びSN-38の場合、HSAによるカルボキシレート薬剤形態のこのような優先的な結合性は観察されない。カンプトセシン及びその9-アミノ類似体による状態と反対に、HSAは優先的にSN-38のラクトン型と結合し、それによってこの生物学的に活性な種のより高い循環濃度を助長する。
臨床関連のカンプトセシンで起こる活性薬剤の急速かつ広範な損失は、改良されたヒト血液安定性を有するカンプトセシンを同定することが非常に有利であることを示している。
【００４２】
本研究では、我々は以下の効果を有するＡ及びＢ環でカンプトセシンを修正した：１）タンパク質結合性を低減すること；２）親油性を高めること；及び３）ヒトアルブミンに対するカルボキシレートの結合性を減少させ、親油性をも高めることを両立させること。我々は、本化合物の設計に拡張されたＥ−環をも含めた。我々の研究は、従来のα−ヒドロキシラクトン官能性を含有するＡ、Ｂ−環修正カンプトセシン類似体と同様の先行技術の化合物ホモカンプトセシンより勝る血液安定性パラメータを有する、今までに同定された最も血液安定性かつ本質的に強力なカンプトセシン類似体である新規なＡ、Ｂ、Ｅ−環修正カンプトセシンの設計を導いた。本発明の新規なカンプトセシン類似体は、優れたヒト血液安定性と高い抗癌活性を併せもつというような新奇な特性を示す。
【００４３】
蛍光異方性滴定は、本発明の新規なホモシラテカンが脂質ベシクルの広範な平衡会合定数を示し、かつＥ−環拡張がシラテカンの親油性を高めることを実証する。
図３は、リン酸緩衝食塩水（PBS）及び脂質二重層中における１μMのDB-38の蛍光発光スペクトルを示す。このデータは、試料中に脂質二重層を導入すると、該薬剤と膜との間の相互作用を表わしている化合物の蛍光発光が増加することを示している。溶媒をエタノールに変えると、蛍光も変化する。膜を有する各場合に、薬剤が脂質二重層微小環境中に分配するにつれて蛍光強度が顕著に増加する。それぞれの場合、発光スペクトルに目立ったブルーシフト性又はシフトがあり、薬剤の膜との相互作用に基づく波長を低下させる（表１参照）。図３に示されるスペクトルデータは、ホモシラテカンは蛍光性であり、かつ試料に脂質二重層の添加すると、薬剤のスペクトルパラメータが変化することを示している。下表１では、新しいホモシラテカン類似体の最高励起及び発光波長を比較する。また、我々は、DB-90及びDB-91の開環型の膜相互作用をも調べ、我々の結果は、開環種について同様のスペクトルシフトを示している。
【００４４】
【表１】
表１．溶液中及びDMPC及びDMPG SUVsに結合されたホモシラテカン（DB-38、DB-81 、 DB-90 、 DB-91 ）の蛍光スペクトルパラメータ
ホモシラテカンのラクトン及びカルボキシレート型の固有な蛍光特質は、定常状態蛍光異方性滴定の高感度法を使用して種々の類似体の脂質二重層との結合相互作用の強さを決定するのを可能にする。
定常状態蛍光異方性（ａ）の測定値は、以下のペロン(Perrin)方程式によって蛍光分子の回転速度と関係づけられ：
ａ0／ａ＝１＋（τ／φ）
式中、ａ0は脱分極性回転がない場合の極限の蛍光異方性であり、τは励起状態の寿命であり、かつφは発蛍光団の回転相関時間である。上記方程式は、蛍光性化合物のτ又はφ値のいずれかの変化が、その定常状態異方性を調節できることを述べている。
【００４６】
PBS、グリセロール、及びメタノール中におけるカンプトセシン励起状態寿命値
を37℃で調べた。寿命値は、それぞれ4.7ns、3.8ns、及び3.5nsと測定された。同様に、カンプトセシンがDMPC二重層と会合されたときの寿命値が37℃で測定され、膜結合された薬剤の平均値が3.7nsであることがわかった。
このように、上述の寿命の測定は、カンプトセシンの励起状態の寿命が微小環境の変化（例えば、水性環境から親油性膜への溶媒又は発蛍光団再配置における変化）に比較的感受性であることを示している。その回転運動に強く影響する遷移（溶媒粘度又はリポソーム粒子のような大きな巨大分子集合に対する発蛍光団の結合性の変化のような）の間比較的安定しているτ値を有する発蛍光団については、ペロン方程式はａ及びφ値との間に直接的な関係が存在することを示している（すなわち、蛍光性化合物のφ値が増加するにつれ、その定常状態異方性値も増加する）。
【００４７】
カンプトセシン類似体及び新規なホモシラテカンの定常状態蛍光異方性値が溶媒粘度及び小さい単層脂質ベシクルとの会合に非常に感受性であることがわかった。例えば、トポテカンはPBS中で0.008というａ値を有するが、そのａ値は粘性溶媒のオクタノール及びグリセロール中では、それぞれ９倍及び40倍増加する。カンプトセシンのａ値では、薬剤がDMPC又はDMPGのどちらかで構成されたベシクルに結合すると、21倍の増加が観測される。膜会合に対するカンプトセシン薬のａが高感度なので、蛍光異方性滴定の方法を利用してカンプトセシン類似体の脂質二重層との平衡結合性を研究した。この実験は、１セットの試料に対して、それぞれの薬剤濃度が一定に保たれるが（典型的には１又は２μM）、１セットの膜についての脂質濃度は０〜0.29Ｍに変化する場合のａ値を決定することを含む。
【００４８】
新しく合成されたホモシラテカン由来の光り輝く蛍光発光の結果として（スペクトルパラメータの概要は表１に示される）、図４に要約されている脂質二重層吸着等温線は、いずれのバックグランドシグナルも比較的無かった。蛍光異方性滴定の方法を使用して吸着等温線を作成した。実験は、PBS緩衝液中（37℃）１μMの薬剤濃度で行われた。DB-38、DB-90及びDB-91の異方性値は、カンプトセシン又はトポテカンの異方性値よりずっと速く滴定し、新規なホモシラテカンがカンプトセシン及びトポテカンよりもずっとこれら膜との強い相互作用を有することを示している。PBS中でホモシラテカン及びカンプトセシンのラクトン環が加水分解する可能性があるので、各薬剤のラクトン型をリポソーム懸濁液に添加後即座に（約１分）各脂質濃度における異方性値を測定して、カルボキシレート型への転換のいずれの可能性をも最少にした。１μMの薬剤濃度と、バックグラウンドシグナル由来の発光（すなわち、存在する可能性のある不純物から生じる散乱励起光及び無関係な蛍光シグナル）を分離するために長い流路フィルタを使用すると、PBS緩衝液中に溶解された薬剤由来のシグナルレベルは、膜が無い場合に通常99.97％で、膜が存在する場合は98％より大きかった。吸着等温線を使用して、ホモシラテカン、シラテカン、及びカンプトセシン薬の全体的な会合定数を決定した。全体的な会合定数は、以下のように定義され：
Ｋ＝[ＡB]／[ＡF][Ｌ]
式中、[ＡB]は結合された薬剤の濃度を表し、[ＡF]は遊離薬剤の濃度を表し、かつ[Ｌ]はベシクル懸濁液中の全脂質濃度を表している。この方程式は、遊離脂質の濃度が全脂質の濃度にほぼ等しい（すなわち、遊離脂質の濃度が結合されている薬剤の濃度よりかなり過剰である）場合に有効である。この条件のときに、Ｋは２重逆数プロットの勾配の逆から決定されうる。このような２重逆数プロットでは、１／結合されたすべての薬剤のフラクションが、１／脂質濃度に対してプロットされ、１というｙ切片値を有する（結合部分の均一性を示す系に対して）。新しいホモシラテカン類似体（ラクトンとカルボキシレート型の両方）のDMPC及びDMPG小単層ベシクル（SUV）調製品との会合についてのこのような２重逆数プロットは、良い相関係数を有する直線だった。これらプロットの直線性、並びに他のタイプの膜調製品との薬剤会合についての対応プロットは、これらの脂質濃度における発蛍光団の結合性が上記方程式によって適切に述べられることを示している。
【００４９】
表２に要約されている研究は、脂質二重層のホモシラテカン会合の構造的基準を調べている。これら研究には２つのタイプの膜が含まれ、生理的条件に近いｐＨ及び温度で行われ；これら膜は、液層と電気的に中性なＬ-α-ジミリストイルホスファチジル-コリン（DMPC）；及び液層と負に荷電されたＬ-α-ジミリストイルホスファチジルグリセロール（DMPG）を含む。DMPC及びDMPGは同一の鎖長を有するが、それらの先端基上の電荷が異なる。
【００５０】
【表２】
表２．ｐＨ7.4及び37℃のPBS中における電気的に中性のDMPC及び負に荷電されたDMPGの単層ベシクルと相互作用するホモシラテカン及びカンプトセシン類似体の全体的な会合定数
表２の研究で、上述したような蛍光異方性滴定の方法を用いて結合性等温線が作成され、Ｋ値がその２重逆数プロットの勾配から決定された。Ｋ値は、10％の不確実性を受ける。表２に含まれるデータの最も目立つ特徴の１つは、Ａ、Ｂ、Ｅ−環修正カンプトセシン（例えば、DB-38、DB-90、及びDB-91として知られるホモシラテカン）又はＢ、Ｅ−環修正カンプトセシン（例えば、DB-81として知られるホモシラテカン）の創製によって達成しうる強い調節である。７位に単一の置換基又は７位と10位に２つの置換基を含有するホモシラテカンが創製され、非常に高い親油性を示すことがわかった。表２に含まれるのはカンプトセシン化合物（トポテカン及びカンプトセシン）である。DB-81については、DMPC膜の親油性がトポテカンの対応値と比較して1,400倍より多く増加している。これら薬剤についてのデータは、トポテカン及びカンプトセシンのような化合物と比較して新しいホモシラテカンの高い親油性を示している。表２から、本発明の化合物は、カンプトセシン又はトポテカンよりもずっと親油性であるこが明かである。
【００５２】
表２に含まれるデータの検査に基づき、他の興味深いまた予想外の発見が明かになる。２つのホモシラテカンについてのＫDMPC値を対応するシラテカン類似体（Ｅ−環系が、それぞれβ-ヒドロキシラクトン対α-ヒドロキシラクトン部分である）と比較すると、ホモカンプトセシンがより高い親油性を示すことがわかる。例えば、DB-38（CHJ-792、ＫDMPC＝820Ｍ-1）及びDB-91（DB-67、ＫDMPC＝2,500Ｍ-1）のシラテカン対応物のＫDMPC値は、対応するホモシラテカンよりも約２倍〜３倍小さい。このように、DB-38及びDB-91については、拡張されたＥ−環が膜結合性にとって好ましい理由であり、ひいてはヒト血液中での薬剤安定性を促進する。
【００５３】
薬剤のカルボキシレート型を研究したとき、他の驚くべき傾向が観察された。カンプトセシンのラクトン環の開環によってDMPCの親和性が３倍減少することは、以前に観察されている。Burke,T.G.、Mishra,A.K.、Wani,M.C.及びWall,M.E.，“カンプトセシン薬の脂質二重層分配性及び安定性”，Biochemistry 32:5352-5364(1993)。DB-90及びDB-91ホモカンプトセシンについて、我々は、開環によってDMPC結合性が10倍減少することを観察した。それゆえに、ホモシラテカンは顕著に向上された親油性を示すばかりでなく、ラクトンとカルボキシレート型との間の差次的結合性のレベルも、α−ヒドロキシラクトン環系を含有するカンプトセシンと比較してかなり高い（10倍対３倍）ようである。上述した２つの理由（高い親油性及びラクトンのカルボキシレート型よりも高い差次的結合性）が、ホモシラテカンがカンプトセシン及びホモカンプトセシンを超えて示す最適化された血液安定性に寄与する因子である。
【００５４】
DB-91 ホモシラテカンの赤血球との広範な膜相互作用の直接的な蛍光スペクトルの評価
図５は、ｐＨ7.4のリン酸緩衝食塩水（PBS）、エタノール、及びそれらの混合物の溶液中における１μMの7-t-ブチルジメチルシリル-10-ヒドロキシホモカンプトセシン（DB-91）の蛍光発光スペクトルを示す。すべてのスペクトルは、37℃で394nmの励起光を用いて記録された。PBS中のDB-91の発光最大値は554nmであるが、この値は無水エタノール中で約410nmのλmaxにかなりシフトする。DB-91は10-ヒドロキシ官能性を含むので、蛍光が２つの別の種から生じる可能性が存在する。非プロトン性溶媒又は非水性微小環境中では、プロトン化された（10-ヒドロキシ官能性について）種が優勢であり、水のようなプロトン性溶媒中では、脱プロトンされた励起状態複合体が優勢である。554nmピークは脱プロトンされた励起状態複合体と関係づけられ、約410nmのλmaxはプロトン化励起状態複合体と関係する。脱プロトンされた励起状態複合体の形成は、水の存在によって非常に促進され；１％のような少量の水でさえ、脱プロトンされた励起状態複合体の水促進型形成と関係する550nm周辺にピークが現れる。DB-91、及び10-ヒドロキシ官能性を含有するカンプトセシン系統群の他のメンバーのスペクトル感度は、薬剤を水性環境から赤血球の表面のような疎水性環境に分配することを研究する有用なアプローチを提供する。
【００５５】
図６は、ｐＨ7.4のリン酸緩衝食塩水（PBS）溶液中及び（10±1）×106細胞／μL濃度のアルブミン−フリー赤血球を含有するｐＨ7.4のPBS中における１μMの7-t-ブチルジメチルシリル-10-ヒドロキシ-ホモカンプトセシン（DB-91）の蛍光発光スペクトルを示し、かつホモシラテカンの赤血球との広範な相互作用の直接的な証拠を与えている。スペクトルは、10μMのDB-91濃度と370nmの励起光を用いて37℃で（散乱レベルに対する蛍光を最適化するため）前面キュベット内で記録された。
【００５６】
PBS中のDB-91の発光最大値は554nmである。赤血球が存在する場合、かなり低いλmax値を有するピークが観察され、この薬剤が赤血球膜中に分配可能であることを示している。赤血球の膜は、プロトン化された励起状態の複合体が生成できる疎水性の微小環境及び蛍光を与える。ヒト赤血球の存在下でのDB-91の発光スペクトルと、臨床関連の7-エチル-10-ヒドロキシカンプトセシン（SN-38）の発光スペクトルを比較すると、図７に示されるように、DB-91の場合、さらに広範なプロトン化された励起状態の複合体形成があることがわかる。図６の研究と同様に、図７のスペクトルは、10μMのSN-38濃度と370nmの励起光を用いて37℃で、前面キュベット内で記録された。これら実測値は、SN-38の膜結合性がDB-91について記録された広範な相互作用よりもかなり少ないことを示している（DB-91が8,000Ｍ-1のＫDMPC値を示すのに対して、SN-38は、300Ｍ-1のＫDMPC値を示す）モデル膜研究を実証している。スペクトルの研究から、我々は、新規なホモシラテカンDB-91が、FDA承認されているSN-38よりも親油性で、赤血球相互作用的薬剤であると結論する。
【００５７】
ホモシラテカンは、α - ヒドロキシラクトンファルマコフォアを含有するカンプトセシンと比較して水溶液中で改良された安定性を示す
図８〜１１は、ｐＨ値5.0、7.4、8.0、及び9.0のリン酸緩衝食塩水（PBS）の溶液中におけるDB-38、DB-81、DB-90、及びDB-91の１μM溶液の安定性のｐＨ依存性を示す。各薬剤の安定性パラメータは、HPLC法で決定された。すべての実験は37℃で行った。加水分解は、7.4、8.0、及び9.0のｐＨ値で観察され、より高いｐＨ値では、さらに広範な加水分解が観察される。
7.4、8.0、及び9.0のｐＨ値で加水分解が観察されるが、我々のデータは、ホモシラテカンのラクトン環は、従来のα-ヒドロキシラクトン環部分を含有するシラテカン及びカンプトセシンよりも不安定性が低い（すなわち、かなりゆっくり加水分解を受ける）ことを示している。
【００５８】
図１２は、本発明の４種の新規なホモシラテカンの改良された安定性を、それらの対応するα-ヒドロキシラクトン官能性を含有するシラテカン構造と対比している。図１２のすべての実験は、PBS中、37℃で行った。パネルＡ〜Ｄは、それぞれ新規なホモシラテカン（オープン環）と、トポテカン、SN-38、CPT-11及び9-アミノカンプトセシンのようなカンプトセシン及び他の臨床関連のカンプトセシン類似体に見られる従来のα-ヒドロキシラクトン環部分を含有する対応シラテカン（ソリッド環）の安定性プロフィルを含む。
【００５９】
すべての場合に、拡張されたＥ−環又はホモシラテカン構造を含有する薬剤が顕著に改良された安定性を示した。ホモシラテカンについての安定性パラメータは、表３にまとめられている。データは、ホモシラテカンのラクトン環は、シラテカン及びカンプトセシンの両者に含まれるα-ヒドロキシラクトン環部分と比較して不安定性が低い（すなわち、かなりゆっくり加水分解を受ける）ことを示している。トポテカン及びカンプトセシンのようなシラテカン類及びカンプトセシン類については、約12％のラクトンが３時間後の平衡状態で残存しているのに対して、同一のインキュベーション条件下の各ホモシラテカンについては80％より多いラクトンが残存している。
【００６０】
ヒト血清アルブミン存在下におけるホモシラテカンの優れた安定性の決定
図１３は、本発明の４種の新規なホモシラテカンの37℃で30mg/mlのヒト血清アルブミンを含有するPBS中でインキュベーション後の改良された安定性を示す。パネルＡ〜Ｄは、それぞれ新規なホモシラテカンと、トポテカン、SN-38、CPT-11及び9-アミノカンプトセシンのようなカンプトセシン及び他の臨床関連のカンプトセシン類似体に見られる従来のα-ヒドロキシラクトン環部分を含有する対応シラテカンの安定性プロフィルを含む。すべての場合に、拡張されたＥ−環構造を含有する薬剤が、HSAの存在下で顕著に改良された安定性を示した。ホモシラテカンについての安定性パラメータは、表３にまとめられている。図１４に示されるように、本発明のホモシラテカンは、トポテカン、SN-38、及びCPT-119のようなカンプトセシンより、ヒト血漿中でも優れた安定性を示した。ホモシラテカンのうち、DB-81は、ヒト血漿中で最高の安定性を示し、次いでDB-90及びDB-91であり、DB-38は（研究したホモシラテカンのうち最低の親油性）ヒト血漿中で最低の安定性を示した。図１４のすべての実験は、ヒト血漿中37℃で行われた。血漿試料は、持続的に血液ガス流によって通気して、ｐＨを7.5±0.1の値に維持した。すべての場合、拡張されたＥ−環又はホモシラテカン構造を含有する薬剤が、従来のα-ヒドロキシラクトン環部分を含有する元の薬剤カンプトセシンと比較して顕著に改良された安定性を示した。ホモシラテカンについての安定性パラメータは、表３にまとめられている。
【００６１】
我々の研究は、親油性のみならずより水溶性のホモシラテカンの両者が、Ａ及びＢ環に置換基を含まないホモカンプトセシンよりも改良された安定性を示すことを実証している。Lavergneら，“ホモカンプトセシン：新規なＥ−環−修正カンプトセシン類似体の合成及び抗腫瘍活性”J. Med. Chem. 41:5410-5419(1998)を参照せよ。従って、本発明は、ホモカンプトセシンのＡ及びＢ環の置換が血液安定性に関して好ましい因子であることを示している。有望な説明は、無置換ホモカンプトセシンカルボキシレートは、カンプトセシンカルボキシレートと同様に、優先的にカルボキシレート型でHSAを結合し、ラクトン−カルボキシレート平衡を有効に右にシフトするということである。
【００６２】
我々の結果は、β-ヒドロキシラクトンファルマコフォアと、以下の同時に生じる構造的な変化を組み合わせることによって、劇的に改良されたヒト血漿安定性が認められることを示している。：１）７位でのシリル又はシリルアルキル官能性のようなＢ−環修正（例えば、DB-81）；２）トポテカンに含まれる構造修正のようなＡ−環修正（9-ジメチルアミノメチル及び10-ヒドロキシ官能性の包含のような水可溶性の変化はHSAに対するカルボキシレートの結合性をきらう）；及び３）Ａ及びＢ環の両方で置換を併用し、例えば、７位でのシリル又はシリルアルキル置換基（例えば、DB-90及びDB-91）が挙げられる。また、Mi,Z.、Malak,H.、及びBurke,T.G.，“低減されたアルブミン結合性がヒト血液中におけるトポテカンの安定性及び活性を促進する”，Biochemistry,34,13722-13728(1995)を参照せよ。後者の例の化合物は、高い親油性及びカルボキシレート薬剤形態とHSAとの低減された特異的相互作用を示し、両因子は改良された血漿安定性に寄与する。
【００６３】
ヒト血液中における新規なホモシラテカンの顕著に改良された安定性
図１５は、生理的に適切な濃度[(５±１)×106細胞／μL]のアルブミンフリー赤血球を含有するPBS懸濁液中における本発明の４種の新規なホモシラテカンの安定性を示す。安定特性は、HPLS法を用いて37℃で測定された。すべての場合に、拡張されたＥ−環又はホモシラテカン構造を含有する薬剤が、従来のα-ヒドロキシラクトン環部分を含有するカンプトセシン類似体（臨床関連の薬剤SN-38、9-アミノカンプトセシン、9-ニトロカンプトセシン、GI-147211C、トポテカン等のような）についての公開文献の値と比較して、赤血球存在下で顕著に改良された安定性を示した。ホモシラテカンについての安定性パラメータは、表３にまとめられている。
【００６４】
図１６及び図１７は、本発明の４種の新規なホモシラテカンの改良されたヒト血液安定性を示す。すべての実験はｐＨ7.4かつ37℃で行われた。図１６では、パネルＡ〜Ｄは、それぞれ新規なホモシラテカン（オープン環）と、カンプトセシン及びトポテカン、SN-38、CPT-11及び9-アミノカンプトセシンのような他の臨床関連のカンプトセシン類似体に見られる従来のα-ヒドロキシラクトン環部分を含有する対応シラテカン（ソリッド環）の安定性プロフィル及びさらに実験試薬を含む。すべての場合に、拡張されたＥ−環又はホモシラテカン構造を含有する薬剤が、トポテカン及びSN-38のようなカンプトセシン類似体と比較して顕著に改良されたヒト血液安定性を示した。図１７は、9-アミノカンプトセシン（9AC）、カンプトセシン（CPT）、トポテカン（TPT）及びSN-38（SN38）を含む現在臨床的に関連する薬剤と比較した、本発明の新規なホモシラテカンの改良されたヒト血液安定性を示す。図１６及び図１７の安定性パラメータは、表３にまとめられている。
【００６５】
DB-81、DB-90及びDB-91について記述されたヒト血液安定性の値は、本質的に強力なカンプトセシン類似体について今までに測定された最大値である。３時間のインキュベーション後の80％より高いラクトン値は、9-アミノカンプトセシン（約0.3％）、カンプトセシン（約６％）、トポテカン（約15％）、CPT-11（約21.0）、及びSN-38（約30％）についてのヒト全血中での対応するラクトンのパーセント濃度に比べて非常に優れている。
【００６６】
【表３】
ホモシラテカンに関するヒト血液安定性パラメーターの要約
【表４】
表３続き
本発明の新規ホモシラテカンは過去に臨床上妥当なカンプトテシン、例えば、9-アミノカンプトテシン、9-ニトロカンプトテシン及びカンプトテシンについて観察された血液安定性に関する顕著な種間変化を解消する。
作用及び顕著なマウスin vivo活性のそれらの新規メカニズムについて有名な抗癌剤であるカンプトテシン及び9-アミノカンプトテシンは現在までヒトの癌に対する適度の治療実用性のみを示していた。これらの医薬品は、pH 7.4で、加水分解して生物学的に不活性なカルボキシレート形態を生じるラクトン環部分を含む。9-アミノカンプトテシンに関する医薬品安定性の比較は開環がマウス血液よりもヒト血液中で極めて大きい程度で起こったことを明らかにする（表４を参照のこと）。カンプトテシンは同様に挙動することが既に示されていた。Burke, T.G. Munshi, C.B., Mi, Z., 及びJiang, Y., “The Important Role of Albumin in Determining the Relative Human Blood Stabilities of the Camptothecin Anticancer Drugs”, J. Pharma. Sci. 84, 518-519 (1995); 並びにMi, Z. 及びBurke, T.G., “Marked Interspecies Variations Concerning the Interactions of Camptothecin with Serum Albumins: A Frequency-Domain Fluorescence Spectroscopic Study”, Biochemistry 33, 12540-12545 (1994)。本発明者らはカンプトテシンラクトン及びカルボキシレートの固有の蛍光放出の多頻度相モジュレーション分光分析の技術を使用してヒト血清アルブミン(HSA)の存在下でカンプトテシン及び9-アミノカンプトテシンについて観察された広範な開環についての物理的説明を得た。HSAはラクトン（Ｋ＝約5.5 x 103 M-1）に対しカルボキシレート（Ｋ＝1.2 x 106 M-1）について著しい200倍の結合選択性を示す。その他の種からの血清アルブミンはおよそHSA程にしっかりとではなくカンプトテシンカルボキシレートを結合することがわかった。カンプトテシンカルボキシレート及び9-アミノカンプトテシンカルボキシレートに結合してその医薬品からその生物学的に不活性な形態への広範な変換をもたらすヒトアルブミンの特異な能力のために、癌を動物モデルで撲滅することにおけるこれらの薬剤の成功はヒトで繰り返すのに本来難しいかもしれないことが明らかである。
【００６９】
本発明の新規ホモシラテカンに関するデータはマウス血液対ヒト血液中のラクトンレベルの実質的にわずかに小さい変化を示す。マウス対動物の血液中で観察された変化は9-アミノカンプトテシンについて観察されたラクトンレベルの100倍の差に対し非常に小さい。DB-81及びDB-91に関するマウス血液実験において、ヒト血液中で実際に観察されたラクトンレベルは夫々６％及び20％の値だけ控えめに過小評価される。しかしながら、9-アミノカンプトテシンについて、マウス血液はヒト血液中で実際に観察されたラクトンレベルを100倍だけ過大評価する。これらの結果は動物モデルにおける本発明者らの新規ホモシラテカンの成功がカンプトテシン及び9-アミノカンプトテシンの如き薬剤に対しヒトに容易に転換し得ると考えるのに基礎的な生理学的理由があることを示す。
【００７０】
【表５】
表４ カンプトテシン及び9-アミノカンプトテシンに関する血液安定性の著しい種間変化対新規な高度に親油性のカンプトテシン類似体に関して観察された比較的小さい差の比較a
【００７１】
高度に親油性のカンプトテシンはヒト血清アルブミンの存在下でさえも高い抗癌効力を示す。
MDA-MB-435催腫瘍性転移性ヒト乳癌細胞に対する種々のカンプトテシンの細胞傷害を表５に要約する。細胞傷害値は72時間の暴露時間に関するものである。総合して、本発明者らはDB-38が20nMのIC50値を有して、本発明者らが試験した４種の新規ホモシラテカンの中で最も強力であることを見出し、一方、その他のホモシラテカンに関するIC50値は20nMから115nMまでの範囲であった。本発明者らの結果は、新規ホモシラテカン開発により、ヒト及び動物の血液中の薬剤の安定性が抗癌医薬品のこの重要なクラスの高い固有の効力及び細胞傷害を悪化しないで著しく改良でき、均等化し得ることを明らかに示す。
【００７２】
【表６】
表５ ヒト血清アルミンの不在下及び存在下におけるMDA-MB-435催腫瘍性転移性ヒト乳癌細胞に対するホモシラテカン及びカンプトテシン類似体のIC50値
（実施例）
本発明の新規ホモシラテカンの脂質２層分配（即ち、親油性）及びラクトン環安定性の定性的測定及び定量的測定のための実験方法
薬品 カンプトテシン及びトポテカンはそれらの20(S)-配置であり、蛍光検出によるHPLCアッセイにより測定して高純度（>98％）であった。ホモシラテカンの調製はこの出願のいずれかに記載される。全てのその他の薬剤は試薬等級であり、更に精製しないで使用した。高純度の水がMilli-Q UV PLUS精製システム（ベッドフォード、MA）により提供され、これを全ての実験に使用した。
医薬品原液調製 医薬品の原液を2 x 10-3 Mの濃度でジメチルスルホキシド（A.C.S.スペクトロフォトメトリー等級、アルドリッチ、ミルウォーキー、WI）中で調製し、暗所中で４℃で貯蔵した。L-α-ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)及びL-α-ジミリストイルホスファチジルグリセロール(DMPG)をアバンチ・ポーラー・リピッズ（アラバスター、AL）から入手し、更に精製しないで使用した。全てのその他の薬品は試薬等級であり、これらを更に精製しないで使用した。
【００７４】
小胞調製 小さい単ラメラ小胞(SUV)懸濁液をBurke及びTritton, Biochemistry 24 5972-5980 (1985);並びにBurke, T.G., Mishra, A.K., Wani, M.C.及びWall, M.E. “Lipid bilayer partitioning and stability of camptothecin drugs”, Biochemistry 32: 5352-5364 (1993)（これらの開示が参考として本明細書に含まれる）に既に報告された方法により実験の日に調製した。簡単に言えば、食塩加リン酸緩衝液（PBS、pH 7.4）中に既知の量の脂質（200mg/ml以下の脂質）を含む脂質懸濁原液を脂質のTMより上で5-10分間にわたってボルテックス混合により調製した。次いで脂質分散液をそれらが光学的に透明になるまで3-4時間にわたって浴型ソニケーター（ラボラトリィ・サプライズ社、ヒックスビル、NY）を使用して音波処理した。7.4から6.8までのpHの低下をDMPGのSUV製剤について観察した。それ故、PBS中の少量の2.5 M NaOH、続いて付加的な音波処理を使用して、これらのSUV懸濁液のpHを7.4に調節した。小胞懸濁液の夫々の型を37℃で30分間アニールし、次いで実験に使用した。
【００７５】
蛍光計測 定常状態の蛍光測定を恒温キュベット区画を備えたSLMモデル9850スペクトロフルオロメーターで得た。この装置はIBM PS/2モデル55 SXコンピュータとインターフェースされていた。励起スペクトル及び放出スペクトルを8nmの励起解像度及び4nmの放出解像度で記録した。全ての場合に、スペクトルをブランクのスペクトルの減法により未標識脂質又は溶媒からのバックグラウンド蛍光及び散乱について修正した。定常状態の蛍光強さ測定を偏光子の不在下で行なった。定常状態異方性(a)測定を二つの偏光強さの同時測定のための“T-フォーマット”でその装置で測定した。水中の0.25μmのポリスチレン微小球体（ポリサイエンシズ社、ワリントン、PA）の希薄な懸濁液を使用して、偏光子のアラインメントをルーチンでチェックし、>0.99の異方性値を得た。又、水中のグリコーゲンの希薄な溶液を使用して、偏光子配向をチェックした。異方性をａ＝（Ivv GIVH）/(Ivv + GIVH)（式中、G = IVH/IHH）から計算し、添え字は夫々励起偏光子及び放出偏光子の垂直配向及び水平配向を表す。
【００７６】
370〜400nmの励起光及びバックグラウンド散乱及び／又は残留蛍光から医薬品の蛍光シグナルを分離するための夫々の放出チャンネルの上の長いパスフィルターを使用して、ホモシラテラン及びカンプトテシンに関する異方性測定を行なった。全ての放出フィルターをオリエル・コープ（スタンフォード、CT）から入手した。励起光及び放出フィルターの組み合わせがバックグラウンドシグナルからの蛍光の適切な分離を可能にした。散乱光と一緒の、バックグラウンド蛍光の寄与は典型的には合計の強さの１％未満であった。カンプトテシン及び関連同族体のラクトン環は約20分の半減期で水性媒体中で加水分解を受けるので、全ての測定は実験が加水分解生成物を含まないように医薬品原液を熱的に前平衡にされた溶液と混合した後に可能な最短時間（約0.5〜１分）以内に完結された。赤血球とのホモシラテカン及びカンプトテシンの相互作用に関する情報を得るように設計された蛍光分光分析実験において、10μMの医薬品濃度を使用した。赤血球を用いる実験を前面石英キュベット中で行なって蛍光シグナルを最適化し、散乱光を最小にした。
【００７７】
平衡結合定数の測定 Burke, T.G., Mishra, A.K., Wani, M.C.及びWall, M.E. “Lipid bilayer partitioning and stability of camptothecin drugs”, Biochemistry 32: 5352-5364 (1993)（この開示が参考として本明細書に含まれる）により報告された蛍光異方性滴定の方法を使用して、1 x 10-6 Mの合計医薬品濃度及び種々の脂質濃度を含むリポソーム懸濁液中の医薬品の遊離種及び結合種の濃度を測定した。全ての実験をガラス管中で行なった。全会合定数をＫ＝〔AB〕／〔AF〕〔Ｌ〕と定義し、式中、〔AB〕は結合医薬品の濃度を表し、〔AF〕は遊離医薬品の濃度を表し、〔Ｌ〕はサンプルの合計脂質濃度を表す。結合等温線{１／（医薬品の結合フラクション）vs１／〔脂質〕}の二重反復プロットは線形であり、Ｋ値を線形最小自乗分析の方法によりそれらの傾斜から測定した。Ｋ＝〔AB〕／〔AF〕〔Ｌ〕関係に基づくコンピュータプログラムを書いてＫの特定値及び合計医薬品に関する結合医薬品レベルを予想した。
【００７８】
ホモシラテカン、シラテカン、及びカンプトテシンのラクトン開環の速度論 異なる血液成分の存在下のカンプトテシンの加水分解速度論を上記文献に既に記載された方法から改良された定量的C18逆相高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)アッセイにより測定した。全血及び分別血液サンプルの調製を既に記載されたようにして行なった。シグマ・ケミカル（セントルイス、MO）からの高純度（>97％）の結晶化HSAを使用した。HSA原液を7.40±0.05の最終pHでPBS緩衝液中で調製した。39,800 M-1cm-1の吸光係数を使用してHSA濃度を278nmでUV吸収により測定した（Porter, 1992）。全てのその他の薬剤は試薬等級であり、これらを更に精製しないで使用した。Milli-Q UV PLUS精製システム（ベッドフォード、MA）により提供された高純度の水を全ての実験に使用した。HPLC溶媒はフィッシャー・サイエンティフィックからのものであった。ヒト血漿及び赤血球をセントラル・ケンタッキー血液センターから入手した。全血をヘパリン処理管中で男性ドナーから得、5-10℃で貯蔵し、できるだけ早く使用した（典型的には１週間以内）。マウスからの血液をヘパリン処理管中に回収し、使用まで5-10℃で貯蔵した。
【００７９】
HPLCアッセイを温度制御オートサンプラー及びウォーターズ474走査蛍光検出器を備えたウォーターズ・アライアンス2690HPLCシステムで行なった。第二HPLCシステムは501 HPLCポンプ、717プラス温度制御オートサンプラー及び470走査蛍光検出器を含むウォーターズHPLCシステムを含んでいた。ホモシラテカンに使用したHPLCアッセイ操作を以下に要約する。溶媒Ａはアセトニトリルからなり、溶媒Ｂは１ml/分の流量を有する２％のトリエチルアンモニウムアセテート、pH 5.5であった。DB-38について、イソクラチック溶離を使用した：33％の溶媒Ａ；67％の溶媒Ｂ；λex：345nmかつλem：518nm。DB-81について、イソクラチック溶離を使用した：56％の溶媒Ａ；44％の溶媒Ｂ；λex：375nmかつλem：444nm。DB-90について、イソクラチック溶離を使用した：41％の溶媒Ａ；59％の溶媒Ｂ；λex：412nmかつλem：526nm。DB-91について、イソクラチック溶離を使用した：42％の溶媒Ａ；58％の溶媒Ｂ；λex：392nmかつλem：562nm。
【００８０】
PBS中のホモシラテカンの安定性を測定するために、DMSO中のホモシラテカンの夫々のアリコートを水浴中で37℃に維持されたHPLCオートサンプラーバイアル中の食塩加リン酸緩衝液(PBS)、pH 7.4に添加して１μMの最終医薬品濃度を得た。医薬品を含むバイアルを37℃に維持されたオートサンプラーに迅速に移し、アリコートを種々の時点で分析した。全ての測定を３回反復で行なった。データを集め、ウォーターズ・ミレニアム・ソフトウェアを使用して分析した。ラクトン及びカルボキシレートのピークのピーク面積を使用し、ラクトン／カルボキシレート比を使用して、ラクトンのフラクションを計算した。
全血中の医薬品安定性を測定するために、全血を37℃で30分間インキュベートし、pHを測定した。0.1 M KOH又は0.1 M HClを使用して、血液pHを7.4±0.5に調節した。血液サンプルを37℃で30分間インキュベートし、pHを測定して個々のアッセイが開始される前にそれがその範囲にあることを確実にした。血液のアリコート（夫々2ml）を除去し、三つの使い捨てガラス試験管に入れ、管を37℃でインキュベートした。次いでDMSO中の医薬品のアリコートを血液に添加して１μMの最終医薬品濃度を得た。37℃のインキュベーションを続け、150μlのアリコートを異なる時点で除去し、エッペンドルフ管中の冷メタノール（-20℃）600μlに添加した。次いで管を10秒撹拌し、卓上小型遠心分離機中で8000rpmで45秒遠心分離した。上澄みを除去し、オートサンプラーバイアルに入れ、そのバイアルを４℃に維持されたオートサンプラーに迅速に添加した。サンプルをHPLCセットアップで直ちに分析した。データ分析はPBSのみのサンプル中の医薬品について記載されたとおりであった。
【００８１】
ヒト血清アルブミン(HSA)を含むPBS中のホモシラテカンの安定性を研究するために、HSAを30 mg/mlの濃度でPBS、pH 7.4に溶解し、37℃でインキュベートした。pHを測定し、0.1 M KOH又は0.1 M HClを使用して7.4±0.5に調節した。pHが標的範囲内で安定化するまで、インキュベーションを続けた。PBS/HSAのアリコートを除去し、オートサンプラーバイアルに入れ、10分間にわたって37℃に保った。DMSO中の医薬品のアリコートをサンプルに添加して１μMの最終医薬品濃度を得た。バイアルを37℃に維持されたHPLCオートサンプラーに迅速に添加し、アリコートを注入し、異なる時点でHPLCにより分析した。データ分析はPBSのみのサンプル中の医薬品について上記されたとおりであった。
ヒト血漿中の関係する新規シラテカンの安定性を特性決定するために、解凍するために凍結血漿を37℃でインキュベートした。血液ガスを血漿に吹き込んでpHを7.5付近に調節した。血漿のアリコート（5ml）を使い捨てガラス試験管中で37℃でインキュベートし、医薬品DMSO原液を添加して１μMの最終医薬品濃度を得た。次いでこれらのサンプルを37℃で更にインキュベートした。アリコート（150μl）を異なる時点で除去し、エッペンドルフ管中の冷メタノール（-20℃）600μlに添加した。これらの管を10秒撹拌し、卓上小型遠心分離機中で8000rpmで45秒間遠心分離した。上澄みを除去し、オートサンプラーバイアルに入れ、そのバイアルを４℃に維持されたオートサンプラーに迅速に添加した。サンプルをHPLCによりできるだけ早く分析した。データ分析は上記のPBSのみのサンプル中の医薬品について記載されたとおりであった。血液ガスを血漿サンプル中に連続的に吹き込んで7.5±1.0のpHにした。
【００８２】
生理学的に妥当な濃度の赤血球(RBC)の存在下で新規ホモシラテカンの安定性を研究するために、以下の実験を行なった。コウルター細胞カウンターを使用して、セントラル・ケンタッキー・レッド・クロスから入手した濃縮赤血球をカウントした。PBS、pH 7.4を使用して細胞の数を5 x 1012細胞/Lに調節し、37℃で30分間インキュベートした。サンプルのpHを測定し、0.1 M KOH又は0.1 M HClを使用して7.4±0.5に調節した。RBCを37℃で30分間インキュベートし、pHを再度測定して、それがアッセイを開始する前と同じ範囲内にあることを確かめた。RBCのアリコート（夫々2ml）を除去し、三つの使い捨てガラス試験管に入れ、管を37℃でインキュベートした。DMSO中の医薬品のアリコートをPBS中のRBC懸濁液に添加して１μMの最終医薬品濃度を得た。37℃のインキュベーションを続け、150μlのアリコートを異なる時点で除去し、エッペンドルフ管中に存在する冷メタノール（-20℃）600μlに添加した。管を10秒撹拌し、卓上小型遠心分離機中で8000rpmで45秒遠心分離した。上澄みを除去し、オートサンプラーバイアルに入れ、そのバイアルを４℃に維持されたオートサンプラーに迅速に添加した。サンプルをHPLCでできるだけ早く分析した。データ分析は上記のPBSのみのサンプル中の医薬品について記載されたとおりであった。
【００８３】
脂質２層膜とのホモシラテカン相互作用後の蛍光スペクトル変化 蛍光放出データをpH 7.4の食塩加リン酸緩衝液(PBS)及びエタノールの溶液中のホモシラテカンについて記録した。又、データをPBS中の電気中性ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)又はPBS中の負に荷電したジミリストイルホスファチジルグリセロール(DMPG)を含む小さい単ラメラ小胞(SUV)の懸濁液の存在下で新規薬剤について獲得した。5mMの脂質濃度を使用した。DB-38について、37℃で410nmの励起光を使用して、全てのスペクトルを記録した。PBS中のDB-38に関する放出最大は531nmであり、この値は膜の存在下で更に低い値にシフトする（DMPC小胞の存在下では515nmのλmax、又DMPG小胞の存在下では517nmのλmax）。膜の存在下で起こるDB-38のスペクトルシフトはその薬剤が電気中性膜及び負に荷電した膜の両方を結合することができることを示す。スペクトル記録を開始し、溶液又は懸濁液への薬剤のラクトン形態の添加直後に完結し、それにより検出されたシグナルが主として薬剤のラクトン形態（その開環形態ではない）に由来することを確実にした。
【００８４】
又、１μＭの7-t-ブチルジメチルシリルホモカンプトテシン(DB-81)の蛍光放出スペクトルを調べた。10mMの脂質濃度を使用した。37℃で380nmの励起光を使用して、全てのスペクトルを記録した。PBS緩衝液中のDB-81に関する放出最大は452nmであり、この値は膜の存在下で更に低い値にシフトする（DMPC小胞の存在下では443nmのλmax、又DMPG小胞の存在下では442nmのλmax）。膜の存在下で起こるDB-81のスペクトルシフトはその薬剤が電気中性膜及び負に荷電した膜の両方を結合することができることを示す。
又、１μＭの7-t-ブチルジメチルシリル-10-アミノホモカンプトテシン(DB-90)の蛍光放出スペクトルを調べた。37℃で430nmの励起光を使用して、全てのスペクトルを記録した。PBS中のDB-90に関する放出最大は535nmであり、この値は膜の存在下で更に低い値にシフトする（DMPC小胞の存在下では513nmのλmax、又DMPG小胞の存在下では512nmのλmax）。
【００８５】
又、１μＭの7-t-ブチルジメチルシリル-10-ヒドロキシ-ホモカンプトテシン(DB-91)の蛍光放出スペクトルを研究した。10mMの脂質濃度を使用した。37℃で394nmの励起光を使用して、全てのスペクトルを記録した。PBS中のDB-91に関する放出最大は554nmであり、この値は膜の存在下で更に低い値にシフトする（DMPC小胞の存在下では441nmのλmax、又DMPG小胞の存在下では434nmのλmax）。
又、１μＭの7-t-ブチル-ジメチルシリル-10-アミノホモカンプトテシンのカルボキシレート形態（DB90カルボキシレート）の蛍光放出スペクトルを研究した。0.15mMの脂質濃度を使用した。これらの実験に使用した脂質の濃度はDB-90の相当するラクトン形態を使用して行なった実験よりも大きかった。更に高い脂質濃度を医薬品の閉環ラクトン形態に対し医薬品の開環形態の減少された膜会合のために使用した。37℃で430nmの励起光を使用して、全てのスペクトルを記録した。PBS中のDB-90カルボキシレートに関する放出最大は529nmであり、この値は膜の存在下で更に低い値にシフトする（DMPC小胞の存在下では512nmのλmax、又DMPG小胞の存在下では512nmのλmax）。
【００８６】
又、１μＭの7-t-ブチルジメチルシリル-10-ヒドロキシホモカンプトテシンの開環形態即ちカルボキシレート形態（DB-91カルボキシレート）の蛍光放出スペクトルを獲得した。0.15Mの脂質濃度を使用した（結合を促進するためにこれらの実験で必要とされた高濃度の脂質はその薬剤の閉環ラクトン形態に対しその薬剤の開環形態の減少された膜会合により必要とされた）。PBS中のDB-91カルボキシレートに関する放出最大は549nmであり、この値は更に低い値にシフトする（DMPC小胞の存在下では450nmのλmax、又DMPG小胞の存在下では446nmのλmax）。
【００８７】
37℃のPBS中の１μＭの7-t-ブチルジメチルシリル-10-アミノホモカンプトテシンのラクトン形態対カルボキシレート形態（夫々DB-90及びDB-90カルボキシレート）の標準化蛍光放出スペクトルを研究した。蛍光放出スペクトルデータは開環後に更に短い波長領域へのスペクトルのわずかなシフト（即ち、光の青色領域に向かってのスペクトルの更なるシフト）があることを示す。402nmの励起光を使用して、二つのスペクトルを記録した。
37℃のPBS中の１μＭの7-t-ブチルジメチルシリル-10-ヒドロキシホモカンプトテシンのラクトン形態対カルボキシレート形態（夫々DB-91及びDB-91カルボキシレート）の標準化蛍光放出スペクトルを獲得した。蛍光放出スペクトルデータは開環後に更に短い波長領域へのスペクトルのわずかなシフト（即ち、光の青色領域に向かってのスペクトルの更なるシフト）があることを示す。二つのスペクトルを394nmで記録した。
【００８８】
赤血球中のホモシラテカン分配後の蛍光スペクトル変化の直接観察 スペクトル記録を開始し、溶液へのその薬剤のラクトン形態の添加直後に完結し、それにより検出シグナルが主として薬剤のラクトン形態（開環形態ではない）に由来することを確実にした。PBS中のDB-91に関する放出最大は554nmであるが、この値は無水エタノール中で約410nmのλmaxに有意にシフトする。DB-91は10-ヒドロキシ官能基を含むので、蛍光が二つの異なる種から生じ得る可能性が存する。非プロトン性溶媒又は非水性微小環境中で、プロトン化された（10-ヒドロキシ官能基に関して）種が優勢であり、一方、水の如きプロトン性溶媒中では、脱プロトン化された励起状態錯体が優勢である。554nmピークは脱プロトン化された励起状態錯体に相関関係があり、一方、約410nmのλmaxはプロトン化された励起状態錯体と相関関係がある。脱プロトン化された励起状態錯体の生成は水の存在により大いに促進される。１％の如き少量の水でさえも、ピークが550nm付近に現れ、これは脱プロトン化された励起状態錯体の水促進生成と相関関係がある。図６及び７において、本発明者らはプロトン化された励起状態錯体生成の程度を研究し、このパラメーターを夫々が10-ヒドロキシ官能基を含む２種の7-修飾カンプトテシン（DB-91及びSN-38）に関する親油性の相対目安として使用する。
【００８９】
スペクトル記録を開始し、溶液へのその薬剤のラクトン形態の添加直後に完結し、それにより検出シグナルが主として薬剤のラクトン形態（開環形態ではない）に由来することを確実にした。PBS中のDB-91に関する放出最大は554nmである。赤血球の存在下では、かなり低いλmax値を有するピークが観察され、その薬剤が赤血球膜に分配することができることを示す。赤血球の膜はプロトン化された励起状態錯体が生成され、蛍光を発する疎水性微小環境を与える。臨床上妥当な7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンの放出スペクトルとのヒト赤血球の存在下のDB-91の放出スペクトルの比較（図７）はDB-91の場合に広範なプロトン化された励起状態錯体生成があることを示す。これらの知見はモデル膜研究を確証し、SN-38の膜結合がDB-91について観察された広範な相互作用より有意に小さいことを示す（SN-38は300M-1のKDMPC値を示し、一方、DB-91は8,000M-1のKDMPC値を示す）。
【００９０】
新規ホモシラテカンDB-91は既知化合物7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン(SN-38)に対し更に親油性の赤血球相互作用性薬剤である。PBS中のSN-38に関する放出最大は約550nmである。又、SN-38薬剤は、DB-91のように、10-ヒドロキシ官能基を含み、その結果として、SN-38は又水の存在に感受性である蛍光スペクトル特性を示す。赤血球の存在下で、かなり低いλmax値（約440nm）を有するピークがSN-38について観察され、その薬剤が赤血球膜に分配することができることを示す。しかしながら、更に低いλmax値におけるピークがDB-91について観察された状況に対しSN-38について減少される（図６を参照のこと）。これらの結果はDB-91の場合に広範なプロトン化された励起状態錯体生成があることを示し、新規ホモシラテカンDB-91が既知化合物7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン(SN-38)に対し更に親油性の赤血球相互作用性薬剤であることを確証する。
【００９１】
in vitro細胞培養実験により測定されるようなホモシラテカンの抗癌活性 MDA-MB-435催腫瘍性ヒト乳癌細胞を使用して、細胞傷害測定を行なった。細胞を72時間の暴露期間にわたって或る範囲の医薬品濃度に暴露し、次いでスルホローダミンＢ(SRB)アッセイを使用して生存度を評価した。SRBは生細胞中の合計タンパク質レベルを測定する。死滅細胞からのタンパク質を溶解し、TCA固定の前に洗浄工程で除去する。しかしながら、死滅の早期段階の細胞は依然としてそれらの膜保全性を有し、それ故、内部にタンパク質含量を保持することが可能である。結果として、490nmにおける光学密度が時として過大評価され、細胞傷害が過小評価され得る。SRBアッセイを実証するために、異なる範囲の化学療法薬剤を腫瘍細胞系の多重パネルにわたって試験し、密接な相関関係が標準テトラゾリウム(MIT)アッセイ及びクローン化可能アッセイについて見られた。SRBアッセイは現在良く注目されているアッセイであり、抗癌医薬品スクリーニングの標準アッセイとしてNCIにより最近認可された。SRBアッセイを使用して、72時間にわたって本発明者らの新規ホモシラテカンに暴露された細胞に関する細胞傷害値を測定した。ヒト血清アルブミンの不在下及び存在下のMDA-MB-435催腫瘍性の転移性ヒト乳癌細胞に対するホモシラテカン及びカンプトテシンの細胞傷害を測定し、表５に要約する。夫々のIC50値は３回反復で研究された夫々の用量レベルでの三つの別々の試験の平均を表す。
【００９２】
(+/-) 4-エチル-8-メトキシ-6-トリメチルシラニル-3,4-ジヒドロ-1H-ピラノ〔3,4-c〕ピリジン-3,4-ジオール(4)
丸底フラスコに、N-メチルモルホリンN-オキサイド（0.89g、7.6ミリモル）、続いてH2O（10ml）及びt-BuOH（10ml）を添加した。t-BuOH（0.5ml）中のOsO4の2.5重量％溶液を添加し、続いてエノールエーテル(3)（0.5g、1.9ミリモル）を添加した。12時間後に、22℃で、Na2SO3（1.0g）をその混合物に添加した。30分後に、混合物をH2O（100ml）で希釈し、CH2Cl2（2x100ml）で抽出した。有機層を乾燥させ（MgSO4）、粗残渣をクロマトグラフィー（ヘキサン：EtOAc 3:1）にかけてラクトール(4)0.55g（98％）を白色の固体として得た。IR (CHCl3, cm-1) 3602, 3569, 3398, 3022, 2950, 1579, 1456, 1351; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.22 (s, 9 H), 0.83 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1.71-1.79 (m, J = 7 Hz, 2 H), 2.91 (s, 1 H), 3.90 (s, 3 H), 4.19 (d, J = 5 Hz, 1 H), 4.53 (d, J = 16 Hz, 1 H), 4.70 (d, J = 16 Hz, 1 H), 5.06 (d, J = 5 Hz, 1 H), 7.25 (s, 1 H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ -1.7, 7.8, 31.5, 53.1, 58.8, 70.9, 93.8, 115.1, 119.7, 145.8, 158.0, 162.8; HRMS (EI) m/z C14H23NO4Si (M+)としての計算値 473.0519, 実測値 473.0507 LRMS (EI) m/z 473 (M+), 458, 386, 360, 346, 139, 73, 57
【００９３】
ギ酸2-メトキシ-4-プロピオニル-6-トリメチルシラニル-ピリジン-3-イルメチルエステル(5)
丸底フラスコに、ラクトール(4)（0.100g、0.34ミリモル）、続いてAcOH（9ml）及びテトラ酢酸鉛（0.18g、0.406ミリモル）を添加した。50℃で３時間後に、混合物を氷冷飽和NaHCO3溶液に注ぎ、エーテル(3x75 ml)で抽出した。有機層を乾燥させ（MgSO4）、クロマトグラフィー（ヘキサン：EtOAc 95:5）にかけてケト-ホルメートエステル(5) 91mg (91％)を透明な油として得た。IR（ニート, cm-1） 2963, 2902, 1733, 1556, 1455, 1345; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.30 (s, 9 H), 1.21 (t, J = 7 Hz, 3 H), 2.75-2.95 (m, J = 7 Hz, 2 H), 4.02 (s, 3 H), 5.28 (s, 2 H), 7.07 (s, 1 H), 8.05 (s, 1 H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 1.8, 7.9, 35.9, 54.0, 57.6, 112.9, 118.7, 148.5, 160.8, 162.2, 167.6, 205.6; HRMS (EI) m/z C14H21NO4Si (M+) としての計算値 295.1240, 実測値 295.1239 LRMS (EI) m/z 295 (M+), 280, 267, 250, 234, 222, 206, 176, 162, 103, 89, 79, 73, 57
【００９４】
(+/-) 3-ヒドロキシ-3-(3-ヒドロキシメチル-2-メトキシ-6-トリメチルシラニル-ピリジン-4-イル)-ペンタン酸tert-ブチルエステル(6)
フレーム乾燥フラスコに、ケト-ホルメートエステル(5)（0.5g、1.69ミリモル）、続いてジオキサン(20ml)を添加した。α-ブロモ-tert-ブチルアセテート（0.9ml、6.08ミリモル）、続いて活性化Zn（0.59g、9.1ミリモル）を添加した。ZnをJ. Organic. Chem., 47, 5030頁(1982)（その開示が参考として本明細書に含まれる）に示されたカバ方法により活性化した。次にI2（0.16g、0.63ミリモル）を添加し、その混合物を3.2時間にわたって音波処理した。音波処理後に、混合物をH2O（100ml）及びエーテル（100ml）で希釈した。得られるエマルションをセライトのパッドで濾過し、相を分離し、水層をエーテル（2x100ml）で抽出した。合わせたエーテル抽出液を乾燥させ（MgSO4）、クロマトグラフィー（ヘキサン：EtOAc 85:15）にかけてβ-ヒドロキシエステル(6)0.50g（78％）を透明な油として得た。IR (ニート, cm-1) 3469, 2980, 1705, 1575, 1545, 1447, 1342, 1248, 1153; 1H NMR (300 MHz, C6D6) δ 0.38 (s, 9 H), 0.79 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1.15 (s, 9 H), 1.75-1.92 (m, J = 7 Hz, 2 H), 2.52 (d, J = 16 Hz, 1 H), 2.79 (d, J = 16 Hz, 1 H), 3.03 (t, J = 7 Hz, 2 H), 3.74 (s, 3 H), 5.18 (d, J = 7 Hz, 2 H), 5.19 (s, 1 H), 7.18 (s, 1 H); 13C NMR (75 MHz, C6D6) δ -1.9, 8.1, 27.6, 35.5, 45.6, 53.0, 57.0, 77.3, 81.5, 120.9, 121.8, 152.3, 162.6, 163.3, 172.3; HRMS (EI) m/z C19H31NO4Si (M-H2O)としての計算値 365.2022, 実測値 365.2028 LRMS (EI) m/z 383 (M+), 365, 336, 309, 280, 262, 250, 208, 89, 73, 57
【００９５】
(+/-) 5-エチル-4,5-ジヒドロ-5-ヒドロキシ-7-トリメチルシリル-9-メトキシオキセピノ〔3,4-c〕ピリジン-3(1H)-オン(7)
100mlのフラスコに、β-ヒドロキシエステル(6)（0.75g、1.9ミリモル）、続いてトリフルオロ酢酸(150ml)を添加した。24時間後に、その混合物を飽和NaHCO3溶液（pH 8）に注ぎ、エーテル(3x100ml)で抽出した。有機相を乾燥させ（MgSO4）、クロマトグラフィー（ヘキサン：EtOAc 2:1）にかけてβ-ヒドロキシラクトン(7)0.48g（79％）を白色の固体として得た。IR (CHCl3, cm-1) 3020, 2978, 2873, 1742, 1561, 1448, 1384, 1348, 1110, 909, 842; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.22 (s, 9 H), 0.83 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1.81-1.88 (m, J = 7 Hz, 2 H), 1.37 (br s, 1 H), 3.00 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.32 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.91 (s, 3 H), 5.18 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.42 (d, J = 15 Hz, 1 H), 7.26 (s, 1 H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ -1.9, 8.4, 33.9, 42.9, 53.8, 62.2, 73.8, 114.7, 121.2, 151.6, 159.8, 165.9, 172.3; HRMS (EI) m/z C15H23NO4Si (M+)としての計算値 309.1396, 実測値 309.1399 LRMS (EI) m/z 309 (M+), 294, 266, 252, 238, 89
【００９６】
(+/-) 5-エチル-4,5-ジヒドロ-5-ヒドロキシ-7-ヨード-9-メトキシオキセピノ〔3,4-c〕ピリジン-3(1H)-オン(8)
フレーム乾燥フラスコに、０℃でβ-ヒドロキシラクトン(7)（0.94g、3.0ミリモル）、続いて乾燥CH2Cl2 (25ml)を添加した。ICl（3.2g、19.7ミリモル）を-78℃でフレーム乾燥フラスコに添加した。フラスコを浴から取り出し、わずかに温め、過剰の水分を外部からふき取り、それを窒素雰囲気下で迅速に計量した。計量後、それを-78℃の浴に戻し、氷冷CCl4（16ml）で希釈してIClの1.2Mの溶液を得た。得られるICl溶液を氷浴に移し、０℃に平衡にした。そのICl溶液の一部(10.1ml)を暗所でその混合物に滴下して移した。暗所で16時間後に、混合物を５％のNa2SO3と飽和食塩水の1:1溶液(100ml)に注ぎ、EtOAc（3x100ml）で抽出した。有機層を乾燥させ（MgSO4）、クロマトグラフィー（ヘキサン：EtOAc 3:1）にかけてβ-ヒドロキシラクトン(7)0.43g（46％）及びヨードラクトン(8)0.41g（37％）を得た。IR (CHCl3, cm-1) 2974, 2951, 1747, 1573, 1554, 1359, 1278, 1212, 1054, 870; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.84 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1.78-1.85 (m, J = 7 Hz, 2 H), 2.98 (br d, J = 14 Hz, 2 H), 3.30 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.90 (s, 3 H), 5.10 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.35 (d, J = 15 Hz, 1 H), 7.51 (s, 1 H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 8.4, 37.4, 42.7, 55.0, 61.8, 73.4, 114.0, 114.9, 127.3, 155.3, 159.8, 171.9; HRMS (EI) m/z C12H14INO4 (M+) としての計算値 362.9967, 実測値 362.9955 LRMS (EI) m/z 363 (M+), 334, 326, 317, 302, 292, 262, 234, 162, 137, 120, 57
【００９７】
(+/-) 5-エチル-1,4,5,8-テトラヒドロ-5-ヒドロキシ-7-ヨードオキセピノ〔3,4-c〕ピリジン-3,9-ジオン(9)
フレーム乾燥フラスコに、ヨードラクトン(8)（0.33g、0.90ミリモル）、続いて乾燥アセトニトリル(12ml)を添加した。ヨウ化ナトリウム（0.22g、1.44ミリモル）、続いてクロロトリメチルシラン（0.18ml、1.44ミリモル）を添加した。得られる混合物を22℃で15分間撹拌し、その時点でH2O（7.6μl、0.42ミリモル）を添加し、その混合物を60℃で加熱した。60℃で５時間後に、混合物を５％のNa2SO3／食塩水の1:1溶液(75ml)に注ぎ、次いでEtOAc (6x75ml)で迅速に抽出した。有機層を乾燥させ（MgSO4）、クロマトグラフィー（CH2Cl2:MeOH 95:5）にかけてヨードピリドン(9)を白色の固体0.19g（61％）として得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3/CD3OD) δ 0.62 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1.45-1.54 (m, J = 7 Hz, 2 H), 2.80 (d, J = 14 Hz, 1 H), 2.97 (d, J = 14 Hz, 1 H), 4.93 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.06 (d, J = 15 Hz, 1 H), 6.66 (s, 1 H) ; 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 7.5, 35.6, 41.9, 61.6, 72.5, 94.4, 118.3, 121.1, 156.5, 162.6, 172.7; HRMS (EI) m/z C11H12INO4 (M+) としての計算値 348.9811, 実測値 348.9815 LRMS (EI) m/z 349 (M+), 331, 320, 303, 289, 278, 264, 250, 162, 150, 122, 94, 57
【００９８】
N-アルキル化ヨードピリドンの調製
(+/-) 5-エチル-1,4,5-トリヒドロ-5-ヒドロキシ-7-ヨード-8-(3-トリメチルシリル-2-プロピニル)-オキセピノ〔3,4-c〕ピリジン-3,9-ジオン(10a)
フレーム乾燥フラスコに、ヨードピリドン(9)（0.16g、0.46ミリモル）、続いて乾燥DME（3.8ml）及びDMF（0.95ml）を添加した。この溶液を０℃に低下し、NaH、油中60％の分散液（19.3mg、0.483ミリモル）を滴下して添加した。15分後に、２当量の真空フレーム乾燥LiBr（81mg、0.92ミリモル）を添加し、その混合物を22℃に上昇した。22℃で25分後に、そのトリメチルシリルプロパルギルブロミド（0.130ml、0.92ミリモル）を添加し、その混合物を65℃で加熱した。16時間後に、混合物を食塩水(50ml)に注ぎ、EtOAc (8x30ml)で抽出した。EtOAc層を乾燥させ（MgSO4）、クロマトグラフィー（CH2Cl2:EtOAc 80:20）にかけて所望のＮアルキル化ピリドン(10a)134mg（63％）を白色のフォームとして得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.005 (s, 9 H), 0.80 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1.60-1.74 (m, J = 7 Hz, 2 H), 2.94 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.11 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.60 (br s, 1 H), 4.82 (d, J = 17 Hz, 1 H), 5.01 (d, J = 17 Hz, 1 H), 5.09 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.26 (d, J = 15 Hz, 1 H), 7.01 (s, 1 H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3/CD3OD) δ -0.44, 7.9, 35.7, 42.2, 45.2, 62.3, 72.6, 90.7, 98.1, 99.2, 119.9, 122.3, 155.1, 160.6, 172.6; HRMS (EI) m/z C17H22INO4Si (M+) としての計算値 459.0363, 実測値 459.0366 LRMS (EI) m/z 459 (M+), 444, 388, 306, 111, 96, 83, 73, 57
【００９９】
(+/-) 5-エチル-1,4,5-トリヒドロ-5-ヒドロキシ-7-ヨード-8-(3-tert-ブチルジメチルシリル-2-プロピニル)-オキセピノ〔3,4-c〕ピリジン-3,9-ジオン(10b)
先に概説した操作に従って、ヨードピリドン(7)（0.16g、0.46ミリモル）をTBDMSプロパルギルブロミド（0.21g、0.92ミリモル）でＮアルキル化した。フラッシュクロマトグラフィー（CH2Cl2:EtOAc 9:1）にかけてヨードピリドン(8b) 134mg (58％)を白色のフォームとして得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.097 (s, 6 H), 0.92 (br s, 12 H), 1.82-1.89 (br m, 2 H), 3.01 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.33 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.48 (br s, 1 H), 5.07 (s, 2 H), 5.12 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.47 (d, J = 15 Hz, 1 H), 7.10 (s, 1 H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ -4.7, 8.3, 16.6, 26.3, 36.0, 42.6, 45.3, 62.8, 73.5, 89.4, 98.6, 99.5, 119.5, 122.9, 154.1, 160.4, 172.0; HRMS (EI) m/z C20H28INO4Si (M+) としての計算値 501.0832, 実測値 501.0843 LRMS (EI) m/z 501 (M+), 444, 402, 335, 318, 169, 121, 96, 57
【０１００】
(+/-) 5-エチル-1,4,5,13-テトラヒドロ-5-ヒドロキシ-12-トリメチルシリル-3H,15H-オキセピノ〔3',4':6,7〕インドリジノ〔1,2-b〕キノリン-3,15-ジオン(1h)
(7-トリメチルシリルホモカンプトテシン)
Ar雰囲気下のオーブン乾燥加圧管に、ヨードピリドン(10a)（15mg、0.033ミリモル）、続いてベンゼン(0.25ml)及びt-BuOH（0.5ml）を添加した。次にフェニルイソニトリル（13.6mg、0.13ミリモル）及びヘキサメチルジスズ（16.0mg、0.049ミリモル）を添加し、管をArでフラッシュし、シールし、275W GE太陽灯の前に置いた。照射の12時間後に、その混合物を濃縮し、クロマトグラフィー（CH2Cl2:アセトン5:1）にかけてホモカンプトテシン(1h)5.2mg（36％）を黄褐色の固体として得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3/CD3OD) δ 0.64 (s, 9 H), 0.96 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1.96-2.05 (m, J = 7 Hz, 2 H), 3.19 (d, J = 14 Hz, 2 H), 3.46 (d, J = 14 Hz, 1 H), 5.34 (s, 2 H), 5.44 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.63 (d, J = 15 Hz, 1 H), 7.65-7.71 (m, 2 H), 7.78-7.84 (m, 1 H), 8.18 (d, J = 8 Hz, 1 H), 8.27 (d, J = 8 Hz, 1 H); HRMS (EI) m/z C24H26N2O4Si (M+) としての計算値 434.1662, 実測値 434.1679 LRMS (EI) m/z 434 (M+), 419, 388, 374, 363, 347, 335, 320, 303, 289, 275, 261, 247, 231, 219, 174, 149, 73
【０１０１】
(+/-) 5-エチル-1,4,5,13-テトラヒドロ-5-ヒドロキシ-10-(tert-ブチルオキシカルボニルアミノ)-12-トリメチルシリル-3H,15H-オキセピノ〔3',4':6,7〕インドリジノ〔1,2-b〕キノリン-3,15-ジオン(1c) (10-tert-ブチルオキシカルボニルアミノ-7-トリメチルシリルホモカンプトテシン)
上記操作に従って、ヨードピリドン(10a)（30mg、0.065ミリモル）をベンゼン(0.5ml)及びt-BuOH(1ml)中でパラ-bocアミノフェニルイソニトリル（57mg、0.26ミリモル）及びヘキサメチルジスズ（32.2mg、0.1ミリモル）と反応させた。クロマトグラフィー（CH2Cl2:アセトン7:1）にかけて化合物(1c)18.8mg（53％）を褐色の固体として得た。IR (CHCl3, cm-1) 3022, 3007, 1736, 1655, 1594, 1528, 1155, 1062; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 0.70 (s, 9 H), 0.96 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1.61 (s, 9 H), 1.85-2.10 (m, J = 7 Hz, 2 H), 3.31 (d, J = 13 Hz, 1 H), 3.41 (d, J = 13 Hz, 1 H), 5.11 (d, J = 19 Hz, 1 H), 5.34-5.41 (m, 2 H), 5.61 (d, J = 15 Hz, 1 H), 6.96 (s, 1 H), 7.19-7.40 (m, 1 H), 7.62 (s, 1 H), 8.37 (s, 1 H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 1.43, 8.3, 28.4, 35.8, 42.6, 52.4, 62.3, 73.9, 81.2, 100.3, 115.1, 122.2, 123.0, 130.7, 132.6, 134.8, 137.1, 143.4, 143.6, 145.1, 148.2, 152.6, 156.5, 159.8, 171.8; HRMS (EI) m/z C29H35N3O6Si (M+) としての計算値 549.2295, 実測値 549.2274 LRMS (EI) m/z 549 (M+), 493, 475, 449, 433, 415, 404, 389, 378, 350, 304, 260, 195, 182, 73
【０１０２】
(+/-) 5-エチル-1,4,5,13-テトラヒドロ-5-ヒドロキシ-10-アセトキシ-12-トリメチルシリル-3H,15H-オキセピノ〔3',4':6,7〕インドリジノ〔1,2-b〕キノリン-3,15-ジオン (10-アセトキシ-7-トリメチルシリルホモカンプトテシン)
上記操作に従って、ヨードピリドン(10a)（30mg、0.065ミリモル）をベンゼン(0.5ml)及びt-BuOH(1ml)中でパラ-アセトキシフェニルイソニトリル（42mg、0.26ミリモル）及びヘキサメチルジスズ（32.2mg、0.1ミリモル）と反応させた。クロマトグラフィー（CH2Cl2:アセトン5:1）にかけて生成物6.6mg（21％）を黄褐色の固体として得た。IR (CHCl3, cm-1) 3025, 2992, 2953, 1753, 1657, 1600, 1504, 1193; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.67 (s, 9 H), 0.98 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1.99-2.07 (m, 2 H), 2.42 (s, 3 H), 3.26 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.45 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.66 (br s, 1 H), 5.18 (d, J = 19 Hz, 1 H), 5.35 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.39 (d, J = 19 Hz, 1 H), 5.66 (d, J = 15 Hz, 1 H), 7.38 (dd, J1 = 9 Hz, J2 = 2 Hz, 1 H), 7.40 (s, 1 H), 7.88 (d, J = 9 Hz, 1 H), 7.92 (d, J = 2 Hz, 1 H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 1.6, 8.3, 21.5, 35.9, 42.6, 52.2, 62.2, 74.0, 100.5, 118.9, 122.9, 124.7, 131.3, 132.2, 135.0, 144.1, 144.8, 145.0, 148.9, 150.0, 156.0, 159.7, 169.1, 171.5; HRMS (EI) m/z C26H28N2O6Si (M+) としての計算値 492.1717, 実測値 492.1707 LRMS (EI) m/z 492 (M+), 477, 459, 450, 432, 421, 403, 393, 379, 365, 351, 336, 147
【０１０３】
(+/-) 5-エチル-1,4,5,13-テトラヒドロ-5-ヒドロキシ-12-tert-ブチルジメチルシリル-3H,15H-オキセピノ〔3',4':6,7〕インドリジノ〔1,2-b〕キノリン-3,15-ジオン (1g) (7-tert-ブチルジメチルシリルホモカンプトテシン)
上記操作に従って、ヨードピリドン(10b)（25mg、0.05ミリモル）をベンゼン(0.75ml)中でフェニルイソニトリル（15.5mg、0.15ミリモル）及びヘキサメチルジスズ（25mg、0.075ミリモル）と反応させた。クロマトグラフィー（CH2Cl2:アセトン7:1）にかけて化合物(1g)6.4mg（27％）を黄褐色の固体として得た。IR (CHCl3, cm-1) 3027, 2958, 2932, 2859, 1745, 1655, 1600, 1269, 1065; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.69 (s, 3 H), 0.70 (s, 3 H), 0.92 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1.00 (s, 9 H), 1.92-2.02 (m, J = 7 Hz, 2 H), 3.23 (d, J = 13 Hz, 1 H), 3.39 (d, J = 13 Hz, 1 H), 3.90 (br s, 1 H), 5.11 (d, J = 19 Hz, 1 H), 5.31 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.40 (d, J = 19 Hz, 1 H), 5.60 (d, J = 15 Hz, 1 H), 7.35 (s, 1 H), 7.39-7.49 (m, 2 H), 7.70 (d, J = 8 Hz, 1 H), 8.07 (d, J = 8 Hz, 1 H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ-0.5, -0.3, 8.3, 19.4, 27.3, 35.9, 42.7, 52.9, 62.3, 74.0, 100.3, 122.8, 126.9, 129.4, 130.3, 132.7, 136.0, 143.3, 145.3, 147.6, 150.1, 156.1, 159.9, 171.5; HRMS (EI) m/z C27H32N2O4Si (M+) としての計算値 476.2131, 実測値 476.2118 LRMS (EI) m/z 476 (M+), 458, 430, 419, 405, 389, 377, 361, 345, 319, 304, 275, 149, 117, 91, 73, 56
【０１０４】
(+/-) 5-エチル-1,4,5,13-テトラヒドロ-5-ヒドロキシ-10-(tert-ブチルオキシカルボニルアミノ)-12-tert-ブチルジメチルシリル-3H,15H-オキセピノ〔3',4':6,7〕インドリジノ〔1,2-b〕キノリン-3,15-ジオン(1a) (10-tert-ブチルオキシカルボニルアミノ-7-tert-ブチルジメチルシリルホモカンプトテシン)
上記操作に従って、ヨードピリドン(10b)（45mg、0.089ミリモル）をベンゼン(1.3ml)中でパラ-bocアミノフェニルイソニトリル(58mg、0.27ミリモル)及びヘキサメチルジスズ(45mg、0.13ミリモル)と反応させた。クロマトグラフィー（CH2Cl2:アセトン10:1）にかけて化合物(1a)7.8mg（15％）を黄褐色の固体として得た。IR (CHCl3, cm-1) 3435, 3022, 2931, 2859, 1738, 1654, 1563, 1528, 1156; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.76 (s, 3 H), 0.77 (s, 3 H), 0.96 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1.10 (s, 9 H), 1.62 (s, 9 H), 1.91-2.07 (m, J = 7 Hz, 2 H), 3.34 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.41 (d, J = 14 Hz, 1 H), 4.42 (br s, 1 H), 5.09 (d, J = 19 Hz, 1 H), 5.38 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.47 (d, J = 19 Hz, 1 H), 5.62 (d, J = 15 Hz, 1 H), 6.99 (br s, 1 H), 7.21-7.25 (m, 2 H), 7.45 (d, J = 9 Hz, 1 H), 8.37 (d, J = 2 Hz, 1 H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ -0.9, -0.5, 8.3, 19.6, 27.4, 28.4, 35.5, 42.7, 53.0, 62.2, 73.8, 81.1, 100.0, 116.2, 122.2, 123.0, 130.3, 133.5, 136.3, 136.9, 144.4, 145.2, 148.2, 152.6, 156.4, 160.0, 171.5; HRMS (EI) m/z C32H41N3O6Si (M+) としての計算値 591.2765, 実測値 591.2751 LRMS (EI) m/z 534 (M-57), 516, 488, 477, 459, 435, 417, 393, 375, 111, 97, 83, 69, 57
【０１０５】
(+/-) 5-エチル-1,4,5,13-テトラヒドロ-5-ヒドロキシ-10-アセトキシ-12-tert-ブチルジメチルシリル-3H,15H-オキセピノ〔3',4':6,7〕インドリジノ〔1,2-b〕キノリン-3,15-ジオン(1e)
(10-アセトキシ-7-tert-ブチルジメチルシリルホモカンプトテシン)
上記操作に従って、ヨードピリドン(10b)（45mg、0.089ミリモル）をベンゼン(1.3ml)中でパラ-アセトキシフェニルイソニトリル（43mg、0.27ミリモル）及びヘキサメチルジスズ（45mg、0.13ミリモル）と反応させた。クロマトグラフィー（CH2Cl2:アセトン10:1）にかけて化合物(1e)9.6mg（20％）を黄褐色の固体として得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.73 (s, 3 H), 0.74 (s, 3 H), 0.97 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1.07 (s, 9 H), 1.94-2.08 (m, J = 7 Hz, 2 H), 2.42 (s, 3 H), 3.29 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.44 (d, J = 14 Hz, 1 H), 4.05 (br s, 1 H), 5.16 (d, J = 19 Hz, 1 H), 5.37 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.48 (d, J = 19 Hz, 1 H), 5.65 (d, J = 15 Hz, 1 H), 7.31 (dd, J1 = 9 Hz, J2 = 2 Hz, 1 H), 7.36 (s, 1 H), 7.70 (d, J = 9 Hz, 1 H), 7.97 (d, J = 2 Hz, 1 H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ -0.7, -0.5, 8.3, 19.3, 21.5, 27.2, 35.8, 42.7, 52.9, 62.2, 73.9, 100.4, 120.1, 122.8, 124.7, 131.1, 133.0, 136.5, 143.0, 145.0, 145.4, 148.9, 149.9, 156.2, 159.9, 169.0, 171.5; HRMS (EI) m/z C29H34N2O6Si (M+) としての計算値 534.2186, 実測値 534.2188 LRMS (EI) m/z 534 (M+), 516, 488, 477, 459, 435, 417, 393, 375, 335, 320, 291, 275, 234, 164, 137, 125, 111, 97, 83, 69, 57
【０１０６】
(+/-) 5-エチル-1,4,5,13-テトラヒドロ-5-ヒドロキシ-10-ヒドロキシ-12-tert-ブチルジメチルシリル-3H,15H-オキセピノ〔3',4':6,7〕インドリジノ〔1,2-b〕キノリン-3,15-ジオン(1f)
(10-ヒドロキシ-7-tert-ブチルジメチルシリルホモカンプトテシン)
化合物(1e)（11.9mg、0.022ミリモル）をH2O(0.3ml)及びMeOH（0.3ml）に溶解した。次にK2CO3（7.5mg、0.054ミリモル）を添加し、その混合物を22℃で撹拌した。４時間後に、溶媒を蒸発させ、残渣をCH2Cl2(2ml)及びTFA(2ml)に溶解した。22℃で16時間撹拌した後、pH5に達するまで飽和NaHCO3溶液を慎重に添加した。この時点で、その溶液をEtOAc (3x10ml)で抽出し、有機層を乾燥させ（Na2SO4）、濃縮した。残渣を２回クロマトグラフィー（1:CH2Cl2:MeOH:AcOH 94:5:1）(2:CH2Cl2:アセトン5:1)にかけて化合物(1f)8.6mg（79％）を黄色の固体として得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3/CD3OD) δ 0.65 (s, 6 H), 0.90-0.99 (m, 12 H), 1.89-2.05 (m, 2 H), 3.14 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.34 (d, J = 14 Hz, 1 H), 5.23 (s, 2 H), 5.35 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.57 (d, J = 15 Hz, 1 H), 7.42 (dd, J1 = 9 Hz, J2 = 2 Hz, 1 H), 7.58 (d, J = 2 Hz, 1 H), 7.70 (s, 1 H), 8.16 (d, J = 9 Hz, 1 H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3/CD3OD) δ -1.1, 8.1, 19.2, 26.9, 36.1, 42.1, 52.8, 62.1, 73.5, 101.8, 111.5, 122.7, 123.6, 127.5, 129.0, 135.0, 136.6, 139.8, 143.1, 145.5, 156.7, 156.9, 159.6, 172.8; HRMS (EI) m/z C27H32N2O5Si (M+) としての計算値 492.2080, 実測値 492.2087 LRMS (EI) m/z 492 (M+), 474, 446, 435, 421, 393, 375, 346, 335, 315, 291, 273, 259, 231, 183, 155
【０１０７】
(+/-) 5-エチル-1,4,5,13-テトラヒドロ-5-ヒドロキシ-10-アミノ-12-tert-ブチルジメチルシリル-3H,15H-オキセピノ〔3',4':6,7〕インドリジノ〔1,2-b〕キノリン-3,15-ジオン(1b) (10-アミノ-7-tert-ブチルジメチルシリルホモカンプトテシン)
トリフルオロ酢酸(0.1ml)をCH2Cl2（0.5ml）及び化合物(1a)（8.1mg、0.014ミリモル）を含む溶液に添加し、内容物を22℃で撹拌した。５時間後に、その混合物を飽和NaHCO3溶液（2ml）に注ぎ、EtOAc (6x2ml)で抽出した。EtOAcを乾燥させ（Na2SO4）、濃縮し、クロマトグラフィー（CH2Cl2:MeOH 96:4）にかけて(1b)6mg（89％）を黄色の固体として得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3/CD3OD) δ 0.28 (s, 6 H), 0.78-0.88 (m, 12 H), 1.78-1.90 (m, 2 H), 3.04 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.24 (d, J = 14 Hz, 1 H), 5.02-5.11 (m, 2 H), 5.24 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.46 (d, J = 15 Hz, 1 H), 7.20 (s, 1 H), 7.26 (dd, J1 = 9 Hz, J2 = 2 Hz, 1 H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3/CD3OD) δ -1.0, 8.0, 19.1, 26.9, 36.1, 42.1, 52.7, 62.1, 73.4, 100.7, 122.0, 123.2, 130.5, 134.3, 136.8, 141.8, 144.2, 147.1, 156.7, 159.7, 172.8; HRMS (EI) m/z C27H33N3O4Si (M+) としての計算値 491.2240, 実測値 491.2242 LRMS (EI) m/z 491 (M+), 434, 392, 376, 319, 279, 262, 223, 178, 167, 149, 136, 121, 107, 91, 77, 57
【０１０８】
(+/-) 5-エチル-1,4,5,13-テトラヒドロ-5-ヒドロキシ-10-アミノ-12-トリメチルシリル-3H,15H-オキセピノ〔3',4':6,7〕インドリジノ〔1,2-b〕キノリン-3,15-ジオン(1d) 10-アミノ-7-トリメチルシリルホモカンプトテシン）
トリフルオロ酢酸(0.1ml)をCH2Cl2（0.5ml）及び化合物(1c)（6.6mg、0.012ミリモル）を含む溶液に添加し、内容物を22℃で撹拌した。５時間後に、混合物を飽和NaHCO3溶液(2ml)に注ぎ、EtOAc (6x2ml)で抽出した。EtOAcを乾燥させ（Na2SO4）、濃縮し、クロマトグラフィー（CH2Cl2:MeOH 95:5）にかけて(1d)2.5mg（45％）をオレンジ赤色の固体として得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3/CD3OD) δ 0.60 (s, 9 H), 0.94 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1.92-2.05 (m, 2 H), 3.16 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.46 (d, J = 14 Hz, 1 H), 5.24 (s, 2 H), 5.40 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.61 (d, J = 15 Hz, 1 H), 7.25-7.32 (m, 2 H), 7.52 (s, 1 H), 7.89 (d, J = 9 Hz, 1 H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3/CD3OD) δ -0.12, 7.1, 35.7, 41.5, 51.6, 61.3, 72.8, 99.3, 107.0, 120.4, 121.7, 129.9, 133.6, 134.4, 139.5, 141.0, 144.7, 145.2, 146.4, 156.2, 159.3, 172.6; HRMS (EI) m/z C24H27N3O4Si (M+) としての計算値 449.1771, 実測値 449.1791 LRMS (EI) m/z 449 (M+), 434, 402, 389, 374, 350, 335, 304, 178, 73
【０１０９】
(+/-) 5-エチル-1,4,5-トリヒドロ-5-ヒドロキシ-7-ヨード-8-(5-トリメチルシリル-2-ペンチニル)オキセピノ〔3,4-c〕ピリジン-3,9-ジオン(10c)
先に概説した操作に従って、ヨードピリドン(9)（0.106g、0.92ミリモル）を2-トリメチルシリルエチルプロパルギルブロミド（0.43g、1.84ミリモル）でN-アルキル化した。フラッシュクロマトグラフィー（CH2Cl2:EtOAc 10:1）にかけてヨードピリドン(10c)68mg（46％）を明黄色のフォームとして得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ -0.069 (s, 9 H), 0.72 (t, J = 8 Hz, 2 H), 0.87 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1.70-1.88 (m, 2 H), 2.10-2.20 (m, 2 H), 2.96 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.15 (br s, 1 H), 3.27 (d, J = 14 Hz, 1 H), 4.90-5.00 (m, 2 H), 5.07 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.41 (d, J = 15 Hz, 1 H), 7.02 (s, 1 H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ -1.6, 8.2, 13.5, 15.7, 35.9, 42.5, 45.3, 62.7, 72.5, 73.4, 88.0, 99.7, 119.2, 122.8, 153.9, 160.4, 171.8; HRMS (EI) m/z C19H26INO4Si (M+) としての計算値 487.0676, 実測値 487.0676 LRMS (EI) m/z 487 (M+), 472, 400, 374, 346, 96, 73
【０１１０】
(+/-) 5-エチル-1,4,5,13-テトラヒドロ-5-ヒドロキシ-12-(2-トリメチルシリルエチル)-3H,15H-オキセピノ〔3',4':6,7〕インドリジノ〔1,2-b〕キノリン-3,15-ジオン(1i) (7-(2-トリメチルシリルエチル)ホモカンプトテシン)
Ar雰囲気下のオーブン乾燥加圧管に、ヨードピリドン(10c)（16mg、0.033ミリモル）、続いてベンゼン(0.5ml)を添加した。次にフェニルイソニトリル（10.2mg、0.1ミリモル）及びヘキサメチルジスズ（16.7mg、0.051ミリモル）を添加し、管をArでフラッシュし、シールし、275W GE太陽灯の前に置いた。照射の12時間後に、その混合物を濃縮し、クロマトグラフィー（CH2Cl2:アセトン4:1）にかけて所望のホモカンプトテシン(1i)3.6mg（24％）を黄褐色の固体として得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.184 (s, 9 H), 0.85-1.05 (m, 5 H), 1.98-2.10 (m, 2 H), 3.00-3.12 (m, 2 H), 3.18 (d, J = 14 Hz, 2 H), 3.48 (d, J = 13 Hz, 1 H), 5.14 (d, J = 19 Hz, 1 H), 5.24 (d, J = 19 Hz, 1 H), 5.34 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.71 (d, J = 15 Hz, 1 H), 7.53 (s, 1 H), 7.57-7.63 (m, 1 H), 7.70-7.77 (m, 1 H), 7.94 (d, J = 8 Hz, 1 H), 8.10 (d, J = 8 Hz, 1 H); HRMS (EI) m/z C26H30N2O4Si (M+) としての計算値 462.1975, 実測値 462.1976 LRMS (EI) m/z 462 (M+), 447, 415, 402, 391, 377, 363, 348, 317, 289, 243, 231, 73, 59
【０１１１】
(+/-) 5-エチル-1,4,5,13-テトラヒドロ-5-ヒドロキシ-10-(tert-ブチルオキシカルボニルアミノ)-12-(2-トリメチルシリルエチル)-3H,15H-オキセピノ〔3',4':6,7〕インドリジノ〔1,2-b〕キノリン-3,15-ジオン(1j)
(10-tert-ブチルオキシカルボニルアミノ-7-(2-トリメチルシリルエチル)ホモカンプトテシン)
上記操作に従って、ヨードピリドン(10c)（16mg、0.033ミリモル）をベンゼン(0.5ml)中でパラ-Bocアミノフェニルイソニトリル（21.6mg、0.1ミリモル）及びヘキサメチルジスズ（16.7mg、0.051ミリモル）と反応させた。クロマトグラフィー（CH2Cl2:アセトン7:1）にかけて化合物(1j)10.7mg（56％）を褐色の固体として得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.20 (s, 9 H), 0.83-0.93 (m, 2 H), 0.99 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1.60 (s, 9 H), 1.93-2.10 (m, 2 H), 2.90-3.05 (m, 2 H), 3.24 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.44 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.74 (br s, 1 H), 5.03 (d, J = 19 Hz, 1 H), 5.20 (d, J = 19 Hz, 1 H), 5.33 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.67 (d, J = 15 Hz, 1 H), 6.85 (s, 1 H), 7.35-7.44 (m, 2 H), 7.85 (d, J = 9 Hz, 1 H), 8.11 (br s, 1 H); HRMS (EI) m/z C31H39N3O6Si (M+) としての計算値 577.2608, 実測値 577.2611 LRMS (EI) m/z 577 (M+), 521, 477, 462, 434, 417, 378, 304, 260, 178, 108, 73
【０１１２】
(+/-) 5-エチル-1,4,5,13-テトラヒドロ-5-ヒドロキシ-10-アセトキシ-12-(2-トリメチルシリルエチル)-3H,15H-オキセピノ〔3',4':6,7〕インドリジノ〔1,2-b〕キノリン-3,15-ジオン(1k)
(10-アセトキシ-7-(2-トリメチルシリルエチル)ホモカンプトテシン)
上記操作に従って、ヨードピリドン(10c)（16mg、0.033ミリモル）をベンゼン(0.5ml)中でパラ-アセトキシフェニルイソニトリル（16mg、0.1ミリモル）及びヘキサメチルジスズ（16.7mg、0.051ミリモル）と反応させた。クロマトグラフィー（CH2Cl2:アセトン5:1）にかけて化合物(1k)7.1mg（41％）を黄褐色の固体として得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.19 (s, 9 H), 0.82-0.89 (m, 2 H), 0.99 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1.95-2.06 (m, 2 H), 2.42 (s, 3 H), 2.94-2.98 (m, 2 H), 3.23 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.46 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.59 (br s, 1 H), 5.08 (d, J = 19 Hz, 1 H), 5.24 (d, J = 19 Hz, 1 H), 5.35 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.68 (d, J = 15 Hz, 1 H), 7.41-7.49 (m, 2 H), 7.60 (d, J = 2 Hz, 1 H), 7.96 (d, J = 9 Hz, 1 H); HRMS (EI) m/z C28H32N2O6Si (M+) としての計算値 520.2030, 実測値 520.2017 LMRS (EI) m/z 520 (M+), 491, 478, 463, 449, 431, 421, 406, 393, 379, 333, 305, 261, 178, 109, 73
【０１１３】
(+/-) 5-エチル-1,4,5,13-テトラヒドロ-5-ヒドロキシ-10-ヒドロキシ-12-(2-トリメチルシリルエチル)-3H,15H-オキセピノ〔3',4':6,7〕インドリジノ〔1,2-b〕キノリン-3,15-ジオン(1l) (10-ヒドロキシ-7-(2-トリメチルシリルエチル)ホモカンプトテシン)
先に概説した操作に従って、化合物(1k)（7.1mg、0.014ミリモル）をMeOH/H2O溶液中でK2CO3（4mg、0.028ミリモル）と反応させた。残渣をクロマトグラフィー（CH2Cl2:アセトン7:1）にかけて化合物(1l)2.6mg（39％）を黄色の固体として得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3/CD3OD) δ 0.042 (s, 9 H), 0.68-0.92 (m, 5 H), 1.80-1.95 (m, 2 H), 2.83-2.95 (m, 2 H), 3.07 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.28 (d, J = 14 Hz, 1 H), 5.05 (s, 2 H), 5.29 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.51 (d, J = 15 Hz, 1 H), 7.22 (d, J = 2 Hz, 1 H), 7.26-7.34 (m, 1 H), 7.40 (s, 1 H), 7.89 (d, J = 9 Hz, 1 H); HRMS (IE) m/z C26H30N2O5Si (M+) としての計算値 478.1924, 実測値 478.1915 LRMS (EI) m/z 478 (M+), 463, 431, 418, 393, 379, 364, 305, 261, 153, 117, 105, 91, 73, 59
【０１１４】
(+/-) 5-エチル-1,4,5,13-テトラヒドロ-5-ヒドロキシ-10-アミノ-12-(2-トリメチルシリルエチル)-3H,15H-オキセピノ〔3',4':6,7〕インドリジノ〔1,2-b〕キノリン-3,15-ジオン(1m) (10-アミノ-7-(2-トリメチルシリルエチル)ホモカンプトテシン)
トリフルオロ酢酸(0.1ml)をCH2Cl2(0.5ml)及び化合物(1i)（10.7mg、0.018ミリモル）を含む溶液に添加し、内容物を22℃で撹拌した。５時間後に、その混合物を飽和NaHCO3溶液(2ml)に注ぎ、EtOAc (6x2ml)で抽出した。EtOAcを乾燥させ（Na2SO4）、濃縮し、クロマトグラフィー（CH2Cl2:MeOH 96:4）にかけて(1m)6.7mg（78％）を黄色の固体として得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3/CD3OD) δ 0.059 (s, 9 H), 0.70-0.92 (m, 5 H), 1.82-1.98 (m, 2 H), 2.80-2.92 (m, 2 H), 3.08 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.29 (d, J = 14 Hz, 1 H), 5.00 (s, 2 H), 5.29 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5.52 (d, J = 15 Hz, 1 H), 6.95 (d, J = 2 Hz, 1 H), 7.18 (dd, J1 = 9 Hz, J2 = 2 Hz, 1 H), 7.38 (s, 1 H), 7.83 (d, J = 9 Hz, 1 H)
【０１１５】
本発明が上記実施例に関して詳しく記載されたが、このような詳細はその目的のためのみであり、種々の変化が特許請求の範囲により限定される以外は本発明の精神から逸脱しないで当業者によりなし得ることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 カスケードラジカル反応用の前駆体の合成を示す。
【図２ａ】 新規なＡＢ−環修正ホモカンプトセシン／ホモシラテカン誘導体の合成を示す。
【図２ｂ】 新規なＡＢ−環修正ホモカンプトセシン／ホモシラテカン誘導体の合成を示す。
【図３】 脂質二重層の存在下及び不在下におけるホモシラテカン（１μMの7-トリメチルシリル-10-アミノホモカンプトセシン（DB-38））の典型的な蛍光発光スペクトルを示す。
【図４】 PBS中の電気的に中性のジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)で構成されたSUVsに対する４つの新規なホモシラテカンの平衡結合性の、同様にカンプトセシン（CPT）及びトポテカン（TPT）について得られたデータとの比較を示す。
【図５】 水の存在についての１μMの7-t-ブチルジメチルシリル-10-ヒドロキシホモカンプトセシン（DB-91））の蛍光発光スペクトルの顕著な依存性を示す。
【図６】 ｐＨ7.4のリン酸緩衝食塩水（PBS）溶液中及び（10±１）×106細胞／μLの濃度でアルブミンフリー赤血球を含有するｐＨ7.4のPBS中における１μMの7-t-ブチルジメチルシリル-10-ヒドロキシホモカンプトセシン（DB-91）の蛍光発光スペクトルを示す。
【図７】 ｐＨ7.4のリン酸緩衝食塩水（PBS）溶液中及び（10±１）×106細胞／μLの濃度でアルブミンフリー赤血球を含有するｐＨ7.4のPBS中における先行技術の化合物7-エチル-10-ヒドロキシカンプトセシン（SN-38）の蛍光発光スペクトルを示す。
【図８】 HPLC法を用いて決定されたｐＨ値5.0、7.4、8.0、及び9.0のリン酸緩衝食塩水（PBS）溶液中における１μMの7-トリメチルシリル-10-アミノホモカンプトセシン（DB38）の安定性のｐＨ依存性を示す。
【図９】 HPLC法を用いて決定されたｐＨ値5.0、7.4、8.0、及び9.0のリン酸緩衝食塩水（PBS）溶液中における１μMの7-t-ブチルジメチルシリルホモカンプトセシン（DB81）の安定性のｐＨ依存性を示す。
【図１０】 HPLC法を用いて決定されたｐＨ値5.0、7.4、8.0、及び9.0のリン酸緩衝食塩水（PBS）溶液中における１μMの7-t-ブチルジメチルシリル-10-アミノホモカンプトセシン（DB90）の安定性のｐＨ依存性を示す。
【図１１】 HPLC法を用いて決定されたｐＨ値5.0、7.4、8.0、及び9.0のリン酸緩衝食塩水（PBS）溶液中における１μMの7-t-ブチルジメチルシリル-10-ヒドロキシホモカンプトセシン（DB91）の安定性のｐＨ依存性を示す。
【図１２】 HPLC法を用いて決定されたPBS溶液中における本発明の４種の新規なホモシラテカンの改良された安定性を示す。
【図１３】 HPLC法を用いて決定されたPBS／HSA溶液中における本発明の４種の新規なホモシラテカンの改良された安定性を示す。
【図１４】 HPLC法を用いて決定された本発明の４種の新規なホモシラテカンのヒト血漿安定性を示す。
【図１５】 生理的に適切な濃度[(５±１)×106細胞／μL]のアルブミンフリー赤血球を含有するPBS懸濁液中における本発明の４種の新規なホモシラテカンの安定性を示す。
【図１６】 HPLC法を用いて決定された本発明の４種の新規なホモシラテカンの改良されたヒト血液安定性を示す。
【図１７】 9-アミノカンプトセシン（9AC）、カンプトセシン（CPT）、トポテカン（TPT）及びSN-38を含む先行技術の臨床関連の薬剤と比較した本発明の４種の新規なホモシラテカンの改良されたヒト血液安定性を示す。
Claims (61)
- 下記式を有するラセミ形態、エナンチオマー富化形態又はエナンチオマー純粋形態の化合物、又はその製薬的に許容性の塩。
Ｒ3は、Ｈ、ハロゲン原子、ニトロ基、アミノ基、ヒドロキシ基、若しくはシアノ基であるか又はＲ2及びＲ3が一緒になって、ＣＨ、ＣＨ2、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、若しくはＮＲ15の群から選択される３若しくは４員の鎖を形成し；
Ｒ4は、Ｈ、Ｆ、アミノ基、Ｃ1-3アルキル基、Ｃ2-3アルケニル基、Ｃ2-3アルキニル基、トリアルキルシリル基又はＣ1-3アルコキシ基であり；
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４の少なくとも１つは、Ｈ又はハロゲン原子ではなく、
Ｒ5は、Ｃ1-10アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、又はベンジル基であり；
Ｒ6は、−Ｓｉ(Ｒ8Ｒ9Ｒ10)又は−(Ｒ7)Ｓｉ(Ｒ8Ｒ9Ｒ10)（式中Ｒ7がアルキレン基、アルケニレン基、又はアルキニレン基）であり；Ｒ8、Ｒ9及びＲ10は、独立に、Ｃ1-10アルキル基、Ｃ2-10アルケニル基、Ｃ2-10アルキニル基、アリール基又は−(ＣＨ2)ｔＲ11基（式中ｔが１〜10の範囲の整数であり、Ｒ11がヒドロキシ基、アルコキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、ハロゲン原子、シアノ基、−ＳＲC若しくはニトロ基）であり；
Ｒ13は、Ｈ、Ｆ、又は−ＣＨ3であり；
Ｒ16は、−Ｃ(Ｏ)Ｒf又はＨである。 - Ｒ16がＨである請求項１に記載の化合物。
- Ｒ2とＲ3が一緒になって、式−Ｏ(ＣＨ2)nＯ−（式中ｎが整数１又は２を表す）を形成する請求項２に記載の化合物。
- Ｒ5が、エチル基、アリル基、ベンジル基又はプロパギル基である請求項２に記載の化合物。
- Ｒ13がＨである請求項２に記載の化合物。
- Ｒ5がエチル基である請求項５に記載の化合物。
- Ｒ4がＨである請求項６に記載の化合物。
- Ｒ8及びＲ9がメチル基であり、Ｒ10がtert-ブチル基又はメチル基であり、Ｒ1がＨであり、かつＲ3がＨである請求項７に記載の化合物。
- Ｒ2 がＮＨ2又はＯＨである請求項８に記載の化合物。
- 下記式、
（式中、Ｘは、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩであり；
Ｒ1及びＲ2は独立に同一又は異なり、かつ水素、−Ｃ(Ｏ)Ｒf（式中Ｒfがアルキル基、アルコキシ基、アミノ基若しくはヒドロキシ基である）、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アシルオキシ基、−ＯＣ(Ｏ)ＯＲd（式中Ｒdがアルキル基である）、−ＯＣ(Ｏ)ＮＲaＲb（式中Ｒa及びＲbは独立に同一又は異なり、Ｈ、−Ｃ(Ｏ)Ｒf、アルキル基若しくはアリール基である）、ハロゲン、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、アジド基、ホルミル基、ヒドラジノ基、アミノ基、−ＳＲc（式中Ｒcが水素、−Ｃ(Ｏ)Ｒf、アルキル基若しくはアリール基である）であるか又はＲ1及びＲ2が一緒になって、ＣＨ、ＣＨ2、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、若しくはＮＲ15（式中Ｒ15がＣ1-Ｃ6アルキル基である）の群から選択される３若しくは４員の鎖を形成し；
Ｒ3は、Ｈ、ハロゲン原子、ニトロ基、アミノ基、ヒドロキシ基、若しくはシアノ基であるか、又はＲ2及びＲ3が一緒になって、ＣＨ、ＣＨ2、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、若しくはＮＲ15の群から選択される３若しくは４員の鎖を形成し；
Ｒ4は、Ｈ、Ｆ、アミノ基、Ｃ1-3アルキル基、Ｃ2-3アルケニル基、Ｃ2-3アルキニル基、トリアルキルシリル基又はＣ1-3アルコキシ基であり；
Ｒ5は、Ｃ1-10アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、又はベンジル基であり；
Ｒ13は、Ｈ、Ｆ、又は−ＣＨ3であり；かつＲ6は、Ｈ、アルキル基、−Ｓｉ(Ｒ8Ｒ9Ｒ10)又は−(Ｒ7)Ｓｉ(Ｒ8Ｒ9Ｒ10)（式中Ｒ7がアルキレン基、アルケニレン基、又はアルキニレン基である）であり；
かつＲ8、Ｒ9及びＲ10は、独立に、Ｃ1-10アルキル基、Ｃ2-10アルケニル基、Ｃ2-10アルキニル基、アリール基又は−(ＣＨ2)ｔＲ11基（式中ｔが１〜10の範囲の整数であり、Ｒ11がヒドロキシ基、アルコキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、ハロゲン原子、シアノ基、−ＳＲC若しくはニトロ基である）である。） - Ｒ2とＲ3が一緒になって、式−Ｏ(ＣＨ2)nＯ−（式中ｎが整数１又は２を表す）を形成する請求項１０に記載の方法。
- Ｒ5が、エチル基、アリル基、ベンジル基又はプロパギル基である請求項１０に記載の方法。
- ＸがＢｒ又はＩである請求項１０に記載の方法。
- Ｒ13がＨである請求項１３に記載の方法。
- Ｒ5がエチル基である請求項１４に記載の方法。
- Ｒ4がＨである請求項１５に記載の方法。
- Ｒ8及びＲ9がメチル基であり、Ｒ10がtert-ブチル基又はメチル基であり、Ｒ1がＨであり、かつＲ3がＨである請求項１６に記載の方法。
- Ｒ2がＨ、ＮＨ2又はＯＨである請求項１７に記載の方法。
- 下記式を有するラセミ形態、エナンチオマー富化形態又はエナンチオマー純粋形態の化合物又は、その製薬的に許容性の塩。
Ｒ3は、Ｈ、ハロゲン原子、ニトロ基、アミノ基、ヒドロキシ基、若しくはシアノ基であるか、又はＲ2及びＲ3が一緒になって、ＣＨ、ＣＨ2、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、若しくはＮＲ15（式中Ｒ15がＣ1-Ｃ6アルキル基である）の群から選択される３若しくは４員の鎖を形成し；
Ｒ4は、Ｈ、Ｆ、アミノ基、Ｃ1-3アルキル基、Ｃ2-3アルケニル基、Ｃ2-3アルキニル基、トリアルキルシリル基又はＣ1-3アルコキシ基であり；
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４の少なくとも１つは、Ｈ又はハロゲン原子ではなく、
Ｒ5は、Ｃ1-10アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、又はベンジル基であり；
Ｒ6は、−Ｓｉ(Ｒ8Ｒ9Ｒ10)又は−(Ｒ7)Ｓｉ(Ｒ8Ｒ9Ｒ10)（式中Ｒ7がアルキレン基、アルケニレン基、又はアルキニレン基）であり；かつＲ8、Ｒ9及びＲ10は、独立に、Ｃ1-10アルキル基、Ｃ2-10アルケニル基、Ｃ2-10アルキニル基、アリール基又は−(ＣＨ2)ｔＲ11基（式中ｔが１〜10の範囲の整数であり、かつＲ11がヒドロキシ基、アルコキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、ハロゲン原子、シアノ基、−ＳＲC若しくはニトロ基）、であり；
Ｒ12は、Ｈ又は−Ｃ(Ｏ)Ｒf、−Ｃ(Ｏ)ＯＲd、−Ｃ(Ｏ)ＮＲaＲbであり；
Ｒ13は、Ｈ、Ｆ、又は−ＣＨ3である。） - Ｒ2とＲ3が一緒に、式−Ｏ(ＣＨ2)nＯ−（式中ｎが整数１又は２を表す）を形成する請求項１９に記載の化合物。
- Ｒ5が、エチル基、アリル基、ベンジル基又はプロパギル基である請求項１９に記載の化合物。
- Ｒ13がＨである請求項１９に記載の化合物。
- Ｒ5がエチル基である請求項２２に記載の化合物。
- Ｒ4がＨである請求項２３に記載の化合物。
- Ｒ8及びＲ9がメチル基であり、Ｒ10がtert-ブチル基又はメチル基であり、Ｒ1がＨであり、かつＲ3がＨである請求項２４に記載の化合物。
- Ｒ2 がＮＨ2又はＯＨである請求項２５に記載の化合物。
- 下記式を有するラセミ形態、エナンチオマー富化形態又はエナンチオマー純粋形態の化合物。
Ｒ5は、Ｃ1-10アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、又はベンジル基であり；
Ｒ6は、アルキル基、−Ｓｉ(Ｒ8Ｒ9Ｒ10)又は−(Ｒ7)Ｓｉ(Ｒ8Ｒ9Ｒ10)（式中Ｒ7がアルキレン基、アルケニレン基、又はアルキニレン基）であり；かつＲ8、Ｒ9及びＲ10は、独立に、Ｃ1-10アルキル基、Ｃ2-10アルケニル基、Ｃ2-10アルキニル基、アリール基又は−(ＣＨ2)ｔＲ11基（式中ｔが１〜10の範囲の整数であり、かつＲ11がヒドロキシ基、アルコキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、ハロゲン原子、シアノ基、−ＳＲC（ただし、Ｒｃは、水素原子、−Ｃ（Ｏ）Ｒｆ （ただし、Ｒ ｆ は、アルキル基、アルコキシ基又はヒドロキシ基である）、アルキル基又はアリール基である）、若しくはニトロ基）であり；かつＲ13は、Ｈ、Ｆ、又は−ＣＨ3である。） - Ｒ5が、エチル基、アリル基、ベンジル基又はプロパギル基である請求項２７に記載の化合物。
- ＸがＢｒ又はＩである請求項２７に記載の化合物。
- Ｒ13がＨである請求項２７に記載の化合物。
- Ｒ5がエチル基である請求項３０に記載の化合物。
- 下記式を有するラセミ形態、エナンチオマー富化形態又はエナンチオマー純粋形態の化合物。
- Ｒ5が、エチル基、アリル基、ベンジル基又はプロパギル基である請求項３２に記載の化合物。
- ＸがＢｒ又はＩである請求項３３に記載の化合物。
- Ｒ13がＨである請求項３２に記載の化合物。
- Ｒ5がエチル基である請求項３５に記載の化合物。
- 下記式を有する化合物。
Ｒ12は、Ｈ又は−Ｃ(Ｏ)Ｒf、−Ｃ(Ｏ)ＯＲd又は−Ｃ(Ｏ)ＮＲaＲbであり、ここで、Ｒｆは、アルキル基、アルコキシ基、アミノ基又はヒドロキシ基であり、Ｒｄは、アルキル基であり、Ｒａ及びＲｂは、独立に、同一又は異なり、Ｈ、−Ｃ(Ｏ)Ｒf、アルキル基又はアリール基である。 - Ｒ5が、エチル基、アリル基、ベンジル基又はプロパギル基である請求項３７に記載の化合物。
- Ｒ5がエチル基である請求項３８に記載の化合物。
- 下記式を有する化合物。
Ｒ13は、Ｈ、Ｆ、又は−ＣＨ3であり；かつＲ15は、Ｃ1−Ｃ6アルキル基である。） - Ｒ5が、エチル基、アリル基、ベンジル基又はプロパギル基である請求項４０に記載の化合物。
- Ｒ13がＨである請求項４１に記載の化合物。
- Ｒ5がエチル基である請求項４２に記載の化合物。
- 下記式を有するラセミ形態、エナンチオマー富化形態又はエナンチオマー純粋形態の化合物。
Ｒ13は、Ｈ、Ｆ、又は−ＣＨ3であり；かつＲ14は、ＳｉＭｅ3、Ｉ、又はＢｒである。） - 下記式を有する化合物の合成方法であって；
Ｒ5は、Ｃ1-10アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、又はベンジル基であり；
Ｒ6は、アルキル基、−Ｓｉ(Ｒ8Ｒ9Ｒ10)又は−(Ｒ7)Ｓｉ(Ｒ8Ｒ9Ｒ10)（式中Ｒ7がアルキレン基、アルケニレン基、又はアルキニレン基）であり；かつＲ8、Ｒ9及びＲ10は、独立に、Ｃ1-10アルキル基、Ｃ2-10アルケニル基、Ｃ2-10アルキニル基、アリール基又は−(ＣＨ2)ｔＲ11基（式中ｔが１〜10の範囲の整数であり、かつＲ11がヒドロキシ基、アルコキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、ハロゲン原子、シアノ基、−ＳＲC（ただし、Ｒｃは、水素原子、−Ｃ（Ｏ）Ｒｆ （ただし、Ｒ ｆ は、アルキル基、アルコキシ基又はヒドロキシ基である）、アルキル基又はアリール基である）、若しくはニトロ基）であり；かつＲ13は、Ｈ、Ｆ、又は−ＣＨ3であり、以下の工程を包含する方法。
（ａ）適切な酸化的開裂条件下、下記構造、
（ｂ）工程（ａ）で生成された化合物を、適切な条件下、下記構造、
ＭＣ(Ｒ13)(Ｒ13)ＣＯ2Ｒ15
（式中、ＭがＬｉ、Ｎａ、Ｋ、ＭｇＹ、又はＺｎＹであり、Ｒ15は、Ｃ1−Ｃ6アルキル基である）を有する有機金属試薬で処理して、下記構造、
（ｃ）工程（ｂ）で生成された化合物を、適切な条件下、酸で処理し、下記構造、
（ｄ）工程（ｃ）で生成された化合物を、ハロゲンによる脱シリルの適切な条件下で処理して、下記構造、
（ｅ）工程（ｄ）で生成された化合物を、脱メチルのための適切な条件下、酸又はヨードトリメチルシランで処理して、下記構造、
（ｆ）工程（ｅ）の化合物を、無機リチウム塩の存在下、リチウム塩基又はナトリウム塩基で処理し、窒素原子を脱プロトンする工程、
（ｇ）工程（ｆ）の結果脱プロトンされた種を、下記構造、
- Ｒ5が、エチル基、アリル基、ベンジル基又はプロパギル基である請求項４５に記載の方法。
- Ｒ13がＨである請求項４６に記載の方法。
- Ｒ5がエチル基である請求項４７に記載の方法。
- 請求項１に記載の化合物又はその医薬的に許容性の塩を含有する、癌又は白血病の治療のための医薬組成物。
- 脳癌、乳癌又は白血病の治療のための、請求項４９に記載の医薬組成物。
- 請求項１又は１９に記載の化合物又はその製薬的に許容性の塩を含有する、癌又は白血病の治療のための医薬組成物。
- 脳癌、乳癌又は白血病の治療のための、請求項５１に記載の医薬組成物。
- 下記式を有するラセミ形態、エナンチオマー富化形態又はエナンチオマー純粋形態の化合物。
Ｒ5は、Ｃ1-10アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、又はベンジル基であり；
Ｒ6は、アルキル基、−Ｓｉ(Ｒ8Ｒ9Ｒ10)又は−(Ｒ7)Ｓｉ(Ｒ8Ｒ9Ｒ10)（式中Ｒ7がアルキレン基、アルケニレン基、又はアルキニレン基）であり；かつＲ8、Ｒ9及びＲ10は、独立に、Ｃ1-10アルキル基、Ｃ2-10アルケニル基、Ｃ2-10アルキニル基、アリール基又は−(ＣＨ2)ｔＲ11基（式中ｔが１〜10の範囲の整数であり、かつＲ11がヒドロキシ基、アルコキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、ハロゲン原子、シアノ基、−ＳＲC（ただし、Ｒｃは、水素原子、−Ｃ（Ｏ）Ｒｆ （ただし、Ｒ ｆ は、アルキル基、アルコキシ基又はヒドロキシ基である）、アルキル基又はアリール基である）、若しくはニトロ基）であり；かつＲ13は、Ｈ、Ｆ、又は−ＣＨ3である。） - Ｒ5が、エチル基、アリル基、ベンジル基又はプロパギル基である請求項５３に記載の化合物。
- ＸがＢｒ又はＩである請求項５４に記載の化合物。
- Ｒ13がＨである請求項５５に記載の化合物。
- Ｒ5がエチル基である請求項５６に記載の化合物。
- 癌又は白血病の治療のための医薬の製造における、請求項１に記載の化合物又はその医薬的に許容性の塩の使用。
- 前記医薬が、脳癌、乳癌又は白血病の治療のためである、請求項５８に記載の使用。
- 癌又は白血病の治療のための医薬の製造における、請求項１９に記載の化合物又はその製薬的に許容性の塩の使用。
- 前記医薬が、脳癌、乳癌又は白血病の治療のためである、請求項６０に記載の使用。
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