KR100686552B1 - 에난티오머 혼합물을 분할하기 위한 비균질 시스템 - Google Patents

에난티오머 혼합물을 분할하기 위한 비균질 시스템 Download PDF

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Abstract

본 발명은 2상(biphasic) 용매 시스템을 사용하여 소수성 에스테르의 에난티오머 혼합물을 생체촉매-개재된 에난티오선택적 방식으로 전환시키는 방법에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 비균질 반응 시스템에서 2-하이드록시메틸-5-(5-플루오로사이토신-1-일)-1,3-옥사티올란(FTC) 및 그의 유사체와 같은 항바이러스 화합물을 효소-개재된 에난티오선택적 방식으로 합성하는 방법에 관한 것이다.

Description

에난티오머 혼합물을 분할하기 위한 비균질 시스템{Non-homogeneous systems for the resolution of enantiomeric mixtures}
본 발명은 2상(biphasic) 용매 시스템을 사용하여 소수성 에스테르의 에난티오머 혼합물을 생체촉매-개재된 에난티오선택적 방식으로 전환시키는 방법에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 비균질 반응 시스템에서 2-하이드록시메틸-5-(5-플루오로사이토신-1-일)-1,3-옥사티올란(FTC) 및 그의 유사체와 같은 항바이러스 화합물을 효소-개재된 에난티오선택적 방식으로 합성하는 방법에 관한 것이다.
소수성 에스테르의 에난티오머 혼합물을 효소적으로 분할하기 위해 상업화할 수 있는 방법은 상당한 장애가 따른다. 예를 들어, 효소적 전환방법을 유기용매의 존재하에서 이용하는 경우, 효소 불활성화 속도는 수성용매중에서 수행된 동일한 방법에 비해 매우 높다. 난처한 문제는 촉매에 덜 파괴적인 용매가 종종 보다 더 소수성인 기질을 덜 가용화시킬 수 있다는 것이다. 이상적으로, 상기 방법을 비-혼화성 유기용매와 같은 좀 더 소수성인 용매중에서 수행하는 경우 많은 방법들이 더욱 더 효율적으로 될 수 있다. 본 발명의 한가지 목적은 생성물로 전환되는 소수성 기질의 농도를 높임과 동시에 촉매를 덜 소비하는 비균질 시스템을 제공하 는 것이다.
상기 언급된 장애는 에난티오머 약제인 항바이러스 약제의 제조비용을 감소시키기 위하여 극복되어야 한다. 이러한 약제는 신종 바이러스성 질환을 정복하기 위한 노력을 성공으로 이끄는데 있어 중요하다. 예를 들어, 오늘날에도, HIV 감염 비율은 전세계적으로 하루에 16,000 명의 새로운 감염자꼴로 경이적인 속도로 계속되고 있다[참조: Balter, M. Science 280, 1863-1864 (1998)]. 사하라사막 이남 아프리카 지역, 예를 들어 보츠와나 및 짐바브웨에서는 인구의 적어도 25%가 감염되어 있다. 그러나, 항바이러스 약제의 가격은 현재 이러한 HIV 감염 희생자 대부분을 구제하기에는 너무 높게 책정되어 있다.
3'-티아리보푸라노실-βL-사이토신("3-TC"), 3'-아지도-3'-데옥시티미딘 (AZT)[참조: Blair E., Darby, G., Gough, E., Littler, D., Rowlands, D., Tisdale, M. Antiviral Therapy, BIOS Scientific Publishers Limited, 1998], (-)-2',3'-디데옥시-5-플루오로-3'-티아사이티딘("FTC") 및 2',3'-디데옥시-3'-티아사이티딘과 같은 뉴클레오사이드 유사체는 중요한 항바이러스제이다[참조: Liotta, D.C. 216th ACS National Meeting, Medicinal Chemistry Abstract, Boston, MA, August 2327, 1998; Hoong, L.K., Strange, L.E., Liotta, D.C., Koszalka, G.W., Burns, C.L., 및 Schinazi, R.F., J. Org. Chem. 1992, 57, 5563-5565]. 3-TC가 항-HIV 및 항-HBV 약제 모두로서 판매되어 왔으며, FTC는 항바이러스 약제로서 평가를 위해 임상시험중에 있다[참조: Liotta, D.C., Schinazi, R.F., 및 Choi, W.-B., 미국 특허 제 5,210,085 호, 5,700,937 호 및 5,814,639 호]. 상응하는 (+)- 이성체와 비교하여 볼 때 (-)-FTC 및 (-)-2',3'-디데옥시-3'-티아사이티딘의 (-) 에난티오머가 독성이 가장 낮고 효능이 가장 뛰어난 항바이러스 활성을 나타내기 때문에, 전세계적으로 환자에게 치료의 기회를 확대하기 위하여 (-)-FTC 및 (-)-2',3'-디데옥시-3'-티아사이티딘 이성체를 비용-효율적으로 제조하는 효과적인 방법이 요망되고 있다[참조: Liotta, D.C. 216th ACS National Meeting, Medicinal Chemistry Abstract, Boston, MA, August 23-27, 1998; Hoong, L.K., Strange, L.E., Liotta, D.C., Koszalka, G.W., Burns, C.L., 및 Schinazi, R.F., J. Org. Chem. 1992, 57, 5563-5565].
FTC 에스테르를 분할하기 위하여 많은 가수분해 효소가 사용되어 왔다[참조: Hoong, L.K., Strange, L.E., Liotta, D.C., Koszalka, G.W., Burns, C.L., 및 Schinazi, R.F., J. Org. Chem. 1992, 57, 5563-5565]. 그러나, FTC 및 유사 화합물을 제조하기 위한 실용적인 효소 개재된 화학적 방법을 개발하는데 있어 장애가 남아 있다. 첫째, 리파제를 제외한 가수분해 효소는 2상 환경에 취약한 것으로 여겨져 왔다[참조: WO 97/44445, Lalonde er al., J. Am. Chem. Soc., 117, 6845-6852 (1995), Milton, et al., Chemical Abstracts, 124(5), abstract #55332 (1996), Brand et al., Chemical Abstracts, 127(20), abstract #278395 (1997)]. 둘째, 수성 매질중에서 다수 FTC 에스테르의 용해도가 너무 낮아 분할된 생성물을 경제적으로 제조할 수 없다. 용액중 에스테르의 농도를 증가시키기 위하여 하나의 가능한 용액이 수혼화성 공-유기용매에 첨가되어 왔다. 일례로서 아세토니트릴 및 물의 용액이 사용되었다[참조: Hoong, L.K., Strange, L.E., Liotta, D.C., Koszalka, G.W., Burns, C.L., 및 Schinazi, R.F., J. Org. Chem. 1992, 57, 5563-5565; Liotta et al., 미국 특허 제 5,827,727 호]. 수혼화성 유기용매 및 수용액을 사용하는 것이 용액중 기질의 농도를 증가시킨다 하더라도, 이는 효소 촉매화된 전환율 및 효소 안정성을 상당히 떨어뜨리는 불리한 효과를 갖는다. 이러한 문제는 기질이 완전히 용해되지 않을 뿐만 아니라 또한 용해되지 않은 고체 현탁물(고농도의 기질 함유)로서 존재하는 경우 특히 명백하다. 유사한 결과가 우리 실험실에서도 얻어졌다. 이소프로판올, 디메틸포름아미드(DMF), 1-메틸-2-피롤리디논, 디메틸설폭사이드(DMSO), 메탄올, 아세토니트릴, 에탄올, 1-프로판올과 같은 수혼화성 유기용매가 분할을 위해 공용매로 사용된 경우, 최대 기질 농도 함량은 3% 이었다. 기질의 농도가 3%를 초과하는 경우, 용해되지 않은 기질이 존재하면 에난티오선택성이 감소된다. 또한, 수혼화성 유기 공용매의 농도가 20%를 초과하는 양으로 수혼화성 유기용매 및 수용액을 사용하게 되면 특히 돼지간 에스테라제(PLE)의 경우에 효소 활성에 뚜렷이 불리한 영향을 주게 된다.
본 발명은 특히 에난티오머 혼합물의 효소적 분할에 비경제적인 영향을 주는 선행 기술의 몇가지 장애를 주목하였다. 첫째, 2상 시스템은 재현성이 불량하기 때문에, 효소 전환은 균질한 조건하에서 수행되어야 할 것으로 판단된다[참조: Liotta et al., 미국 특허 제 5,827,727 호, 5,892,025 호, 5,914,331 호; 또는 수성 및 유기성분을 분리하기 위하여 활성막을 제안한 Matson 에 의한 미국 특허 제 4,800,162 호]. 비균질 시스템을 사용하는데 있어 가능한 한가지 장점은 기질의 용해성을 향상시킬 수 있다는 것이다. 아마도, 비균질 시스템에서는 대다수 소수성 기질의 고농도가 달성될 수 있을 것으로 보인다. 본 발명 이전에, 알콜 용매는 효소를 변성시키기 때문에 피해져야 한다고 여겨졌다[참조: Liotta et al., 미국 특허 제 5,827,727 호, 5,892,025 호, 5,914,331 호]. 본 발명은 특히 물과 비균질 시스템을 이루는 알콜 용매를 사용할 수 있기 때문에 선행 기술을 진보시킨 것이다. 또한, 비균질 용매 시스템을 사용함으로써 선행 기술에서 이미 달성할 수 있었던 것 이상으로 소수성 기질의 용해성을 증대시킬 수 있었다. 이것은 기질 자체가 물에 좀더 많이 용해되어 수성성분에 분산되는 다른 방법과 대조적이다[참조: Wald et al., 미국 특허 제 5,057,427 호]. 추가로, 본 발명은 생성물 1 단위에 대해 효소를 덜 필요로 하는 방법을 개시한다.
본 발명을 통해 달성된 추가의 개선점은 효소 방법에 수개의 알콜 용매를 사용할 수 있게끔 하였다는 것이다. 또한, 본 발명은 계면활성제를 첨가하여 필요한 효소 및 유기용매의 양을 감소시킨 대안적 방법 모드를 제공한다. 마지막으로, 본 발명은 에난티오선택성을 높은 수준으로 유지하면서 보다 더 유효한 효소적 방법을 제공하는 것에 관한 것이다.
도면의 간단한 설명
반응식 1은 FTC 부티레이트의 에난티오머 혼합물중 하나의 에난티오머 형태를 상응하는 비-라세미 알콜 및 목적하는 비-라세미 에스테르로 에난티오선택적으로 전환시키는 것을 도시한 것이다.
본 발명은 키랄성 비-라세미 에스테르를 제조하는 다수의 개선된 방법에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 생체촉매를 사용하는 2상 비균질 시스템을 사용하여 FTC 에스테르 및 FTC 에스테르 유사체의 에난티오머 혼합물을 분할하는 개선된 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 효소의 소모량을 감소시킴과 동시에 기질 함량을 높일 수 있는 개선된 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 제 1 개선 방법은 고 기질 농도에서 에스테르의 에난티오머 혼합물을 유기용매 시스템에 분산시켜 유기성분을 제조한다. 수성성분은 바람직하게는 분산된 가수분해 효소를 함유한다. 별법으로, 가수분해 효소는 전체 비균 질 시스템에 첨가될 수 있거나, 덜 바람직하게는 유기성분에 첨가될 수 있다. 이 방법은 추가로 키랄성 비-라세미 에스테르 및 비-라세미 알콜을 수득하기 위해 혼합물을 분할할 수 있는 조건하에서 유기성분과 수성성분을 접촉시켜 비균질 시스템을 형성하는 것을 필요로 한다. 유기성분과 수성성분을 배합함으로써 비균질 시스템이 형성된다. 비균질 시스템을 사용함으로써 훨씬 더 높은 기질 농도가 가능하다. 한 구체예에서, 반응을 수행한 후, 유기성분으로부터 키랄성 비-라세미 에스테르 화합물을 분리할 수 있고, 수성성분으로부터 키랄성 비-라세미 알콜 화합물을 분리할 수 있다. 분리 단계는 특정 화합물 및 조건에 따라 달라질 수 있다.
본 발명은 또한 주어진 생성물을 제조하는데 필요한 효소의 양을 상당히 감소시킴으로써 개선된 결과를 제공하는 또 다른 방법을 제공한다. 이러한 개선점은 상기 유기성분, 수성성분, 또는 비균질 시스템에 계면활성제를 첨가하거나, 계면활성제를 가수분해 효소와 제제화시켜 기질을 가용화시키기 위한 유기용매를 덜 필요로 하는 개선된 비균질 시스템을 제공함으로써 달성된다.
다른 구체예에서, 본 발명은 저 유기/물 상 비를 채용함으로써 필요로 하는 가수분해 효소의 양을 추가로 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 시스템에 계면활성제를 첨가함으로써 효소 반응 속도를 향상시킬 수 있으며, 기질의 용해도를 높일 수 있다. 반응 속도가 빨라짐으로써 공정 조작에 드는 전체 효소 비용이 절감된다.
명세서에서, 용어들은 다음과 같이 정의된다:
생체촉매 - 가수분해 효소와 같은 단백질 분자. 이들의 예로 에스테라제, 프로테아제 및 리파제가 포함된다.
키랄 화합물 - 거울상이 겹쳐지지 않는 화합물로서 보통 네 개의 상이한 그룹이 동일한 탄소에 부착된 비대칭 탄소원자를 갖는다.
공-용매 - 유기용매.
전환 - 단일 에난티오머를 상이한 키랄체로 변환시키는 촉매로 화합물의 에난티오머 혼합물을 처리하는 방법.
디아스테레오머 - 서로의 거울 반사체에 대해 관련이 없는 입체이성체.
분산 - 효소 또는 에난티오머 혼합물질이 용매에 분포되어 있는 것. 효소는 가교결합된 효소 결정, 고정화 효소 또는 가용성 효소의 형태일 수 있으며, 에난티오머 혼합물이 용해될 수 있거나, 잔류 미립자를 함유할 수 있다. 분산 시스템은 고체 결정성 및/또는 미립자 물질을 갖는 세 개 이하의 상 및 두 개의 상이한 액체상을 포함할 수 있다.
에난티오머 - 거울상적으로 서로 대향되는 입체이성체 쌍. 에난티오머는 그의 거울상이 겹쳐지지 않는다. 에난티오머는 다른 키랄 분자와 반응하는 방식 및 편광면에 대한 행동 양식만이 상이한 키랄 입체이성체이다. 별개의 에난티오머는 편광면을 동등한 정도이지만 반대 방향으로 회전한다. 상이한 에난티오머는 R 및 S로 표기되며, 편광면에 대해 오른쪽으로 회전(우선성(+))하는지, 또는 왼쪽으로 회전(좌선성(-))하는지에 따라 구별된다.
에난티오머 과량 - 하나의 에난티오머가 더 많은 양으로 존재하는 두 개의 에난티오머의 혼합물(용액)에서, 용액은 과량으로 존재하는 에난티오머에 상응하는 광회전(+ 또는 - 회전)을 나타낼 것이다. 에난티오머 과량은 라세미 혼합물의 것 에 비해 과량으로 관찰되는 에난티오머의 퍼센트로서 다음과 같이 산정된다:
(혼합물의 비선광도(specific rotation))÷(순수 에난티오머의 비선광도) ×100 = 에난티오머 과량%.
에난티오머 혼합물 - 두 에난티오머의 혼합물.
에난티오선택성 - 에난티오머 혼합물로부터 하나의 에난티오머를 전환시키기 위한 우선성(preference).
FTC 부티레이트 - 화합물 2',3'-디데옥시-5'-부티레이트-5-플루오로-3'-티아사이티딘(또는 다른 명명법 사용)의 에난티오머 혼합물을 의미하는 것으로, 이 화합물은 2-부티릴옥시메틸-5-(5-플루오로사이토신-1-일)-1,3-옥사티올란 또는 덜 공식적으로는 2-하이드록시메틸-5-(5-플루오로사이토신-1-일)-1,3-옥사티올란의 5' 부티레이트 에스테르이다.
불완전하게 수-혼화성인 유기용매 - 25 ℃에서 물에 완전히 용해되지 않는(완전하지 않게) 유기용매로서 물과 비균질 용액을 형성한다.
비균질 시스템 - 생체촉매, 유기성분, 수성성분 및 기질을 포함하는 2상 매질. 비균질 시스템은 또한 비균질 매질 또는 비균질 상태 또는 비균질 조성물로도 언급된다.
유기용매 시스템 - 하나이상의 하기 용매들을 포함하는 용액: C1-C8 비치환된 알칸, 알콜, 방향족, 케톤 에테르, 니트로, 할로-알칸 또는 방향족 유기용매, 예를 들어 t-아밀 알콜, 이소-아밀 알콜, 1-펜탄올, 3-펜탄올, 1-부탄올, 2-부탄올, t-부탄올, 3-메틸-3-펜탄올, 4-메틸-2-펜탄올, 3-에틸-3-펜탄올, 3-헵탄올, 톨루엔, 부틸아세테이트, 니트로에탄, 니트로메탄, 디클로로메탄, 메틸 이소부틸 케톤, 디메틸 설파이드, 설폴란 또는 효소의 작용성을 파괴시키지 않으면서 에난티오머 혼합물의 용해도를 촉진시키는 물과 약 50% 이하로 혼화될 수 있는 유기용매.
라세미 혼합물 - 일반적으로 키랄 중심에서 화학 반응의 결과로 형성되는 것으로서, 라세미 변형으로도 알려져 있는 두 에난티오머의 등몰 혼합물(에난티오머 생성물은 바람직하지 않다).
에난티오머 분할 또는 분할화 - 에난티오머 혼합물로부터 한 쌍의 에난티오머를 분리하는 방법.
라세미 혼합물의 분할 - 에난티오머의 라세미 혼합물의 분리.
FTC 및 FTC 부티레이트의 입체화학 - 본 출원을 통해 언급되는 FTC 화합물의 입체화학은 다음과 같다:
Figure 112001007839978-pct00001
Figure 112001007839978-pct00002
Figure 112001007839978-pct00003
Figure 112001007839978-pct00004
입체이성체 - 구성 원자가 다른 화합물의 것과 동일한 순서로 배열되었으나, 공간배열만이 다른 화합물. 이러한 입체이성체의 예로는 에난티오머 및 디아스테레오머가 포함된다.
기질 함량 - 에난티오머 혼합물의 농도. 이후 예에 있어서, 기질 함량은 총 용매 부피에 대한 %(중량/비균질 시스템의 부피)로 표시된다. 반복하면, 기질 함량(%)(중량/부피)는 수성 및 유기성분 모두를 포함하는 전체 비균질 시스템의 부피를 기준으로 한다.
계면활성제 - 용액에 용해시 용액의 표면장력을 감소시키는 표면활성제. 계면활성제는 또한 두 액체간 또는 액체와 고체간의 계면장력을 감소시킨다. 계면활성제는 동일한 메카니즘을 통해 작용하는 세 범주내에 속한다. 이 범주는 포함된 표면 성질에 따라 세정제, 유화제 및 습윤제를 포함한다. 계면활성제 농도는 (%)(중량/부피)로 표시되며, 수성 및 유기성분 모두를 포함하는 전체 비균질 시스템의 부피를 기준으로 한다.
수-불혼화성 유기용매 - 25 ℃에서 물에 대한 용해도가 최대 10%인 유기용매이며, 물과 비균질 용액을 형성한다. 유기용매 농도는 (%)(중량/부피)로 표시되며, 수성 및 유기성분 모두를 포함하는 전체 비균질 시스템의 부피를 기준으로 한다.
약 50% 이하의 수혼화성 유기용매 - 25 ℃에서 물에 약 50% 이하로 용해되는 유기용매이며, 물과 비균질 용액을 형성한다.
수혼화성 유기 공용매 - 25 ℃에서 물과 완전히 혼화될 수 있는 유기용매.
본 발명은
(a) 하기 일반식 (I)의 에스테르의 에난티오머 혼합물을 약 1 내지 약 25%(중량/비균질 시스템의 부피)의 농도로 유기용매 시스템에 분산시켜 유기성분을 제조하고;
(b) 수성용매 시스템을 제공하여 수성성분을 제조한 후;
(c) 상기 혼합물을 분할할 수 있는 조건하에서 상기 유기성분 및 수성성분을 접촉시켜 비균질 시스템을 형성시킴으로써 하기 일반식 (I)의 키랄성 비-라세미 에스테르 및 하기 일반식 (II)의 비-라세미 알콜을 제조하는 단계를 특징으로 하여,
가수분해 효소를 사용하여 하기 일반식 (I)의 키랄성 비-라세미 에스테르를 제조하는 방법을 제공하는 것으로서, 가수분해 효소는 유기성분, 수성성분 또는 비균질 시스템에 분산된다:
Figure 112001007839978-pct00005
(I)
Figure 112001007839978-pct00006
(II)
상기 식에서,
R 은 C1-C8 알킬, 알케닐 또는 알키닐을 나타내고,
X 는 H 또는 F를 나타내며,
Y 는 CH2, O, S, Se 또는 NH를 나타낸다.
본 발명은
(a) 상기 소수성 에스테르의 에난티오머 혼합물을 약 1 내지 약 25%(중량/비균질 시스템의 부피)의 농도로 유기용매 시스템에 분산시켜 유기성분을 제조하고;
(b) 수성용매 시스템을 제공하여 수성성분을 제조한 후;
(c) 상기 에난티오머 혼합물중 하나의 에난티오머 형태를 상응하는 알콜로 에난티오선택적으로 전환시킬 수 있는 조건하에서 상기 유기성분 및 수성성분을 접촉시켜 비균질 시스템을 형성시키는 단계를 특징으로 하여,
가수분해 효소를 사용하여 키랄성 비-라세미 소수성 에스테르를 제조하는 방법을 제공하는 것으로서, 가수분해 효소는 유기성분, 수성성분 또는 비균질 시스템에 분산된다.
별법으로, 본 발명은 계면활성제를 추가로 포함함을 특징으로 하여 일반식 (I)의 에난티오머 혼합물 또는 소수성 에스테르의 에난티오머 혼합물로부터 일반식 (I)의 키랄성 비-라세미 혼합물을 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
(a) 2-부티릴옥시메틸-5-(5-플루오로사이토신-1-일)-1,3-옥사티올란의 에난티오머 혼합물을 약 1 내지 약 25%(중량/비균질 시스템의 부피)의 농도로 유기용매 시스템에 분산시켜 유기성분을 제조하고;
(b) 수성용매 시스템을 제공하여 수성성분을 제조한 후;
(c) 상기 에난티오머 혼합물중 하나의 에난티오머 형태를 상응하는 알콜로 에난티오선택적으로 전환시킬 수 있는 조건하에서 상기 유기성분 및 수성성분을 접촉시켜 비균질 시스템을 형성시키는 단계를 특징으로 하여,
가수분해 효소를 사용하여 2-부티릴옥시메틸-5-(5-플루오로사이토신-1-일)-1,3-옥사티올란의 키랄성 비-라세미 에스테르를 제조하는 방법을 제공하는 것으로서, 가수분해 효소는 유기성분, 수성성분 또는 비균질 시스템에 분산되고, 에난티오머 혼합물의 농도는 비균질 시스템의 부피를 기준으로 하여 산정된다.
본 발명의 한 구체예는
(a) 2-부티릴옥시메틸-5-(5-플루오로사이토신-1-일)-1,3-옥사티올란의 에난티오머 혼합물을 약 1 내지 약 25%(중량/비균질 시스템의 부피)의 농도로 유기용매 시스템에 분산시켜 유기성분을 제조하고;
(b) 수성용매 시스템을 제공하여 수성성분을 제조한 후;
(c) 상기 에난티오머 혼합물중 하나의 에난티오머 형태를 상응하는 알콜로 에난티오선택적으로 전환시킬 수 있는 조건하에서 상기 유기성분 및 수성성분을 접촉시켜 비균질 시스템을 형성시키는 단계를 특징으로 하여,
가수분해 효소를 사용하여 2-부티릴옥시메틸-5-(5-플루오로사이토신-1-일)-1,3-옥사티올란의 키랄성 비-라세미 에스테르를 제조하는 방법을 제공하는 것으로서, 가수분해 효소는 유기성분, 수성성분 또는 비균질 시스템에 분산되고, 유기성분은 비균질 시스템의 약 5 내지 약 90%로 함유되며, 비균질 시스템은 또한 비균질 시스템의 부피를 기준으로 하여 계산된 약 1 내지 약 20% 농도의 계면활성제를 포함한다.
본 발명의 다른 목적은 가수분해 효소를 사용하여 키랄성 비-라세미 소수성 에스테르를 제조하기 위해 하기 성분들을 포함하는 비균질 시스템을 제공하는 것이다:
(a) 가수분해 효소;
(b) 소수성 에스테르 기질;
(c) 유기성분; 및
(d) 수성성분.
본 발명의 한가지 목적은 에난티오머 혼합물로부터 목적하는 에난티오머를 분할하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 소수성 에스테르의 에난티오머 혼합물로부터 목적하는 에난티오머를 분할하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 일반식 (I)을 갖는 항바이러스 화합물의 에 난티오머를 분할하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 가장 바람직한 구체예는 에난티오머성 FTC 부티레이트(또는 상기 일반식 (I)에서 R 은 프로필이고, X 는 F이며, Y 는 S인 경우)를 분할하는 방법을 제공하는 것이다.
기질 함량은 소수성 에스테르의 에난티오머 혼합물을 유기용매 시스템에 분산시켜 유기성분을 제공할 만큼 필요하다. 농도 범위는 %(중량/비균질 시스템의 부피)의 단위로 표시되며, 약 0.5 내지 약 45%; 약 1.0 내지 약 45%; 약 5.0 내지 약 45%; 약 10 내지 약 40%; 약 10 내지 약 30%; 약 5 내지 약 20%; 약 1 내지 약 5%; 및 약 10 내지 약 20%의 범위로 구성된 그룹중에서 선택된다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 유기용매 시스템은 에난티오머 혼합물의 용해력을 촉진시키는 약 50% 이하의 수혼화성 유기용매를 하나이상 포함한다.
더욱 바람직한 구체예에서, 본 발명의 유기용매 시스템은 하나이상의 C4-C8 알콜을 포함한다.
가장 바람직한 구체예에서, 본 발명의 유기용매 시스템은 n-아밀 알콜 및 3-메틸-3-펜탄올중 어느 하나 또는 둘다를 포함한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 수성용매 시스템은 물, 하나이상의 완충염, 알칼리화제, 항균성 방부제, 안정화제, 여과 보조제, 공-효소, 또는 효소 작용 및 분산성을 촉진시키는 다른 부형제를 포함한다.
더욱 바람직한 구체예에서, 본 발명의 수성용매 시스템은 물, 하나이상의 완충염, 알칼리화제, 또는 효소 작용 및 분산성을 촉진시키는 다른 부형제를 포함한 다.
더욱 더 바람직한 구체예에서, 본 발명의 수성용매 시스템은 물, 및 약 0.01 내지 약 0.5 몰의 pH 약 7.0 내지 약 8.0의 포스페이트 완충액을 포함한다.
가장 바람직한 구체예에서, 본 발명의 수성용매 시스템은 물, 및 약 0.2 내지 약 0.4 몰의 pH 약 7.2 내지 약 7.8의 포스페이트 완충액을 포함한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 가수분해 효소는 한쌍의 에난티오머를 분할할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 가수분해 효소는 하나의 에난티오머와 효소 촉매화된 입체선택적 방식으로 반응하여 한쌍의 에난티오머를 분할할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 가수분해 효소는 하나의 에난티오머를 효소 촉매화된 입체선택적 방식으로 전환시켜 한쌍의 에난티오머를 분할할 수 있다.
본 발명의 가장 바람직한 구체예에서, 가수분해 효소는 2-부티릴옥시메틸-5-(5-플루오로사이토신-1-일)-1,3-옥사티올란(또는 상기 일반식 (I)에서 R 이 프로필이고, X 는 F이며, Y 는 S인 것 또는 FTC 부티레이트)의 (+) 에난티오머를 효소 촉매화된 입체선택적 방식으로 전환시켜 한쌍의 에난티오머를 분할할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 생체촉매는 효소이다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 효소는 가수분해효소이다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 효소는 에스테라제, 리파제 및 프로페아제 중에서 선택된다.
본 발명의 가장 바람직한 구체예에서, 효소는 돼지 췌장 리파제("PL"), 슈도 모나스 종(pseudomonas species) 리파제, 아스퍼길루스 니거(Aspergillus niger) 리파제, 섭틸리신(subtilisin) 또는 돼지 간 에스테라제("PLE") 중에서 선택된다.
본 발명의 한 구체예에서, 수성성분을 유기성분과 접촉시켜 비균질 시스템을 형성시킨 후 비균질 시스템에 생체촉매를 첨가한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 수성성분을 유기성분과 접촉시켜 비균질 시스템을 형성시키기 전에 생체촉매를 유기성분의 일부로서 유기상에 첨가한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 수성성분을 유기성분과 접촉시킨 후, 교반 및 혼합하여 비균질 시스템을 형성시키기 전에 수성상에 생체촉매를 첨가하여 수성성분을 제조한다.
본 발명의 가장 바람직한 구체예에서, 수성성분을 유기성분과 접촉시켜 비균질 시스템을 형성시키전에 수성상에 생체촉매를 첨가하여 수성성분을 제조한다.
본 발명의 한 구체예에서, 에난티오머 혼합물을 분할하기 위한 방법에 사용된 비균질 시스템은 계면활성제를 함유한다. %(중량/비균질 시스템의 부피)로서 계면활성제의 농도 범위는 약 1 내지 약 30%의 계면활성제; 약 1 내지 약 20%의 계면활성제; 약 1 내지 약 10%의 계면활성제; 약 1 내지 약 5%의 계면활성제; 약 5 내지 약 30%의 계면활성제; 약 10 내지 약 25%의 계면활성제; 약 15 내지 약 25%의 계면활성제; 약 20 내지 약 30%의 계면활성제; 및 약 5 내지 약 15%의 계면활성제로 구성된 그룹중에서 선택된다.
본 발명의 한 구체예에서, 효소는 매트릭스상에 고정되어 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 효소 형태는 예를 들어 PCT 특허출원 제 WO 92/02617(Navia 등)에 기재된 바와 같은 가교결합된 효소 결정의 형태이다.
본 발명의 더욱 바람직한 구체예에서, 효소 형태는 예를 들어 PCT 특허출원 제 WO 98/46732(Margolin 등)에 기재된 바와 같은 용해도가 조절되는 가교결합된 단백질 결정의 형태이다.
본 발명의 가장 바람직한 구체예에서, 효소는 가용 형태이다.
본 발명의 한 구체예에서, 비균질 시스템은 약 10 내지 약 99%의 유기성분을 포함한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 비균질 시스템은 약 10 내지 약 90%의 유기성분을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 비균질 시스템은 약 20 내지 약 80%의 유기성분을 포함한다. 더욱 더 바람직하게는, 비균질 시스템은 약 30 내지 약 70%의 유기성분을 포함한다. 보다 더 바람직한 구체예에서, 비균질 시스템은 약 10 내지 약 50%의 유기성분을 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 비균질 시스템은 약 10 내지 약 60%의 유기성분을 포함한다. 추가로 바람직한 구체예에서, 비균질 시스템은 약 20 내지 약 70%의 유기성분을 포함한다. 또한 더 바람직한 구체예에서, 비균질 시스템은 약 50 내지 약 20%의 유기성분을 포함한다.
본 발명의 한 구체예에서, 목적하는 에난티오머를 분할하기 위한 상기 방법은 약 0 내지 약 45 ℃; 약 10 내지 약 45 ℃; 약 20 내지 약 45 ℃; 약 30 내지 약 45 ℃; 약 10 내지 약 40 ℃; 약 10 내지 약 30 ℃; 약 10 내지 약 25 ℃; 약 15 내지 약 40 ℃; 약 15 내지 약 35 ℃; 약 15 내지 약 30 ℃; 약 15 내지 약 25 ℃; 및 약 20 내지 약 35 ℃로 구성된 그룹중에서 선택된 온도에서 수행된다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용된 수성성분은 비균질 시스템의 적어도 10%(부피/부피)를 구성한다.
더욱 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용된 수성성분은 비균질 시스템의 적어도 50%(부피/부피)를 구성한다.
가장 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용된 수성성분은 비균질 시스템의 적어도 90%(부피/부피)를 구성한다.
본 발명의 한 구체예에서, 목적하는 에난티오머를 분할하기 위한 상기 방법은 계면활성제를 포함하는 비균질 시스템에서 수행된다. 계면활성제가 상기 비균질 시스템의 일부인 경우, 유기성분의 농도 범위는 %(부피/부피)로서 비균질 시스템의 약 5 내지 약 90%; 비균질 시스템의 약 5 내지 약 80%; 비균질 시스템의 약 5 내지 약 70%; 비균질 시스템의 약 5 내지 약 60%; 비균질 시스템의 약 5 내지 약 50%; 비균질 시스템의 약 5 내지 약 30%; 비균질 시스템의 약 5 내지 약 20%; 비균질 시스템의 약 5 내지 약 10%; 비균질 시스템의 약 10 내지 약 30%; 비균질 시스템의 약 10 내지 약 20%; 비균질 시스템의 약 20 내지 약 70%; 비균질 시스템의 약 25 내지 약 50%; 및 비균질 시스템의 약 30 내지 약 60%로 구성된 그룹중에서 선택된다.
에난티오머 혼합물을 분할하기 위한 반응식은 이후 반응식 1에 도시된 반응으로 설명된다: 여기에서, 기질은 FTC의 아세테이트, 포르메이트, 프로피오네이트, 부티레이트, 펜타노에이트 또는 다른 n-알킬 및 측쇄 또는 아릴 에스테르, 또는 이러한 FTC 에스테르의 유도체이고, 유기 공용매는 약 50% 이하로 수혼화성인 알콜성, 알칸, 방향족, 케톤 에테르, 니트로, 할로-알칸 또는 방향족 유기용매, 예를 들어 n-아밀 알콜, 이소-아밀 알콜, t-아밀 알콜, 3-펜탄올, 1- 또는 3-헵탄올, 3-메틸-3-펜탄올, 4-메틸-2-펜탄올, 3-에틸-3-펜탄올, 1- 또는 2-부탄올, 니트로메탄, 디클로로메탄, 메틸 이소부틸 케톤, 디메틸 설파이드, 설폴란 등이다.
하기 반응식 1에서, 반응 생성물은 비-라세미 에스테르 및 비-라세미 알콜이다(참조: 반응식 1). 일례로서, X 가 불소이고, R 이 C3H7 이며, Y 가 황인 경우, 화합물 A는 FTC 부티레이트의 에난티오머 혼합물을 나타낸다. 돼지 간 에스테라제(PLE), 슈도모나스 종으로부터의 리파제(PSL) 및 아스퍼길루스 니거로부터의 리파제(ANL)와 같은 여러 가수분해 효소가 촉매로서 사용되어 왔다[혼합 유기용매에서 PLE 촉매 반응에 대한 참조: Ariente-Fliche, C., Braun, J., 및 Le Goffic, F., Synth. Commun. 22, 1149-1153(1992); Basavaiah, D., 및 Krishna, P.R., Pure & Applied Chem., 64, 1067-1072(1992); Basavaiah, D., Pandiaraju, S., 및 Muthukumaran, K., Tetrahedron: Asymmetry, 7, 13-16, (1996); Mahmoudian, M., Baines, B.S., Dawson, M.J., 및 Lawrence, G.C., Enzyme Microb. Technol., 14, 911-916, (1992); Izumi, T. 및 Kasahara, A., 일본 특허 제 JP08092269A(1996)].
반응식 1
Figure 112001007839978-pct00007
상기 식에서,
R 은 C1-C8 알킬, 알케닐 또는 알키닐을 나타내고,
X 는 H 또는 F를 나타내며,
Y 는 CH2, O, S, Se 또는 NH를 나타내고,
생체촉매는 가용성 또는 고정화 효소 또는 가교결합된 효소 결정 형태일 수 있으며; 유기 공용매는 약 50% 이하의 수혼화성 유기용매, 예를 들어 n-아밀 알콜, 이소-아밀 알콜, t-아밀 알콜, 3-펜탄올, 1- 또는 3-헵탄올, 3-메틸-3-펜탄올, 4-메틸-2-펜탄올, 3-에틸-3-펜탄올, 1- 또는 2-부탄올, 니트로메탄, 디클로로메탄 등일 수 있다.
생체촉매는 가용성 효소, 고정화 효소 또는 효소의 가교결합된 결정(CLECTM) 형태일 수 있다(참조: Altus Biologics, Inc., Cambridge, Massachusetts). 반응은 배치 반응기, 칼럼, 유공섬유(hollow-fiber) 막[참조: Enzyme Catalysis in Organic Synthesis, pp. 138-150, edited by Drauz, K. 및 Waldmann, H., VCH Verlagsgesellschaft GmbH, Weinheim, 1995] 또는 막 반응기[참조: Dodds, D.R., Lopez., J.L., Zepp, C.M., 및 Rossi, R.F. PCT 특허출원 제 WO 90/04643. 1990년 5월]에서 수행될 수 있다.
주어진 기질 쌍에 대해 어떤 미립자 효소가 가장 적합한지 선별하는 것은 한쌍의 에난티오머 샘플을 다양한 효소, 예를 들어 돼지 간 에스테라제, 돼지 췌장 리파제, 슈도모나스 종으로부터의 리파제(PSL) 및 아스퍼길루스 니거로부터의 리파 제(ANL), 및 섭틸리신 또는 α-키모트립신과 같은 프로테아제로 처리하여 결정한다. 에난티오머 혼합물을 분할 효소로 처리한 후, 표준 추출 또는 크로마토그래피법으로 생성물을 분리한다. 가장 많은 에난티오머 과량의 목적 생성물을 생성하는 효소가 본 발명의 방법에 사용하기에 가장 적합한 것으로 선택되어야 한다.
소정의 에난티오머 혼합물을 선택하고 효소 배합물을 분할한 후, 반응에 이상적인 용매 조건을 결정하여 방법을 추가로 개선시킬 수 있다. 2상 시스템에서, 유기용매의 종류를 결정하여야 한다. 최적의 유기용매는 물과 약 50% 이하로 혼화될 수 있는 동일한 양의 일련된 유기용매의 존재하에서 선택된 효소로 에난티오머 혼합물의 샘플을 처리하여 결정할 수 있다. 특정 용매에는 물과 약 50% 이하로 혼화될 수 있는(실온에서 물에 대해 50% 미만의 용해도) 알콜성, 알칸, 방향족, 케톤 에테르, 니트로, 할로-알칸 또는 방향족 유기용매, 예를 들어 n-아밀 알콜, 이소-아밀 알콜, t-아밀 알콜, 3-펜탄올, 1- 또는 3-헵탄올, 3-메틸-3-펜탄올, 4-메틸-2-펜탄올, 3-에틸-3-펜탄올, 1- 또는 2-부탄올, 니트로메탄, 디클로로메탄, 메틸 이소부틸 케톤, 디메틸 설파이드, 설폴란 등이 포함된다. 에난티오머 혼합물을 동일한 양의 각종 용매의 존재하에서 분할 효소로 처리한 후, 생성물을 표준 추출 또는 크로마토그래피법으로 분리한다. 가장 많은 에난티오머 과량의 목적 생성물을 생성하는 용매/효소 쌍이 본 발명의 방법에 사용하기에 가장 적합한 것으로 선택되어야 한다.
선택된 유기용매의 상대량은 또한 최적의 결과를 이루도록 결정되어야 한다. 이를 위해, 상기와 유사한 방법이 수반된다. 특정 효소/라세미 혼합물의 사용시, 선택된 유기용매/수성용매의 비는 하기와 같이 다양하다: 95:5, 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80, 10:90 및 5:95, ([유기용매]:[수성용매]). 에난티오머 혼합물의 동일한 샘플을 다양한 비율의 유기용매 대 수성용매의 존재하에서 표준양의 특정 효소로 설정된 시간동안 처리한다. 총부피는 일정하게 유지한다. 에난티오머 혼합물을 동일한 양의 여러 용매의 존재하에서 분할 효소로 처리한 후, 생성물을 표준 추출 또는 크로마토그래피법으로 분리한다. 가장 많은 에난티오머 과량의 목적 생성물을 생성하는 용매 시스템/효소 쌍이 본 발명의 방법에 사용하기에 가장 적합한 것으로 선택되어야 한다.
또한, 일부 라세미 혼합물:효소:유기용매 배합물에 대해, 반응물에 계면활성제를 첨가함으로써 유기용매의 양을 감소시키고 효소 활성을 향상시킬 수 있다. 특정 방법에 대해 계면활성제의 첨가여부를 평가하기 위해, 일부 변형되는 하기 과정이 수반될 수 있다. 첫째, 에난티오머 혼합물의 샘플을 약 50% 이하의 수혼화성 유기용매 및 수성용매로 구성된 비균질 시스템의 존재하에서 선택된 효소 및 일련의 계면활성제로 처리하여 계면활성제를 선택한다. 시스템은 계면활성제의 부재하에서 수행되는 반응과 양립하는(compatible) 것이어야 한다. 계면활성제의 예로 Tween, 예를 들어 Tween 20TM, Tween 80TM, PrionexTM, Teepol HB7 TM, Tergitol TMN-6TM, Tergitol TMN-10TM, Tergitol NP-4TM, Tergitol 15-S-3TM , Igepal CA-630TM, TyloxapolTM, 글루코데옥시콜린산, 옥틸 β-글루코-피라노사이드, CHAPSTM, 디옥틸 설포숙시네이트 또는 데옥시콜린산이 포함된다. 에난티오머 혼합물을 2상 용매 시스템 및 일정한 양의 여러 계면활성제의 존재하에서 분할 효소로 처리한 후, 생성물을 표준 추출 또는 크로마토그래피법으로 분리한다. 설정된 시간동안 가장 많은 에난티오머 과량의 목적 생성물을 생성하는 용매/효소/계면활성제 배합물이 본 발명의 방법에 사용하기에 가장 적합한 것으로 선택되어야 한다.
계면활성제는 한번에 얼마나 많은 샘플이 처리될 수 있는지에 따라 농도 또는 농도 범위로 첨가될 수 있다. 주어진 용매/효소/계면활성제 배합물에 대해, 최적의 계면활성제 농도를 결정하여야 한다. 당 업계의 숙련자라면 계면활성제의 농도로만 달라지는 일련의 독립적인 반응이 설정되어야 함을 알 수 있을 것이다. 예를 들어, 반응은 20% 펜탄올 및 80% 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 또는 [2-아미노-2-(하이드록시메틸)-1,3-프로판디올 완충액(pH 7.4)중에서 PLE를 사용하여 수행될 수 있다. 1%, 3%, 5%, 7.5%, 10%, 12.5%, 15%, 20%, 25% 및 30%의 계면활성제 농도를 갖는 동일한 반응이 설정될 수 있다. 에난티오머 혼합물을 2상 용매 시스템의 존재하에서 계면활성제의 농도를 증가시켜 가면서 설정된 시간동안 분할 효소로 처리한 후, 생성물을 표준 추출 또는 크로마토그래피법으로 분리한다. 설정된 시간동안 가장 많은 에난티오머 과량의 목적 생성물을 생성하는 용매/효소/계면활성제 배합물이 본 발명의 방법에 사용하기에 가장 적합한 것으로 선택되어야 한다.
본 발명을 수행하는데 있어 유용한 계면활성제로는 양이온성, 음이온성, 비이온성 또는 양쪽성 계면활성제, 또는 이들의 혼합물이 포함된다. 바람직한 계면활성제는 특정 효소 및/또는 기질 성분에 따라 달라질 것이다. 이러한 스크리닝 과정은 당 업계의 숙련자들에게는 잘 알려져 있다. 스크리닝 과정을 이후 실시예 14 내지 30 에 설명하였다.
유용한 양이온성 예면활성제의 예로 아민, 아민염, 설포늄, 포스포늄 및 사급 암모늄 화합물이 포함된다. 이러한 양이온성 계면활성제의 구체적인 예로 하기 화합물들이 포함된다:
메틸 트리옥틸암모늄 클로라이드
(Aliquat 336)
N,N',N'-폴리옥시에틸렌(10)-N-탈로우-1,3-디아미노프로판
(EDT-20, 'PEG-10 탈로우).
유용한 음이온성 계면활성제에는 예를 들어 선형 알킬벤젠 설포네이트, 알파-올레핀 설포네이트, 알킬 설페이트, 알콜 에톡시 설페이트, 카복실산, 황산 에스테르 및 알칸 설폰산이 포함된다. 음이온성 계면활성제의 예로 하기의 화합물들이 포함된다:
Triton QS-30 (음이온성)
Aerosol 22
디옥틸 설포숙시네이트(AOT)
알킬 소듐 설페이트(Niaproof):
Type-4
Type-8
알킬(C9-C13)소듐 설페이트
(TEEPOL HB7).
안정화에 유용한 비이온성 계면활성제로는 노닐 페놀 에톡실레이트, 알콜 에톡실레이트, 소르비탄 트리올리에이트, 비이온성 블록 공중합체 계면활성제, 폴리에틸렌 옥사이드 또는 페닐 알콜 또는 지방산의 폴리에틸렌 옥사이드 유도체가 포함된다. 비이온성 계면활성제의 예로 하기의 화합물들이 포함된다:
폴리옥시 에틸렌 에테르:
4 아릴 에테르(Brij 30)
23 라우릴 에테르(Brij 35)
옥틸 페녹시 폴리에톡시에탄올(Tritons):
Tx-15
Tx-100
Tx-114
Tx-405
DF-16
N-57
DF-12
CF-10
CF-54
폴리옥시에틸렌소르비탄:
모노라우레이트(Tween 20)
소르비탄:
세스퀴올리에이트(Arlacel 83)
트리올리에이트(Span 85)
폴리글리콜 에테르(Tergitol):
Type NP-4
Type NP-9
Type NP-35
Type TMN-10
Type 15-S-3
Type TMN-6(2,6,8-트리메틸-4-노닐옥시폴리에틸렌옥시에탄올)
Type 15-S-40.
적합한 계면활성제의 선택후, 때로 생성물의 수율 또는 에난티오선택성의 손실없이 유기용매의 비를 상당히 감소시킬 수 있다. 당 업계의 숙련자는 유기용매를 얼마나 많이 감소시킬 수 있는지 결정하는 과정이 다음과 같음을 인지할 것이다: 특정 효소/라세미 혼합물/계면활성제 배합물 사용시, 선택된 유기용매 대 수성용매의 비는 다음과 같다: [유기용매%:수성용매%], 95:5, 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80, 10:90 및 5:95, 및 필요에 따라 그밖의 다른 비. 에난티오머 혼합물의 샘플을 여러 비율의 유기용매 대 수성용매 및 계면활성제의 존재하에서 설정된 시간동안 표준양의 특정 효소로 처리한다. 에난티오머 혼합물을 동일한 양의 여러 용매의 존재하에서 분할 효소로 처리한 후, 생성물을 표준 추출 또는 크로마토그래피법으로 분리한다. 가장 많은 에난티오머 과량의 목적 생성물을 생성하는 용매/효소 쌍이 본 발명의 방법에 사용하기에 가장 적합한 것으로 선택되어야 한다.
본 발명의 방법을 수행하는데 있어서 추가로 고려되어야 할 점은 제조되는 생성물의 단위당 드는 효소의 비용이다. 본 발명은 생성물 1 단위를 기초로 하여 반응과정에 필요한 효소의 양을 감소시킨다. 한 구체예로, 유기성분의 양이 비균질 시스템에서 감소된다. 다른 구체예로, 계면활성제를 비균질 시스템에 첨가하여 필요한 효소의 양을 감소시키고, 과정을 수행하는데 드는 비용을 추가로 감소시킨다.
본 발명은 특히 기질이 소수성 에스테르를 포함하는 효소 반응에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 기질이 수성 용액에 비교적 불용성인 효소 반응에 관한 것이다. 물과 완전하게 혼화되지 않는 유기 공용매를 갖는 비균질 시스템을 사용하여 수혼화성 유기용매를 사용한 시스템의 것에 비해 소수성 에스테르 및 다른 소수성 및 불용 화합물의 용매화를 증대시킨다.
본 발명이 더 잘 이해되도록 하기 위하여 하기 실시예가 기재된다. 이들 실시예는 설명할 목적으로만 제시된 것이며, 본 발명의 내용을 어떤 방식으로든 제한하고자 함은 아니다.
실시예
실시예 1 : FTC 부티레이트의 돼지 간 에스테라제 촉매화된 분할
라세미 FTC-부티레이트(1.0 g)를 30 분동안 75 ℃로 가열하여 n-아밀 알콜 5.0 ㎖에 용해시켜 유기성분을 제조하였다. 그후, 유기성분을 0.3M의 pH 7.5 포스페이트 완충액 3.8 ㎖를 포함하는 수성성분과 혼합하고, 비균질 시스템을 35 ℃로 냉각하였다. 이어서, 돼지 간 에스테라제 용액, 650 U/㎖ Altus PLE 용액 (Altus Biologics, Cambridge, MA) 1.2 ㎖를 수성층에 첨가하고, 생성된 현탁액을 온화하게 저으면서 교반하였다. 외부 수조에 의해 온도를 32 ℃로 유지시켰다. 필요에 따라, 50% 수성 수산화나트륨을 첨가하여 pH 를 7.5 로 유지하였다. 비반응 (-)-부티레이트 에스테르 및 (+)-FTC 알콜 생성물의 광학 순도를 키랄 정지상 칼럼을 사용하여 HPLC 분석에 따라 조사하였다. 24 시간후, FTC 에스테르의 (+)-에난티오머를 이후 기술되는 HPLC 분석에 근거하여 완전히 전환시켰다. 유기상으로부터 비반응 에스테르를 추출하고 유기용매를 증발시켜 목적하는 (-)-FTC 에스테르를 수득하였다. 회수한 수율은 단일 (-) 에난티오머를 기준으로 하여 89.4% 이고, 광학 순도는 99% 이상이었다.
과정
키랄 HPLC 조건 :
CHIRAPAKR AS; 0.46 ㎝ ×25 ㎝ HPLC 칼럼(Daicel Chemical Inc.), 이동상 = 100% 아세토니트릴, 유량 = 1 ㎖/분, 260 nm 에서 UV 검출. 체류 시간: (-)-FTC 부티레이트, 6.2 분; (-)-FTC, 7.4 분; (+)-FTC 부티레이트, 8.8 분; 및 (+)-FTC, 11.4 분.
산의 제조를 위해 래디오미터(Radiometer) pH-stat 장치를 이용하여 에틸 부티레이트의 전환율로 효소 활성을 측정하였다. 에틸 부티레이트(40 ㎖)를 5 mM 붕산(pH 8) 20 ㎖에 첨가하고, 25 ℃에서 용해가 완결될 때까지(10 분) 교반하였다. PLE를 첨가하고, 0.01N NaOH를 첨가하여 pH를 8.0 으로 유지하였다. 5 분간에 걸친 염기의 첨가 비율로부터 산의 제조 비율을 결정하였다.
반응 진행동안 효소 안정성을 측정하였다. 효소 용액의 분취량을 정기적으로 제거하고, 에틸 부티레이트 분석을 이용하여 활성을 측정함으로써 효소 안정성을 측정하였다.
실시예 2
83%의 n-아밀 알콜(또는 3-메틸-3-펜탄올)/수성 혼합물에서 FTC 부티레이트의 CLEC TM -PLE 촉매화된 반응
포스페이트 완충액의 부피가 1 ㎖이고, 유기성분의 부피가 8.3 ㎖인 것을 제외하고 반응 조건 및 과정은 실시예 1과 동일하다. 36 시간후, 전환율은 n-아밀 알콜에 대해 38%이고, 3-메틸-3-펜탄올에 대해 25% 이었다(표 1, 반응 12 및 13 참조).
실시예 3
50% n-아밀 알콜/수성 혼합물에서 FTC 부티레이트의 PSL-촉매화된 반응
가용성 PSL-30(PSL-30은 Amano로부터의 PS30이다) 100 ㎎이 사용되는 것을 제외하고 반응 조건 및 과정은 실시예 1과 동일하다. 24 시간후, 전환율은 56%이 고, (-)-에난티오머가 우선적으로 가수분해되었다. 잔류 에스테르의 광학 순도는 56% 전환율에서 92% 이었다(표 1, 반응 21 참조).
실시예 4
50% n-아밀 알콜/수성 혼합물에서 FTC 부티레이트의 ANL-촉매화된 반응
가용성 ANL 200 ㎎이 사용되는 것을 제외하고 반응 조건 및 과정은 실시예 1과 동일하다. 36 시간후, 전환율은 45% 이었다. 잔류 에스테르의 광학 순도는 45% 전환율에서 63% 이었다(표 1, 반응 22 참조).
실시예 5
20% 이소프로판올(또는 다른 수혼화성 유기 공용매)/수성 혼합물 및 2% 기질 농도에서 (±)-FTC 부티레이트의 PLE-촉매화된 전환
하기 실시예는 균질 시스템에서 효소 촉매를 다량 사용한 선행 기술을 설명한다. 0.3M 포스페이트 완충액(pH 7.5) 39 ㎖ 중의 Altus Biologics, Inc.로부터의 Altus PLE 용액(650 단위/㎖) 1 ㎖의 용액에 이소프로판올중의 10% FTC 부티레이트 10 ㎖를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 24 내지 26 ℃에서 교반하고, 반응 진행을 HPLC로 조사하였다. 22 시간 반응후 전환율은 51%에 이르렀으며, 잔류하는 키랄성 비-라세미 에스테르 화합물의 광학 순도는 99% 이상(48%의 화학적 수율)이었다. 이러한 결과는 잔류하는 키랄성 비-라세미 에스테르 화합물의 HPLC 분석 에 근거한 것이다. 수성층은 가수분해된 생성물 (+)-FTC 및 (-)-FTC를 포함하였다. (+)-FTC 및 (-)-FTC의 비는 96.6 대 3.4 이었다. 유기층을 증발시켜 (-)-FTC 부티레이트 0.457 g을 수득하였다.
아세토니트릴, DMF, 1-메틸-2-피롤리디논, 메탄올, 에탄올, t-부탄올, DMSO, 피리딘, 디(에틸렌 글리콜)메틸 에테르, PEG 200 및 PEG 600 등을 포함한 그밖의 다른 수혼화성 유기 공용매를 사용하여 유사한 반응을 수행하였다. 아세토니트릴은 이소프로판올과 동일한 높은 에나티오선택성을 나타내었으며, 유사한 다량의 효소를 필요로 하였다. 다른 모든 용매는 이소프로판올보다 덜 에난티오선택적이었다.
실시예 6
20% 이소프로판올/수성 혼합물 및 5% 기질 농도에서 (±)-FTC 부티레이트의 PLE-촉매화된 전환
0.3M 포스페이트 완충액(pH 7.5) 37.5 ㎖ 중의 Altus Biologics, Inc.로부터의 Altus PLE 용액(650 단위/㎖) 2.5 ㎖의 용액에 이소프로판올중의 25% FTC 부티레이트 10.0 ㎖를 첨가하였다. 이러한 조건하에서, 기질은 완전히 용해되지 않았다. 생성된 혼합물을 24 내지 26 ℃에서 교반하고, 반응을 HPLC로 조사하였다. 96 반응시간후 전환율은 60%에 이르렀으며, 잔류 에스테르의 광학 순도는 74%(38%의 화학적 수율)이었다. 에난티오선택성은 2% 기질 농도를 이용한 반응보다 훨씬 더 낮았다.
실시예 7
30% 이소프로판올/수성 용액 및 3% 기질 농도에서 (±)-FTC 부티레이트의 PLE-촉매화된 전환
0.3M 포스페이트 완충액(pH 7.5) 33.5 ㎖ 중의 Altus Biologics, Inc.로부터의 Altus PLE 용액(650 단위/㎖) 1.5 ㎖의 용액에 이소프로판올중의 10% FTC 부티레이트 15 ㎖를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 24 내지 26 ℃에서 교반하고, 반응을 HPLC로 조사하였다. 2 시간후 전환율은 8%이었으며, 그후 증가되지 않았다. 효소는 30% 이소프로판올에서 활성을 급속히 모두 잃어버렸다.
하기 표 1은 50% 이하의 수혼화성 유기용매 및 완충 수용액을 포함하는 2상 비균질 시스템에서 여러 효소를 사용한 FTC-부티레이트의 분할반응 결과를 나타낸다.
표 1
다양한 2상 시스템a에서 각종 효소를 사용한 FTC-부티레이트의 에난티오머 혼합물의 분할
반응번호 효소 공-유기용매 시간(시) 전환율(%) ee(%)b에스테르 입체화학 우선성
1 PLE-Cc n-아밀 알콜 24 52 >98 (+)
2 PLE-Ic n-아밀 알콜 36 53 >98 (+)
3 PLE-Sc n-아밀 알콜 24 52 >98 (+)
4 PLE-C 이소-아밀 알콜 36 52 >98 (+)
5 PLE-C t-아밀 알콜 36 37 59 (+)
6 PLE-C 1-부탄올 24 12 10 (+)
7 PLE-C 2-부탄올 24 7 7.5 (+)
8 PLE-C 3-펜탄올 36 40 67 (+)
9 PLE-C 1-헵탄올 36 39 64 (+)
10 PLE-C 3-헵탄올 36 39 52 (+)
11 PLE-C 3-메틸-3-펜탄올 36 53 >98 (+)
12 PLE-C 3-메틸-3-펜탄올d 36 25 33 (+)
13 PLE-C n-아밀 알콜d 36 38 61 (+)
14 PLE-C 4-메틸-2-펜탄올 36 45 82 (+)
15 PLE-C 3-에틸-3-펜탄올 36 48 92 (+)
16 PLE-C 니트로메탄 36 24 32 (+)
17 PLE-C 디클로로메탄 36 20 25 (+)
18 PLE-C 톨루엔 36 18 16 (+)
19 PLE-C 메틸 이소부틸 케톤 36 20 33 (+)
20 PLE-C t-부틸 아세테이트 36 23 29 (+)
21 PSL n-아밀 알콜 24 56 92 (-)
22 ANL n-아밀 알콜 36 45 63 (+)
a. 반응 조건: 50% 유기/수성 혼합물 10 ㎖ 중의 (±)-FTC-부티레이트 1 g을 실온에서 PLE, PSL 또는 ANL로 가수분해시켰다.
b. 광학 순도는 HPLC 분석에 기초한다.
c. PLE-C = CLECTM-PLE, PLE-I = 고정화 PLE, PLE-S = Altus PLE 용액 650 단위/㎖.
d. 6 ㎖ 또는 83% 유기/수성 혼합물에서.
실시예 5 내지 7은 본 발명의 방법에 있어서 균질 시스템에서 수혼화성 알콜을 사용하는 경우 몇가지 문제점을 예증한다. 이러한 시스템은 광학 순도가 감소되고 반응 시간이 긴 생성물을 생성하며, 효소를 불활성화시킨다.
실시예 8 내지 13
n-아밀 알콜 및 물을 사용한 비균질 시스템에서 (+)-FTC-부티레이트의 PLE 촉매화된 전환
반응 조건 및 과정은 실시예 1과 동일하다. 비균질 시스템은 촉매로서 Altus PLE 용액(650 U/㎖) 1 ㎖를 포함하며, 사용한 아밀 알콜 및 포스페이트 완충액의 부피는 하기 표 2와 같다. 각 경우, (+)-이성체의 전환 선택성이 거의 절대적이었으며, 따라서 50% 를 약간 상회하는 목적하는 전환율로 비반응 (-) 에스테르의 에난티오머 순도는 거의 100%에 달했다(하기 표 2 참조).
표 2, 실시예 8-13
실시예 8 9 10 11 12 13
아밀 알콜 2 ㎖ 3 ㎖ 4 ㎖ 5 ㎖ 6 ㎖ 7 ㎖
포스페이트 완충액 7 ㎖ 6 ㎖ 5 ㎖ 4 ㎖ 3 ㎖ 2 ㎖
반응 시간(시) 전환율(%)
0 0 0 0 0 0 0
1 28 26 24 21 20 19
3 43.2 42 39 34 33 33
8 49 49 48 45 41 41
24 49.8 49.8 49.2 47.5 46.7 47.3
실시예 14 내지 30
계면활성제의 존재하에 n-아밀 알콜 및 물 혼합물을 포함한 비균질 시스템에서 (±)-FTC-부티레이트의 PLE-촉매화된 전환
실시예 14 내지 30을 하기 표 3에 나타내었다. 반응 조건 및 과정은 실시예 1과 동일하다. 비균질 시스템은 촉매로서 Altus PLE 용액(650 U/㎖) 1 ㎖를 포함하며, 1 ㎖(실시예 14-21, 23, 24 및 30) 또는 0.1 g(실시예 25-29)의 계면활성제가 계면활성제로서 반응 혼합물에 첨가되었다. 유기성분은 n-아밀 알콜을 포함하며, 수성성분은 0.3M 포스페이트 완충액을 포함한다(50:50 비).
표 3, 실시예 14-30
하기 시간(시)에서 전환율(%)
실시예 계면활성제 (t) 시간
0 1 3 7 24
14 Tween 20 0 18 34 45 50
15 Prionex 0 17 30 42 49
16 Teepol HB7 0 9 15 21 26
17 Tergitol TMN-6 0 14 32 44 48
18 Tergitol 15-S-3 0 17 29 40 47
19 Igepal CA-630 0 19 35 45 49
20 Tyloxapol 0 18 35 46 50
21 Tergitol TMN-10 0 17 30 42 48
표 3 - 계속
하기 시간(시)에서 전환율(%)
실시예 계면활성제 (t) 시간
0 1 3 20
22 없음 0 21 34 47.5
23 Aerosol 22 0 7 7 8
24 Tergitol NP-4 0 18 34 49.5
25 글루코데옥시콜린산 0 14 25 44
26 옥틸 β-글루코피라노사이드 0 15 30 47
27 CHAPS 0 14 21 39
28 디옥틸 설포숙시네이트 Na+ 염 0 17 32 49.5
29 데옥시콜린산 Na+ 염 0 13 23 43.4
30 Tween 80 0 18 33 50
표 3에 나타난 바와 같이, 계면활성제를 광범하게 스크리닝하였을 때, 일부는 활성적이었고(실시예 14, 15, 19, 20, 24, 28 및 30 참조), 일부는 억제적이었다(실시예 16, 23, 27 및 29 참조). 추가의 분석을 위해 15 개의 계면활성제가 선택되었다. 계면활성제 Tergitol NP-4, Tween 80, Tyloxapol 및 디옥틸 설포숙시네이트 소듐은 모두 PLE 활성을 거의 동일한 수준으로 증가시켰다. 속도 향상은 반응 후부에서 가장 뚜렷하며, 이는 촉매 효율에 대한 효과뿐 아니라 효소 안정화 및 침전 방지에 기인할 수 있다.
실시예 31 내지 34
Tween-80의 존재하에 2-상 n-아밀 알콜/물 혼합물에서 (±)-FTC-부티레이트의 PLE 촉매화된 전환
실시예 31 내지 34를 하기 표 4에 나타내었다. 반응 조건 및 과정은 실시예 1과 동일하다. 비균질 시스템은 계면활성제로서 Tween 80을 포함하고, 촉매로 서 Altus PLE 용액(650 U/㎖) 0.6 ㎖를 포함하며, 사용된 아밀 알콜 및 0.3M 포스페이트 완충액의 부피는 하기 표 4에 나타낸 바와 같다.
표 4, 실시예 31-34
실시예 31 32 33 34
아밀 알콜 4 ㎖ 4.5 ㎖ 4.75 ㎖ 4.9 ㎖
Tween-80 1 ㎖ 0.5 ㎖ 0.25 ㎖ 0.1 ㎖
0.3M 포스페이트 완충액 5 ㎖ 5 ㎖ 5 ㎖ 5 ㎖
반응 시간(시) 1 1 1 1
전환율(%) 10 8 6 5
실시예 35
효소 및 유기용매 요구량의 유리한 감소
반응 조건 및 과정은 실시예 1과 동일하다. 비균질 시스템은 계면활성제로서 Tween 80 0.5 ㎖, 촉매로서 Altus PLE 용액(650 U/㎖) 0.3 ㎖, 및 용매로서 아밀 알콜 2.0 ㎖ 및 0.3M 포스페이트 완충액 7.5 ㎖를 포함한다. 비균질 시스템은 유기성분 25% 및 수성성분 75%을 포함한다. 48 시간후, 전환율은 50% 이었고, 잔류 에스테르의 광학 순도는 99.3% 이었다.
이 실시예에서, 효소 및 유기용매의 양은 모두 실시예 31 내지 34에 사용된 수준의 약 절반으로 감소되었으며, 생성물 수율의 손실은 없었다. 또한, 효소 필요량은 실시예 1에서 필요한 것의 25% 밖에 되지 않았다.
실시예 36 내지 39
계면활성제로서 디옥틸 설포숙시네이트(디옥틸 SS)
실시예 36 내지 39를 하기 표 5에 나타내었다. 반응 조건 및 과정은 실시예 1과 동일하다. 비균질 시스템은 계면활성제로서 디옥틸 설포숙시네이트(디옥틸 SS) 및 아밀 알콜 2 ㎖ 및 0.3M 포스페이트 완충액 8 ㎖중의 Altus PLE 효소 용액(650 U/㎖) 0.4 ㎖를 포함한다.
표 5, 실시예 36 내지 39
실시예 36 37 38 39
디옥틸 SS 10 ㎎ 25 ㎎ 100 ㎎ 200 ㎎
시간(시) 전환율
0 0 0 0 0
1 5 5.5 9 9
3 20 22 25 23
5.5 27 32 34 30
21 40 47 48 45
실시예 40
반응 조건 및 과정은 실시예 1과 동일하다. 촉매는 총 714 단위의 돼지 간 에스테라제(Sigma, st. Louis, MO)를 포함한다. 비균질 시스템은 유기성분으로서 50%의 n-아밀 알콜 및 수성성분으로서 50%의 0.3M 포스페이트 완충액(pH 7.4)을 포함한다. 24 시간후, 전환율은 50% 이었고, 잔류 에스테르의 광학 순도는 97.5% 이었다.
실시예 41
저효소 함량 및 음이온성 계면활성제에 의한 속도 향상
Tween-80을 사용하는 것 이외에, 속도를 향상시키기 위하여 음이온성 계면활성제 디옥틸 설포숙시네이트 소듐염이 선택되었다. 하기 표 6에 나타난 바와 같 이, 비균질 시스템에서 1%의 계면활성제면 속도를 상당히 향상시키는데 충분하다.
반응 조건은 다음을 포함한다: 1 g의 FTC 부티레이트, 0.4% PLE 함량, 유기용매 1-펜탄올, 2:8 용매비, 반응은 30 ℃에서 수행된다(표 6 참조).
표 6, 실시예 41
계면활성제(×㎎) 사용시 전환율%
시간(시) 계면활성제 ㎎
10 ㎎ 25 ㎎ 100 ㎎ 200 ㎎
0 0 0 0 0
1 5 5.5 9 9
3 20 22 25 23
5.5 27 32 34 30
21 40 47 48 45
실시예 42
효소 함량 및 유기용매 농도에 대한 계면활성제 효과
본 발명의 바람직한 구체예는 10% 기질 함량을 갖는 FTC 부티레이트에 대해 효소 함량이 0.3 내지 0.4% 이다. 실행-실행 변수 및 광학 순도에 대한 전환 효과를 좀더 정확히 결정하기 위하여 다수의 반응을 다소 대규모로 수행하였다. 결과를 하기 표 7에 나타내었다.
표 7, 저 효소 함량에서 5 g 규모 반응(28 ℃, 45% 1-펜탄올, 5% Tween-80, 50% 수성)
PLE(%) Tween-80(%) 시간(시) 광학 순도(e.e.%)
0.6 2.5 26 95.32
0.6 5 24 98.34
0.4 5 24 96.20
0.4 5 42 >99.0
표 8에 나타난 바와 같이, 반응은 저 유기/수성비로 수행되었으며, 48 시간 미만에 있어서 0.3% 효소 함량으로 높은 광학 순도를 제공하였다.
표 8, 저 효소 함량에서 1 g 규모 반응(28 ℃, 20% 1-펜탄올/5% Tween-80, 75% 수성)
PLE(%) 시간(시) e.e.(%)
0.4% 25 99.20
0.3% 25 95.88
0.3% 31 97.68
0.3% 48 99.32
상기 본 발명의 구체예가 다수 예시되었지만, 본 발명의 기본적 구성을 변형시켜 본 발명의 방법 및 조성물을 이용하는 다른 구체예를 제공할 수 있음은 자명한 사실이다. 따라서, 본 발명의 영역은 실시예로 상기 언급되어 있는 특정 구체예에 의해서 보다는 첨부된 청구범위에 의해 한정될 것이다.

Claims (118)

  1. (a) 하기 일반식 (Ⅰ)의 화합물의 에난티오머 혼합물을 약 5 내지 약 45%(중량/비균질 시스템의 부피)의 농도로 유기용매 시스템에 분산시켜 유기성분을 제조하고;
    (b) 수성용매 시스템을 제공하여 수성성분을 제조한 후;
    (c) 가수분해 효소로 상기 혼합물을 분할할 수 있는 조건하에서 상기 유기성분 및 수성성분을 접촉시켜 비균질 시스템을 형성시킴으로써 하기 일반식 (Ⅰ)의 키랄성 비-라세미 에스테르 및 하기 일반식 (Ⅱ)의 비-라세미 알콜을 제조하는 단계를 특징으로 하여, 하기 일반식 (Ⅱ)의 화합물을 분할하는 방법으로서,
    가수분해 효소가 유기성분, 수성성분 또는 비균질 시스템에 분산되는 방법:
    Figure 112006054289648-pct00008
    (Ⅰ)
    Figure 112006054289648-pct00009
    (Ⅱ)
    상기 식에서,
    X 는 F를 나타내고,
    Y 는 S를 나타내며,
    R 은 C1-C8 알킬, 알케닐 또는 알키닐을 나타낸다.
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  61. 제 1 항에 있어서, 일반식 (Ⅰ)의 화합물이 2-부티릴옥시메틸-5-(5-플루오로사이토신-1-일)-1,3-옥사티올란인 방법.
  62. 제 61 항에 있어서,
    일반식 (Ⅰ)의 화합물이 2-부티릴옥시메틸-5-(5-플루오로사이토신-1-일)-1,3-옥사티올란이고,
    (a) 2-부티릴옥시메틸-5-(5-플루오로사이토신-1-일)-1,3-옥사티올란의 에난티오머 혼합물을 약 5 내지 약 45%(중량/비균질 시스템의 부피)의 농도로 유기용매 시스템에 분산시켜 유기성분을 제조하고;
    (b) 수성용매 시스템을 제공하여 수성성분을 제조한 후;
    (c) 상기 에난티오머 혼합물중 하나의 에난티오머 형태를 상응하는 알콜로 에난티오선택적으로 전환시킬 수 있는 조건하에서 상기 유기성분 및 수성성분을 접촉시켜 비균질 시스템을 형성시키는 단계를 특징으로 하며,
    가수분해 효소가 유기성분, 수성성분 또는 비균질 시스템에 분산되는 방법.
  63. 제 61 항에 있어서,
    일반식 (Ⅰ)의 화합물이 2-부티릴옥시메틸-5-(5-플루오로사이토신-1-일)-1,3-옥사티올란이고,
    (a) 2-부티릴옥시메틸-5-(5-플루오로사이토신-1-일)-1,3-옥사티올란의 에난티오머 혼합물을 약 5 내지 약 45%(중량/비균질 시스템의 부피)의 농도로 유기용매 시스템에 분산시켜 유기성분을 제조하고;
    (b) 수성용매 시스템을 제공하여 수성성분을 제조한 후;
    (c) 상기 에난티오머 혼합물중 하나의 에난티오머 형태를 상응하는 알콜로 에난티오선택적으로 전환시킬 수 있는 조건하에서 상기 유기성분 및 수성성분을 접촉시켜 비균질 시스템을 형성시키는 단계를 특징으로 하며,
    가수분해 효소가 유기성분, 수성성분 또는 비균질 시스템에 분산되고, 유기성분이 비균질 시스템의 약 5 내지 약 90%로 함유되며, 비균질 시스템이 또한 약 1 내지 약 20% 농도의 계면활성제를 포함하는 방법.
  64. 제 1 항 또는 제 61 항 내지 63 항중 어느 한 항에 있어서, 가수분해 효소가 돼지 간 에스테라제, 돼지 췌장 리파제, 슈도모나스 종(pseudomonas species) 리파제, 아스퍼길루스 니거(Aspergillus niger) 리파제 및 섭틸리신(subtilisin)으로 구성된 그룹중에서 선택되는 방법.
  65. 제 64 항에 있어서, 가수분해 효소가 가교결합된 효소 결정인 방법.
  66. 제 65 항에 있어서, 가교결합된 효소 결정이 글루타르알데하이드와 가교결합되는 방법.
  67. 제 64 항에 있어서, 가수분해 효소가 고정화 효소인 방법.
  68. 제 64 항에 있어서, 가수분해 효소가 가용성 효소인 방법.
  69. 제 64 항에 있어서, 가수분해 효소가 돼지 간 에스테라제인 방법.
  70. 제 1 항 또는 제 61 항 내지 63 항중 어느 한 항에 있어서, 키랄성 비-라세미 에스테르가 유기성분으로부터 분리되는 방법.
  71. 제 1 항 또는 제 61 항 내지 63 항중 어느 한 항에 있어서, 키랄성 비-라세미 알콜이 수성성분으로부터 분리되는 방법.
  72. 제 1 항에 있어서, 일반식 (Ⅰ)의 화합물이 FTC 부티레이트인 방법.
  73. 제 61 항에 있어서, 에난티오머 혼합물이 2-부티릴옥시메틸-5-(5-플루오로사이토신-1-일)-1,3-옥사티올란을 포함하는 방법.
  74. 제 1 항 또는 제 61 항 내지 63 항중 어느 한 항에 있어서, 에난티오머 혼합물이 유기성분중에 약 5 내지 약 20%의 농도로 분산되는 방법.
  75. 삭제
  76. 제 1 항 또는 61 항에 있어서, 에난티오머 혼합물이 유기성분중에 약 10 내지 약 20%의 농도로 분산되는 방법.
  77. 제 1 항 또는 제 61 항 내지 63 항중 어느 한 항에 있어서, 유기성분이 약 50% 이하의 수혼화성 유기용매를 포함하는 방법.
  78. 제 77 항에 있어서, 유기성분이 C4-C8 알콜, 니트로메탄, 디클로로메탄, 톨루엔, 메틸 이소부틸 케톤, t-부틸 아세테이트 및 알칸으로 구성된 그룹중에서 선택된 하나이상의 용매를 포함하는 방법.
  79. 제 78 항에 있어서, 유기성분이 n-아밀 알콜 및 3-메틸-3-펜탄올중 어느 하나 또는 둘다를 포함하는 방법.
  80. 제 63 항에 있어서, 계면활성제가 양이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제로 구성된 그룹중에서 선택되는 방법.
  81. 제 80 항에 있어서, 계면활성제가 폴리옥시에틸렌소르비탄 모노라우레이트, 알킬(C9-C13) 소듐 설페이트폴리글리콜 에테르, 2,6,8-트리메틸-4-노닐옥시폴리에틸렌옥시에탄올, 글루코데옥시콜린산, 옥틸 β-글루코-피라노사이드, 디옥틸 설포숙시네이트 및 데옥시콜린산으로 구성된 그룹중에서 선택되는 방법.
  82. 제 81 항에 있어서, 계면활성제가 폴리옥시에틸렌소르비탄 모노라우레이트인 방법.
  83. 제 81 항에 있어서, 계면활성제가 디옥틸 설포숙시네이트인 방법.
  84. 제 63 항에 있어서, 계면활성제가 유기성분에 첨가되는 방법.
  85. 제 63 항에 있어서, 계면활성제가 수성성분에 첨가되는 방법.
  86. 제 63 항에 있어서, 계면활성제가 비균질 시스템에 첨가되는 방법.
  87. 제 63 항에 있어서, 계면활성제가 가수분해 효소와 제제화되는 방법.
  88. 제 1 항 또는 제 61 내지 63 항중 어느 한 항에 있어서, 수성용매 시스템이 물, 및 완충염, 알칼리화제, 항균성 방부제, 안정화제, 여과 보조제, 공-효소, 분산성을 촉진시키는 부형제 및 효소 작용을 촉진시키는 부형제로 구성된 그룹중에서 선택된 부형제를 포함하는 방법.
  89. 제 88 항에 있어서, 수성용매 시스템이 pH 가 약 7 보다 큰 포스페이트 완충액으로 완충된 물을 포함하는 방법.
  90. 제 88 항에 있어서, 수성용매 시스템이 2-아미노-2-(하이드록시메틸)-1,3-프로판디올 또는 트리스 (하이드록시메틸)아미노메탄으로 완충된 물을 포함하는 방법.
  91. 제 1 항 또는 제 61 내지 63 항중 어느 한 항에 있어서, 에난티오머 혼합물중 하나의 에난티오머 형태를 상응하는 알콜로 에난티오선택적으로 전환시킬 수 있는 조건이 약 0 내지 약 45 ℃의 온도를 포함하는 방법.
  92. (a) 가수분해 효소;
    (b) 일반식 (Ⅰ)의 화합물의 에난티오머 혼합물;
    (c) 유기성분; 및
    (d) 유기성분과 접촉하고 있는 수성성분을 포함하고,
    에난티오머 혼합물이 유기성분중에 분산되어 있는, 일반식 (Ⅱ)의 화합물을 분할하기 위한 2상 비균질 시스템:
    Figure 112006054289648-pct00010
    (Ⅰ)
    Figure 112006054289648-pct00011
    (Ⅱ)
    상기 식에서,
    X 는 F를 나타내고,
    Y 는 S를 나타내며,
    R 은 C1-C8 알킬, 알케닐 또는 알키닐을 나타낸다.
  93. 제 92 항에 있어서, 가수분해 효소가 돼지 간 에스테라제, 돼지 췌장 리파제, 슈도모나스 종 리파제, 아스퍼길루스 니거 리파제 및 섭틸리신으로 구성된 그룹중에서 선택되는 비균질 시스템.
  94. 제 92 항에 있어서, 가수분해 효소가 가교결합된 효소 결정인 비균질 시스템.
  95. 제 94 항에 있어서, 가교결합된 효소 결정이 글루타르알데하이드와 가교결합되는 비균질 시스템.
  96. 제 92 항에 있어서, 가수분해 효소가 고정화 효소인 비균질 시스템.
  97. 제 92 항에 있어서, 가수분해 효소가 가용성 효소인 비균질 시스템.
  98. 제 93 항에 있어서, 가수분해 효소가 돼지 간 에스테라제인 비균질 시스템.
  99. 제 92 항에 있어서, 에난티오머 혼합물이 2-부티릴옥시메틸-5-(5-플루오로사이토신-1-일)-1,3-옥사티올란을 포함하는 비균질 시스템.
  100. 제 92 항에 있어서, 에난티오머 혼합물이 유기성분중에 약 5 내지 약 20%의 농도로 분산된 비균질 시스템.
  101. 제 92 항에 있어서, 에난티오머 혼합물이 유기성분중에 약 10 내지 약 20%의 농도로 분산된 비균질 시스템.
  102. 제 92 항에 있어서, 에난티오머 혼합물이 유기성분중에 약 5 내지 약 45%의 농도로 분산된 비균질 시스템.
  103. 제 92 항에 있어서, 유기성분이 약 50% 이하의 수혼화성 유기용매를 포함하는 비균질 시스템.
  104. 제 103 항에 있어서, 약 50% 이하의 수혼화성 유기용매가 C4-C8 알콜, 니트로메탄, 디클로로메탄, 톨루엔, 메틸 이소부틸 케톤, t-부틸 아세테이트 및 알칸으로 구성된 그룹중에서 선택된 하나이상의 용매를 포함하는 비균질 시스템.
  105. 제 104 항에 있어서, 유기성분이 n-아밀 알콜 및 3-메틸-3-펜탄올중 어느 하나 또는 둘다를 포함하는 비균질 시스템.
  106. 제 92 항에 있어서, 계면활성제를 추가로 포함하는 비균질 시스템.
  107. 제 106 항에 있어서, 계면활성제가 양이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제로 구성된 그룹중에서 선택되는 비균질 시스템.
  108. 제 107 항에 있어서, 계면활성제가 폴리옥시에틸렌소르비탄 모노라우레이트, 알킬(C9-C13) 소듐 설페이트폴리글리콜 에테르, 2,6,8-트리메틸-4-노닐옥시폴리에틸렌옥시에탄올, 글루코데옥시콜린산, 옥틸 β-글루코-피라노사이드, 디옥틸 설포숙시네이트 및 데옥시콜린산으로 구성된 그룹중에서 선택되는 비균질 시스템.
  109. 제 108 항에 있어서, 계면활성제가 폴리옥시에틸렌소르비탄 모노라우레이트인 비균질 시스템.
  110. 제 108 항에 있어서, 계면활성제가 디옥틸 설포숙시네이트인 비균질 시스템.
  111. 제 106 항에 있어서, 유기성분이 계면활성제를 포함하는 비균질 시스템.
  112. 제 106 항에 있어서, 수성성분이 계면활성제를 포함하는 비균질 시스템.
  113. 제 106 항에 있어서, 계면활성제가 가수분해 효소와 제제화되는 비균질 시스템.
  114. 제 92 항에 있어서, 수성용매 시스템이 물, 및 완충염, 알칼리화제, 항균성 방부제, 안정화제, 여과 보조제, 공-효소, 분산성을 촉진시키는 부형제 및 효소 작용을 촉진시키는 부형제로 구성된 그룹중에서 선택된 부형제를 포함하는 비균질 시스템.
  115. 제 92 항에 있어서, 수성용매 시스템이 pH 가 약 7 보다 큰 포스페이트 완충액으로 완충된 물을 포함하는 비균질 시스템.
  116. 제 92 항에 있어서, 수성 용매 시스템이 2-아미노-2-(하이드록시메틸)-1,3-프로판디올 또는 트리스 (하이드록시메틸)아미노메탄으로 완충된 물을 포함하는 비균질 시스템.
  117. 제 92 항에 있어서, 유기성분 및 수성성분이 에난티오머 혼합물중 하나의 에난티오머 형태를 상응하는 알콜로 에난티오선택적으로 전환시킬 수 있는 조건하에서 접촉되는 비균질 시스템.
  118. 제 117 항에 있어서, 유기성분 및 수성성분이 에난티오머 혼합물중 하나의 에난티오머 형태를 상응하는 알콜로 에난티오선택적으로 전환시킬 수 있는 조건하에서 접촉되며, 약 0 내지 45 ℃의 온도로 유지되는 비균질 시스템.
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