KR20070039447A - 고호열성 리가아제 효소 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 고호열성 리가아제(ligase) 효소 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, Thermococcus sp. 균주로부터 분리되어진 신규의 고호열성 리가아제 효소 및 이의 기능적 동등물, 이들의 아미노산 서열을 가진 단백질 및 고호열성 리가아제 효소 생산방법을 제공한다. 본 발명에 따른 리가아제 효소는 고호열성이다.

리가아제, 고호열성

Description

고호열성 리가아제 효소 및 이의 제조방법{Hyperthermophilic Ligase Enzyme and Methods of Preparation Thereof}

도 1은 Thermococcus sp. NA1 (TNA1), T. kodakarensis KOD1(TkKOD1, gi:57160399), Pyrococcus furiosus GE5(PaGE5, gi:545975), 및 P. furiosus DSM3638(pfDSM3638, gi:18893788)로부터의 DNA 리가아제의 아미노산 서열을 비교한 것을 보인다. 대시는 갭(gap)을 나타내고, 오른쪽의 숫자는 원래 서열안에 있는 마지막 잔기의 번호를 나타낸다. 4개의 효소 사이에 같은 잔기는 * 로 나타내었고 보존적 치환을 가진 잔기 및 반-보존적으로 치환된 것은 : 으로 나타내었다. 영역 I에서 IV까지, ATP-의존적 DNA 리가아제의 보전되어진 영역; 고세균의 DNA 리가아제에서 보전된 서열이 표시되었다.

도 2는 분리정제된 효소의 SDS-PAGE(12%) 분석결과이다. M, 표준시료; 1, 초음파 처리된 조추출액; 2, 열처리후 조추출액 3, His-태그된 친화성 크로마토그라피에서 용출된 단백질 분획. 분자량 표준물(레인 M)은 포스포릴라아제 b (103 kDa), 소 혈청 알부민 (77 kDa), 오발부민 (50 kDa), 카보닉 안하이드라아제 (34.3 kDa), 콩 트립신 억제제 (28.8 kDA), 및 리소자임 (20.7 kDa)이다.

도 3은 TNA1-lig의 활성에 대한 pH (A) 및 온도 (B)의 영향을 보인다. A. 활성도 분석은 다음의 완충용액(각각 50mM)에서 표준적인 방법으로 행하여졌다: MES, pH 6.0-7.0; 트리스-HCl, pH 7.0-9.0; 글리신, pH 9.0-10.0. B. 시료 온도가 40 에서 80℃로 올라가면서 표준 조건에서 활성분석이 행하여졌다.

도 4는 TNA1-lig의 활성에 대한 여러 종류의 2가 이온 (A) 및 MgCl₂ 농도 (B) 효과를 보인다. 활성도 분석은 여러 농도의 NaCl 존재하에서 수행되었다. B: 활성도 분석은 여러 농도의 KCl의 존재하에서 수행되었다.

도 5은 TNA1-lig의 활성도에 대한 NaCl (A) 및 KCl 농도 (B)의 효과를 보인다. A: 여러 농도의 NaCl 존재하에서 활성도 분석이 수행되었다. B: 여러 농도의 KCl 존재하에서 활성도 분석이 수행되었다.

도 6 TNA1_lig의 활성도에 대한 조효소 특이성(A), ATP 농도 (B), NAD⁺ 농도 (C)을 보인다. A: 활성도 분석은 여러 가지 dNTP가 포함되어 있는 표준의 닉-연결 활성도 분석 완충용액에서 행하여졌다. B: 활성도 분석은 여러 가지 농도의 ATP의 존재하에서 수행되었다. C:활성도 분석은 여러 가지 NAD⁺ 농도의 존재하에서 수행되었다.

도 7은 ATP 및 NAD⁺로의 TNA_lig의 라이게이션 분석을 보인다. 닉-연결 활성은 ³²P-레이블된 닉 기질이 연결되어지는 것에 의해 결정되어진다. 사이즈의 변화는 변성 15% 폴리아크릴아마이드-7M 우리아 겔위에서 관측된다. 레인 1, 80℃에서 20분간 조효소로 ATP로 반응한 후; 레인 2, 80℃에서 20분간 조효소로 NAD⁺로 반응한 후; 레인 3, 80℃에서 20분간 조효소로 ATP로 반응하기 전.

도 8은 본 발명에 따른 재조합 DNA 리가아제 효소를 가지고 있는 재조합플라스미드의 개열지도를 보인다.

게놈의 연구의 최근의 진보는 막대한 양의 서열 정보를 생산했다. 종래의 유전자 공학 및 게놈의 연구 기술의 일반적인 조합과 함께, 몇몇의 고호열성 미생물의 게놈 서열은 생물 공학 분야에서 열에 강한 효소 때문에 관심을 받고 있으며, 많은 매우 열안정적 효소가 생물 공학의 목적으로 개발되고 있다.

DNA 리가아제(EC 6.5.1.1 및 EC 6.5.1.2)는 이중나선 DNA에서 단일가닥의 쪽에서 5'-인산과 3'-하이드록시기 말단을 연결하거나, 상보적인 단일가닥 또는 블런트(blunt) 말단을 가지고 있는 두개 분절을 연결시킨다. 이런 기능이 DNA 복제, 재조합, 및 수선(Lehman 1974, Jessberger 1991, Li 1984, Wood 1988)에서 매우 중요하다. DNA 리가아제는 활성에 조효소를 필요로 하는가에 따라 두개의 그룹으로 나눈다. ATP를 요구하는 그룹(Kletzin, 1992) 및 NAD⁺를 요구하는 그룹(Thorbjarnardottir 1995)이 있다. 높은 유사성이 ATP-의존적 그룹(Kletzin 1992) 또는 NAD⁺ 의존적 그룹(Thorbjarnardottir 1995)에서 발견되었다. 진핵세포(Johnsosn 1997, Robins 1996, Knopf 1977), 바이러스(odell 1996, Parks 1994), 및 박테리오파아지(Coherty 1996, Knopf 1977)가 ATP-의존적 효소를 가지고 있다. 반면에 세균으로부터의 여러 가지 DNA 리가아제(Ishino 1986, Takahashi 1984, Thorbjarnardottir 1995)가 조효소로서 NAD⁺를 이용한다는 것을 보였다. 생물의 제 3 계인 고세균으로부터의 DNA 리가아제는 거의 알려져 있지 않다. 그러나 최근에 열안정적 리파아제가 호열성 고세균으로부터 알려졌다(Sriskanda 2000). Methanobacteium thermoautotrophicum △H (Sriskanda 2000), Pyrococcus abysii(http://www.genescope.cns.fr/pab/) Archaeoglobus fulgidus (Klenk 1997), 및 Methanococcus jannaschii (Bult 1996)으로부터의 DNA 리가아제에 대한 보고가 고세균 효소는 ATP 의존적 이라는 것을 나타낸다(Kletzin 1992). 그러나, Thermococcus에 속하는 고세균 리가아제는 아마도 조효소로서 NAD⁺ 및 ATP 모두를 요구할 것이라고 보고되었다(Nakatani et al. 2000; Rolland et al. 2004)

라이게이션(ligation) 분석은 단일 뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism; SNP)을 결정하는데 이상적인 면이 있다. 그리고 열안정적 DNA 리가아제는 단일-염기 유전 질환을 증폭 및 검출하기 위한 리가아제 연쇄 반응(Ligase chain reaction; LCR)의 핵심 성분이다(Barany 1991) 본 발명자들은 새로운 종의 Thermococcus의 신종을 분리하였으며, 지놈 정보의 분석을 통해 리가아제 효소를 가지고 있는 것을 발견하고, 리가아제에 상응하는 유전자의 클론닝 하였으며, 대장균에서 발현시켰다. 더욱더 재조합 효소가 분리되어져 그의 효소적 활성을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 신규의 고호열성인 DNA 리가아제 효소를 제공하는 것이다.

본 발명은 신규의 고호열성인 DNA 리가아제 효소를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 DNA 리가아제 효소 및 이를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 제조방법은 이에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 유전공학적 방법에 의한 제조방법이다.

본 발명은 DNA 리가아제 효소를 암호화하는 분리된 DNA 서열 및 이를 함유하는 재조합 벡터를 제공한다.

제 1 양태로, 본 발명은 고온에서 안정한 DNA 리가아제 효소를 암호화하는 핵산서열 및 상기 서열에 등가의 핵산서열을 제공한다. 상기 핵산서열들은 보다 구체적으로는 서열번호 1이다.

"등가의 핵산서열"에는 상기 DNA 리가아제 효소 서열의 코돈 축퇴성 서열을 포함한다.

"코돈 축퇴성 서열"이란 상기 자연 발생의 서열과는 상이하나 본 발명에 개시된 자연 발생의 DNA 리가아제 효소와 동일한 서열의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산서열을 의미한다.

제 2 양태로, 본 발명은 DNA 리가아제 효소를 제공한다. 보다 상세하게는 서열번호 2로 표시되는 DNA 리가아제 효소 및 이의 기능적 동등물을 제공한다.

본 발명의 "기능적 동등물"에는 서열번호 2의 DNA 리가아제 효소 중 일부 또는 전부가 치환되거나, 아미노산의 일부가 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함된다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 DNA 중합효소의 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다.

본 발명은, 제 3 양태로는 상기 DNA 리가아제 효소를 암호화하는 분리된 DNA 분절을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에서 사용되는 벡터라는 용어는 또다른 핵산을 그것에 결합시켜 이송시킬 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 발현벡터란 용어는 상기 벡터에 의해 운반되는 각 재조합형 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 합성시킬 수 있는 플라스미드, 코스미드 또는 파아지를 포함한다. 바람직한 벡터는 그것이 결합된 핵산을 자기 복제 및 발현시킬 수 있는 벡터이다.

본 발명의 제 4 양태로는, 상기 재조합벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.

본 발명에서 사용되는 '형질전환'이란 용어는 외래 DNA 또는 RNA가 세포에 흡수되어 세포의 유전형이 변화되는 것을 말한다.

적합한 형질전환세포로는 원핵생물, 곰팡이, 식물, 동물세포 등이 포함되나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는 대장균을 이용한다.

본 발명의 제 5 양태로는 상기 형질전환 세포, 또는 상기 Thermococcus sp.를 이용하여 DNA 리가아제 효소를 생산하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정이 되는 것은 아니다.

[실시예 1] Thermococcus sp. NA1으로부터 DNA 리가아제 유전자의 클론닝

균주 및 성장 조건

E. coli DH5α가 플라스미드 증식 및 핵산 서열분석을 위해 사용되었다. E. coli BL21-Codonplus(DE3)-RIL 세포(스트라타진, 라졸라, 캘리포니아) 및 플라스미드 pET-24a(+)(노바겐, 메이디슨, 위스콘신)가 유전자 발현을 위해 사용되었다. E. coli 균주는 37℃에서 루리아-베르타니(Luria-Bertani) 배지 안에서 배양되었고, 카나마이신이 최종농도가 50㎍/ml이 되도록 배지에 첨가되었다.

DNA 조작 및 서열분석

DNA 조작은 샘브록 및 러셀에 의해 기술된 것처럼 표준적인 방법으로 행하여졌다. Thermococcus sp.의 게놈 DNA는 표준적인 방법으로 분리되었다. 제한효소 및 다른 변형시키는 효소는 프로메가(메이디슨, 위스콘신)으로부터 구매하였다. E. coli 세포로부터 플라스미드 DNA의 적은 양의 제조는 플라스미드 미니 키트(퀴아겐, 힐덴, 독일)을 이용하여 행하여졌다. DNA 서열분석은 GenScan(PE Applied Biosystems, 포스터시, 캘리포니아) 프로그램이 장착된 자동 서열분석기(AB3100)로 행하여졌다.

TNA1_lig 유전자의 클로닝 및 발현

Nde I 및 Sal I 사이트로 플랭크(flank)된 전장의 Thermococcus sp. NA1 리가아제 유전자가 게놈 DNA 및 두 개의 프라이머(센스 [5'- CGACC CGG CAT ATG GGA GAC ATG AAA TAC ACT GAA CTC-3'(서열번호 3)] 및 안티센스[5'- CT CCA CAT GTC GAC CTT TTT AGC CTT GAA CCT CTC CTG -3'(서열번호 4)]; 센스 프라이머의 밑줄친 곳이 Nde I 사이트를 나타내고, 안티센스 프라이머의 밑줄친 곳이 Sal I 사이트를 나타낸다)을 이용하여 PCR 증폭되었다. 증폭되어진 DNA 절편은 서열을 확인한 후 Nde I 및 Sal I으로 다이제스트 되었다. 분절은 플라스미드 pET-24a(+)의 상응하는 사이트에 연결되고, 얻어진 재조합 플라스미드가 E. coli BL21-codonPlus(DE3)-RIL을 형질전환시키는데 사용되었다. 유전자의 과량발현은 이소프로필-β-_D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 중간 기학급수적 성장기에 첨가하고, 37℃에서 3시간 동안 항온 배양함으로써 유도되었다. 세포는 원심분리(4℃에서 20분간 6,000 x g)를 통하여 얻어졌고, 0.1M KCl 및 10% 글리세롤을 포함하는 50mM 트리스-HCl 완충용액(pH 8.0)에서 재현탁시켰다. 세포는 초음파에 의해서 분쇄되어지고, 원심분리(4℃에서 30분간 20,000 x g)에 의해서 분리되었다. 얻어진 상등액은 TALON^TM 금속 친화성 레진(BD Bioscience Clontech, 파우로 알토, 캘리포니아)의 컬럼에 처리되고, 0.1 M KCl 및 10% 글리세롤을 포함하는 50mM 트리스-HCl 완충용액(pH 8.0)안의 10mM 이미다졸(시그마, 세이트 루이스, 미주리)로 세척되었고, TNA1_lig는 완충용액내의 300mM의 이미다졸으로 용출되었다. 모아진 분획은 50 mM 트리스-HCl(pH 7.5), 1 mM DTT, 1mM EDTA, 및 10% 글리세롤을 포함하는 저장 완충용액으로 투석되어졌다. 단백질 농도는 브래드포드의 비색분석 방법에 의해 결정되었다. 단백질의 정제도는 표준 방법으로 수행되어진 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 분석에 의해서 조사되었다.

게놈 서열 분석에 의해 T. Kodakarensis (Nakatani 200)로부터의 리가아제와 비슷한 562개의 아미노산으로 이루어진 단백질(서열번호 2)을 암호화하는 오픈 리딩 프레임(1,689 bp; 서열번호 1)이 발견되었다. 리가아제의 활성에 필수적이고 모든 고세균의 서열 사이에서 보존되어져 있는 대부분의 잔기는 TNA1_lig에 잘 보전되어져 있었다(도 1). - TNA1_lig에서 Phe182에서 Ala206 및 6개의 모티프(I, III, IIIa, IV, V, VI)(subramanya 1996). ATP 분자와 반응하는 잔기는 또한 보존되어져 있었다. -AMP Lys252(AMP 결합), Arg257, Arg272, 및 Glu302 (리보스 결합), Phe342(퓨린 끼움) 및 Lys423(인산 결합), 이는 TNA1_lig가 리가아제 활성을 위해서 조효소로 ATP가 필요하다는 것을 의미한다. 그러나, Asn416 잔기는 사람 효소에서의 Lys737에 상응하는 위치를 대체했다(Tomkinson 1990). 페어와이즈 어라인먼트에서, TNA1_lig의 아미노산 서열은 Thermococcus kodakaransis KOD1 (82.0% 동일성, gi:7160399), Pyrococcus abyssi (75.0% 동일성, gi:5457975), Pyrococcus furiosus DSM3638 (72.0% 동일성, gi:18893788), 및 Archaeoglobus fulgidus DSM4304 (50.5% 동일성, gi:11498231)로부터 높은 유사성을 보였다. TNA1_lig 유전자는 PCR 증폭에 의해서 클론되었고, 발현된 효소는 상기 전술한 바와같이 분리되었다. SDS/PAGE의한 분석은 63-kDa 단백질(도 2)이었고, 이것은 62-kDa 단백질 및 C-말단에서의 LEH6-(His-Tag)1-kDa 펩타이드로 구성된 융합 생산물의 예상되었던 사이즈이고, 이것이 분리되어진 시료의 주된 성분이었다.

[실시예 2] 효소의 생화학적 성질

리가아제 기질

DNA 결합 및 라이게이션 분석에 사용되어진 기질은 중앙에 닉(nick)이 있는 70bp의 DNA 듀플렉스(duplex)이다. DNA 듀플렉스는 다음과 같이 70단위 주형 가닥에 35단위의 올리고데옥시뉴클레오타이드 두 개를 어닐링함으로써 형성되었다. 주형의 5' 사이드에 상보적인 3NA-Com 올리고머(5'-GGTCTAGAGGAGCGTCGAGTACCGTGGTTCGCGTC-3'(서열번호 5), 20 pmol)는 37℃에서 1시간 동안 200μCi[γ-³²P]ATP(3000 Ci/mmol, 암스테르담 바이오사이언스, 영국)의 존재하에서 T4 폴리뉴클레오타이드 키나아제에의해서 라디오 레이블되었다. 레이블된 올리고머는 어닐링 완충용액(20mM 트리스-HCl, pH 8.0, 및 10mM KCl)에서 주형 가닥(NA-Tem, 5'-GACGCGAACCACGGTACTCGACGCTCCTCTAGACCCGACCTGTTGGCATGCAGCTACGGATCCGGACTCG-3'(서열번호 6))에 주형 가닥의 3' 사이드에 상보적인 5NA-com 올리고머((5'-CGAGTCCGGATCCGTAGCTGCATGCCAACAGGTCG-3'(서열번호 7)가 재결합되었다. 혼합물은 95℃로 5분 동안 가열한 후에 대기온도로 서냉 되었다. 상기 성분들의 몰비는 3NA-com, 5-NA-com, 및 NA-Tem이 어닐링 혼합물에서 각각 1:1:1 이었다.

닉-연결 활성도 분석

DNA 리가아제의 닉-연결 활성도에 대한 분석은 쏘올브자아나르도티어 등(Thorbjarnardottir 1995)의 방법에 의하여 수행하였다. 닉-연결 활성도 분석을 위한 기질 준비에 사용된 올리고데옥시뉴클레오타이드의 서열은 상기 설명된 바와 같다. 그러나, 3NA-Com 올리고머가 3'-말단에 바이오틴으로 레이블되었고, 5'-말단에 인산화되었다. 그리고 5NA-com 올리고머는 5'-말단에서 형광물질로 레이블되었다. TNA1-lig (0.2 pmol)이 20 ㎕의 표준 분석 완충용액(20mM 트리스-HCl, pH 8.0, 10mM KCl, 5mM MgCl₂, 1mM ATP 및 0.01% BSA)에서 5pmole의 재결합된 기질과 혼합되었다. DNA 리가아제의 활성은 15분간 80℃에서 분석되었다. 반응은 2.0 ㎕의 0.1M EDTA를 첨가하여 종결되었고, 얼음에서 10분간 항온보관되었다. 각각 반응된 시료로부터 세벌의 20㎕의 일부량이 스트렙타비딘 코팅된 96-웰 마이크로타이터 플레이트(MaxiSorp; Nunc, 덴마아크)에 30㎕의 세척 완충용액(100 mM 트리스-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl 및 0.05% 트윈20)과 함께 웰들에게 올려졌다. 플레이트는 1시간동안 37℃ 에서 항온보관 되었고, 멸균수로 두 번 세척되고, 변성 완충용액(0.1 N NaOH 및 0.05% 트윈20)으로 한 번 더 세척하고, 50㎕의 세척 완충용액에서 1:3000 희석된 항-플루레신알카라인 포스페이트 컨쥬게이트(뵈링거-만하임, 독일)로 30분간 37℃에서 항온보관 되었다. 세척 완충용액으로 6번 세척한 다음에, 50㎕의 새로운 기질 용액(5mM ρ-니트로페닐 포스페이트, 100mM 트리스-HCl, pH 9.0, 1mM MgCl₂ 및 0.5mM ZnCl₂)이 첨가되고 1시간 동안 37℃에서 항온보관되었다. 얻어진 황색이 분광기로 405nm에서 읽어졌다.

라이게이션 분석

DNA 라이게이션 분석을 위해, 20mM 트리스-HCl, pH 8.0, 10mM KCl, 1 mM MgCl₂, 2mM DTT, 1mM ATP, 0.2 pmol 의 ³²P-레이블된 닉(nick)되어진 듀플렉스 기질반응 혼합물(20㎕) 및 1 pmol TNA1_lig가 20분안 80℃에서 항온보관 되었다. 항온보관 후에, 반응은 EDTA 및 포름아마이드의 첨가에 의해 정지되었다. 반응되어진 샘플은 5분 동안 95℃에서 가열되었고, 다음으로 TBE안에 7 M 우리아를 포함하는 15% 폴리아크릴아마이드 겔에서 전기영동 되었다. 라이게이션 산물은 건조된 젤의 오토라디오그라피에 의해 가시화 되었다.

TNA1_lig의 리가아제 활성은 전술한 바와 같이 측정되었다. 활성은 고온에서 강하게 촉진되었고, 최적 온도가 80℃ 이었고, 40-50℃에서는 최대 활성의 40%보다 적었다(도 3). TNA1_lig에 대한 pH의 영향은 pH 6.0 내지 10.0 사이에서 측정되었고, 최적 활성도는 pH 7.5 이었다. Mg²⁺ 및 Zn²⁺의 첨가는 활성을 상당히 증가시켰지만 이들 이온은 Ca²⁺, Mn²⁺, 및 Ni²⁺에 의해서 대체되어질 수 없었다(도 4). Mg²⁺의 최적 농도는 0.5mM으로 결정되었다. 흥미롭게도, 리가아제 활성은 Mg²⁺가 없어도 관측이 되었다. TNA1_lig 활성을 위해서 염을 필요로 하지 않는 것으로 보였으나, 40mM의 NaCl 및 6 mM KCl은 활성도를 각각 20% 및 30% 증가시켰다(도 5).

ATP 분자와 결합하는 잔기의 존재는 APT을 필요로 하는 것을 의미할 수 있으나, 고세균 리가아제의 NAD⁺ 요구가 있다는 보고들은 서열 분석이 고세균 리가아제에서 조효소의 요구을 예측하는데 충분하지 않다는 것을 제시한다. 이점을 명확히하기 위해, TNA1_lig의 조효소 요구가 시험되었다. 도 6에서 보이는 것처럼 ATP 및 NAD⁺가 TNA1_lig 활성도를 농도 의존적으로 촉진한다. 상기 리가아제의 활성도는 ATP 및 NAD⁺가 없으면 매우 낮았다. 재조합 TNA1_lig 준비동안에 ATP의 오염 논란을 없애기 위하여, TNA1_lig가 오염된 ATP를 소모시키기 위해서 레이블되지 않은 기질과 전-항온반응 되었으나, 전-항온보관되어진 TNA1_lig의 리가아제 활성은 변하지 않았다. 더욱더, ³²P-레이블된 기질을 이용한 분석에서도 확인되었다. 도 7에서 보이듯이, 70단위 올리고뉴클레오타이드인 라이게이션 산물은, ATP 뿐만아니라 NAD⁺로 보충되어진 반응에서 나타났다. 이들 결과는 TNA1_lig가 두개의 조효소와 함께 같은 촉매 잔기를 사용 할 것 같다는 것을 제시한다. NAD⁺로 보충되어진 효소 활성은 ATP가 라이게이션 분석에서 이용되었을 때 보다 효소 활성이 높았고, 이것은 NAD⁺가 더 선호되는 조효소임을 가르킨다. 그러나, NAD⁺ 의 효과는 닉-연결 분석에서 ATP의 효과의 것과 비슷하였다.

본 발명에 따른 DNA 리가아제 효소는 고호열인 신규한 DNA 리가아제 효소이다. 따라서 라이게이션(ligation) 분석을 통한 단일 뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism; SNP)을 결정하는데 유용하며, 단일-염기 유전 질환을 증폭 및 검출하기 위한 리가아제 연쇄 반응(Ligase chain reaction; LCR)에 적용가능하다.

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145 150 155 160 Val Leu Gly Met Met Arg Thr Gly Val Ala Glu Gly Ile Leu Arg Asp 165 170 175 Ala Ile Ala Glu Ala Phe Lys Val Lys Ala Glu Leu Val Glu Arg Ala 180 185 190 Tyr Met Leu Thr Ser Asp Phe Gly Tyr Val Ala Lys Val Ala Lys Leu 195 200 205 Glu Gly Asn Asp Gly Leu Gly Lys Val His Ile Gln Ile Gly Lys Pro 210 215 220 Ile Arg Pro Met Leu Ala Gln Asn Ala Ala Ser Val Lys Glu Ala Leu 225 230 235 240 Leu Glu Met Gly Ala Glu Ala Ala Phe Glu Ile Lys Tyr Asp Gly Ala 245 250 255 Arg Val Gln Val His Lys Asp Gly Asp Arg Val Val Ile Tyr Ser Arg 260 265 270 Arg Leu Glu Asn Val Thr Arg Ser Ile Pro Glu Val Val Asp Ala Ile 275 280 285 Lys Ala Ser Ile Lys Ser Glu Lys Ala Ile Val Glu Gly Glu Leu Val 290 295 300 Ala Val Gly Glu Gly Gly Arg Pro Arg Pro Phe Gln Tyr Val Leu Arg 305 310 315 320 Arg Phe Arg Arg Lys Tyr Asn Ile Glu Glu Met Ile Glu Lys Ile Pro 325 330 335 Leu Glu Leu Asn Leu Phe Asp Val Leu Tyr Val Asp Gly Glu Pro Leu 340 345 350 Ile Asp Thr Pro Phe Arg Glu Arg Arg Ala Lys Leu Glu Glu Ile Val 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<220> <223> TNA1_lig sense primer <400> 3 cgacccggca tatgggagac atgaaataca ctgaactc 38 <210> 4 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TNA1_lig antesense primer <400> 4 Cys Thr Cys Cys Ala Cys Ala Thr Gly Thr Cys Gly Ala Cys Cys Thr 1 5 10 15 Thr Thr Thr Thr Ala Gly Cys Cys Thr Thr Gly Ala Ala Cys Cys Thr 20 25 30 Cys Thr Cys Cys Thr Gly 35 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3NA-com oligonucleotide <400> 5 ggtctagagg agcgtcgagt accgtggttc gcgtc 35 <210> 6 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NA-tem oligonucleotide <400> 6 gacgcgaacc acggtactcg acgctcctct agacccgacc tgttggcatg cagctacgga 60 tccggactcg 70 <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5NA-com oligonucleotide <400> 7 cgagtccgga tccgtagctg catgccaaca ggtcg 35

Claims (13)

1. Thermococcus sp. 균주로부터 분리되어진 고호열성 DNA 리가아제 효소 및 이의 기능적 동등물.
2. 서열번호의 2의 아미노산 서열을 가진 단백질.
3. 서열번호 1의 유전자.
4. 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자.
5. 제 1 항에 따른 상기 고호열성 리가아제 효소를 암호화하는 핵산서열.
6. 제 5 항에 있어서, 서열번호 1의 상기 고호열성 리가아제 효소를 암호화하는 DNA 핵산서열.
7. 제 5 항에 있어서, 상기 고호열성 리가아제 효소를 암호화하는 DNA 핵산서열이 서열번호 1과 코돈 축퇴성에 의한 등가인 것을 특징으로 하는 핵산서열.
8. 제 1 항에 따른 고호열성 리가아제 효소가 서열번호 2를 가지는 것을 특징으로 하는 리가아제 효소.
9. 제 1 항에 따른 고호열성 리가아제 효소가 서열번호 2와 기능적으로 동등한 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 리가아제 효소.
10. 제 5 항 내지 제 7 항의 어느 한 항에 따른, 핵산서열을 포함하는 재조합벡터.
11. 제 10 항에 있어서, 상기 재조합벡터가 도 8에 기재된 개열지도를 가지는 것을 특징으로 하는 플라스미드.
12. 제 10 항에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 세포.
13. 균주 Thermococcus sp. NA1. 또는 제 12 항에 따른 형질전환된 세포를 배양하고, 상기 배양된 세포로부터 리가아제 효소를 분리하는 것을 특징으로 하는 고호열성 리가아제 효소 생산방법.

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