KR100571937B1 - 돌연변이 티로신 페놀리아제 및 이의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 돌연변이 티로신 페놀리아제 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로는 심비오박테리움 퇴비(Symbiobacterium toebii) 유래의 티로신 분해/합성 효소인 티로신 페놀리아제(tyrosine phenol-lyase; TPL)의 돌연변이체, 이를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함한 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 대장균 및 상기 대장균을 이용한 돌연변이 티로신 페놀리아제의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 돌연변이 티로신 페놀리아제는 야생형의 티로신 페놀리아제에 비하여 열에 대한 안정성과 유기용매와 같은 단백질 변성제에 대한 저항성이 증가되어 L-DOPA의 생산과 같은 산업적 생물공정에 매우 유용하게 이용될 수 있다.
티로신 페놀리아제, 열안정성, 변성제 저항성, 돌연변이

Description

돌연변이 티로신 페놀리아제 및 이의 제조방법{Mutant tyrosinse phenol-lyase and preparation method thereof}
도 1은 돌연변이 프라이머를 이용한 PCR을 통하여 유전자를 증폭하는 무작위적 돌연변이 유발법에 의하여, 돌연변이 티로신 페놀리아제(A13V) 유전자를 포함하는 발현벡터 제조 과정을 개략적으로 나타낸 모식도이고,
도 2는 본 발명의 돌연변이 티로신 페놀리아제(A13V)와 야생형 티로신 페놀리아제(TPL)의 열 안정성을 효소활성(%)으로 비교한 그래프이고,
●: 돌연변이 티로신 페놀리아제(A13V),
○: 야생형 티로신 페놀리아제(TPL),
도 3은 본 발명의 돌연변이 티로신 페놀리아제(A13V)와 야생형 티로신 페놀리아제(TPL)의 단백질 변성제인 요소에 대한 저항성을 효소활성(%)으로 비교한 그래프이고,
●: 돌연변이 티로신 페놀리아제(A13V),
○: 야생형 티로신 페놀리아제(TPL),
도 4는 본 발명의 돌연변이 티로신 페놀리아제(A13V)와 야생형 티로신 페놀리아제(TPL)의 정제과정별 SDS-PAGE 분석 사진이고,
1: 분자량 마커,
2: 야생형의 세포질액,
3: 야생형의 열처리 후 상등액,
4: 야생형의 암모늄설페이트 침전,
5: 야생형의 크로마토그래피 정제,
6: A13V의 세포질액,
7: A13V의 열처리 후 상등액,
8: A13V의 암모늄설페이트 침전,
9: A13V의 크로마토그래피 정제,
도 5는 본 발명의 돌연변이 티로신 페놀리아제(A13V)와 야생형 티로신 페놀리아제 (TPL)의 염기 및 아미노산 서열을 비교한 모식도이다.
본 발명은 돌연변이 티로신 페놀리아제에 관한 것으로, 구체적으로는 티로신 분해/합성 효소인 티로신 페놀리아제의 돌연변이체, 이를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함한 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 미생물 및 상기 미생물을 이용한 돌연변이 티로신 페놀리아제의 제조방법에 관한 것이다.
티로신 페놀리아제(tyrosine phenol-lyase; 이하, 'TPL'로 약칭함)는 티로신이 유도물질로 첨가된 배지에서 배양한 미생물, 예를 들어 에스케리치아(Escherichia) 속(Kumagai and Yamada, J. Biol. Chem., 245, 1767-1772 (1970)), 어위니아(Erwinia) 속(Enei, et al., Agri. Biol. Chem., 37, 725-735 (1973)), 시트로박터(Citrobacter) 속(Kupletskaya, M.B. et al., Prinkl. Biokhim. Microbiol., 17, 278-283 (1981), 심비오박테리움(Symbiobacterium) 속(Suzuki, et al., Biosci. Biotech. Biochem., 56, 84-89 (1992)) 등에서 흔히 발견되는 효소이다.
TPL은 티로신을 페놀과 피루브산(pyruvic acid)으로 가수분해하는 α,β-제거반응(α,β-elimination), 동일 기질로부터 페놀과 세린(serine)을 생성하는 β-교환반응(β-replacement) 등의 다양한 반응을 촉매한다(Enei, et al., Agri. Biol. Chem., 36, 18649-1876 (1972)). 또한, TPL은 카테콜(catechol)을 기질로 하여 파킨슨병 치료제로서 주목받고 있는 고부가가치 의약용 아미노산인 L-DOPA(3,4-dihydroxyphenylalanine; 3,4-디하이드록시페닐알라닌)를 합성할 수 있다. 구체적으로, 페놀 대신 카테콜을 첨가한 반응액에 높은 농도의 암모늄 이온과 피루브산을 가하여 반응의 평형을 물리적으로 α,β-제거반응의 역반응을 촉진시키는 반응조건을 형성시킴에 의하여, 다음과 같이 미생물로부터 분리된 티로신 페놀리아제 효소를 이용한 L-DOPA의 합성이 이루어진다(Enei, et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 43, 1345-1349 (1971)):
피루브산 + 암모늄 이온 + 카테콜 ----> L-DOPA + 물
한편, 효소를 생물 촉매제로 이용하는 생물 공정에 있어서 가장 중요한 요소는 효소 즉, 생물 촉매제의 안정성이다. 특히, TPL 효소를 이용하여 L-DOPA를 생산하는 효소공정은 반응기질로 사용되는 카테콜이 강력한 단백질 변성제이기 때문에, 더욱 안정성이 높은 TPL 효소를 필요로 한다. 따라서, 미생물로부터 분리ㆍ정제된 효소 또는 미생물 자체를 고정화시키거나 카테콜의 독성을 감소시키는 보렉스(sodium borate; 소듐보레이트)의 첨가 등을 이용하여 TPL 효소를 안정화시키려는 연구가 시도되었다(Kupletskaya, M.B. Prikl. Biokhim. Mikrobiol., 17(2), 278-283 (1981)). 그러나, 이러한 다양한 연구에도 불구하고 TPL를 이용하여 성공적으로 L-DOPA 합성 반응의 생산성을 개선한 결과는 거의 보고된 바가 없다. 이는 L-DOPA의 합성을 촉매하는 효소 자체의 안정성이 증가되지 않고서는 L-DOPA 생산 반응을 효율적으로 수행하기 어려움을 보여주는 것이다.
일반적으로 열에 대하여 안정한 내열성 효소는 열에 대하여 안정한 특징뿐만 아니라 유기용매에 대한 안정성, 극단의 수소이온 농도에 대한 안정성 및 화학 변성제에 대한 안정도도 높은 것으로 알려져 있다. 따라서, L-DOPA 합성을 위한 생물 촉매제로서 보다 안정하고 강력한 내열성 효소를 개발하는 것이야말로 L-DOPA 합성 반응의 생산성 향상 개선에 가장 중요한 요소라 할 수 있다.
이에, 본 발명자들은 L-DOPA 합성의 생물 촉매제로 사용될 수 있는 티로신 페놀리아제의 안정성 및 활성을 증대시키는 방법을 연구하던 중, 티로신 페놀리아 제 유전자에 무작위적으로 돌연변이를 유발하여 만들어진 돌연변이 효소들 중에 야생형 티로신 페놀리아제의 13번째 알라닌이 발린으로 치환된 티로신 페놀리아제의 돌연변이체가 높은 열안정성과 변성제에 대한 안정성을 가짐을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 의약용 아미노산인 티로신의 생산을 위하여 생물 공정에 유용하게 이용될 수 있는 열안정성 및 유기용매에 대한 안정성이 증대된 신규한 돌연변이 티로신 페놀리아제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 돌연변이 티로신 페놀리아제를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현벡터 및 상기 발현벡터로 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환 미생물을 이용하여 돌연변이 티로신 페놀리아제의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 내열성과 변성제 저항성이 증대된 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 심비오박테리움 퇴비(Symbiobacterium toebii) 유래의 티로신 페놀리아제의 돌연변이체(A13V)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 돌연변이 티로신 페놀리아제(A13V)를 코딩하는 유전자, 상기 A13V를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터 pHCE19T(Ⅱ)-A13V 및 상기 발현벡터 pHCE19T(Ⅱ)-A13V로 형질전환된 대장균(DH5α/pHCE19T(Ⅱ)-A13V)을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환된 대장균(DH5α/pHCE19T(Ⅱ)-A13V)의 배양, 단백질의 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 상기 돌연변이 티로신 페놀리아제(A13V)의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 내열성과 변성제 저항성이 증대된 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 심비오박테리움 퇴비(Symbiobacterium toebii) 유래의 티로신 페놀리아제의 돌연변이체를 제공한다.
본 발명의 돌연변이 티로신 페놀리아제는 야생형 티로신 페놀리아제(또는 'TPL'이라 칭함) 아미노산 서열(서열번호 5)과 비교하였을 때, 1개의 아미노산 잔기가 치환된 서열을 갖는 단백질이다. 본 발명자들은 상기 돌연변이 티로신 페놀리아제를 '티로신 페놀리아제 A13V(또는 'A13V'라 약칭함)'라 명명하였다. 티로신 페놀리아제 A13V는 TPL의 아미노산 서열의 13번째 알라닌(alanine) 잔기가 발린(valine) 잔기로 치환된 돌연변이체이다. 또한, 2번 글루타민(glutamine)은 아스파라긴(asparagine) 잔기로, 3번 알지닌(arginine)이 세린(serine) 잔기로 치환되었다.
상기의 티로신 페놀리아제 A13V는 분자량이 52 kDa이며, 야생형보다 내열성은 4.2℃, 변성제 저항성은 50% 증진된 단백질이다. A13V의 아미노산 변화 자리는 단백질의 구조에서 N-말단의 암(arm)에 위치하고 있다(Antson, et al., Biochemistry, 32, 4195-4206 (1993)). 상기 암은 소단위체(subunit)들의 β-가닥(strand)의 접촉부위(connecting region)와 반평행(antiparallel) β-구조(structure)를 형성한다. 상기 A13V는 TPL의 아미노산 서열의 13번째 알라닌(alanine) 잔기가 발린(valine) 잔기로 치환됨에 의하여, N-말단 암의 접촉부위의 결합력이 강화되었으며, 이러한 결합력 강화가 내열성의 증진을 유발하였을 것으로 판단된다. 또한, 상기 결합력 강화는 촉매 능력에도 영향을 미쳤을 것으로 여겨진다. 따라서, 본 발명의 티로신 페놀리아제 A13V는 생물 공정에 촉매제로써 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 티로신 페놀리아제 A13V를 코딩하는 유전자를 제공한다. 이때, A13V를 코딩하는 유전자는 서열번호 4로 기재되는 염기서열을 가지는 유전자인 것이 바람직하다. 서열번호 1로 기재되는 A13V를 코딩하는 유전자의 염기서열은 모두 1377개의 염기로 구성되며(서열번호 4 참조), 이때 상기 단백질의 아미노산을 코딩하는 유전자의 시작 코돈(start codon)은 1 번째 염기(ATG)에서 시작한다. 또한, 종료 코돈(stop codon)은 1375번 염기(TAA)에서 상기 단백질의 코딩이 종료된다. 재조합 프라이머의 제작으로 인하여, 시작 코돈 다음 5개의 염기가 AATTC로 치환되어 야생형의 아미노산과 상이하다.
또한, 본 발명은 상기 A13V를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터 pHCE19T(Ⅱ)-A13V를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 발현벡터 pHCE19T(Ⅱ)-A13V로 형질전환된 대장균(DH5α/pHCE19T(Ⅱ)-A13V)을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환된 대장균(DH5α/pHCE19T(Ⅱ)-A13V)의 배양, 단백질의 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 상기 돌연변이 티로신 페놀리아제(A13V)의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 내열성 및 변성제 저항성이 향상된 돌연변이 티로신 페놀리아제(A13V)를 제조하는 바람직한 실시예를 도 1에 개략적으로 도시하였다. 본 발명에 따르면, 야생형 티로신 페놀리아제로부터 무작위적 돌연변이 유발법을 이용하여 돌연변이 티로신 페놀리아제 유전자의 라이브러리(library)를 제조하고, 이로부터 안정성이 증대된 신규한 돌연변이 티로신 페놀리아제를 탐색하여 그의 유전자 염기 배열을 결정하고, 상기 유전자를 대장균에서 발현시켜 분리 및 정제하여 안정성이 증대된 티로신 페놀리아제를 수득하고, 이를 L-DOPA 합성의 생물공정에 이용할 수 있다.
구체적으로, 무작위적 돌연변이 유발은 DNA 중합효소(polymerase) 반응의 정확도(fidelity)가 감소된 조건에서 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)을 수행하여 주형(template) DNA의 뉴클레오티드(nucleotide)에 상보적이지 않은 뉴클레오티드가 일부 결합되어 DNA 염기 배열이 변화된 새로운 폴리펩티드가 만 들어지도록 하는 것이다(Fromant et al., Anal. Biochem., 224, 347-353 (1995)). 본 발명에서는 중합효소 연쇄반응을 이용한 무작위적 돌연변이 유발을 위하여, 심비오박테리움 퇴비로부터 유래된 TPL 유전자를 포함하는 플라스미드를 제조한 후, 이를 주형으로 하여 돌연변이 유발형 중합효소 연쇄반응에 의하여, 야생형 티로신 페놀리아제 유전자에 무작위적인 돌연변이를 유발시킴으로써 돌연변이 티로신 페놀리아제 유전자의 DNA를 수득하였다. 돌연변이체의 발현과 선별과정의 효율에 적합한 pHCE19T(Ⅱ) 플라스미드에 상기 돌연변이 DNA를 접합(ligation)시킨 후, 상기 접합 DNA로 대장균을 형질전환시켜 돌연변이 라이브러리를 제조하였다.
이어서, 돌연변이 티로신 페놀리아제 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환시킨 대장균주를 75℃에서 고온 열처리함으로써 내열성이 향상된 티로신 페놀리아제를 선별하는 활성탐색 방법에 의하여 내열성을 갖는 돌연변이 티로신 페놀리아제를 생산하는 대장균 1주를 분리하였다. 상기 분리된 대장균 균주로부터 돌연변이 티로신 페놀리아제 유전자 염기서열을 공지된 방법에 의하여 결정하였으며, 이로부터 유래된 돌연변이 티로신 페놀리아제를 야생형 티로신 페놀리아제의 아미노산 서열과 비교할 경우, 1개의 아미노산이 치환된 배열을 갖는 단백질(13번째 알라닌 잔기가 발린으로 치환)인 것을 확인하고, 이를 '티로신 페놀리아제 A13V'라 명명하였다(서열번호 1 참조).
상기 티로신 페놀리아제 A13V의 유전자를 포함하는 발현벡터 pHCE19T(Ⅱ)-A13V를 제작하고, 상기 발현벡터를 대장균(E. coli) DH5α에 도입하여 최종적으로 형질전환된 대장균들을 수득하였다. 본 발명자들은 상기 형질전환된 대장균을 DH5 α/pHCE19T(Ⅱ)-A13V로 명명하였다. 상기 대장균 DH5α/pHCE19T(Ⅱ)-A13V를 배양하여 상기 티로신 페놀리아제 A13V를 분리ㆍ정제한 결과, 가용성이며 활성이 유지된 상태이면서 99% 이상의 순수한 내열성 티로신 페놀리아제 A13V를 함유하고 있음을 확인하였다(도 4 참조).
또한, 상기의 티로신 페놀리아제 A13V를 정제하여 내열성과 변성제 저항성을 확인한 결과, 야생형보다 내열성은 4.2℃, 변성제 저항성은 50% 향상된 것을 확인하였다(도 2도 3 참조). 따라서, 본 발명의 티로신 페놀리아제의 돌연변이체는 생물 공정에 촉매로써 유용하게 응용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 돌연변이 티로신 페놀리아제 유전자의 라이브러리 제조
티로신 페놀리아제 유전자(TPL)에 무작위적 돌연변이 유발법을 이용하여 돌연변이들을 유발함으로써 다양한 돌연변이 티로신 페놀리아제 유전자들을 하기와 같이 제조하였다. 도 1은 본 발명의 무작위적 돌연변이 유발법에 의하여, 돌연변이 티로신 페놀리아제 유전자를 함유하는 발현벡터의 제조과정을 개략하여 도시한 것이다.
구체적으로 무작위적 돌연변이 유발법을 위하여, 심비오박테리움 퇴비 유래 의 TPL 유전자의 염기서열에 근거하여 서열번호 2로 기재되는 N-말단 프라이머와 서열번호 3으로 기재되는 C-말단 프라이머를 합성하였다. 심비오박테리아 퇴비로부터 유래된 1.4 kb의 TPL 유전자를 상기 서열번호 2로 기재되는 N-말단 프라이머와 상기 서열번호 3으로 기재되는 C-말단 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)으로 DNA를 합성ㆍ증폭한 후, EcoRⅠ과 HindⅢ 제한효소로 양 말단을 절단하였다. 동일 제한효소로 절단된 pHCE19T(Ⅱ) 플라스미드(바이오리더스, 한국)의 HCE 프로모터와 rrnBT1T2 터미네이터(terminator) 사이에 상기 PCR로 증폭된 TPL 유전자를 삽입하여 재조합 플라스미드 pHCE19T(Ⅱ)-TTPL을 제조하고, 이를 무작위적 돌연변이 유발법의 주형으로 준비하였다.
돌연변이 유발법을 위한 PCR은 각각 0.2 μM의 상기 N-말단 프라이머(서열번호 2) 및 C-말단 프라이머(서열번호 3)로 이루어지는 프라이머쌍, 주형으로 사용되는 재조합 플라스미드 pHCE19T(Ⅱ)-TTPL 10 ng, 10 mM의 Tris-HCl(pH 8.3), 50 mM의 KCl, 2 mM의 MgCl2, 0.2 mM의 MnCl2, 0.2 mM의 dATP, 1 mM의 dCTP, 1 mM의 dGTP, 1 mM의 dTTP 및 Taq 중합효소 1.25 Unit를 포함하는 50 ㎕의 PCR 반응액을 제조하였다. 그 후, 상기 반응액을 95℃에서 1분(첫번째 사이클에서는 3분), 58℃에서 30초, 72℃에서 1분(마지막 사이클에서는 5분)의 조건으로 PCR을 28회 수행하여 주형 재조합 플라스미드 DNA를 증폭시켰다.
상기와 같이 증폭된 DNA 단편을 제한효소 EcoRI, HindⅢ로 절단한 후, 플라스미드 pHCE19T(Ⅱ)를 동일한 제한효소로 절단하여 얻은 단편과 접합시켜 재조합 벡터를 제조한 후, 일렉트로포레이션법에 의하여 상기 재조합 벡터로 대장균 DH5α(ATCC)를 형질전환시켜 돌연변이 티로신 페놀리아제 유전자의 라이브러리를 제조하였다(도 1).
<실시예 2> 내열성이 증대된 돌연변이 티로신 페놀리아제의 탐색
실시예 1에서 제조된 돌연변이 티로신 페놀리아제 유전자의 라이브러리로부터 내열성이 증가된 돌연변이 티로신 페놀리아제의 탐색은 반응온도를 야생형 티로신 페놀리아제의 내열성 온도보다 높은 75℃에서 열처리한 후, L-티로신(tyrosine)의 분해반응을 수행하여 생성된 페놀을 검출하는 시약(1.5%의 NaHCO3, 0.85%의 4-아미노안티퓨린(aminoantipyrine), 5.4%의 K3Fe(CN)6)의 구성물질을 50 ㎕씩 차례로 첨가하여 A505㎚에서 발색되는 붉은색의 농도를 측정ㆍ비교하여 탐색하였다. 탐색 결과, 야생형 티로신 페놀리아제 보다 열안정성이 증대된 돌연변이 티로신 페놀리아제를 생산하는 재조합 대장균 1종을 분리하고, 상기 돌연변이 티로신 페놀리아제를 '티로신 페놀리아제 A13V'(또는 'A13V')라 명명하였다.
<실시예 3> A13V(돌연변이 티로신 페놀리아제)의 아미노산 서열 및 A13V를 코딩하는 유전자의 염기서열 결정
A13V 유전자의 염기서열은 생거 방법(Sanger, F., Science, 214, 1205-1210 (1981))에 의해서 결정하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 재조합 발현벡터 pHCE19T(Ⅱ)-A13V에 함유된 A13V 유전자의 DNA 염기서열은 서열번호 4로 기재되는 서열임을 확인하였다.
상기 염기서열로부터 재조합 벡터 pHCE19T(Ⅱ)-A13V에서 분리된 DNA 단편에 티로신 페놀리아제 A13V를 코딩하는 1.4 kb 크기의 유전자가 포함되어 있는 것을 확인하였다. 또한, 상기 유전자의 염기서열로부터 티로신 페놀리아제 A13V의 아미노산 서열을 추정하고, 야생형 티로신 페놀리아제의 서열과 비교하였다(도 5). 그 결과, 유전자의 염기 및 단백질의 아미노산 서열에 있어서, TPL 유전자의 38번째 시토신(C)이 A13V 유전자에서는 티민(T)으로 치환되고, 따라서 TPL의 13번째 알라닌(Ala) 잔기가 A13V에서는 발린(Val)으로 치환되었음을 확인하였다(도 5).
<실시예 4> 재조합 돌연변이 티로신 페놀리아제(A13V)의 생산과 정제
실시예 2에서 분리한 A13V 유전자를 포함하는 발현벡터 pHCE19T(Ⅱ)-A13V로 형질전환된 대장균 대장균 DH5α(ATCC)를 'DH5α/pHCE19T(Ⅱ)-A13V'라 명명하였다.
또한, 100 mg/ℓ의 암피실린(ampicillin)이 첨가된 LB 배지(1%의 박토트립톤, 1%의 효모 추출물, 0.5%의 NaCl)에 상기 형질전환 대장균 DH5α/pHCE19T(Ⅱ)-A13V를 접종하고, 37℃에서 200 rpm으로 진탕배양 하였다. 이어, 약 A600㎚이 2.0인 균체 농도에 도달할 때까지 계속 배양하여 내열성 티로신 페놀리아제 A13V가 지속적으로 발현되게 한 후, 5,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 균체를 회수하였다.
상기 회수된 DH5α/pHCE19T(Ⅱ)-A13V 균체를 100 mM의 포타슘포스페이트 완 충액(potassium phosphate)(pH 8.0)으로 세척한 후, 100 mM의 포타슘포스페이트(pH 8.0), 2 mM의 EDTA, 0.1 mM의 PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)(Sigma, USA)을 포함하는 세포용해 완충액에 현탁시키고 초음파로 세포를 파쇄한 후, 이를 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 상기 상등액을 60℃의 수조에서 30분간 열처리하여 대장균의 비내열성 단백질을 침전시킨 뒤, 냉각시키고 다시 원심분리하여 상등액을 분리하였다. 상기 상등액에 암모늄설페이트(ammonium sulfate)를 30-35%까지 첨가하여 4℃에서 5시간 동안 방치한 후, 원심분리하여 얻은 침전물을 50 mM의 Tris-HCl(pH 8.0)에 용해시킨 뒤 동일한 완충액에서 투석하였다. 투석 후의 단백질을 Resource Q 컬럼(Amersham Biosciences, Sweden)에 통과시켜 순수한 내열성 티로신 페놀리아제 A13V를 정제하였다. 상기 정제된 효소를 SDS-PAGE로 분석한 결과, 최종적인 효소액에는 99% 이상의 순수한 내열성 티로신 페놀리아제 A13V만이 함유되어 있었으며, 이들은 모두 가용성이고 티로신 페놀리아제의 활성이 유지된 상태임을 확인하였다(도 4). SDS-PAGE 분석 결과, 가용성 티로신 페놀리아제 야생형과 A13V의 정제과정시에 유사한 분리ㆍ정제과정을 거치며, 거의 유사한 분자량을 나타냄을 확인하였다(도 4; 1번, 분자량 마커; 2번, 야생형의 세포질액; 3번, 야생형의 열처리 후 상등액; 4번, 야생형의 암모늄설페이트 침전; 5번, 야생형의 크로마토그래피 정제; 6번, A13V의 세포질액; 7번, A13V의 열처리 후 상등액; 8번, A13V의 암모늄설페이트 침전; 9번 A13V의 크로마토그래피 정제).
따라서, A13V 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환시킨 대장균으로부터 티로신 페놀리아제 활성이 유지된 내열성의 티로신 페놀리아제 A13V를 용이하게 제조할 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예 5> 재조합 티로신 페놀리아제 A13V의 열 및 유기용매에 대한 안정성
돌연변이 티로신 페놀리아제의 내열성을 야생형과 비교하기 위하여, 각 온도별로 열처리 한 후, 남아있는 티로신 페놀리아제의 효소 활성을 측정하였다.
구체적으로, 정제된 효소 100 ㎍을 800 ㎕의 50 mM의 포타슘포스페이트 완충액(pH 7.2)에 용해시키고, 60-90℃에서 30분간 열처리하였다. 여기에 0.1 mM의 PLP(pyridoxal 5'-phosphate)(Sigma, USA) 100 ㎕와 L-티로신(tyrosine) 포화용액 50 ㎕을 첨가하여 60℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 페놀 검출용액(1.5%의 NaHCO3, 0.85%의 4-아미노안티퓨린(aminoantipyrine) 및 5.4%의 K3Fe(CN)6)의 구성물질들을 50 ㎕씩 차례로 첨가하고, 붉은 색을 검출하기 위해 A505㎚를 측정하여 정량하였다.
그 결과, 야생형 티로신 페놀리아제(TPL)는 70℃까지 안정하고 그 이상의 온도에서는 효소활성이 급격히 감소하지만, 신규 내열성이 증대된 돌연변이 티로신 페놀리아제 A13V는 74℃까지 효소활성이 80% 정도 남아있으며, 그 이상의 온도에서도 효소활성이 상당히 남아 있음을 확인하였다. 또한, TPL은 73℃에서 절반의 효소활성을 나타내지만, A13V는 약 77.4℃에서 절반의 효소활성을 나타냄으로써, 약 4.3℃의 내열성 증가를 보임을 확인하였다(도 2).
한편, 유기용매와 같은 변성제에 대한 저항성을 평가하기 위하여, 요소의 농도에 따른 효소의 활성을 측정하였다. 50 mM의 포타슘포스페이트 완충액(pH 7.2)에 용해되어 있는 1 내지 7 M의 요소에 효소 100 ㎍을 첨가하여 25℃에서 2시간 동안 평형 상태가 되도록 유지하였다. 여기에 0.1 mM의 PLP와 50 ㎕의 티로신 포화용액을 첨가하여 60℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 후, 페놀 검출용액(1.5%의 NaHCO3, 0.85%의 4-아미노안티퓨린 및 5.4%의 K3Fe(CN)6)의 구성물질들을 50 ㎕씩 차례로 첨가하고, 붉은 색을 검출하기 위하여 A505㎚를 측정하여 정량하였다(도 3). 그 결과, 야생형 티로신 페놀리아제에 비하여 티로신 페놀리아제 A13V는 변성제 저항성이 약 50% 증가된 것을 확인하였다. 붉은 색을 검출하기 위하여 OD505를 측정하여 정량하였다(도 3).
따라서, 본 발명의 티로신 페놀리아제 A13V는 야생형과 비교하여 아미노산 서열이 다를 뿐만 아니라 내열성 및 변성제 저항성이 증대되어, 기존의 야생형 티로신 페놀리아제와 다른 특성을 갖는 돌연변이 티로신 페놀리아제이며, L-DOPA의 생산 등의 생물공정을 포함한 다양한 산업에서 널리 활용될 수 있으리라 여겨진다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 티로신 분해/합성 효소인 티로신 페놀리아제의 돌연변이체로서 내열성이 증대된 돌연변이 티로신 페놀리아제(A13V), 이를 코딩하는 유전자, 상기 돌연변이체의 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 대장균 및 형질전환된 대장균으로부터 티로신 페놀리아제 돌연변이체의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 돌연변이 티로신 페놀리아제는 야생형 티로신 페놀리아제에 비하여 효소의 열 안정성과 변성제 저항성이 증대되었으므로, L-DOPA의 생산 등의 생물공정 뿐만 아니라 의약 산업 등의 다양한 분야에서 유용하게 활용될 수 있다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Mutant phenol-lyase and preparation method thereof <130> 3p-10-41 <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 458 <212> PRT <213> Symbiobacterium toebii <400> 1 Met Asn Ser Pro Trp Ala Glu Pro Tyr Lys Ile Lys Val Val Glu Pro 1 5 10 15 Ile Arg Met Thr Thr Arg Glu Tyr Arg Glu Gln Ala Ile Arg Glu Ala 20 25 30 Gly Tyr Asn Thr Phe Leu Leu Arg Ser Glu Asp Val Tyr Ile Asp Leu 35 40 45 Leu Thr Asp Ser Gly Thr Asn Ala Met Ser Asp Arg Gln Trp Gly Ala 50 55 60 Leu Met Met Gly Asp Glu Ala Tyr Ala Gly Ala Arg Ser Phe Phe Arg 65 70 75 80 Leu Glu Glu Ala Val Arg Glu Ile Tyr Gly Phe Lys Tyr Val Val Pro 85 90 95 Thr His Gln Gly Arg Gly Ala Glu His Leu Ile Ser Arg Ile Leu Ile 100 105 110 Lys Pro Gly Asp Tyr Ile Pro Gly Asn Met Tyr Phe Thr Thr Thr Arg 115 120 125 Thr His Gln Glu Leu Gln Gly Gly Thr Phe Val Asp Val Ile Ile Asp 130 135 140 Glu Ala His Asp Pro Gln Ala Asn His Pro Phe Lys Gly Asn Val Asp 145 150 155 160 Ile Ala Lys Phe Glu Ala Leu Ile Asp Arg Val Gly Ala Asp Lys Ile 165 170 175 Pro Tyr Ile Asn Val Ala Leu Thr Val Asn Met Ala Gly Gly Gln Pro 180 185 190 Val Ser Met Ala Asn Leu Arg Glu Val Arg Lys Val Cys Asp Arg His 195 200 205 Gly Ile Arg Met Trp Ser Asp Ala Thr Arg Ala Val Glu Asn Ala Tyr 210 215 220 Phe Ile Lys Glu Arg Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Lys Pro Val Arg Glu 225 230 235 240 Ile Leu Lys Glu Met Met Ser Tyr Phe Asp Gly Cys Thr Met Ser Gly 245 250 255 Lys Lys Asp Cys Leu Val Asn Ile Gly Gly Phe Leu Ala Met Asn Glu 260 265 270 Glu Trp Ile Leu Gln Lys Ala Arg Glu Gln Val Val Ile Phe Glu Gly 275 280 285 Met Pro Thr Tyr Gly Gly Leu Ala Gly Arg Asp Met Glu Ala Ile Ala 290 295 300 Gln Gly Ile Tyr Glu Met Val Asp Asp Asp Tyr Ile Ala His Arg Ile 305 310 315 320 His Gln Val Arg Tyr Leu Gly Glu Gln Leu Leu Glu Ala Gly Ile Pro 325 330 335 Ile Val Gln Pro Ile Gly Gly His Ala Val Phe Leu Asp Ala Arg Ala 340 345 350 Phe Leu Pro His Ile Pro Gln Asp Gln Phe Pro Ala Gln Ala Leu Ala 355 360 365 Ala Ala Leu Tyr Val Asp Ser Gly Val Arg Ala Met Glu Arg Gly Ile 370 375 380 Val Ser Ala Gly Arg Asn Pro Gln Thr Gly Glu His Asn Tyr Pro Lys 385 390 395 400 Leu Glu Leu Val Arg Leu Thr Ile Pro Arg Arg Val Tyr Thr Asp Arg 405 410 415 His Met Asp Val Val Ala Tyr Ser Val Lys His Leu Trp Lys Glu Arg 420 425 430 Asp Thr Ile Arg Gly Leu Arg Met Val Tyr Glu Pro Pro Thr Leu Arg 435 440 445 Phe Phe Thr Ala Arg Phe Glu Pro Ile Ser 450 455 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal primer <400> 2 atgaattcac cctgggcgga acc 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal primer <400> 3 caaaacagcc aagcttatta gct 23 <210> 4 <211> 1377 <212> DNA <213> Symbiobacterium toebii <400> 4 atgaattcac cctgggcgga accgtacaag atcaaggtgg tggaacccat ccgcatgacg 60 acccgggagt accgggaaca ggcgatccgg gaggccggct acaacacctt cctgctgcgc 120 agcgaggacg tgtacatcga cctgctgacg gactcgggaa ccaacgcgat gtcggaccgg 180 cagtggggcg ccctgatgat gggcgatgag gcctacgccg gcgcacgctc cttcttccgc 240 ctggaggagg cggtgcgcga gatctacggc ttcaagtacg tggtgccgac ccatcagggg 300 cgcggtgccg agcacctgat ctcccgcatc ctcatcaagc ccggcgacta catccccggc 360 aacatgtact tcacgacgac gcgcacccac caggagctgc aggggggcac gttcgtcgac 420 gtgatcatcg acgaggccca cgatccccag gccaatcacc cgttcaaggg gaacgtggac 480 atcgccaagt tcgaggcgct catcgaccgg gtcggggccg acaagatccc gtacatcaac 540 gtggcgctta cggtcaacat ggccggtggt cagcccgtct ccatggccaa cctgcgtgag 600 gtgcggaagg tttgcgaccg gcacggcatc cggatgtgga gcgacgcgac ccgcgccgtg 660 gagaacgcct acttcatcaa ggagcgggag gagggctacc aggacaagcc ggtccgggag 720 atcctgaagg agatgatgtc ctacttcgac ggctgcacca tgtcgggaaa gaaggactgc 780 ctggtcaaca tcggcggctt cctggccatg aacgaggagt ggatcctcca gaaggcccgg 840 gagcaggtgg tcatcttcga gggcatgccc acgtacggcg gcctggccgg gcgcgacatg 900 gaggcgatcg ctcagggcat ctacgagatg gtggacgacg actacatcgc ccaccggatc 960 catcaggtgc gctacctggg cgagcagctg ctggaggcgg gcatccccat cgtgcagccc 1020 atcggcggcc acgccgtctt cctggacgcc cgggccttcc tgcctcacat cccgcaggac 1080 cagttccctg cccaggcgct ggcggcggcg ctctacgtgg actccggggt gcgcgcgatg 1140 gagcggggca tcgtctccgc cggccgcaac ccccagaccg gtgagcacaa ctatcccaag 1200 ctggagctgg tgcgcctcac gatcccgcgg cgggtctaca ccgaccggca catggacgtg 1260 gtggcgtact cggtgaagca cctgtggaag gagcgcgaca ccatccgcgg gctgcgcatg 1320 gtctacgagc cgcccaccct gcggttcttc acggcccgct tcgagccgat cagctaa 1377 <210> 5 <211> 458 <212> PRT <213> Symbiobacterium toebii <400> 5 Met Gln Arg Pro Trp Ala Glu Pro Tyr Lys Ile Lys Val Val Glu Pro 1 5 10 15 Ile Arg Met Thr Thr Arg Glu Tyr Arg Glu Gln Ala Ile Arg Glu Ala 20 25 30 Gly Tyr Asn Thr Phe Leu Leu Arg Ser Glu Asp Val Tyr Ile Asp Leu 35 40 45 Leu Thr Asp Ser Gly Thr Asn Ala Met Ser Asp Arg Gln Trp Gly Ala 50 55 60 Leu Met Met Gly Asp Glu Ala Tyr Ala Gly Ala Arg Ser Phe Phe Arg 65 70 75 80 Leu Glu Glu Ala Val Arg Glu Ile Tyr Gly Phe Lys Tyr Val Val Pro 85 90 95 Thr His Gln Gly Arg Gly Ala Glu His Leu Ile Ser Arg Ile Leu Ile 100 105 110 Lys Pro Gly Asp Tyr Ile Pro Gly Asn Met Tyr Phe Thr Thr Thr Arg 115 120 125 Thr His Gln Glu Leu Gln Gly Gly Thr Phe Val Asp Val Ile Ile Asp 130 135 140 Glu Ala His Asp Pro Gln Ala Asn His Pro Phe Lys Gly Asn Val Asp 145 150 155 160 Ile Ala Lys Phe Glu Ala Leu Ile Asp Arg Val Gly Ala Asp Lys Ile 165 170 175 Pro Tyr Ile Asn Val Ala Leu Thr Val Asn Met Ala Gly Gly Gln Pro 180 185 190 Val Ser Met Ala Asn Leu Arg Glu Val Arg Lys Val Cys Asp Arg His 195 200 205 Gly Ile Arg Met Trp Ser Asp Ala Thr Arg Ala Val Glu Asn Ala Tyr 210 215 220 Phe Ile Lys Glu Arg Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Lys Pro Val Arg Glu 225 230 235 240 Ile Leu Lys Glu Met Met Ser Tyr Phe Asp Gly Cys Thr Met Ser Gly 245 250 255 Lys Lys Asp Cys Leu Val Asn Ile Gly Gly Phe Leu Ala Met Asn Glu 260 265 270 Glu Trp Ile Leu Gln Lys Ala Arg Glu Gln Val Val Ile Phe Glu Gly 275 280 285 Met Pro Thr Tyr Gly Gly Leu Ala Gly Arg Asp Met Glu Ala Ile Ala 290 295 300 Gln Gly Ile Tyr Glu Met Val Asp Asp Asp Tyr Ile Ala His Arg Ile 305 310 315 320 His Gln Val Arg Tyr Leu Gly Glu Gln Leu Leu Glu Ala Gly Ile Pro 325 330 335 Ile Val Gln Pro Ile Gly Gly His Ala Val Phe Leu Asp Ala Arg Ala 340 345 350 Phe Leu Pro His Ile Pro Gln Asp Gln Phe Pro Ala Gln Ala Leu Ala 355 360 365 Ala Ala Leu Tyr Val Asp Ser Gly Val Arg Ala Met Glu Arg Gly Ile 370 375 380 Val Ser Ala Gly Arg Asn Pro Gln Thr Gly Glu His Asn Tyr Pro Lys 385 390 395 400 Leu Glu Leu Val Arg Leu Thr Ile Pro Arg Arg Val Tyr Thr Asp Arg 405 410 415 His Met Asp Val Val Ala Tyr Ser Val Lys His Leu Trp Lys Glu Arg 420 425 430 Asp Thr Ile Arg Gly Leu Arg Met Val Tyr Glu Pro Pro Thr Leu Arg 435 440 445 Phe Phe Thr Ala Arg Phe Glu Pro Ile Ser 450 455

Claims (9)

  1. 내열성과 변성제 저항성이 증대된 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 심비오박테리움 퇴비(Symbiobacterium toebii) 유래의 티로신 페놀리아제의 돌연변이체(A13V).
  2. 제 1항의 티로신 페놀리아제의 돌연변이체(A13V)를 코딩하는 유전자.
  3. 제 2항에 있어서, 서열번호 4로 기재되는 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 유전자.
  4. 제 2항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  5. 제 4항의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 대장균.
  6. 제 5항의 형질전환 대장균의 배양, 단백질의 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 제 1항의 티로신 페놀리아제의 돌연변이체(A13V)의 제조방법.
  7. 제 4항에 있어서, 도 1의 개열지도로 나타내어지는 pHCE19T(II)-A13V인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  8. 제 5항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 제 7항의 재조합 벡터인 것을 특징으로 하는 형질전환 대장균.
  9. 제 6항에 있어서, 상기 형질전환 대장균은 제 8항의 형질전환 대장균인 것을 특징으로 하는 티로신 페놀리아제의 돌연변이체(A13V)의 제조방법.
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