KR100600691B1

KR100600691B1 - 활성 물질의 담체 매트릭스로의 결합

Info

Publication number: KR100600691B1
Application number: KR1020007011361A
Authority: KR
Inventors: 마리에-로우이세 안데르슨; 카테리네 보이시어; 아네 마리에 주포; 아네테 라르슨
Original assignee: 아스트라제네카 아베
Priority date: 1998-04-14
Filing date: 1999-04-09
Publication date: 2006-07-19
Also published as: AU4066399A; JP2002511400A; ID29286A; US6372260B1; ATE329580T1; KR20010042660A; TR200002960T2; WO1999052507A1; CA2327522A1; SE9801287D0; HUP0102305A3; PL344077A1; IL138635A0; BR9909636A; DE69931904T2; CN1201728C; NO20005150D0; PT1069890E; DK1069890T3; AR019262A1

Abstract

본 발명은 성분들의 에멀젼 형성 및 유동 기체 기술을 이용한 시스템의 침전에 의한 활성 물질의 담체 시스템으로의 결합 방법에 관한 것이다.

초임계 유체, 담체 시스템

Description

활성 물질의 담체 매트릭스로의 결합 {Incorporation of Active Substances in Carrier Matrixes}

본 발명은 성분들의 에멀젼을 형성하고, 유동 기체 기술을 이용해 시스템을 침전시켜, 담체와 회합된 활성 물질을 포함하는 제제의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 방법에 의해 얻어진 제제에 관한 것이다.

입자 시스템을 얻기 위해 담체 매트릭스에 활성 성분을 결합시키는 문제점을 해결하는 여러 방안이 제안되어 왔다. 이러한 시스템은 예를 들어, 중간 방출 제제, 개질 방출 제제, 서방성 제제, 펄스 방출 제제 등에 사용될 수 있다.

이러한 기술의 몇몇 예에는

- 고온 용융 마이크로캡슐화 (Schwope 등의 Life Sci. 1975 , 17, 1877),

- 계면 중합반응 (Birrenbach and Speiser, J. Pharm.Sci. 1976, 65, 1763, Thies, In Encyclopedia of Chemical Technology, 4 ed. Ed. Kirk-Othmer, 1996, 16, 페이지 632),

- 용매 증발법 (Cleland, In Vaccine Design. The subunit and adjuvant approach, Eds: Powell and Newman Plenum Press, New York, 1995, 439),

- 용매 추출법 (Cleland, In Vaccine Design. The subunit and adjuvant approach, Eds: Powell and Newman Plenum Press, New York, 1995, 439),

- 분무 건조법 (국제 특허 출원 공개 제94/15636호)이 있다.

이러한 시스템의 제조에서 중요한 단계는 활성 물질의 결합 단계이다. 방출 시스템의 제조 방법은 결합될 활성 물질의 종류 및 수송 시스템으로부터의 활성 성분의 바람직한 방출 특성에 따라 결정된다. 위에 기재된 모든 기술은 장점 및 단점을 갖고 있다. 예를 들어, 고온 용융 마이크로캡슐화 방법은 감열성 활성 물질에 부적합하다. 계면 중합반응 방법에는 물 불혼화성 용매 중 높은 반응성 단량체가 코어 물질 및 캡슐화된 활성 물질 모두와 반응할 수 있다는 단점이 있다. 용매 증발법은 시간 소모적이며, 배치식으로만 수행될 수 있다는 단점이 있다. 용매 증발 기술과 마찬가지로 추출법도 또한 배치식으로만 수행될 수 있어 시간 소모적이다. 분무 건조법은 나노미터 크기 범위의 입자를 형성하기 어렵다는 단점이 있다. 이 방법은 또한 공정 중에 열 및 공기에 노출되므로 감열성 물질 또는 감산화성 활성 물질에 부적합하다.

초임계 유체 기술은 최근에 개발되었다. 간단히 말하면, 초임계 유체는 임계 압력 및 임계 온도 동시에서의 또는 그 이상에서의 유체로 정의될 수 있다. 초임계 유체의 물리화학적 특성은 온도 및 압력에 따라 유동적이며, 주어진 응용에 맞도록 선택될 수 있는 것이다. 오늘날 이용되는 여러 신기술 중 하나는 초임계 용액의 급속 팽창 (rapid expansion of supercritical solutions)(RESS)이고, 다른 하나는 기체 항용매 침전법(gas anti-solvent precipitation)(GAS)으로서 공지되어 있다. GAS 기술에서는 대상 물질이 종래의 용매에 용해되고, 이산화탄소와 같은 초임계 유체가 이 용액에 도입되어 용액 부피의 급속 팽창을 일으킨다. 그 결과 용매력이 단기간 동안 극적으로 감소하여 입자의 침전이 유도된다 (J. W. Tom 및 P. G. Debenedetti의 J. Aerosol Sci., 22 (1991), 555-584; P. G. Debenedetti 등의 J. Controlled Release, 24 (1993), 27-44 및 J. W. Tom 등의 ACS Symp Ser 514 (1993) 238-257; 유럽 특허 제437 451호 (업죤(Upjohn)) 및 유럽 특허 제322 687호 (슈발츠 파마(Schwarz Pharma)) 참조). GAS 시스템의 변형된 방법이 최근 개발되었다 (국제 특허 출원 공개 제95/01221호 및 국제 특허 출원 공개 제96/00610호). 이는 입자 형성을 위해 초임계 유체 기술을 이용하는 SEDS (초임계 유체에 의한 용액 촉진 분산 (solution enhanced dispersion by supercritical fluid)) 공정이라고도 불린다.

단백질은 상기 기재된 캡슐화 방법으로 다른 활성 물질과 같이 담체 매트릭스내에 결합될 수 있다. 단백질은 수상에 용해되며, 담체를 함유한 상에 현탁되거나 직접적으로 용해된다. 유기 용매에 용해된 단백질의 단점은 유기 용매 및 초임계 유체/개질 초임계 흐름 중 단백질의 낮은 용해성이다 (Stahl 등의 "Dense Gas Results", Fluid Phase Equilibra, 1983, 10, 269). 유기 용매에 직접 용해되거나 현탁된 단백질의 다른 단점은 유기 용매에 의해 단백질이 개열되거나 변성될 수 있다는 점이다 (Dill 및 Shortle의 Ann. Rev. Biochem., 1991, 60, 795-825). 이로 인해 치료학적 효과, 예를 들어 면역학적 효과가 손실될 수 있다.

초임계 유체 기술에서 순수 단백질 입자의 제조를 위해 단백질을 DMSO에 직접 용해하거나 (Winters 등의 J.Pharm.Sci., 1996, 85, 586-594 및 Pharm.Res., 1997, 14, 1370-1378), 또는 DMSO에 용해된 중합체 및 단백질과 함께 중합체와의 공침물에 용해하였다 (국제 특허 출원 공개 제9629998호 및 Bertucco 등의 In High Pressure Chemical Engineering, 1996, 217-222). 심지어 에탄올 및 물의 혼합물을 SAS에서 단백질 및 중합체의 용매로서 사용해왔다 (유럽 특허 제0542314호 및 Tom 등의 In Supercritical Fluid Engineering Science, ACS Symposium Series, 1993, 514, 238-257).

단백질 입자는 수용액으로부터, 3성분 노즐을 이용해 SEDS 기술로 제조되어 왔으며, 여기서 수중 단백질 용액은 먼저 에탄올과 함께 도입된 후, 노즐에서 초임계 이산화탄소 (국제 특허 출원 공개 제9600610호)와 혼합된다. 수성 용액 및 에탄올간의 접촉 시간이 너무 짧으면 단백질 형태가 파괴될 수 있다.

저분자량 물질도 또한 초임계 유체 기술로 중합체와 공침될 수 있다. 유럽 특허 제322687호에는 항용매 (anti-solvent) 기술 및 RESS로 활성 물질 및 담체를 함유하는 약물 제형을 제조하는 것이 기재되어 있다 (Kim 등의 Biotechnol. Prog 1996, 12, 650-661, Chou 및 Tomasko, The 4 ^th Int.Symp, on Supercritical Fluids, Sendai, Japan, 1997, 55). 여기서, 항용매 기술에서 활성 물질 및 담체를 동일한 액체 매질에 용해하거나 분산시키고, 초임계 유체와 합한다. 그 예는 소수성 화합물의 L-PLA 구면으로의 결합만을 언급한 이들 문서에 기재되어 있다. PCA (Bodmeier 등의 Pharm.Res., 1995, 12, 1211-1217), SAS (Bertucco 등의 In High Pressure Chemical Engineering, 1996, 217-222), GAS (Chou 및 Tomasko, The 4 ^th Int.Symp. on Supercritical Fluids, Sendai, Japan, 1997, 55) 또는 ASES (Bleich 및 Mueller, J. Microencapsulation, 1996, 13, 131-139)에 대해 보고한 다른 연구에서도 수성상 중 화합물에 대해서는 언급되어 있지 않다.

본 발명자들은 이제 성분들의 에멀젼을 형성하고 유동 기체 기술을 이용해 시스템을 침전시켜 담체 시스템과 활성 물질 또는 물질들을 회합시키는 것이 가능하다는 것을 밝혀내었다. 활성 물질 또는 활성 물질들은 담체 시스템 내부 및(또는) 주위에 결합하며, 또한 담체가 활성 물질 또는 활성 물질들을 둘러싸는 것도 가능하다.

담체 시스템을 포함하는 활성 물질의 개선된 제조 방법은 에멀젼의 사용을 기초로 한다. 에멀젼은 한 종류의 액체가 다른 종류의 액체 중에 미세하게 분산된 2종의 불혼화성 액체 또는 상들의 혼합물이다. 한 종류의 액체 (예, 물 또는 수성상)가 다른 종류의 액체 (예, 유기 용매 또는 용매들의 혼합물 (오일상, 이후 비수성상이라고 함))보다 극성이 더 크다. 에멀젼은 동력학적으로 안정하거나 (마크로에멀젼), 또는 열역학적으로 안정하거나 (마이크로에멀젼), 또는 그의 조합일 수 있다. 에멀젼을 안정하게 하기 위해, 유화제를 단독으로 사용하거나, 계면활성제, 중합체, 지질과 같은 (이에 제한되지 않음) 다른 유화제와 함께 사용할 수 있다. 유화제는 수성상 및(또는) 비수성상에 용해된다. 담체 시스템에 결합되거나(고) 회합될 활성 물질 또는 물질들은 수성상에 용해, 현탁 또는 가용화된다. 담체 물질은 비수성상 또는 수성상에 용해된다. 수성상이 비수성상에 유화되거나, 또는 비수성상이 수성상에 유화된다.

비이온성 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 수크로스 에스테르 및 n-옥틸-b,D-글리코피라노사이드 (n-OG)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

음이온성 계면활성제는 나트륨 도데실 술페이트, 나트륨 1,4-비스(2-에틸헥실)술포숙시네이트 (AOT) 및 지방산의 염일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

양이온성 계면활성제는 알킬트리메틸암모늄염 및 디알킬디메틸암모늄염일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

양쪽이온성 계면활성제는 3((3-콜아미도프로필)디메틸암모니오)-1-프로판 술포네이트, 도데실-N-베타인일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

중합체 유화제에는 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리글리세롤 폴리리시놀리에이트, 폴리(비닐 알코올) 및 블록 공중합체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

지질 유화제는 콜레스테롤, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민 및 포스파티드산일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서, 수성상은 수용액 (비수성상과 불혼화성임), 및(또는) 비수성상과 불혼화성이고 비수성상보다 더 극성인 다른 용액으로 정의된다.

비수성상은 메틸렌 클로라이드, 클로로포름, 에틸아세테이트, 또는 유기 용매의 혼합물과 같은 종래의 유기 용매를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

담체 물질은 중합체, 충전제, 붕해제, 결합제, 용해 촉진제 및 다른 부형제, 및 그의 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

중합체는 합성 또는 천연일 수 있다. 이들은 생분해성이거나, 또는 그렇지 않을 수 있다 (예, 폴리스티렌). 담체로서 사용될 수 있는 중합체의 군에는 다당류(polysaccharide), 폴리에스테르, 폴리에테르, 폴리안히드라이드 및 폴리펩티드가 있으나, 이에 제한되지 않는다.

다당류의 예에는 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스 (HPMC), 에틸셀룰로오스 (EC), 펙틴, 알지네이트, 키토산, 아가(agar), 히드록시에틸셀룰로오스 (HEC), 크산탄, 에틸히드록시에틸셀룰로오스 (EHEC)가 있으나, 이에 제한되지 않는다.

폴리에스테르의 예에는 폴리락타이드 (PLA), 폴리글리콜라이드 (PGA), 그들의 공중합체 (PLG), 폴리히드록시부티레이트 (PHB) 및 폴리카프로락톤이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

폴리에테르의 예에는 폴리에틸렌옥사이드 및 폴리프로필렌옥사이드가 있으나, 이에 제한되지 않는다.

폴리안히드라이드의 예에는 폴리(세바스산), 폴리(카르보페녹시프로판), 폴리(푸마르산) 또는 그들의 공중합체가 있으나, 이에 제한되지 않는다.

활성 물질의 예에는 의약품, 독소, 살충제, 바이러스, 진단 보조제, 농업 화학제품, 상업 화학제품, 정밀 화학제품, 식료품, 염료, 폭발물, 페인트, 중합체 또는 화장품 등이 있다. 활성 물질은 단백질, 헬리코박터 (Helicobacter) 항원과 같은 항원, 폴리펩티드, 폴리핵산, 다당류와 같은 (이에 제한되지 않음) 고분자량 물질 (본 발명에서 5000 달톤 초과로 정의됨)이거나, 바디피 (Bodipy)^(R)와 같은 (이에 제한되지 않음) 저분자량 물질 (본 발명에서 5000 달톤 이하로 정의됨)일 수 있다. 단백질의 효소 활성 및 면역 활성은 본 발명에 따른 방법을 이용해 유지될 수 있다.

여기서, 유동 기체는 압축 기체뿐만 아니라 그의 초임계 상태 및 초임계에 가까운 상태의 물질을 포함하는 것으로 정의된다. 초임계 유체는 이산화탄소, 이산화질소, 육불화황, 제논, 에틸렌, 클로로트리플루오로메탄, 에탄 및 트리플루오로메탄일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서 초임계에 가까운 상태는 압력 및(또는) 온도가 임계값 이하인 상태로서 정의된다. 예를 들어, 이산화탄소의 초임계에 가까운 상태의 하한값은 0.65 Tc (임계 온도)이며, 프로판은 0.30 Tc이다.

기재된 에멀젼 시스템은

- 완충제, 예를 들어 포스페이트, 카보네이트, 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 (TRIS) 등;

- 물질의 화학적 및(또는) 물리적 안정성을 증가시키기 위한 물질, 예를 들어 트레할로오스 및 폴리에틸렌글리콜 (PEG);

- 활성 물질의 효과를 더 증가시키기 위한 보조제, 예를 들어 지질 A 및 그의 유도체, 콜레라 독소 (CT)와 같은 면역학적 반응 자극제, 또는 흡수 촉진제, 예를 들어 모노- 또는 디글리세라이드, 지방산, 담즙염 또는 효소 억제제, 예를 들어 아프로토닌, 에틸렌디아민테트라아세트산, 폴리아크릴산, 또는 활성 물질 타게팅을 위한 보조제, 예를 들어 항체;

- n-옥틸-b,D-글리코피라노사이드 (n-OG)와 같은 가용화제와 같은 (이에 제한되지 않음) 1종 이상의 첨가제를 포함할 수 있다.

본 발명은 간단히 말해서,

- 액체 비수성상 및 활성 물질 또는 활성 물질들을 함유하는 액체 수성상 (이들 상 중 적어도 어느 하나에 담체가 존재함)을 혼합함으로써 에멀젼을 제조하고,

- 에멀젼을 항용매 기술을 이용해 유동 기체와 접촉시키고,

- 액체상이 없는 단위 제형을 얻는 것을 특징으로 하는, 담체와 회합된 활성 물질 또는 활성 물질들을 함유하는 제제의 제조 방법으로서 기재될 수 있다.

담체 시스템의 선택된 제조 방법의 예는 하기 일반 설명 및 실험 부분에 기재되어 있다.

일반적으로, 이들 방법은

- 활성 물질 또는 물질들을 함유하는 수성상을 제조하고,

- 비수성상(들) (수성상과 불혼화성임)을 제조하고,

- 비수성상 및(또는) 수성상에 담체 물질, 유화제 및(또는) 첨가제를 용해하고,

- 적어도 수성상 및 비수성상으로 이루어진 에멀젼을 제조하고;

- 유동 기체 기술을 이용해 활성 물질을 함유한 담체 시스템을 제조하는 단계로의 담체 시스템의 제조를 기초로 한다.

제1 단계는 활성 물질 또는 물질들을 수성상에 용해, 분산 및(또는) 가용화함으로써 수행될 수 있다.

제4 단계는 예를 들어, 균일화, 초음파 및 고압 균일화와 같은 유화를 위한 다른 기술을 이용해 수행될 수 있다. 마이크로에멀젼 또는 마크로에멀젼은 또한 비수성상이 다른 비수성상에 분산된 수성상 (활성 물질(들)을 함유함)에 분산되거나, 또는 수성상 (활성 물질(들)을 함유함)이 다른 수성상에 분산된 비수성상에 분산된 소위 더블 에멀젼일 수도 있다.

제5 단계에서 활성 물질을 함유한 담체 시스템의 제조를 위해 이용되는 유동 기체 기술은 SEDS, ASES, SAS, GAS 및 PCA와 같은 (이에 제한되지 않음) 항용매 기술이다. 수성상이 마크로에멀젼 또는 마이크로에멀젼의 최외상이면 개질제는 유동 기체와 혼합되거나, 또는 유동 기체와 접촉하기 직전에 에멀젼과 동시에 도입될 필요가 있을 수 있다. 이 개질제는 에탄올 및 아세톤 (이에 제한되지 않음)과 같은 유기 용매이다.

본 발명에 따른 활성 물질(들)을 함유한 담체 시스템은 치료학, 예방학 및 진단학적 목적과 같은 (이에 제한되지 않음) 제약학적 목적을 위해 사용될 수 있다.

본 발명이 제약학적으로 응용되면, 활성 물질-부하 담체 시스템은 경구, 직장, 편도선, 구강, 비강, 질, 비경구, 근육내, 피하, 안내 (intraocular), 폐, 경피, 임플란트, 또는 정맥내 등의 투여 경로와 같은 (이에 제한되지 않음) 상이한 투여 경로로 투여될 수 있다.

이 기술을 이용하여 제조된 제약학적 투여 형태는 블렌딩, 과립화, 타정, 코팅 등과 같은 공지된 제약학적 기술을 이용해 제조된 고상, 반고상, 또는 액체 분산액일 수 있다. 또한, 상기 제제는 정제 또는 캡슐과 같은 단일 제제이거나, 정제, 캡슐 또는 사케트 (sachet)로 투여되는 다중 제제의 형태일 수 있다.

유화제가 어느 정도 연속상에 용해될 수 있으므로 소적 크기는 유화제에 영향을 받는다. 통상적으로 유화제는 표면 에너지를 감소시켜 소적 크기를 감소시키는데 도움이 된다.

유화제는 소적/초임계 계면에 존재할 수 있기 때문에 담체 시스템의 응집에 영향을 미칠 수 있다. 소적이 담체 시스템으로 변환되면 유화제는 여전히 담체 시스템의 표면에 위치할 수 있다. 그로인해, 표면 또는 담체 시스템상의 유화제의 존재는 형성된 담체 시스템의 응집도를 감소시킬 수 있으며, 이는 이전에 중합체 입자에 대해 기재된 바와 같다 (Mawson 등의 Macromolecules, 1997, 30, 71).

또한, 물질 또는 물질들뿐만 아니라 담체 시스템에 결합된 에멀젼을 위한 유화제는, 예를 들어 물질의 가용화 및 담체 시스템내로의 물의 급속 투과에 의해 (이에 제한되지 않음) 담체 시스템으로부터의 방출 특성을 개선할 수 있다.

<실험 부분>

재료 및 방법

이 부분에는 하기 실시예에서 사용된 재료, 분석 방법 및 제조 기술이 기재되어 있다.

폴리(3-히드록시부티레이트) (PHB, 아스트라 테크 (Astra Tech), 스웨덴, 분자량 (MW) 63500 g/mol) 또는 폴리(DL-락트-코-글리콜산) 50:50 (PLG RG 502 H, 베링거 인겔하임 (Boehringer Ingelheim), 독일, MW 6000 g/mol)을 담체 재료로서 사용하였다. n-옥틸-β-D-글루코피라노사이드 (n-OG, 시그마 (Sigma), 미국 미주리주), 폴리(비닐피롤리돈) (PVP, 알드리히(Aldrich), 독일, MW 10000 g/mol) 및 나트륨 1,4-비스(2-에틸헥실)술포숙시네이트 (AOT, 시그마, 미국 미주리주)을 안정제로서 사용하였다. 메틸렌 클로라이드 (99.5%)를 용매로서 사용하고, 이산화탄소를 초임계 유체로서 사용하였다. 에탄올 (99.5%)을 초임계 공정에서 개질제로서 사용하였다.

고수용성 탄산탈수효소(carbonic anhydrase)(CA, 시그마, 미국 미주리주), 원액 중 지질화 수불용성 헬리코박터 파이로리 (Helicobacter pylori) 접착 단백질 A (HpaA, CSL, 오스트레일리아)의 2종의 단백질을 사용하였다. 저분자량 모델 물질로서 사용된 형광 물질은 바디피^(R)이었다 (D3238, Molecular Probes Europe, 네덜란드).

단백질 분석에서 SDS 라엠리 시약 (laemmli reagent) 용액을, TRIS HCl 2M (pH 6.8) 완충용액 1.25 mL, 글리세롤 (99%) 5.05 g, 나트륨 도데실술페이트 (SDS) 0.8 g, 2-메르캅토에탄올 1 mL, 브로모페놀 블루 1 ㎕, 및 물 10 mL로 이루어진 원액을 1 내지 4배 희석하여 제조하였다.

입자 분석

입자 크기, 형태 및 형태학을 주사 전자 현미경으로 연구하였다.

활성 물질 부하의 결정

PHB 입자

a) 총 단백질 함량:

입자 (3-10 mg)를 클로로포름 300 ㎕에 용해하였다. 그후 SDS-라엠리 (400 ㎕)를 가하고, 단백질을 유기상으로부터 수상으로 추출하였다. 시료를 60℃에서 30 분 동안 교반하였다. 수상을 95℃로 15 분 동안 가열하고, 단백질 함량을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에 의해 분석하였다.

b) 바디피^(R) 함량:

바디피^(R)을 함유하는 입자 2 mg에 물 (5 mL)을 가하였다 (입자는 용해되지 않음). 바디피^(R)가 입자로부터 방출되면 농도를 분광분석기 (흡광계수 97000 M^-1cm ³ GBC UV/VIS 920, 오스트레일리아)로 측정하였다.

PLG 입자

a) 총 단백질 함량

PLG 입자 (3-10 mg)에 아세톤 1 mL을 가하였다. 단백질은 침전된 반면, 중합체는 용해되었다. 단백질 침전물을 15 분 동안 17530xg에서 원심분리하고, 해밀톤 (Hamilton) 주사기로 상등액의 약 2/3을 제거하였다. 순수 아세톤 (1 mL)을 가하여 침전물을 2회 세척하였다. 남은 아세톤을 진공 원심분리에 의해 증발시켰다. SDS-라엠리 (200 ㎕)를 가하고, 시료를 95℃에서 15 분 동안 가열하였다. SDS-PAGE에 의해 단백질 함량을 분석하였다.

b) 표면 회합된 단백질의 양 분석:

Rafati 등의 문헌 (Journal of Controlled Release 1997 43, 89-102)에 따라서 표면에 회합된 단백질의 양을 분석하였다. PLG 입자 5-6 mg에 수중 2 중량/부피% SDS 2 mL를 가하였다. 시료를 4 시간 동안 교반하였다. 그후 시료를 2700xg에서 3 분 동안 원심분리하고, 상등액을 새 튜브로 옮겼다. 진공 원심분리에 의해 물을 증발시키고, 라엠리 (SDS 없음) 1 mL를 가하였다. 수상을 95℃에서 15 분 동안 가열하고, SDS-PAGE에 의해 단백질의 양을 분석하였다.

입자 제조

입자를 SEDS 장치 (브래드포드 파티클 디자인 (Bradford Particle Design), 영국 브래드포드)에서 활성 물질 및 담체를 함유한 에멀젼으로부터 제조하였다 (국제 특허 출원 공개 제9501221호 및 국제 특허 출원 공개 제9600610호).

에멀젼 및 항용매(CO₂)를 오븐안에 위치한 압력관의 내부에 위치한 동축 노즐에 도입하였다. 압력 및 온도를 제어하는 조건하에서, 형성된 에멀젼 소적으로부터 용매를 항용매로 추출하였다. 이에 소적 중 담체의 농도가 증가하여 입자가 빠르게 형성되었다. 항용매 및 추출된 용매가 배압 조절기를 통해 나타난 반면, 입자는 관에 집합되었다.

사용된 노즐은 샌드위치 모드 또는 2-용액 모드에 연결된, 개구부의 직경이 0.2 mm인 3성분 노즐이었다. 샌드위치 모드에서 에멀젼이 중간 통로를 통해 통과하는 반면, 초임계 유체는 최내부 및 최외부 통로를 통해 통과하였다. 2-용액 모 드에서 에멀젼 및 예를 들어, 에탄올과 같은 개질제를 초임계 유체와 접촉하기 직전에 혼합하였다. 초임계 유체는 외부 통로를 통해, 개질제는 중간 통로를 통해, 에멀젼은 내부 통로를 통해 통과하였다.

실시예 1. PHB 중 HpaA, 에멀젼의 물 함량: 20 부피/부피%

PHB를 메틸렌 클로라이드에 2 bar, 90℃에서 용해하였다. 동부피의 2 중량/중량% PVP(수성) 및 HpaA 원액 [TRIS-HCl 완충액 중 HpaA 1.11 mg/mL; (10 mM, pH 8) 및 2 중량/중량% n-OG]을 혼합하였다. 이 혼합물 (3.8 mL)을 25 mL 키네마티카 분산관 (Kinematica dispersion vessel)에서 1 중량/중량% PHB 및 0.4 중량/중량% AOT를 함유하는 메틸렌 클로라이드 15.2 mL에 (20000 rpm에서 균일화하는 동안) 주입하였다. 총 균일화 시간은 3 분이었다. 이용된 균질기는 폴리트론(Polytron) PT3100, 로터(Rotor) PT-DA 3012/2 (키네마티카 아게 (Kinematica AG), 스위스)이었다. 모든 공정은 주변 조건하에서 수행하였다.

SEDS 장치에서 서로 다른 실행 조건으로 상기 에멀젼으로 실행을 2회 수행하였다. 실행 1은 개질제로서 에탄올 (유속 0.5 mL/분)로 제조된 2-용액 모드에서 3성분 노즐을 이용해 수행하였다. 실행 2에서는 샌드위치 모드를 사용하였다 (표 1).

실시예 1에서 에멀젼의 SEDS 공정

실행	개질제	압력(bar)	온도(℃)	CO₂의 유속 (mL/분)	에멀젼의 유속 (mL/분)
1	에탄올	180	50	26	0.1
2	-	240	35	26	0.1

SEM 그래프에 따라서 입자 크기는 두 실행 (실행 1 및 실행 2)에서 모두 1 내지 3 ㎛이었다.

이론상 입자 조성물은 PHB 55.8 중량/중량%, 계면활성제 43.5 중량/중량%, HpaA 0.6 중량/중량%이어야 한다. 입자 중 HpaA의 총량을 분석한 결과 실행 1 및 실행 2에서 HpaA는 모두 0.4%이었다.

실시예 2. PHB 중 바디피 ^(R) , 에멀젼의 물 함량: 33 부피/부피%

본 실시예의 목적은 물 함량이 33 부피/부피%인 에멀젼을 사용해 저분자량 분자를 담체 매트릭스에 회합하는 것이다. PHB를 메틸렌 클로라이드에 2 bar, 90℃에서 용해하였다. 동부피의 2 중량/중량% PVP(수성) 및 2 중량/중량% n-OG, TRIS-HCl 완충액 (10 mM, pH 8) 중 바디피^(R) 1.0 mg/mL를 혼합하였다. 이 용액 (2 mL)을 25 mL 키네마티카 분산관에서 1 중량/중량% PHB 및 0.4 중량/중량% AOT를 함유하는 메틸렌 클로라이드 4 mL에 (20000 rpm에서 균일화하는 동안) 주입하였다. 총 균일화 시간은 3 분이었다. 이용된 균질기는 폴리트론 PT3100, 로터 PT-DA 3012/2 (키네마티카 아게, 스위스)이었다. 모든 공정은 주변 조건하에서 수행하였다. 에탄올을 개질제로서 (2-용액 모드에 연결된 3성분 노즐) 유속 0.5 mL/분으로 사용하였다. 실행 조건은 하기 표 2에 기재되어 있다.

실시예 2에서 에멀젼의 SEDS 공정

실행	압력(bar)	온도(℃)	CO₂의 유속 (mL/분)	에멀젼의 유속 (mL/분)
3	180	50	26	0.1

SEM 그래프에 따라서 입자 크기는 1 내지 3 ㎛이었다.

이산화탄소가 흐르는 관에서 나올 때 형광물질이 발견되지 않았다. 이는 바디피^(R)가 사용된 초임계 유체 또는 용매에 의해 추출되지 않는다는 것을 의미한다.

실시예 3. PHB 중 바디피 ^(R) , 에멀젼의 물 함량: 20 부피/부피%

본 실시예의 목적은 물 함량이 20 부피/부피%인 에멀젼을 사용해 (실시예 2와 같이) 저분자량 분자를 담체 매트릭스에 회합하는 것이다. PHB를 메틸렌 클로라이드에 2 bar, 90℃에서 용해하였다. 동부피의 2 중량/중량% PVP(수성) 및 2 중량/중량% n-OG, TRIS-HCl 완충액 (10 mM, pH 8) 중 바디피^(R) 1.0 mg/mL를 혼합하였다. 이 용액 (2 mL)을 25 mL 키네마티카 분산관에서 1 중량/중량% PHB 및 0.4 중량/중량% AOT를 함유하는 메틸렌 클로라이드 8 mL에 (20000 rpm에서 균일화하는 동안) 주입하였다. 총 균일화 시간은 3 분이었다. 이용된 균질기는 폴리트론 PT3100, 로터 PT-DA 3012/2 (키네마티카 아게, 스위스)이었다. 모든 공정은 주변 조건하에서 수행하였다.

SEDS 장치에서 개질제로서 에탄올 (유속 0.5 mL/분)로 2-용액 모드에 연결된 3성분 노즐을 사용하여 실행 4를 수행하였다. 실행 5에서 샌드위치 모드를 사용하였다 (표 3).

실시예 3에서 에멀젼의 SEDS 공정

실행	개질제	압력(bar)	온도(℃)	CO₂의 유속 (mL/분)	에멀젼의 유속 (mL/분)
4	에탄올	180	50	26	0.1
5	-	240	35	26	0.1

SEM 그래프에 따라서 두 배치(batch)는 1 내지 3 ㎛의 입자 크기를 갖는다.

이론상 입자 조성물은 PHB 55.8 중량/중량%, 계면활성제 43.5 중량/중량% 및 바디피^(R) 0.6 중량/중량%이었다. 실행 5의 입자에 회합된 바디피^(R) 양은 상기 분석에 따라서 0.7 중량/중량%이었다.

실시예 4. PLG에서 탄산탈수효소, 에멀젼의 물 함량: 20 부피/부피%

약 30 내지 50 W에서 3 분 동안 초음파 탐침 (CV26, 소닉스 앤드 머티어리얼스 인크. (Sonics & Materials Inc.), USA)으로 균일화하는 동안 TRIS-SO₄ 완충액 (0.1 M, pH 7.5) 중 20 mg/mL 탄산탈수효소 (93%) 200 ㎕를 8 중량/중량% PLG 800 ㎕, 0.4 중량/중량% 스팬(Span) 85/트윈(Tween) 80 (중량비 80:20)에 가하였다. 에멀젼을 얼음상 4 mL 유리 바이알에서 제조하였다.

입자의 제조를 위한 실행 조건은 하기 표 4에 기재되어 있다. 샌드위치 모드에서 3성분 노즐로 실행을 수행하였다.

실시예 3에서 에멀젼의 SEDS 공정

실행	압력(bar)	온도(℃)	CO₂의 유속 (mL/분)	에멀젼의 유속 (mL/분)
6	240	35	26	0.1

SEM 그래프에 따라서 형성된 입자 크기는 10 내지 100 ㎛이었다.

이론상 입자 조성물은 PLG 91.4 중량/중량%, 계면활성제 4.6 중량/중량% 및 탄산탈수효소 4.0 중량/중량%이었다. 단백질의 양을 분석한 결과 탄산탈수효소는 4 중량/중량%이었으며, 입자 표면에 회합된 단백질은 없었다.

Claims

- 액체 비수성상 및 활성 물질 또는 활성 물질들을 함유하는 액체 수성상 (이들 상 중 적어도 어느 하나에 담체가 존재함)을 혼합함으로써 에멀젼을 제조하고,

- 에멀젼을 항용매 기술(anti-solvent technique)을 이용해 유동 기체와 접촉시키고,

- 액체상이 없는 단위 제형을 얻는 것을 특징으로 하는, 담체와 회합된 활성 물질 또는 활성 물질들을 함유하는 제제의 제조 방법.
제1항에 있어서, 활성 물질이 수성상에 용해되는 방법.
제1항에 있어서, 활성 물질이 수성상에 분산되는 방법.
제1항에 있어서, 활성 물질이 수성상에 가용화되는 방법.
제1 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 물질이 단백질인 방법.
제5항에 있어서, 활성 물질이 항원인 방법.
제6항에 있어서, 활성 물질이 헬리코박터 항원인 방법.
제7항에 있어서, 활성 물질이 지질화 수불용성 헬리코박터 파이로리 (Helicobacter pylori) 접착 단백질 A인 방법.
제8항에 있어서, 활성 물질이 헬리코박터 파이로리 접착 단백질 A의 특정 전체 지질화된 형태인 방법.
제1 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 물질이 저분자량 물질인 방법.
제1 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 비수성상이 유기 용매를 함유하는 방법.
제1 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 비수성상이 유기 용매의 혼합물을 함유하는 방법.
제1 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 수성상이 비수성상보다 더 극성인 방법.
제1 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 에멀젼이 마크로에멀젼인 방법.
제1 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 에멀젼이 마이크로에멀젼인 방법.
제1 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 에멀젼이 마크로에멀젼과 마이크로에멀젼의 조합인 방법.
제1 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 에멀젼이 유화제를 함유하는 방법.
제17항에 있어서, 유화제가 비이온성 계면활성제인 방법.
제17항에 있어서, 유화제가 음이온성 계면활성제인 방법.
제17항에 있어서, 유화제가 양이온성 계면활성제인 방법.
제17항에 있어서, 유화제가 양쪽이온성 계면활성제인 방법.
제17항에 있어서, 유화제가 중합체인 방법.
제17항에 있어서, 유화제가 지질인 방법.
제1 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 담체가 폴리(3-히드록시부티레이트)인 방법.
제1 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 담체가 폴리(DL-락트-코-글리콜산)인 방법.
제1 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 에멀젼을 유동 기체 기술을 이용해 유동 기체와 접촉시키는 방법.
제26항에 있어서, 이용된 유동 기체 기술이 초임계 유체에 의한 용액 촉진 분산(Solution Enhanced Dispersion by Supercritical fluid; SEDS) 공정인 방법.
제26항에 있어서, 이용된 유동 기체 기술이 에어로졸 용매 추출 시스템(Aerosol Solvent Extraction System; ASES) 공정인 방법.
제26항에 있어서, 이용된 유동 기체 기술이 초임계 항용매(Supercritical Anti-Solvent; SAS) 공정인 방법.
제26항에 있어서, 이용된 유동 기체 기술이 기체 항용매(Gas Anti-Solvent; GAS) 침전법인 방법.
제26항에 있어서, 이용된 유동 기체 기술이 압축 항용매를 사용한 침전법(Precipitation with Compressed Anti-solvent; PCA)인 방법.
제1 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 유동 기체가 이산화탄소인 방법.
제1 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 물질이 단백질이고 담체가 폴리(3-히드록시부티레이트) 또는 폴리(DL-락트-코-글리콜산)으로부터 선택되는 방법.
제33항에 있어서, 활성 물질이 항원인 방법.
제1 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 물질이 단백질이고 이용된 유동 기체 기술이 초임계 유체에 의한 용액 촉진 분산(SEDS) 공정인 방법.
제35항에 있어서, 담체가 폴리(3-히드록시부티레이트) 또는 폴리(DL-락트-코-글리콜산)으로부터 선택되는 방법.
제1 내지 4항 중 어느 한 항에 기재된 바와 같이 제조되는 제제.