상기 본 발명의 목적을 달성하기 위한 특수 영양식용 변성 곡물 전분의 제조방법은, 곡물 전분 대 물의 비율이 1:5 - 1:10(w/v)이 되도록 상기 곡물 전분에 가수하여 곡물 전분 혼탁액을 얻는 단계; 및 상기 곡물 전분 혼탁액을 균질기를 이용하여 균질화하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 균질화 단계는 유체전단 균질기를 이용하여 상기 곡물 전분 혼탁액을 1,000 내지 20,500 rpm 으로 2분 내지 20분간 균질화한다.
또 다르게, 상기 균질화 단계는 초음파 균질기를 이용하여 상기 곡물 전분 혼탁액을 펄스 5 내지 60초, 발진 주파수 20 내지 40KHz로 2분 내지 60분간 균질화한다.
본 발명에서 사용되는 곡물 전분의 예는 구체적으로 한정되는 것은 아니나, 쌀 전분, 옥수수 전분, 감자 전분, 타피오카 전분, 밀 전분 또는 고구마 전분이 바 람직하다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위한 특수 영양식용 변성 곡물 전분의 또 다른 제조방법은, 곡물 전분 대 물의 비율이 1:5 - 1:10(w/v)이 되도록 상기 곡물 전분에 가수하여 곡물 전분 혼탁액을 얻는 단계, 상기 곡물 전분 혼탁액을 호화시키는 단계; 및 상기 호화 곡물 전분 혼탁액을 균질기를 이용하여 균질화하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 균질화 단계는 유체전단 균질기를 이용하여 상기 호화 곡물 전분 혼탁액을 1,000 내지 20,500 rpm 으로 2분 내지 20분간 균질화한다.
또 다르게, 상기 균질화 단계는 초음파 균질기를 이용하여 상기 호화 곡물 전분 혼탁액을 펄스 5 내지 60초, 발진 주파수 20 내지 40KHz로 2분 내지 60분간 균질화한다.
본 발명에서 사용되는 곡물 전분의 예는 구체적으로 한정되는 것은 아니나, 쌀 전분, 옥수수 전분, 감자 전분, 타피오카 전분, 밀 전분 또는 고구마 전분이 바람직하다.
이하 실시예를 통해 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하나 이에 본 발명의 범주가 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 쌀 가루와 쌀 전분의 일반성분
유니 농 멥쌀(Oryza sativa L.)을 원료 쌀로 사용하였다. 상기 원료 쌀을 롤러 분쇄기로 분쇄하여 42 메쉬 이하 크기의 쌀 가루로 만들었다. 쌀 가루에 0.2% NaOH 용액을 가하여 얻은 침전물을 뷰렛반응이 나타나지 않을 때까지 0.2% NaOH 용액으로 처리한 다음 증류수로 중성이 될 때까지 씻어 쌀 전분을 얻었다 (알칼리 침지법, 3회 반복과정 거침). 상기 과정을 통해 제조된 쌀 가루와 쌀 전분의 수분, 조단백질, 조지방 및 조회분의 함량을 AOAC(Association of Official Analytical Chemists)법에 의하여 분석하였고, 그 결과는 표 1과 같다. 쌀 가루의 평균수분함량은 13.66%이었으며 조단백질, 조지방 및 조회분이 각각 5.95%, 0.65% 및 0.42% 함유되어 있었다. 쌀 전분 추출은 3회의 반복과정을 거쳤으나 조단백질, 조지방 및 조회분이 각각 쌀가루의 2.35%, 10.77% 및 23.81% 남아 있었다. 침지 횟수를 증가시키면 농도를 줄일 수가 있으나 수율이 많이 떨어지는 문제점을 가지고 있다.
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수분(%) |
조단백질 (%, N x 5.95) |
조지방 (%) |
조회분 (%) |
쌀 가루 |
13.66 |
5.95 |
0.65 |
0.42 |
쌀 전분 |
12.94 |
0.14 |
0.07 |
0.10 |
실시예 2. 쌀 전분의 미세구조
쌀 전분 대 물의 비율을 1:5 (w/v)로 하여 쌀 전분 혼탁액을 만든 후 유체전단 균질기(hydroshear homogenizer, Utra-Turrax T-25, Janke & Kunkel Co., Germany)를 이용하여 20,500 rpm으로 10분간 마쇄한 쌀 전분(B); 쌀 전분 대 물의 비율을 1:5 (w/v)로 하여 쌀 전분 혼탁액을 만든 후 초음파 균질기(ultrasonic homogenizer, Model CV-26, Sonics & Materials Inc., USA)를 사용하여 펄스 5초, 발진 주파수 40KHz로 10분간 마쇄한 쌀 전분(C); 및 어떠한 처리로 하지 않은 쌀 전분(A, 대조구);을 주사전자현미경으로 5000배 확대한 다음 미세구조를 관찰하였다. 그 결과는 도 1과 같다.
대조구(A)에 비하여 유체 전단 균질기로 처리한 쌀 전분(B)과 초음파 균질기로 처리한 쌀 전분(B)의 크기가 작아져 있음을 알 수 있다. 복합전분체(compound starch grain)는 구조적으로 불규칙한 다면체의 전분입자들이 서로 부착되어 구형의 형태로 존재하나 도 1에 나타난 쌀 전분 입자는 5∼6각형의 다면체로 나타났다.
실시예 3. 호화 쌀 전분의 미세구조
쌀 전분 대 물의 비율을 1:5 (w/v)로 하여 쌀 전분 혼탁액을 만든 후 이를 끓는 물에서 30분간 호화시킨 호화 쌀 전분(대조구, A), 쌀 전분 대 물의 비율을 1:5(w/v)로 하여 쌀 전분 혼탁액을 만든 후 이를 끓는 물에서 30분간 호화 시킨 후 유체전단 균질기 20,500 rpm으로 10분간 마쇄한 호화 쌀 전분(B) 및 쌀 전분 대 물의 비율을 1:5(w/v)로 하여 쌀 전분 혼탁액을 만든 후 이를 끓는 물에서 30분간 호화시킨 후 초음파 균질기를 이용하여 펄스 5초, 발진주파수 40 KHz로 10분간 마쇄한 호화 쌀 전분(C)를 주사현미경으로 500배 확대한 다음 미세구조를 관찰하였다, 그 결과는 도 2와 같다. 호화 쌀 전분 입자는 일반 쌀 전분 입자(도 1)에 비하여 팽윤되어 있는 것을 볼 수 있으며, 호화 쌀 전분 입자의 파괴를 알 수 있다. 이는, 쌀 전분의 호화 과정은 전분 입자가 먼저 수화되면서 팽윤이 일어나고 계속적인 가열에 의하여 아밀로오스가 전분 입자 밖으로 용출되어 호화 완료 시점에서는 아밀로펙틴만이 남은 전분 입자는 붕괴되고 용출된 아밀로오스가 서로 결합하여 전분 입자를 둘러싸서 겔을 형성하게 되기 때문이다. 초음파 균질기로 처리한 호화 쌀 전분(C)보다 유체전단 균질기로 처리한 호화 쌀 전분(C)의 파괴가 많이 된 것을 볼 수 있다.
실시예 4. 쌀 전분 입자와 호화 쌀 전분 입자의 크기 분포
쌀 전분 과 호화 쌀 전분 각각 10mg을 약 1g의 증류수에 분산시켜 1분간 초 음파로 처리한 다음 쌀 전분 입자와 호화 쌀 전분 입자를 유체전단 균질기 20,500 rpm으로 10분간 및 초음파 균질기를 이용하여 펄스 5초, 발진주파수 40 KHz로 10분간 처리하였을 때 입자크기의 줄어든 정도를 레이저 시차 입자 분석기(Laser differential particle analyzer)를 이용하여 확인하였다. 그 결과는 도 3과 같다. 비호화 대조구(A), 유체전단 균질기로 균질화된 쌀 전분(B), 초음파 균질기로 균질화된 쌀 전분(C)의 크기 분포는 각각 0.599∼5.070μ, 0.289∼0.621μ 및 0.293∼0.644μ로 나타났으며, 호화 대조구(D), 유체전단 균질기로 균질화된 호화 쌀 전분(E), 초음파 균질기로 균질화된 호화 쌀 전분(F)의 크기분포는 각각 0.639∼3.563μ, 0.296∼3.045μ 및 0.725∼3.924μ로 나타났다. 입자 분포도로 보아 유체전단 균질기나 초음파 균질기로 균질화된 쌀 전분 및 호화 쌀 전분의 크기 분포가 대조구(A, D)보다 훨씬 적은 범위를 나타내는 것을 알 수 있었으며, 이는 전분 입자의 균질화가 이루어 졌음을 나타낸 것이다.
쌀 전분 및 호화 쌀 전분 입자의 평균 크기와 비표면적을 나타낸 결과는 표 2와 같다. 쌀 전분에서는 유체전단 균질기나 초음파 균질기로 균질화시켰을 때 전분의 평균 크기가 1.589μ에서 각각 0.424μ와 0.441μ로 줄어들었으나, 호화 쌀 전분에 있어서는 유체전단 균질기는 효과가 있었던 반면 초음파 균질기는 큰 효과가 나타나지 않음을 알 수 있다. 비표면적에서는 비호화 쌀 전분의 경우 대조구에 비하여 유체전단 균질기로 균질화된 것과 초음파 균질기로 균질화된 것이 각각 21.7배와 1.2배 정도 증가하였다. 이는 전분의 파괴로 인하여 비표면적이 기하급수적으로 증가되었기 때문이다. 호화 쌀 전분의 경우 대조구와 초음파 균질기로 균질화된 것의 경우에는 비슷한 값을 나타낸 반면 유체전단 균질기로 균질화된 경우에는 약 1.6배 증가하였다.
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평균크기(마이크론) |
비표면적(m2/g) |
쌀 전분 |
대조구 |
1.589 |
0.57 |
HHS |
0.424 |
12.37 |
UHS |
0.441 |
1.67 |
호화 쌀 전분 |
대조구 |
1.579 |
0.96 |
호화HHS |
0.505 |
0.53 |
호화UHS |
1.486 |
0.93 |
* HHS : 유체전단 균질기로 균질화된 쌀 전분, UHS : 초음파 균질기로 균질화된 쌀 전분
실시예 5. 쌀 전분 및 호화 쌀 전분의 광투과도
광투과도는 윌슨(Wilson) 등의 방법에 따라 쌀 전분 대 물의 비가 0.2%(w/v)의 시료현탁액을 60, 70, 80 및 90 ℃에서 5분간 가열한 다음 분광광도계를 사용하여 625nm에서 광투과도를 측정하였다. 쌀 전분과 호화 쌀 전분의 각 온도에 따른 광투과도의 결과는 각각 도 4와 도 5와 같다. 쌀 전분의 경우 대조구, 유체전단 균질기로 처리된 쌀 전분, 초음파 균질기로 처리된 쌀 전분 모두 60 ℃ 이후부터 광투과도의 증가속도가 높아지기 시작했으며 80 ℃ 이상에서는 급격한 증가현상을 나타내었다. 이는, 쌀 전분의 호화개시온도가 60 ℃부근 임을 알 수 있는 것이고 시간이 지남에 따라서 전분이 호화되면서 분자들간의 회합이 풀어져 광투과도가 증가되는 것이다. 이러한 광투과도는 저장시간이 지남에 따라 점차 감소하는데 아밀 로오스 길이가 짧을수록 광투과도가 더빨리 감소하며 이는 전분이 노화되면서 분자들간의 회합으로 인하여 광투과도가 상실되기 때문이다. 대조구의 광투과도는 균질기로 처리된 쌀 전분들에 비하여 80 ℃ 까지는 높게 나타났다. 빌리아데리스(Biliaderis) 등은 전분의 호화온도가 전분입자의 결정화도에 의해 영향을 받으며 이는 아밀로펙틴의 분지도가 클수록 결정화도가 낮아 호화온도를 낮추므로 광투과도의 변화 양상을 통하여 입자간 결합강도와 입자내부의 치밀한 정도를 예측할 수 있다고 하였다.
호화 쌀 전분의 경우는 세 가지 시료, 즉, 대조구, 유체전달 균질기로 처리된 호화 쌀 전분, 초음파 균질기로 처리된 호화 쌀 전분, 모두 50 ℃에서 80 ℃의 구간에서는 온도의 증가에 따른 광투과도의 증가현상은 미미하였으나, 80 ℃에서 90 ℃로 온도가 올라감에 따라서 광투과도의 급격한 증가를 보였다. 또한, 쌀 전분의 경우와는 아주 다르게 초음파 균질기로 처리한 호화 쌀 전분이 전반적으로 가장 높게 나타났으며, 그다음 유체전단 균질기로 처리한 호화 쌀 전분, 대조구 순서이었다. 90 ℃를 기준으로 각각 43.12, 34.91 및 20.80 순으로 나타났다.
실시예 6. 용해도, 팽윤력 및 물결합능력
용해도와 팽윤력은 스코치(Schoch)의 방법을 변형하여 쌀 전분, 유체전단 균질기로 처리한 쌀 전분(HHS), 초음파 균질기로 처리한 쌀 전분(UHS)과 호화 쌀 전분, 유체전단 균질기로 처리한 호화 쌀 전분(호화HHS), 초음파 균질기로 처리한 호화 쌀 전분(호화UHS) 각각 1g과 물 50ml를 원심분리관에 담아 잘 분산시킨 다음 90 ℃의 온도에서 30분간 가열한 다음 4500rpm에서 30분간 원심분리하여 측정하였다. 물결합능력은 메드카프(Medcaff)와 길레스(Gilles)의 방법에 따라 용해도와 팽윤력과 같은 시료 각각 2g에 증류수 40ml을 가하고 실온에서 1시간 동안 잘 저어준 다음 3000rpm의 속도로 20분간 원심분리한 후 1분간 거꾸로 세워 상등액을 제거하고 증가된 수분함량과 사료전분의 중량비로부터 물결합능력을 구하였다.
쌀 전분과 호화 쌀 전분의 90 ℃에서 용해도와 팽윤력 및 실온에서의 물결합능력 결과는 표 3과 같다. 쌀 전분과 호화 쌀 전분 모두 대조구 보다 균질기로 처리한 전분이 용해도에서 높은 값을 나타내었으며 쌀 전분 용해도에서는 13∼15% 증가를 보인 반면 호화 쌀 전분의 경우에는 171∼180%의 증가를 나타내었다. 전반적으로 호화 쌀 전분 그룹의 용해도가 쌀 전분 그룹 보다 높은 용해도를 보였다.
팽윤력 또한 쌀 전분의 경우 균질기로 처리한 시료가 78∼95% 높게 나타났으며 호화 쌀 전분은 43∼46% 증가를 보였다. 팽윤력은 쌀 전분이 수화되는 능력을 측정하는 것으로 전분입자 내부의 결합력과 전분입자의 회합정도에 따라 다르며 입자의 크기가 작을수록 팽윤력이 크게 나타나기 때문이다. 또한, 팽윤력은 전분입자내의 결정성과 상관관계를 가지며, 전분입자내의 결합력이 팽윤양상에 영향을 주어 결합정도가 강한 전분은 팽윤력에 대하여 강하게 저항하므로 온도증가에 따른 팽윤력을 비교하여 상대적인 결합정도를 알 수 있다.
물결합능력은 쌀 전분의 경우 세 가지 시료 모두 비슷하게 나타났으나 호화 쌀 전분의 경우 대조구와 유체전단 균질기로 처리한 전분은 비슷하였으나 초음파 균질기로 처리한 전분은 대조구의 약 50% 수준이었다. 호화 쌀 전분의 물결합능력 (369.60∼638.98)은 쌀 전분(108.49∼123.74)에 비하여 높게 나타났는데 이는 호화 쌀 전분을 동결건조 시킨 다음 시료의 물결합능력을 측정하였으므로 나타나는 현상이었다. 물결합능력은 전분입자내의 비결정성 부분에 의한 것으로 전분입자에 비결정성 부분이 많을수록, 전분입자의 내부치밀도가 낮을수록 수분흡수도가 크다고 알려져있다. 일반적으로 물결합능력이 낮은 전분에서는 OH기의 대부분이 물보다는 전분사슬끼리의 수소결합과 공유결합에 관여하여 결정성이 커지고 분자간 강한 회합을 한다.
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|
용해도(%) |
팽윤력 |
물 결합 능력 |
쌀 전분 |
대조구 |
11.07 |
13.27 |
123.74 |
HHS |
16.89 |
25.83 |
116.30 |
UHS |
12.46 |
23.65 |
108.49 |
호화 쌀 전분 |
대조구 |
37.20 |
5.96 |
638.98 |
호화HHS |
67.00 |
8.73 |
739.94 |
호화UHS |
63.65 |
8.55 |
369.60 |
* HHS : 유체전단 균질기로 균질화된 쌀 전분, UHS : 초음파 균질기로 균질화된 쌀전분
실시예 7. 유동특성
브룩필드(Brookfield) 점도계를 사용하여 회전속도를 2∼20rpm으로 변화시키면서 균질화시간, 입자크기 및 가수율에 따라서 겉보기 점도를 측정하였다.
브룩필드 점도계의 rpm 조건에서, 유체전단 균질기의 균질시간, 쌀 전분의 입자크기 및 가수율에 따른 겉보기 점도의 변화는 표 4와 같다. 모든 시료가 브룩필드 점도계의 rpm 이 증가함에 따라서 겉보기 점도는 줄어들었으며 이는 의가소성 성질을 가진 유체를 의미한다. 일반적으로 쌀 전분의 유동특성은 틱소트로피 (thixotrophy) 거동을 가지고 있으며 Herschel-Bulkley식이 가장 적합하다. 유체전단 균질기의 균질시간이 20500rpm 조건에서 증가함에 따라서 겉보기 점도는 큰 감소를 보였다. 이는, 유체전단 균질기가 입자의 크기를 작게 만들기 때문으로 사료된다. 쌀 전분의 입자크기면에서는 42∼100 메쉬체와 100+메쉬체로 구분하여 볼 때 모든 시료에서 100+메쉬의 점도가 작게 나타났는데 이것은 앞서의 유체전단 균질기에서의 효과와 같은 현상 즉, 입자크기가 작을수록 겉보기 점도는 작아진다는 것을 의미한다. 가수율을 5:1과 10:1로 조절하였을 때의 겉보기 점도를 비교하여 보면 겉보기 점도에서 매우 큰 차이를 보이고 있으며 썰 전분용액의 농도가 높을수록 겉보기 점도는 증가함을 알 수 있었다.
RPM |
대조구 (호화쌀 전분) |
10분1)
(호화HHS) |
20분 (호화HHS) |
42-100 메쉬 |
100+ 메쉬 |
42-100 메쉬 |
100+ 메쉬 |
42-100 메쉬 |
100+ 메쉬 |
5:12)
|
10:1 |
5:1 |
10:1 |
5:1 |
10:1 |
5:1 |
10:1 |
5:1 |
10:1 |
5:1 |
10:1 |
2 |
974.00 |
95.00 |
380.00 |
58.50 |
288.00 |
1.32 |
71.50 |
1.58 |
82.20 |
0.95 |
59.80 |
0.49 |
4 |
542.00 |
51.75 |
240.00 |
39.00 |
171.00 |
1.10 |
47.50 |
1.08 |
55.80 |
0.79 |
35.00 |
0.46 |
10 |
298.00 |
25.25 |
126.00 |
18.70 |
96.40 |
0.81 |
27.30 |
0.84 |
33.12 |
0.62 |
17.76 |
0.39 |
20 |
185.40 |
15.80 |
79.80 |
11.50 |
59.20 |
0.17 |
16.50 |
0.83 |
10.06 |
0.56 |
11.70 |
0.35 |
1) 유체전단 균질기로 균질화된 시간
2) 가수율(물:전분)
실시예 8. 호화특성
DSC(Differential Scanning Calorimeter)를 사용하여 크래그(Krag) 등의 방법을 변형하여, 밀폐형(hermatic) 알루미늄 팬에 대조구 쌀 전분, 유체전단 균질기(20,500 rpm)나 초음파 균질기(펄스 5초, 발진 주파수 40 KHz)로 10분간 처리한 쌀 전분 각각 1mg 및 증류수 2ml를 넣고 밀봉하였다. 대조구 팬에는 증류수를 사용하였으며 30 ℃로부터 100 ℃까지 5 ℃/min 속도로 가열하여 흡열 피크를 얻었으며 이 피크로부터 호화특성을 분석하였다.
대조구 쌀 전분과 균질기로 처리한 쌀 전분들의 호화특성은 DSC로 측정한 결과 도 6과 같다. 대조구 쌀 전분(A)에 비하여 유체전단 균질기나 초음파 균질기로 10분간 처리한 쌀 전분(B, C)의 경우가 호화개시온도(T0), 호화최대온도(Tp) 및 호화엔탈피(△H0)가 크게 나타났다. 대조구 쌀 전분(A)의 T0와 Tp 및 △H
0는 각각 53.89℃, 62.26℃ 및 11.82J/g으로나타났다. 유체전단 균질기 및 초음파 균질기로 처리한 쌀 전분(B, C)은 각각 54.55℃, 65.46℃ 및 13.49J/g과 54.46℃, 80.86℃ 및 63.48J/g으로 나타났으며 그만큼 호화가 어렵다는 것을 의미한다. 이는 처리과정에서의 새로운 결정 또는 재결정 그리고 입자내의 작은 결정성 영역이 커지는 것에 의한 현상이다.
실시예 9. 저장성
1) 일반세균
저장기간별 유체전단 균질기(20,500 rpm)나 초음파 균질기(펄스 5초, 발진 주파수 40 KHz)로 10분간 처리한 호화쌀 전분을 무균적으로 채취하여 멸균생리식염수에 넣고 잘 으깬 후 전분이 1% 함유된 NR(nutrient agar) 배지에 도말하여 36 ℃의 배양기에서 48시간 배양 후 균수를 측정하였다.
2) 진균
희석배양법을 사용하여 유체전단 균질기(20, 500 rpm)나 초음파 균질기(펄스 5초, 발진 주파수 40 KHz)로 10분간 처리한 호화쌀 전분 약 1g을 0.05% 배지 용액에 가하고 균일기로 균일한 현탁액을 만들고 0.05% agar 용액으로 희석한 다음 분리배지에서 클로람페니콜(chloramphenicol)첨가 배지나 PDA(potato dextrose agar)배지나 YM agar를 사용하여 진균수를 산출하였다.
3) 황색포도상구균
무균적으로 채취한 유체전단 균질기(20, 500 rpm)나 초음파 균질기(펄스 5초, 발진 주파수 40 KHz)로 10분간 처리한 호화쌀 전분을 희석한 다음 7.5% 식염을 가한 TSB(trypticase soy broth) 시험관에 접종하고 37 ℃에서 48시간 배양하였다. 증식이 된 시험관에서 균액 1백금량씩을 분리배지인 MSEY agar에서 황색포도상구균 성상과 일치한 집락을 검출한 시험관을 양성으로 세어 최확수법에 따라서 균수를 산출하였다.
유체전단 균질기로 처리된 호화 쌀 전분의 수분함량을 진공농축기를 사용하여 40%로 하여 멸균된 200㎖ 스크류 캡병에 담아 4℃ 및 20℃에서 저장하면서 총균 수, 진균수 및 황색포도상구균수를 측정한 결과는 각각 도 7, 8 및 9와 같다. 총균수는 저장 초기 1.5 X 103CFU/ml 수준이었으나 4℃의 저장온도에서는 20℃보다 균주의 증식속도가 낮았으며 저장 24일에서는 4℃와 20℃에서 각각 2.4 X 105CFU/ml 및 1.5 X 106CFU/ml까지 증식하였다. 진균수는 저장초기에는 나타나지 않았으나 저장과정에서 증식하기 시작하였으며 4℃와 20℃에서 24일간 저장 후 각각 2.8 X 104CFU/ml와 1.6 X 105CFU/ml를 나타내었다. 일반적으로 용기 포장 후 진균수는 시료 1g당 1000개 이하로 규제되고 있다. 황색포도상구균은 사람과 동물의 장관내, 피부, 점막표면 등 자연계에 널리 분포하여 있으며 대표적인 독소형 식중독으로 발생율이 가장 높다. 저장 초기에는 나타나지 않았으나 저장 시간이 지남에 따라서 나타났고, 4℃ 저장에서 24일 후에는 1.4 X 104CFU/ml이었으며 20℃에서는 24일 후에는 1.69 X 105CFU/ml로 식중독을 일으키는데 필요한 독소생산인 105CFu/g으로 나타났다.
실시예 10. 성장과 식이 섭취량
4주령 된 (평균 체중 92.8g) Sprague-Dawley 종 수컷 흰쥐 (대한실험동물센터) 32 마리를 실험조건을 일정하게 하기 위해 환경이 조절된 실험동물 사육실에서 1주일간 펠렛(pellet) 형 고형사료(제일사료)로 적응시킨 후, 평균 체중이 유사하 도록 4군으로 나누어 섭취하는 탄수화물의 종류를 달리한 4종의 실험식이를 4주동안 급여하였다. 실험군의 분류는 호화된 것으로서 1) 일반 쌀 전분 섭취 군(rice starch control, RC군), 2) 초음파 균질기에 의해 물리적 변성된 쌀 전분 섭취군(ultrasonic homogenized rice starch, RU군), 3) 유체전단 균질기로 물리적 변성된 쌀 전분 섭취군(hydroshear homogenized rice starch, RH군), 4)옥수수 전분 섭취군(corn starch, CS군)으로 하였다. 실험 식이는 표 5와 같이 AIN-93G 식이를 약간 변형한 기본식이를 공급하였다.
실험식이의 원료로는 정제된 카제인(Junsei 화학, 일본사), 옥수수 전분(삼양사), 대두유(제일제당), 설탕(제일제당), 알파-셀룰로오스 (Sigma Chem., USA)을 사용하였으며 비타민 혼합물(AIN-93G)와 미네랄 혼합물(AIN-93G)은 조제하여 사용하였다.
(g/1kg 식이)
성분 |
RC |
RU |
RH |
CS |
카세인 |
200.000 |
200.000 |
200.000 |
200.000 |
쌀 전분, 대조구 |
529.486 |
|
|
|
쌀 전분, UHS |
|
529.486 |
|
|
쌀 전분,HHS |
|
|
529.486 |
|
옥수수 전분 |
|
|
|
529.486 |
슈크로오스 |
100.000 |
100.000 |
100.000 |
100.000 |
콩 오일 |
70.000 |
70.000 |
70.000 |
70.000 |
셀룰로오스 |
50.000 |
50.000 |
50.000 |
50.000 |
미네랄 혼합물1)
|
35.000 |
35.000 |
35.000 |
35.000 |
비타민 혼합물2)
|
10.000 |
10.000 |
10.000 |
10.000 |
L-시스틴 |
3.000 |
3.000 |
3.000 |
3.000 |
콜린 주석산수소염 (41.1% 콜린) |
2.500 |
2.500 |
2.500 |
2.500 |
tert-부틸하이드로퀴논 |
0.014 |
0.014 |
0.014 |
0.014 |
1) AIN-93G 미네랄 혼합물(g/kg mix)
무수 탄산칼슘(Calcium carbonate, anhydrous) 357.00 : 제1인산칼륨(Potassium phosphate, monobasic) 196.00 : 구연산 칼륨(potassium citrate, tri-potassium, monohydrate) 70.78 : 염화 나트륨(Sodium chloride) 74.00 : 황산칼륨(potassium sulfate) 46.60 : 산화 마그네슘(Magnesium oxide) 24.00 : 구연산철(ferric citrate) 6.06 : 탄산 아연(Zinc carbonate) 1.65 : 탄산 망간(manganous carbonate) 0.63 : 탄산 구리(Cupric carbonate) 0.30 : 요오드산 칼륨(Potassium iodate) 0.01 : 무수 셀렌산나트륨(Sodium selenate, anhydrous) 0.01025 : 파라몰리브덴산 암모늄(Ammonium paramolybdate, 4 hydrate) 0.00795 : 메타규산나트륨, 9 수화물(Sodium meta-silicate, 9 hydrate) 1.45 : 크롬(Ⅲ) 칼륨 황산염, 12 수화물(Chromium potassium sulfate, 12 hydrate) 0.275 : 염화 리튬(Lithium chloride) 0.0174 : 붕산(Boric acid) 0.0815 ; 불화 나트륨(Sodium fluoride) 0.0635 : 탄산 니켈(Nickel Carbonate) 0.0318 : 바나듐산 암모늄(Ammonium vanadate) 0.0066 : 분말 설탕(Powdered sucrose) 221.026
2) AIN 93G 비타민 혼합물 (g/kg mix)
니코틴산(nicotinic acid) 3.000 : 판토텐산 칼슘(Ca panthothenate) 1.600 : 염산 피리독신(Pyridoxine-HCl) 0.700 : 염산 치아민(Thiamin-HCl) 0.600 : 리보플라빈(Riboflavin) 0.600 : 엽산(Folic acid) 0.200 : 바요주석(D-Biotin) 0.020 : 비타민 B12(시아노코발아민; cyanocobalamin) 2.500 : 비타민 E(all-rac-℃-토코페릴 아세테이트; all-rac-℃-tocopheryl acetate, 500IU/g) 15.000 : 비타민 A(all-trans-레티닐 팔미테이트; all-trans-retinyl palmitate, 500,000IU/g) 0.800: 비타민 D3(콜레칼시페롤; cholecalciferol, 400,000IU/g) 0.250 : 비타민 K(필로퀴논; phylloquinone) 0.075 : 분말 설탕(Powdered sucrose) 974.655
실험동물은 스테인레스 우리에 한 마리씩 분리 사육하였으며 사육실의 환경 은 온도 21±2℃, 상대습도(60±5%). 명암은 12시간 주기(빛 6:00AM - 6:00PM)로일정하게 유지하였다. 실험 식이와 물은 자유롭게 섭취하도록 하였다. 체중은 일주일에 한번 같은 시각에 측정하였으며, 식이 섭취량은 2일에 1번 일정시간에 측정하여 식이 효율을 계산하였다.
실험 기간동안의 성장곡선은 도 10에, 식이섭취량, 체중증가량, 식이효율은 표 6에 제시하였다. 체중증가량 및 식이효율은 탄수화물의 섭취에 따른 유의적인 영향을 받지 않았으나 RH군의 일 체중증가량과 식이섭취량이 비교적 높은 편이었다.
|
식이섭취량(g/일) |
체중증가량(g) |
식이효율(FER) |
RC |
17.49±2.60NS2)
|
5.15±0.90NS
|
0.29±0.02NS
|
RU |
17.71±1.66 |
5.20±1.19 |
0.29±0.05 |
RH |
19.09±1.54 |
5.57±0.44 |
0.29±0.02 |
CS |
17.87±2.47 |
5.26±1.12 |
0.29±0.05 |
1) 평균±SD
2) NS : 유의적 차이 없음(not significant)
3) RC: 일반 쌀 전분 섭취 군, RU: 초음파 균질기에 의해 물리적 변성된 쌀 전분 섭취군, RH: 유체전단 균질기로 물리적 변성된 쌀 전분 섭취군, CS: 옥수수 전분 섭취군
실시예 11. 장 기능
장 통과시간은 사육 2주 후에 12시간 절식시킨 후 실험동물 1마리당 사료 2g에 10% 카민레드(Carmine red)(Sigma Chem. CO., USA)를 1㎖ 첨가하여 섭취시킨 후 실험사료를 급여하였고 그 후 붉은색 변이 나오는 처음시간으로 하였다.
실험종료 전 실험동물을 대사장으로 옮겨 72시간 동안의 변을 채취하여 수분 중량을 측정한 후, -50℃에서 냉동시켰다가 항량에 도달할 때까지 건조시킨 다음 건조 중량을 측정하고 수분 중량과의 차이를 수분 함량으로 하였다.
물리적 변성 쌀 전분의 섭취가 장 내용물의 장 통과시간(GI transit time), 분변 배설량, 분변 중 고형물과 수분의 함량에 미치는 효과는 표 7과 같다. 각 실험군의 장 통과시간은 732.3∼826.4분으로 RH군의 장 통과시간이 가장 길었으며 CS군, RU군, RC군 순으로 짧았다. RH군은 RC군에 비해 통계적으로 유의하게 장 내용물의 장통과 시간이 길었다. 분변의 총량과 고형물량(건조 중량), 수분함량은 모든 실험군에서 유의적인 차이가 없었으나 RH군의 분변배설량이 다른 군에 비해 비교적 높은 편이었다. 분변의 건조 중량도 쌀 전분 섭취군이 옥수수 섭취군에 비해 높은 편이었다.
|
WFW |
DFW |
수분함량(%) |
GI 통과시간(분) |
RC |
1.21±0.42NS2)
|
0.87±0.24NS
|
26.59±8.13NS
|
732.3±80.3b3)
|
RU |
1.29±0.31 |
0.89±0.21 |
29.79±12.45 |
756.6±83.2ab
|
RH |
1.43±0.71 |
0.97±0.39 |
28.30±13.73 |
826.4±72.9a
|
CS |
1.08±0.40 |
0.72±0.18 |
31.38±7.99 |
794.4±72.9ab
|
1) 평균±SD
2) NS: 유의적 차이 없음
3) 컬럼 내에서 다른 위첨자를 가진 값들은 Duncan의 다 범위 검정(Duncan's multiple range test)에 의해 군 사이에 α=0.05 수준에서의 유의적 차이 있음.
4) WFW : 수분 분변 중량(Wet fecal weight)
5) DFW : 건조 분변 중량(Dry fecal weight)
6) RC: 일반 쌀 전분 섭취 군, RU: 초음파 균질기에 의해 물리적 변성된 쌀 전분 섭취군, RH: 유체전단 균질기로 물리적 변성된 쌀 전분 섭취군, CS: 옥수수 전분 섭취군
실시예 12. 비피더스 증식효과
실험 식이를 섭취한 0, 4주째 되는 날에 쥐의 항문을 자극하여 분변을 인위적으로 채취하여 멸균 포스페이트 버퍼(phosphate buffer)에 일정 농도로 희석한 후, 비피도박테리아(bifidobacteria) 선택용 배지인 BL 한천배지(Becton & Dickenson, C0., USA)에 항생물질을 첨가한 BS배지를 사용하여 혐기성 배양기에서 37℃로 72시간 배양한 후 균수를 측정하였다. 배지의 조성은 표 8과 같다.
BS agar 배지의 조성
조성 |
함량 |
BL agar 배지 |
1000 ㎖ |
BS 용액 |
50 ㎖ |
프로피온산 나트륨 |
30 g |
황산 파로모마이신 |
100 mg |
황산 네오마이신 |
400 mg |
염화리튬 |
6 g |
증류수 |
100 ㎖ |
표 9에는 장내의 비피더스 균수 측정에 대한 결과를 제시하였다. 실험식이 투여 전에는 비피더스 균수는 각 실험군들간에 유의적 차이가 없었고, 실험식이를 투여한 후 4주에 탄수화물 섭취에 의한 영향을 받아 쌀 전분 섭취군에서 옥수수군 섭취군에 비해 비교적 많이 증가하였으며, RH군이 가장 많이 증가하여 CS군에 비해 유의하게 높았다.
쥐 분변 비피도박테리아의 수 (log colony forming unit(cfu)/g wet feces)
|
0 주 |
4 번째 주 |
RC |
8.06±0.12NS2)
|
8.45±0.40ab3)
|
RU |
8.26±0.30 |
8.48±0.12ab
|
RH |
8.07±0.21 |
8.67±0.17a
|
CS |
8.09±0.26 |
8.27±0.35b
|
1) 평균±SD
2) NS: 유의적 차이 없음
3) 컬럼 내에서 다른 위첨자를 가진 값들은 Duncan의 다 범위 검정(Duncan's multiple range test)에 의해 군 사이에 α=0.05 수준에서의 유의적 차이 있음.
4) RC: 일반 쌀 전분 섭취 군, RU: 초음파 균질기에 의해 물리적 변성된 쌀 전분 섭취군, RH: 유체전단 균질기로 물리적 변성된 쌀 전분 섭취군, CS: 옥수수 전분 섭취군
실시예 13. 기관의 성장
장기 조직중의 DNA, RNA, 단백질 함량은 조직을 균질기로 분쇄하여 적정농도로 희석한 후, DNA 함량은 디페닐아민법(diphenylamine method), RNA의 함량은 오시놀법(Orcinol method)으로 비색정량하였다. 조직의 단백질 함량은 로리법(Lowry method)으로 비색정량하였다.
간조직의 성장
간조직의 무게는 표 10에 제시된 바와 같이 쌀 전분 섭취군이 옥수수 전분 섭취군에 비해 높았으며 RU군은 CS군에 비해 유의적으로 높았다. DNA 함량과 RNA 함량, protein 함량은 각 실험군 간에 유의적인 차이가 없었으나, RH군에서 RNA 함량과 단백질 함량이 다른 군에 비해 높은 편이었다. 단백질 함량도 쌀 전분 섭취군이 유의적이지는 않았으나 옥수수 전분 섭취군에 비해 많았다.
|
수분 중량 (g) |
DNA(mg) |
RNA(mg) |
단백질(mg) |
단백질/DNA |
RC |
7.88±1.09ab3) |
21.0±0.3NS2) |
98.25±13.65NS |
488.8±80.4NS |
23.3±2.8NS |
RU |
9.05±1.64a |
20.1±0.2 |
99.02±17.97 |
521.6±17.97 |
25.9±2.8 |
RH |
7.97±0.86ab |
20.2±0.2 |
105.45±16.47 |
540.3±160.2 |
26.4±4.6 |
CS |
7.54±1.42b |
19.7±0.3 |
105.21±13.35 |
475.1±738.2 |
25.6±9.9 |
1) 평균±SD
2) NS : 유의적 차이 없음
3) 컬럼 내에서 다른 위첨자를 가진 값들은 Duncan의 다 범위 검정(Duncan's multiple range test)에 의해 군 사이에 α=0.05 수준에서의 유의적 차이 있음.
4) RC: 일반 쌀 전분 섭취 군, RU: 초음파 균질기에 의해 물리적 변성된 쌀 전분 섭취군, RH: 유체전단 균질기로 물리적 변성된 쌀 전분 섭취군, CS: 옥수수 전분 섭취군
신장조직의 성장
신장의 무게, DNA함량은 각 실험군들 간에 유의적인 차이가 없었다(표 11). 그러나 RNA 함량은 탄수화물 급원의 영향으로 RH군이 RC군과 CS군에 비해 유의하게 높았으며, 쌀 전분 섭취군이 옥수수 전분 섭취군에 비해 높아졌다. 단백질 함량은 통계적인 유의성은 없었으나 쌀 전분 섭취군이 옥수수전분 섭취군에 비해 높은 편이었다. 단백질/DNA 비율도 물리적 변성 쌀 전분 섭취군인 RH군과 RU군이 일반 쌀전분 섭취군인 RC군과 옥수수 전분 섭취군(CS군)에 비해 높은 편이었다. 단백질/DNA 비율은 세포의 크기를 나타내주는 지표로 물리적 변성 쌀 전분이 신장조직의 세포의 크기를 증가시키는 것으로 사료된다.
|
수분 중량 (g) |
DNA(mg) |
RNA(mg) |
단백질(mg) |
단백질/DNA |
RC |
2.15±0.20NS2)
|
2.53±0.44NS
|
32.25±8.53bc3)
|
290.0±95.9NS
|
114.2±31.6NS
|
RU |
2.17±0.21 |
2.69±0.57 |
37.18±7.38ab
|
328.1±101.0 |
130.2±49.8 |
RH |
2.11±0.17 |
2.54±0.48 |
40.85±5.50a
|
333.5±106.8 |
134.0±54.1 |
CS |
2.06±0.23 |
2.38±0.71 |
28.78±6.99c
|
272.2±137.2 |
114.6±50.7 |
1) 평균±SD
2) NS: 유의적 차이 없음
3) 컬럼 내에서 다른 위첨자를 가진 값들은 Duncan의 다 범위 검정(Duncan's multiple range test)에 의해 군 사이에 α=0.05 수준에서의 유의적 차이 있음.
4) RC: 일반 쌀 전분 섭취 군, RU: 초음파 균질기에 의해 물리적 변성된 쌀 전분 섭취군, RH: 유체전단 균질기로 물리적 변성된 쌀 전분 섭취군, CS: 옥수수 전분 섭취군
심장조직의 성장
심장 조직의 무게, DNA, RNA, 단백질, 단백질/DNA 비율에 대한 결과는 표 12와 같다. 심장의 무게, DNA, RNA, 단백질/DNA 비율은 실험식이 섭취에 따른 영향을 유의적인 차이가 없었다. 단백질 함량은 RC군이 RH군에 비해 유의하게 높았으며 RC군, RU군, CS군, RH군 순으로 낮아졌다. 단백질/DNA 비율은 RC군과 RU군이 유의하지는 않으나 RH군과 CS군에 비해 높은 경향이었다.
|
수분 중량 (g) |
DNA(mg) |
RNA(mg) |
단백질(mg) |
단백질/DNA |
RC |
0.98±0.10NS2)
|
17.7±2.4NS
|
22.18±3.64NS
|
274.3±52.4a3)
|
25.9±7.4NS
|
RU |
1.06±0.15 |
16.8±2.7 |
20.86±5.06 |
257.4±60.5ab
|
25.7±6.9 |
RH |
1.02±0.13 |
15.6±2.3 |
24.13±5.82 |
203.2±34.6b
|
21.0±2.0 |
CS |
0.96±0.13 |
17.7±2.4 |
22.48±4.42 |
231.0±47.4ab
|
21.5±5.6 |
1) 평균±SD
2) NS: 유의적 차이 없음
3) 컬럼 내에서 다른 위첨자를 가진 값들은 Duncan의 다 범위 검정(Duncan's multiple range test)에 의해 군 사이에 α=0.05 수준에서의 유의적 차이 있음.
4) RC: 일반 쌀 전분 섭취 군, RU: 초음파 균질기에 의해 물리적 변성된 쌀 전분 섭취군, RH: 유체전단 균질기로 물리적 변성된 쌀 전분 섭취군, CS: 옥수수 전분 섭취군
실시예 14. 생리기능
혈액은 실험기간 종료 전 12시간 굶긴 동물을 단두하여 혈액을 채취하였으며, 3,000rpm에서 30분간 원심분리하여 혈청을 채취한 후 분석 전까지 -50℃에서 냉동 보관하였다. 혈액채취 후 즉시 간, 심장, 신장을 떼어 지방을 제거하고 냉장 생리식염수에 세척한 다음 필터 패터(filter pater)로 수분을 제거한 후 무게를 측정하고 분석을 위해 바로 - 50℃에서 냉동 보관하였다.
혈청중의 총단백질, 알부민, 총빌리루빈, GOT, GPT, 요소 N, 크레아티닌과 소변의 크레아티닌, 요소-N은 효소법을 이용한 Kit(인화제약(주))로 측정하였다.
간기능
간기능을 나타내주는 지표인 혈중 GOT, GPT 활성은 모든 실험군은 정상범위내에서 차이가 없었으나 RH군이 다른 실험식이 섭취군에 비해 비교적 낮았다(표 13). 총빌리루빈도 간기능을 나타내 줄 수 있는 지표로 간세포 장해가 있거나 유아에 있어서 간내 담즙의 배설이 불완전할 때 그 수치가 증가한다. 본 연구의 각 실험군의 총 빌리루빈의 농도도 모두 정상범위내였으며 통계적인 유의성은 없었으나 물리적 변성 쌀 전분 섭취군인 RU군과 RH군이 RC군과 CS군에 비해 낮은 편이었다. 간기능 성숙을 나타내주는 혈중 요소-N은 RH군과 CS군이 RC군과 RU군에 비해 낮았으며, RH군은 RU군에 비해 통계적으로 유의하게 낮았다.
|
GOT (KA/㎗) |
GPT (KA/㎗) |
총 빌리루빈 (mg/㎗) |
요소 N (mg/㎗) |
RC |
121.3±34.7NS2)
|
45.41±12.8NS
|
0.36±0.23NS
|
17.3±3.7ab3)
|
RU |
122.3±38.2 |
48.7±10.0 |
0.26±0.19 |
17.9±2.2a
|
RH |
105.4±16.1 |
35.8±5.4 |
0.17±0.21 |
14.4±3.0b
|
CS |
125.4±14.0 |
40.6±8.0 |
0.33±0.24 |
14.6±2.7ab
|
1) 평균±SD
2) NS: 유의적 차이 없음
3) RC: 일반 쌀 전분 섭취 군, RU: 초음파 균질기에 의해 물리적 변성된 쌀 전분 섭취군, RH: 유체전단 균질기로 물리적 변성된 쌀 전분 섭취군, CS: 옥수수 전분 섭취군
신장 기능
성장기에 탄수화물 섭취 급원의 차이에 따른 신장기능의 차이를 확인하기 위해 혈청 총단백질, 알부민 및 알부민/글로블린(A/G) 비율과 신장손상의 지표로 사용될 수 있는 혈청 요소 N과 크레아티닌 함량의 결과는 표 14에 제시하였다.
혈청 총 단백질과 알부민은 각 실험군간의 통계적인 유의성은 없었다. A/G 비율은 RU군과 RH군이 RC군과 CS군에 비해 다소 높은 편이었다. 혈중 크레아티닌 함량은 RU군이 유의하게 낮았으며, CS군에서 가장 높았다.
|
총 단백질 (mg/㎗) |
알부민 |
A/G |
크레아티닌 (mg/㎗) |
RC |
6.25±0.82NS2) |
3.59±0.31NS |
1.51±0.52NS |
1.59±0.43ab3) |
RU |
6.45±1.19 |
3.95±0.38 |
2.37±2.34 |
1.26±0.26b |
RH |
6.37±0.80 |
3.78±0.74 |
2.47±2.78 |
1.60±0.55ab |
CS |
6.22±0.25 |
3.84±0.39 |
1.68±0.41 |
1.78±0.33a |
1) 평균±SD
2) NS: 유의적 차이 없음
3) 컬럼 내에서 다른 위첨자를 가진 값들은 Duncan의 다 범위 검정(Duncan's multiple range test)에 의해 군 사이에 α=0.05 수준에서의 유의적 차이 있음.
4) RC: 일반 쌀 전분 섭취 군, RU: 초음파 균질기에 의해 물리적 변성된 쌀 전분 섭취군, RH: 유체전단 균질기로 물리적 변성된 쌀 전분 섭취군, CS: 옥수수 전분 섭취군
신장기능의 차이를 알아 보기 위해 뇨중 요소-N, 크레아티닌 함량 및 크레아티닌 클리어런스(clearance)로 사구체여과율을 측정한 결과는 표 15와 같다. 뇨의 크레아티닌 함량은 RU군과 RH군이 RC군에 비해 유의하게 높았다. 요소 N은 RC군이 다른 물리적 변성 쌀 전분 섭취군에 비해 낮았으며, RU군과는 통계적으로 유의하게 낮았다. 사구체여과율(GFR)은 정상 범위이내였으며, RU군이 다른 식이 섭취군에 비해 유의하게 높았다.
|
크레아티닌 (mg/㎗) |
요소-N (mg/㎗) |
GFR (㎖/min) |
RC |
6.18±2.19b2) |
204.8±63.9b |
0.72±0.35b |
RU |
9.81±3.01a |
340.0±111.8a |
1.32±0.46a |
RH |
8.91±3.93a |
298.5±63.9ab |
0.92±0.31b |
CS |
7.37±1.69 |
241.0±62.5 |
0.81±0.18 |
1) 평균±SD
2) 컬럼 내에서 다른 위첨자를 가진 값들은 Duncan의 다 범위 검정(Duncan's multiple range test)에 의해 군 사이에 α=0.05 수준에서의 유의적 차이 있음.
3) RC: 일반 쌀 전분 섭취 군, RU: 초음파 균질기에 의해 물리적 변성된 쌀 전분 섭취군, RH: 유체전단 균질기로 물리적 변성된 쌀 전분 섭취군, CS: 옥수수 전분 섭취군