KR100564927B1 - 플라티코딘을 유효성분으로 함유하는 항암제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 플라티코딘을 유효성분으로 함유하는 항암제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 NF-κB 활성화를 통하여 세포사멸(apoptosis)을 유발하며, 마우스의 피부암에서 암세포의 성장을 억제하는 효과를 가지는 플라티코딘을 유효성분으로 함유하는 항암제에 관한 것이다. 플라티코딘은 암 세포에 처리했을 때 NF-κB 활성화 및 이를 통한 세포 사멸(apoptosis)을 유발한다. 또한 마우스에서 암세포의 성장을 억제하는 효과를 가진다. 이러한 효과로 인해 본 발명의 플라티코딘은 암에 대한 새로운 치료제의 개발에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

플라티코딘을 유효성분으로 함유하는 항암제{Anti-cancer agent comprising platycodin as an effective ingredient}

도 1은 플라티코딘 D 10 μM의 처리에 대한 HaCaT 세포의 생존도를 MTT법으로 분석하여 나타낸 그래프이다.

도 2는 pNF-κB-SEAP-NPT로 형질감염된 인간 HaCaT세포에 플라티코딘 D, 플라티코딘 D₃, 셀레브렉스, 및 아글리콘을 처리하였을 때 NF-κB가 활성화되는 정도를 나타내는 알칼리인산 분해효소의 활성을 분석하여 나타낸 그래프이다.

AG : 아글리콘

PD : 플라티코딘 D

PD₃ : 플라티코딘 D₃

CBX : 셀레브렉스

도 3은 pNF-κB-SEAP-NPT로 형질감염된 인간 HaCaT세포에 플라티코딘 D를 처리하였을 때 시간의 경과에 따라 NF-κB가 활성화되는 정도를 나타내는 알칼리인산 분해효소의 활성을 분석하여 나타낸 그래프이다.

도 4는 인간 HaCaT세포에 플라티코딘 D를 처리하였을 때 시간이 경과함에 따 라 NF-κB가 활성화되는 것을 나타내는 EMSA(electrophoretic mobility shift assay) 실험 결과(A),

인간 HaCaT세포에 플라티코딘 D를 처리하였을 때 시간의 경과에 따른 세포내의 I-κB의 발현 정도를 나타내는 Western Blot 결과(B),

(A)에서 나타난 밴드가 실제적으로 NF-κB 특이적 복합체인지를 확인한 결과(C),

플라티코딘 D를 농도 의존적으로 처리하여 NF-κB가 활성화되는 것을 나타내는 EMSA 실험 결과(D)이다.

도 5는 각 농도의 플라티코딘 D를 처리한 인간 HaCaT세포로부터 추출한 DNA를 전기영동한 결과(A), 50 μM의 플라티코딘 D를 처리한 인간 HaCaT세포로부터 시간의 경과에 따라 추출한 DNA를 전기영동한 결과이다(B).

도 6은 인간 HaCaT세포에 플라티코딘 D를 처리하였을 때 DNA가 단편화되는 정도를 TUNEL 분석법을 통하여 유세포분석기로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 7은 인간 HaCaT세포에 플라티코딘 D 30 μM을 처리하였을 때 세포내의 Fas, Fas 리간드, 프로카스파제-3, 프로카스파제-8, 카스파제-3 및 카스파제-8 단백질을 각 단백질에 대한 항체를 이용하여 Western Blot으로 확인한 결과이다. 여기에서 각 레인에 동일한 양의 단백질이 로딩되었음을 확인하기 위하여 α-튜블린이 대조군으로 사용되었다.

도 8은 인간 HaCaT세포에 플라티코딘 D 30 μM을 처리하였을 때 시간이 경과 함에 따라 Fas와 Fas 리간드의 유전자가 발현되는 것을 나타내는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)물의 전기영동 결과이다.

도 9는 DMBA와 TPA로 유도된 마우스 피부암에 대하여 플라티코딘 D를 처리하였을 때, 처리하지 않았을 때와 비교하여 유두종을 가지는 마우스의 비율(도 9의 A)과 마우스 개체 당 유두종의 개수(도 9의 B)를 분석하여 나타낸 그래프이다.

도 10은 세포사멸의 진행 경로를 나타내는 모식도이다.

도 11은 NF-κB의 활성화가 Fas 와 Fas 리간드 mRNA의 전사(transcription)를 유도하고, 번역(translataion)된 후 만들어진 Fas 와 Fas 리간드 단백질이 외인적 경로를 통한 세포사멸 신호를 전달하게 됨을 보여주는 모식도이다.

본 발명은 플라티코딘을 유효성분으로 함유하는 항암제 관한 것으로, 보다 상세하게는 NF-κB 활성화를 통하여 세포사멸(apoptosis)을 유발하며, 마우스의 피부암에서 암세포의 성장을 억제하는 효과를 가지는 플라티코딘을 유효성분으로 함유하는 항암제에 관한 것이다.

생명체를 구성하고 있는 다양한 종류의 세포들은 기본적으로 유한한 생명을 갖고 생성된 후 성장, 분화를 거쳐 여러 경로를 통하여 사멸(死滅)된다. 이러한 세포사의 양식에는 세포괴사(necrosis)와 세포사멸(apoptosis)의 2종류가 있다. 이 중, 세포괴사는 영양소의 결핍과 독물 외상 등 외적 환경 요인에 따른 수동적 세포사 즉, 세포의 타살이라 할 수 있으며, 세포 전체와 미토콘드리아가 서서히 팽대되고, 세포내 소기관 장해(특히 미토콘드리아의 ATP 합성 저하 등)가 일어나며, 생체막 삼투압은 제어 불능이 되어 세포가 융해되는 형태적 특징을 가진다. 한편, 세포사멸은 개체의 제어 기구에 의해 예정된 생리적 능동적인 세포사 즉, 세포의 자살이라 할 수 있으며, 세포의 축소, 핵농축, 크로마틴의 응축, DNA 단편화(DNA ladder의 형성), 미섬모의 소실(세포내 소기관의 파괴는 적다)이 일어나며 아폽토틱 바디(apoptotic body)가 형성되어 거식세포에 의해 탐식되는 형태적 특징을 가진다(John D R, Sten O, Boris Z, 2000, J. Structur. Biol. 129, 346~358; Takeuchi M, Hayakawa A, Takagi K, Hiramatsu K, Shimizu Y, Matsumoto S, Hiramatsu T, Ito Y, Kume H, Suzuki R, Yamaki K, Apoptosis, 1999, 4, 461~468).

특히, 세포사멸(apoptosis)은 1972년에 케어 등(Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR. Br. J. Cancer, 1972, 26, 239~257)에 의해 처음 언급되었으며, 이는 다세포 생명체의 정상적인 기관의 발달과 조직의 항상성 유지에 필수적인 생리현상 중의 하나로서, 어떤 자극에 대해 반응하는 세포에서 선택적으로 일어나는 대표적인 세포내 작용 메카니즘이다. 세포사멸은 발생과정의 형태 형성, 세포 조직의 반전, 면역기구 등에 있어, 생리적 세포사로서 중요한 역할을 하며, 생체의 통일성이나 항상성은 세포 증식과 제어된 세포사에 의해 유지되고 있기 때문에 세포사멸 기능이 과도하게 진전되거나 저하되어도 여러 가지 질환이 발생한다. 세포사멸이 과도 하게 진전되는 경우와 관련된 질환으로서 알츠하이머병, 파킨슨병, 근육위축성경화증, 심근경색, 재생 불량성 빈혈, AIDS 등이 있고, 저하되는 경우와 관련되는 질환으로는 유방암, 난소암, 전립선암, 헤르페스 바이러스 감염, 아데노 바이러스 감염 질환 등을 들 수 있다.

이러한 세포사멸의 진행경로는 크게 두 가지로 나눌 수 있는 데, 그 첫 번째는 내인적(intrinsic) 경로로서 미토콘드리아에 관여되는 Bcl-2라든지 Bax 등의 유전자들이 세포사멸에 관련된 단백질 조절에 관여하여 카스파제-9(caspase-9)를 활성화시키고 다시 카스파제-3(caspase-3)를 활성화시킴으로써 세포사멸로 이어지는 경로이며, 다른 하나는 외인적(extrinsic) 경로로서 세포 표면에 있는 Fas와 FADD로 이어지는 단백질의 신호전달에 의해서 카스파제-8(caspase-8)을 활성화시키고 이 후 카스파제-3(caspase-3)를 활성화시킴으로써 세포사멸로 이어지는 경로로 나눌 수 있다(도 10 참조).

또한, 이러한 세포사멸의 분자수준에서의 작용기전에는 전사 조절인자 가운데 하나인 NF-κB가 연관되며 중요한 역할을 한다는 것이 보고되어왔다. NF-κB는 평소에는 저해 단백질인 I-κB 와 세포질 내에서 결합한 형태의 불활성 복합체를 형성하고 존재하다가 세포가 다양한 NF-κB 활성 물질, 예를 들면 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor), 인터루킨-1(IL-1), 리포다당류(lipopolysaccaride) 및 자외선 등에 노출되면 저해 단백질인 I-κB의 인산화가 유발되어 분해되고 결국 I-κB로부터 NF-κB가 분리된 후, NF-κB가 세포핵 내부로 이동하게 되어 목표 유전자의 발현을 야기시킨다고 알려져 있다.

연구 초기에는 NF-κB 활성화에 의해서 세포사멸 과정이 진행된다는 것이 지배적인 생각이었으나, 근래의 많은 실험 결과 NF-κB의 활성화와 세포사멸의 관계는 어떤 세포에 어떤 유발인자(inducer)를 사용했느냐에 따라 달라질 수 있다는 것이 밝혀지고 있다. NF-κB의 활성화가 세포사멸을 유도하는 경우, 세포사멸을 유발하는 유전자인 Fas와 Fas 리간드의 유전자에 NF-κB가 결합할 수 있는 부위가 존재하여, NF-κB가 활성화되어 핵속으로 들어가면 Fas 와 Fas 리간드의 유전자에 결합하여 Fas 와 Fas 리간드 mRNA의 전사(transcription)를 유도하고, 번역(translation)된 후 만들어진 Fas 와 Fas 리간드 단백질이 상기 외인적 경로를 통한 세포사멸 신호를 전달하게 된다(도 11 참조).

전술한 바와 같이, NF-κB의 활성은 세포사멸 과정과 중요한 연관성을 가지기 때문에 여러 가지 질환의 치료에 있어서 중요한 표적이 되고 있으며, 배양세포나 완전한 조직 모델에서 NF-κB 활성을 측정하는 방법으로 전기영동 이동 전이법(electrophoretic mobility shift assay, EMSA), NF-κB p65 단백질의 세포핵으로의 이동(nuclear translocation), NF-κB에 의해 유도되는 유전자의 교차활성(transactivation) 그리고 NF-κB에 의해 조절되는 단백질 발현의 측정 등의 몇 가지 방법이 알려져 있다. 또한 본 발명자들은 NF-κB 활성화를 정량적으로 분석하기 위하여, NF-κB에 전사 리포터(transcription reporter)로 분비성 알칼라인 인산화효소(secretory alkaline phosphatase, SEAP)를 발현하는 유전자와, 선별마커(selectable marker)로 네오마이신 인산화전이효소(neomycin phosphotransferase, NPT)를 융합시켜 제조한 발현벡터(pNF-κB-SEAP-NPT)를 이용하여 세포기반의 분석 시스템 (cell-based assay system)을 이용한 알칼리인산 분해효소 분해능 정도에 따라 NF-κB 발현을 정량적으로 측정하는 분석 시스템을 개발한 바 있다(대한민국 특허출원 제2000-0070557호).

상기에서 언급한 바와 같이, 최근 세포사멸이 세포 증식과 함께 조직의 항상성 유지에 중요한 역할을 함이 밝혀짐에 따라 면역질환 및 종양을 비롯한 많은 질환들이 세포사멸의 조절이상으로 발생한다는 새로운 실례가 대두되게 되었다. 또한, 세포사멸 기작은 암 등과 같은 악성 세포를 제거하는 체내의 주요 방어 기작으로도 작용한다. 따라서 인체의 많은 질환들의 발병기전의 이해 및 이에 따른 치료 방식의 개발을 위해서는 인체 각 조직에서 세포사멸 조절기전에 대한 이해가 큰 관심사로 떠오르게 되었고, 이에 의약학 산업 분야에서의 세포사멸은 부가가치가 높은 부분으로 부상하였으며, 퇴행성 신경질환, 면역계 질환 및 암 등 여러 질병들의 질환에 관련된 예방 및 치료방법의 새로운 방안으로써 약용 식물을 이용한 신기능성 식품의약 등이 개발되고 있다.

도라지(Platycodon grandflorum A. DC.)는 초롱과(Campanulaceae)에 속한 다년생 초본으로서 전체에 털이 없고 뿌리는 비대하며, 줄기는 하나 또는 모여 나 며, 곧게 서고 높이는 50~100 cm이다. 이는 전국 각지 산야에 자생하는 다년초로 잎과 뿌리는 식용되고 있다. 줄기에 상처를 내면 흰색 즙이 나오는데, 이 즙은 인삼과 흡사한 사포닌(saponin) 성분을 포함하며, 특히 생약으로 사용하고 있는 뿌리 는 '길경'(桔梗)이라 하며 한방에서 기침, 담석, 거담제, 코가 막히는데, 감기, 편도선염, 농증의 약으로 이용되고 있다. 일반적으로 사포닌은 트리테르펜(triterpene)류 및 스테로이드(steroid)류를 아글리콘(aglycone)으로 하고 당과 글리코시드(glycoside) 결합을 하고 있는 화합물 군으로 분류하며, 또한 이들 사포닌군은 사포제닌(sapogenin)에 따라 구별할 수 있는데, 이중 길경 사포닌은 5환성 올레아난(oleanane)형 트리테르펜 사포닌(triterpene saponin)에 속한다. 구체적으로 길경에는 사포닌 성분으로 10여종의 트리테르펜 사포닌이 약 2% 함유되어 있으며, 이 사포닌 중, 플라티코디제닌(platycodigenin)의 배당체로 플라티코딘 A, C, D, D₂와 2종의 모노아세테이트(monoacetate), 플라티코딘 D₃가 보고되었다(Rossi M et al., Chem. Pharm. Bull., 16(11)2300, (1968)). 한편, 길경의 면역 약리학적 연구로서 미치노리 등은 70% 메탄올 추출물과 그 분획이 마우스의 세망내피 조직에서 탄소 정화(carbon clearance)방법을 통하여 식세포 활성(phagocytic activity)에 효과가 있음을 보고하였는데 구체적으로, 미정제 플라티코디 이눌린(crude platycodi inulin), 미정제 플라티코디 사포닌(crude platycodi saponin)을 마우스에 경구투여 한 경우, 1시간 후부터 탄소 정화율(carbon clearance-rate)이 현저히 증가하였다고 보고하였다(Michinori et al., Shoyakugaku zasshi, 1986, 40(4):367). 이 결과로 미정제 플라티코디 이눌린과 미정제 플라티코디 사포닌이 세망세피 조직의 포식작용을 촉진하는 것으로 추정하였다. 또한 남바 등은 길경에서 추출한 이눌린(inulin)에 의한 항암활성에 관 하여 보고하였는데, 이 경우에 이눌린을 미토마이신 씨(mitomycin C)와 함께 처리할 때 항암활성을 증가시켰다(Namba et al., Shoyakugaku zasshi, 1986, 40(4):375). 길경 플라티코딘인 조 플라티코딘은 오당류인 디-아피오즈(D-apiose)를 갖는 사포닌이다. 조 플라티코딘 약리작용에 관한 연구로는 위액 분비와 위궤양에 미치는 효과, 급성독성 및 중추억제작용 적출장기에 미치는 작용, 호흡순환기계에 미치는 작용이 확인되었으며 또한 용혈, 항염증, 진핵, 거담, 진통, 진해, 해열작용 등에 대해서도 보고되어 있다. 이러한 길경 사포닌에 대한 생리 활성을 조사해 본 결과 사포닌 구조에 따라 각각의 활성이 다르다고 보고되고 있고, 특히 이러한 사포닌 중에서 플라티코딘 D와 플라티코딘 D₃라는 물질은 염증을 유도하는 COX-2를 간접적으로 저해를 시키는 것으로 보고되고 있으며(Kim YP et al., Planta Med, 2001, 67:362-364), 또한 기도의 뮤신(mucin)을 증가시킴으로써 다양한 기도관련 질병에 대한 치료제로 제시되고 있다(Shin CY et al., Planta Med, 2002, 68(3):221-225). 이러한 만성적 항염증 효과에 대한 생리활성을 지닌 사포닌들은 또한 특정 암세포에 대한 항암제 효과도 가진다고 알려져 있다.

피부암은 악성 흑색종, 육종, 림프종, 및 기타 피부 악성 종양을 포함하여 피부에 발생하는 모든 악성 종양을 총칭한다. 피부암을 일률적으로 말하기는 곤란하나, 기타 부위에 발생하는 암과 마찬가지로 급속히 발육하면서 주위 조직을 침범하고, 원격 부위에 전이를 일으키는 일반적인 특징을 가진다. 사람의 피부도 세포 로 구성되어 있는 이상 역시 암으로 변하는 위험에서 제외될 수는 없다, 또한 다년간 아무렇지 않은 양성의 점, 모반, 사마귀 등이 어떤 자극으로 돌연히 악성화 하는 경우도 있고, 화상을 입은 후의 흉터는 갈라진 틈이 궤양이 되면 짓물러서 암으로 변할 위험이 있다. 티눈도 그것 자체는 아무 걱정 할 것이 없는 것이지만, 다년간 방치해 두면 만성자극을 피부에 주어 암 발생을 유발한다. 사마귀는 바이러스 감염에 의해 생기는 것으로 암은 아니지만 보통 사람이 사마귀로 잘못 알고 피부암에 상처를 입혀서 악화시키는 예도 있다. 일반적으로 피부암의 치료는 우선 국소부위를 절취한 후, 방사선 요법이 행해진다.

지금까지 사포닌 계열에 대하여 항암효과가 나타난다는 보고서는 수 없이 많지만 그러한 항암효과에 대한 자세한 기전은 명쾌히 설명해 주지는 못하는 실정이다. 또한 동양의학 및 국내의 식물약재로부터 암세포들에 대한 단순한 독성을 찾아내는 것만으로는 항암효과의 정확한 기전은 설명할 수는 없다.

이에, 본 발명자들은 플라티코딘의 항암효과를 피부암세포에 적용함으로써 피부암 세포 내에서 사포닌의 일종인 플라티코딘에 의한 세포사멸 작용기전을 규명하고자 하였으며, 도라지로부터 추출한 플라티코딘이 NF-κB 활성화를 통하여 세포 사멸을 유발하며, 유도된 마우스의 피부암에서 암세포의 성장을 억제하는 효과를 가짐을 밝히고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 플라티코딘을 유효성분으로 함유하는 항암제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 플라티코딘을 유효성분으로 함유하는 항암제를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

상기에서, 플라티코딘은 플라티코딘 D 또는 플라티코닌 D₃인 것이 바람직하다. 또한, 암은 피부암, 위암, 간암, 폐암 및 유방암으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 피부암인 것이 바람직하다.

플라티코딘 D는 하기 화학식 1의 구조를 가지며, 플라티코딘 D₃는 하기 화학식 2의 구조를 가진다.

본 발명의 항암제는 통상적으로 사용되는 부형제, 붕해제, 감미제, 활택제, 향미제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 의해 정제, 캅셀제, 산제, 과립제, 현탁제, 유제, 시럽제, 기타 액제로 제형화될 수 있다.

구체적으로 본 발명의 항암제는 경구 투여용 제형, 예를 들면 정제, 트로치제(troches), 로젠지(lozenge), 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에 멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제(elixirs)로 제제화된다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제하기 위해 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕해제; 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유가 함유된다. 캡슐제형의 경우는 상기에서 언급한 물질 이외에도 지방유와 같은 액체 담체를 함유한다.

또한, 본 발명의 항암제는 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 상기 플라티코딘을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제한다.

독성실험 결과 플라티코딘은 600 mg/㎏의 용량으로 래트에게 경구 투여하였을 때 독성이 거의 없는 것으로 밝혀졌고 간을 비롯한 장기의 기능에 어떠한 부작용도 나타내지 않음을 확인하였다.

본 발명에 따른 유효성분인 플라티코딘의 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증 정도에 따라 적절히 선택되나, 일반적으로 성인에게 1일에 체중 1 ㎏당 화학식 1의 화합물을 10∼100 ㎎의 양으로 1회 내지 수회 나누어 투여할 수 있으며, 20∼60 ㎎ 의 용량인 것이 바람직하다.

본 발명자들은 상기 추출한 플라티코딘 D의 처리에 의한 NF-κB 활성화를 확인하기 위한 다양한 실험을 수행하기 위하여 우선, 인간 피부암 세포주인 HaCaT 세포에서 세포독성을 나타내지 않는 플라티코딘의 농도를 결정하였다. 배양한 HaCaT 세포에 플라티코딘 D를 처리하고 MTT 법으로 세포의 생존도를 조사한 결과 10 μM의 농도에서는 세포의 생존에 대하여 영향을 주지 않음을 알 수 있었다(도 1).

NF-κB 활성화에 대한 분석은 본 발명자가 제작한 벡터(대한민국 특허출원,제2000-0070557호) 이용하여 상기 벡터로 형질감염된 세포 내에서 NF-κB가 활성화되면 알칼리 인산 분해효소의 활성이 증가한다는 것을 이용하여, 상기 효소의 활성을 측정하여 분석하는 것으로 NF-κB의 활성화를 증명하였다. 한편으로, 기존의 NF-κB 활성화를 증명하기 위한 방법으로 사용되어온 EMSA(Electrophoretic Mobility Shift Assay) 실험으로 초기 시간대에서의 NF-κB 활성화를 다시 한번 규명하였다. 구체적으로, 배양한 HaCaT 세포에 pNF-kB-SEAP-NPT 벡터를 형질감염 시킨 후, 형질감염된 세포에 플라티코딘 D 10 μM을 처리하여 NF-κB의 활성을 측정하였다. 이 실험에서 플라티코딘 D에 의하여 NF-κB가 활성화되면 동시에 SEAP(secretoty alkaline phosphatase)가 분비되고, 분비된 SEAP에 의해 형광기질로 첨가된 MUP(4-Methylumbelliferyl phosphate)가 분해되어, 이로부터 생성된 분해물의 형광을 측정하면 NF-kB의 활성화 정도를 정량적으로 측정할 수 있다.

도 2에 제시된 결과로부터, 세포독성이 없는 10 μM의 농도에서 플라티코딘 D 및 플라티코딘 D₃(PD 및 PD₃)는 아글리콘(AG) 또는 셀레브렉스(CBX)에 비하여 4배에서 10배 이상 NF-κB 활성이 높음을 알 수 있다. 또한 도 3에 나타난 결과로부터, 플라티코딘 D의 처리 시간에 의존적으로 NF-κB의 활성이 증가함을 알 수 있다. 이러한 상기 실험 결과는 세포독성이 나타나지 않는 농도에서 플라티코딘 D에 의해 NF-κB 복합체가 분리되어 핵 속으로 들어가는 비율이 증가함을 보여준다.

다른 한편으로, 플라티코딘의 NF-κB 활성화를 다시 한번 확인하기 위하여 실시한 EMSA 실험에서는 플라티코딘 D를 처리하여 NF-κB가 활성화되어 핵 안으로 들어간 후, 상기 핵으로부터 추출한 단백질과 NF-κB 결합 부위를 가지는 DNA를 반응시키면 핵추출 단백질의 NF-κB가 상기 DNA에 결합하여 전기영동시 DNA의 이동속도가 달라지게 된다는 것을 이용하여 실험을 수행하였다.

도 4의 A는 핵 추출물에서 NF-κB의 농도가 30분까지는 증가하다가 그 후에는 점차 감소하는 결과를 나타내는데, 이는 NF-κB 활성화 후 일정시간이 지나면 알려진 피드백기전에 의해서 점차적으로 세포질로 나오기 때문이라 추정할 수 있다. 반면에 세포질 내의 I-κB를 Western Blot으로 검출한 도 4의 B에서는 세포질 내에서 NF-κB와 결합하여 NF-κB의 활성을 억제하고있다고 알려진 I-κB가 플라티코딘 D 처리 후, 30분까지는 감소하다가 다시 증가하는 결과를 나타내고 있으며, 이 결과 역시 상기한 일정시간 후 피드백 기전에 의해서 다시 세포질내의 NF-κB가 증가하는 도 4의 A의 경향과 일치함을 알 수 있다. 이러한 결과로 본 발명자들은 플라티코딘 D의 처리에 의하여 I-κB가 분해되어 NF-κB와의 복합체에서 떨어져나가고, 이로 인해 NF-κB가 활성화되어 핵 속으로 이동하고 여러 가지 유전자의 발현을 조절하게됨을 알 수 있었다.

또한, 본 발명자들은 플라티코딘 D의 처리에 의한 세포의 죽음이 세포사멸임을 확인하기 위하여 세포사멸의 대표적인 형태적 특징인 DNA 절단(Fragmentation)과 TUNEL(terminal d-UTP nick-end labeling) 분석을 통한 유전자 단편의 생성을 확인하였다.

먼저, 배양한 HaCaT 세포에 플라티코딘 D를 처리한 후, 처리된 세포로부터 DNA를 추출하여 전기 영동한 결과, 10 μM에서 DNA가 분해되기 시작하여 30 μM부터 DNA 절단 현상이 두드러지게 나타났다(도 5의 A). 한편, 도 5의 B에 나타난 결과에서는 50 μM의 플라티코딘 D를 처리하였을 때 2시간째부터 DNA 절단이 시작되어 3시간째에 두드러지게 나타남을 볼 수 있다. 상기 실험에서 본 발명자들은 플라티코딘 D의 처리에 의한 세포의 죽음이 세포사멸의 전형적인 형태인 DNA 절단의 특징을 가짐을 확인하였다.

한편, 플라티코딘 D에 의한 세포의 죽음이 세포사멸임을 다시 한번 확인하기 위하여, 본 발명자들은 TUNEL 분석을 수행하였다. 구체적으로, 배양한 HaCaT 세포에 플라티코딘 D를 처리한 후, 세포 고정액으로 세포를 고정하고 투과 용액을 처리한 후에 이어서 TUNEL 반응액을 처리하고 각 조건의 세포를 유세포 분석기에 주입하여 분석하였다. 도 6에 제시된 결과에서, 플라티코딘 D의 농도가 높을수록 DNA 조각이 많이 배출되어 형광물질의 결합이 증가되었음을 볼 수 있다. 이 결과로 본 발명자들은 플라티코딘 D의 처리에 의하여 세포사멸이 유도됨을 다시 한번 확인하였다.

아울러, 본 발명자들은 플라티코딘 D의 처리에 의한 세포사멸에 대한 구체적인 작용기전을 규명하기 위하여, 플라티코딘 D를 처리한 세포에서 세포사멸과 관련된 단백질 즉, Fas, Fas 리간드, 프로카스파제-3, 프로카스파제-8, 카스파제-3, 카스파제-8을 Western blot으로 확인하였다. 또한 플라티코딘 D를 처리한 세포에서 세포사멸과 관련된 Fas와 Fas 리간드의 유전자가 발현됨을 역전사 중합효소연쇄반응을 통하여 확인하였다.

구체적으로, 배양한 HaCaT 세포에 플라티코딘 D 30 μM을 처리한 후, 처리한 세포를 용해시켜 단백질을 추출하여 Fas, Fas 리간드, 프로카스파제-3, 프로카스파제-8, 카스파제-3 또는 카스파제-8 항체를 이용하여 Western Blot을 수행하였다. 도 7에서 제시된 결과에서 보는 바와 같이, Fas와 Fas 리간드의 발현 수준은 시간이 경과함에 따라 증가하고, 카스파제-3와 카스파제-8의 비활성형인 프로카스파제-3와 프로카스파제-8은 별다른 변화가 없지만 활성형인 카스파제-3와 카스파제-8의 발현 수준은 시간이 경과함에 따라 확실하게 증가되는 것을 알 수 있다. 이러한 상기 실험결과는 이미 알려진 세포사멸의 경로 중 외인적 경로와 일치하는 것으로서 Fas와 FADD에 의한 조절에 의해서 카스파제-8을 활성화시키고 이어 카스파제-3를 활성화시켜 결국 세포사멸로 이어지는 외인적 경로를 거쳐 플라티코딘 D에의한 세포사멸이 일어난다는 것을 추정할 수 있다(도 11 참조).

한편, 플라티코딘 D의 처리에 의하여 Fas와 Fas 리간드의 유전자가 발현된다는 것을 mRNA 수준에서 증명하기 위하여 배양한 HaCaT 세포에 플라티코딘 D 30 μM을 처리한 후, 처리한 세포로부터 mRNA를 추출한 후 Fas와 Fas 리간드 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하여 역전사 중합효소연쇄반응을 실시하고 그 반응물을 전기영동 하였다. 도 8에 제시된 결과에서 보는 바와 같이, 플라티코딘 D를 처리한 후 시간이 경과함에 따라 Fas 및 Fas 리간드 유전자의 발현이 증가됨을 볼 수 있다.

상기 실험 결과들을 종합하여, 본 발명자들은 피부암세포에 플라티코딘 D를 처리하면 우선 NF-κB가 활성화되고, 이어 Fas와 카스파제-8, 카스파제-3의 활성화로 이어지는 외인적 경로를 통하여 세포사멸이 일어나 DNA 절단 및 단편화 등의 형태적 특징이 나타난다는 결론을 얻었다.

또한, 본 발명자들은 마우스에 유도된 피부암에 대하여 플라티코딘 D가 암세포의 성장을 억제하는 항암활성을 갖는지 확인하기 위하여 동물실험을 수행하였다. 구체적으로, 마우스의 등쪽을 제모하고, DMBA를 처리하여 피부암을 유발한 후, 일주일 간격으로 한 군에는 피부암을 유도하는 TPA만을 처리하고 다른 한 군에는 TPA와 플라티코딘 D를 두 번씩 처리하면서 마우스의 등에 발생한 유두종(papillomas) 수와 유두종을 가지는 마우스의 비율을 20주간 비교 관찰하였다. 실험 결과, TPA만 단독 처리한 경우에는 10주차에 약 70%, 20주차에는 100%의 마우스 가 유두종을 가지게 되는 반면, TPA와 플라티코딘 D를 함께 처리한 경우에는 10주차에 약 30%, 20주차에 약 60%의 마우스에서만 유두종이 관찰되었다(도 9의 A). 또한 마우스 개체 당 발생한 유두종의 수에 대한 실험결과에서도 TPA를 단독 처리한 군에 비하여 플라티코딘 D를 함께 처리한 군에서는 개체 당 유두종의 발생수가 약 50% 정도임을 확인하였다(도 9의 B). 상기 실험결과로부터 마우스에 유도된 피부암에 대하여 플라티코딘 D가 암세포의 성장을 억제하는 항암활성을 가진다는 것을 알 수 있으며 따라서 플라티코딘 D를 피부암에 대한 새로운 치료제의 개발에 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 도라지부터 플라티코딘 D를 추출/분리하여 제조하는 방법

도라지 뿌리 3 kg 를 50% 에탄올로 수욕 상에서 3시간 3회 추출하여 여과, 감압 농축하여 다시 에탄올로 냉침 8시간 실시하여 재 여과, 감압, 농축하여 200 mg의 분말을 얻었다. 분말을 다시 물에 용해시켜서 HP-20 겔 에 통과시켜 크로마토그라피를 실시하여 20% 메탄올로 세척하고 다음 100% 메탄올로 흘려서 얻은 분획을 감압, 농축하여 70 mg의 분말을 얻었다. 이 분말을 실리카겔 크로마토그라피를 실시하여 혼합용매 클로로포름:메탄올:물의 비율을 80:20:2에서 점차적으로 60:40:4까지 높여서 6개의 분획을 얻었다. 그중 플라티코딘 D를 많이 함유한 분획 5 와 플라티코딘 D₃를 많이 함유한 분획 6를 다시 각각 실리카겔 크로마토그라피를 이용하여 혼합용매인 클로로포름:메타놀:물(60:40:8)에 의한 전개조건으로 반복적인 크로마토그라피를 실시하여 순수한 화합물 플라티코딘 D와 플라티코딘 D₃를 얻었다. 정제한 화합물을 TLC 와 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 로 확인하였고 표준품과 비교하여 최종적으로 플라티코딘 D와 플라티코딘 D₃로 동정하였다.

<실시예 2> 세포독성을 일으키지 않는 플라티코딘 D의 농도 결정

플라티코딘 D의 NF-kB 활성을 확인하기 위한 다양한 실험을 수행하기 위하여 우선 피부암 세포주인 HaCaT 세포에서 세포사멸을 초래하지 않는 플라티코딘 D의 농도를 결정하였다.

HaCaT 세포를 96 웰 플레이트에 접종하였다. 구체적으로, HaCaT 세포는 6×10⁴개의 세포를 10 %의 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 100 unit/㎖의 페니실린(penicillin) 그리고 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신(streptomycin)을 포함하는 DMEM(dulbecco's modified eagle's medium) 배지(Gibco BRL, Grand Island, NY)에 부유시켜 96 웰 플레이트에 접종하여 95% 공기, 5% 이산화탄소 존재 하에서 37℃ 세포배양기를 사용하여 아포화(subfluence) 상태로 24시간 배양하였다. 세포의 수는 헤마토사이토미터(hematocytometer)로 계수하였으며, 살아있는 세포는 트리판 블루(trypan blue)로 염색하여 확인하였다.

상기 배양한 HaCaT 세포에서 세포에 독성을 일으키지 않는 플라티코딘 D의 농도를 결정하기 위하여, 우선 플라티코딘 D를 PBS(Phosphate-buffered saline)에 용해시킨 후, 각 well에 20 ㎕ 씩 가하여 시료의 최종 농도가 웰당 각각 10, 30, 50 μM이 되도록 처리하였다. 한 가지 농도 군에 대해서는 5 웰을 동일한 조건으로 사용하며, 나머지는 약물 대신 PBS(Phosphate-buffered saline)만을 20 ㎕ 첨가하였다. 각 농도의 플라티코딘 D의 처리에 대한 HaCaT 세포의 세포독성을 측정하기위하여 MTT 법을 사용하였다. HaCaT 세포와 약물이 접종된 plate를 이산화탄소 배양기에 배양 후, 시간 간격별로 세포로부터 DMEM 배지를 제거하고, 그 후 0.1mg의 MTT(Methylthiazoletetrazolium)를 모든 well에 가해주고 다시 배양기에서 4시간 더 배양하였다. 배양 종료 시 plate를 원심분리한 후 MTT 용액를 모두 제거하였다. 각 well에 DMSO(Dimethyl sulfoxide)를 200 ㎕ 씩 가한 후에 포르마잔(formazan) 결정이 녹을 때까지 약 10 분간 가볍게 진탕해 주고 바로 마이크로플레이트 리더로 540 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 이 흡광도는 MTT 가 세포에 의해 포르마잔(blue)으로 분해된 양을 나타내며 따라서 각 웰에 살아있는 세포(viable cells) 수와 비례한다. 실험 결과, 10 μM의 농도에서는 세포에 대하여 영향을 주지 않음을 알 수 있었다(도 1).

<실시예 3> 알칼리인산 분해효소 분해능 측정에 따른 NF-κB 활성화 확인

피부암 세포에서 플라티코딘 처리에 의한 NF-κB의 활성화를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 본 발명자들이 기출원한 대한민국 특허출원 제2000-0070557호에 기재된 대로 NF-κB에 분비성 알칼라인 인산화효소(secretory alkaline phosphatase, SEAP)를 발현하는 유전자와 네오마이신 인산화전이효소(neomycin phosphotransferase, NPT)를 융합시켜 제조한 발현벡터를 이용하여 세포기반의 분석시스템을 이용한 알칼리인산 분해효소 분해능 정도에 따라 NF-κB 발현을 정량적으로 측정하는 분석 시스템을 이용하였다.

구체적으로 3 x 10⁵ cells/ml 농도의 HaCaT 세포 2 ml을 DMEM 배지가 첨가된 6-웰 플레이트에 접종하여 밤새 배양한 후, 배양된 세포를 혈청이 제거된 DMEM 배지로 두 번 세척하고, 6 ㎍/100 ㎕의 pNF-κB-SEAP-NPT 발현벡터와 25 ㎍/100 ㎕의 리포펙타민(lipofectamine, Life Technologies)을 포함하는 복합체를 첨가한 후 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 상기 세포를 혈청이 첨가된 DMEM 배지에서 48시간 동안 배양한 후, 500 ㎍/㎖의 제네티신(Gibco BRL, Grand Island, NY)이 포함된 DMEM 배지에서 상기 벡터가 형질감염 된 세포를 선별하였다.

상기 기재된 방법에 따라, 형질감염 된 적정한 수의 세포(2X10⁵ cells/ml)를 12 웰 플레이트에서 제네티신이 포함된 배지를 이용하여 24시간 배양하고, D-PBS (Dulbecco-phosphate-buffered saline)로 2번 닦아준 후에 새로운 배지를 넣고 세포 독성이 없는 농도(10 μM)의 플라티코딘 D를 처리한 후 배양하였다. 이 때 바로 30 ㎕ 배지를 취하여 65℃에서 6분 끊여준 다음 냉동시키고, 이어서 10분, 30분, 60분 간격으로 30 ㎕ 배지를 취하여 동일하게 65℃에서 6분 끊여준 다음 냉동 시켰다. 모든 시료를 취한 후에 냉동시킨 배지를 실온에서 녹이고 96-well plate에 25 ㎕와, 1X SEAP(secretory alkaline phosphatase) 완충액를 25 ㎕를 넣고 진 탕시킨 후에 37 ℃에서 15분 방치 한 후, 2X SEAP를 100 ㎕ 씩 넣고 다시 진탕시켰다. 이 플레이트를 암실에 놓고, 10 mM MUP(4-Methylumbelliferyl phosphate)를 10 ㎕ 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 빛이 들어가지 않게 호일로 감싼 후에 37 ℃에 1시간 방치하였다. 이 실험에서 NF-κB의 활성화와 동시에 분비되는 SEAP에 의해 형광기질로 첨가된 MUP가 분해되고, 이로부터 생성된 분해물의 형광을 측정하여 NF-κB의 활성화를 정량적으로 검출하기 위하여 SEAP 형광검출키트(Great EscApe SEAP System Kit, Clontech Laboratories, Inc. Palo Alto, CA)를 사용하였다. 상기 SEAP/MUP 분해물로부터 나오는 형광은 360nm 파장에서 여기(excitation)하며, 449 nm에서 방출(emission)되므로, 이 플레이트를 형광분석계의 360 nm와 449 nm에서 상대형광치(Relative fluorescence unit)값을 측정하였다.

도면 2는 길경(도라지)으로부터 유래한 구조적으로 유사한 화합물인 플라티코딘 D, 플라티코딘 D₃, 당이 없는 아글리콘(aglycone, AG)인 올레아놀릭 산, 및 사이클로옥시게나제 2 저해제인 셀리브락스(celebrex, CBX)에 대해서 NF-κB 활성을 비교한 결과를 나타낸다. 그래프에서 보는 바와 같이, 세포독성이 없는 10 μM의 농도에서 플라티코딘 D 및 D₃(PD, PD₃)는 다른 화합물(AG, CBX)에 비하여 4배에서 10배 이상 높은 NF-κB 활성을 보임을 알 수 있었다. 또한 도면 4에 나타난 결과로부터 플라티코딘 D의 처리 시간이 경과되면서 NF-κB 활성이 증가함을 알 수 있었다. 이러한 실험 결과는 세포독성이 나타나지 않는 농도에서 플라티코딘 D에 의해 NF-κB 복합체가 분리되어 핵 속으로 들어가는 비율이 증가함을 보여준다.

<실시예 4> EMSA 실험을 통한 플라티코딘 D의 NF-κB 활성화 확인

실시예 3에서와 같이 플라티코딘 D 처리에 의한 NF-κB의 활성화를 다시 한번 확인하기 위하여, 기존에 널리 알려진 방법인 EMSA(Electrophoresis Mobility Shift Assay) 실험을 실시하였다. 구체적으로, 플라티코딘 D를 처리하여 NF-κB가 활성화되어 핵 안으로 들어간 후, 상기 핵으로부터 추출한 단백질과 γ-³²P 방사선 동위원소를 말단에 결합하고있는 NF-κB 올리고뉴클레오타이드를 반응시키면 핵추출 단백질의 NF-κB가 상기 NF-κB 올리고뉴클레오타이드에 결합하여 이를 전기영동하면, 젤의 어느 부분에서는 활성화된 NF-κB 결합부위에서 방사선을 띄게된다. 이 젤을 X-ray 필름에 노출하여 현상하면, 밴드의 선밀도의 변화를 통하여 NF-κB가 활성화되었음을 추정할 수 있다.

EMSA 실험 수행을 위한 플라티코딘 D 처리 세포주로부터의 핵단백질 추출법은 Andrew's method를 약간 변형하여 수행하였다. 구체적으로, HaCaT 세포를 적정의 세포수(3X10⁶ cells/ml)를 계산하여 T-75에 48 시간 배양하고, 시료 10 μM를 처리한 후, 원심 분리의 과정을 통해서 세포를 수득한 후에 융해 완충용액(10 mM Tris-Cl, pH 7.4, 3 mM CaCl₂, 2mM MgCl₂, 1% NP-40)을 가하여 융해시킨다. 다시 원심분리 한 후 PBS로 펠렛을 세척하고, 완충액 A(20 mM HEPES-KOH, pH 7.9, 1.5 mM MgCl₂, 10 ml KCl 0.5 mM DTT, 0.5 mM phenylmethylsulfonyl fluoride) 1 ml를 첨가해주고 다시 원심분리 한 후, 30~50 ㎕의 완충액 C(20 mM HEPES-KOH, pH 7.9, 25% glycerol, 420 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM EDTA, 0.5 mM DDT, 0.5 mM PMSF, protease inhibitors cocktails)를 펠렛에 첨가하여 주고 40분 동안 진탕하였다. 상기 추출한 핵단백질은 BSA(Bovine serum albumin)를 표준액으로 하여 단백질 정량용액을 이용해 Bradford법으로 측정하였으며 EMSA 실험을 수행할 때까지 -75℃에 보관하였다.

EMSA 실험에 사용할 올리고뉴클레오티드 프로브(oligonucleotide probe)는 T4 폴리뉴클레오티드 키나제(polynucleotide kinase)를 사용하여 5'-end-labeled with [γ-³²P]-ATP를 이중 가닥의 NF-κB consensus 올리고뉴클레오티드(AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C)와 반응시켜 제조하였다.

상기한 방법으로 추출한 10 ㎍의 핵단백질과 Poly(dI-dC) 1㎍ 및 5'-labeled (³²P) 올리고뉴클레오티드 프로브(15,000에서30,000 cpm) 2 ㎕를 포함하는 결합 완충액(100 mM Tris-Cl, pH 7.9, 250 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 5 mM EDTA, 0.5% NP-40, 2.5% BSA, 50% glycerol)을 실온에서 30분간 반응 시켰다. 이어서 상기 반응액을 6% native 젤에서 전기 영동한 후에, 젤을 말리고, x-ray 필름에 1시간 동안 노출시킨 후 현상하였다.

그 결과, 도 4의 A는 핵 추출물에서 NF-κB의 농도가 30분까지는 증가하다가 그 후에는 점차 감소하는 결과는 나타내는 데, 이는 NF-κB 활성화 후 일정 시간이 지나면 피드백 기전에 의해서 점차적으로 세포질로 나오기 때문이라 추정할 수 있 다. 반면에 세포질 내의 I-κB를 Western Blot으로 검출한 도 4의 B에서는 세포질 내에서 NF-κB와 결합하고 있다고 알려진 I-kB가 플라티코딘 D 처리 후 30분까지는 감소하다가 다시 증가하는 결과를 나타내고 있으며, 이 결과 역시 일정시간 후 피드백 기전에 의해 다시 세포질내의 NF-κB가 증가하는 경향과 일치함을 알 수 있다. 한편, 도 4의 C에서는 몰 비로 40배 이상의 5'-unlabeled 올리고뉴클레오티드 프로브(cold)와 변이가 일어난 5'-labeled 올리고뉴클레오티드(mut)를 위와 같은 방법으로 처리 후에 정상의 [γ-³²P] 5'-labeled 올리고뉴클레오티드를 반응시켰을 때, cold에서는 먼저 40배 이상의 방사선 동위원소가 없는 프로브에 먼저 결합을 하여 나중의 방사선동위원소가 있는 프로브가 있을 때에는 전혀 결합을 하지 못하므로 젤 상에서는 방사선을 띄지 않으므로 밴드가 나타나지 않지만, 전혀 결합을 할 수가 없는 mut에서는 나중의 방사선동위원소가 있는 프로브가 제공되므로써 밴드가 진하게 나옴을 확인하였다. 그러므로 EMSA 실험에서 나타난 밴드가 실제로 NF-κB 복합체임을 알 수 있다. 도 4의 D에서는 농도 의존적으로 플라티코딘 D의 농도가 증가하면서 I-κB가 감소됨을 보여준다. 이러한 결과로 플라티코딘 D의 처리에 의하여 I-κB가 분해되어 NF-κB와의 복합체에서 떨어져나가고, 이로 인해 NF-κB가 핵 속으로 이동할 수 있음을 알 수 있다.

<실시예 5> 플라티코딘 D 처리에 의한 DNA 절단(Fragmentation) 확인

플라티코딘 D 처리에 의한 세포의 죽음이 세포사멸(apoptosis)임을 확인하기 위하여 본 발명자들은 플라티코딘 D를 처리한 세포에서 세포사멸의 대표적인 형태적 특징중 하나인 DNA 절단을 확인하였다.

HaCaT 세포를 적정의 세포수(3X10⁶ cells/ml)를 계산하여 T-75 플레이트에 48시간 배양하고 MTT법으로 플라티코딘 D의 각 농도(0, 1, 10, 30, 50, 100, 200 μM)에 대한 세포 독성을 확인 후에, 다시 동일조건에서 시료를 처리한 후 배양하였다.

일정 시간이 지난 후에 원심분리 시켜 세포를 얻은 다음에 융해 완충용액을 넣고 37℃에서 3시간 배양하였다. 세포의 잔사(cell debris)를 제거하기 위해서 원심분리 하여 상등액만을 취한 후에 RNase와 Proteinase K를 처리하여 37℃에서 20 시간 방치하였다. 다시 원심분리 하여 상등액만을 취한 후에 phenol용액을 1:1로 섞어준 다음 진탕하였다. 진탕한 용액을 원심분리 하여 수용성층(위층)만을 취하고 이와 같은 과정을 반복 수행하고, 클로로포름을 첨가하여 진탕한 후, 다시 원심분리한 후 위층만을 취하였다. 이 얻은 용액에 2배 부피의 100% 에탄올과 0.1부피의 sodium acetate(pH 5.2)을 넣어주고 -75℃에서 1 시간 방치하였다. 다시 원심분리하여 pellet을 얻고 이 pellet을 70% 에탄올로 씻어 주고 초순수 물로 녹인 후 2% Agarose gel에서 전기영동하여 DNA 절단화를 관찰하였다.

상기 실험의 결과는 도 5의 A 및 도 5의 B에 나타내었다. 도 5의 A는 플라티코딘의 농도를 변화시키면서 3시간 동안 처리하였을 때 10 μM에서 DNA가 서서히 분해되고 있음을 보여주고 있으며, 30 μM부터 DNA가 단편화가 두드러지게 나타났 다. 도 5의 B의 경우, 50 μM의 농도로 처리하였을 때 2시간 이상부터 단편화 현상을 보여주면서 3시간째에 두드러졌다. 이러한 결과로 플라티코딘 D의 처리에 의한 세포의 죽음이 세포사멸(apoptosis)의 전형적인 형태를 나타냄을 알 수 있다.

<실시예 6> TUNEL 분석(Terminal dUTP Nick-end Labeling Assay)

실시예 5에서 확인한 바와 같이 플라티코딘 D의 처리에 의한 세포의 죽음이 세포사멸임을 다시 한번 확인하기 위하여, 본 발명자들은 TUNEL 분석(Terminal dUTP Nick-end Labeling)을 수행하였다. 구체적으로 TUNEL assay는 terminal dUTP nick-end labeling stained with the in situ cell death detection kit, TMR red(Roche, Germany)를 이용하였다. 배양한 HaCaT 세포에 우선 세포를 고정하기 위해서 고정(Fixation) 용액(4% 포름알데히드 용액)을 넣어주고 1 시간 실온에서 진탕시켜 주었다. 원심분리하여 세포를 모은 후에 PBS로 2번 세척한 후 투과(Permeabilisation) 용액(0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate)을 넣어주고 이것을 다시 PBS로 2번 세척한 후에 TUNEL 반응 혼합 용액 50 ㎕를 넣고 37℃에서 1 시간 배양하고 다시 PBS로 2번 세척한 후에 PBS로 500 ㎕ 부피를 맞추어 유세포 분석기에서 주입하여 각각 조건의 세포를 20,000개씩 계수하여 형광값을 분석하였다.

도 6에 제시된 결과로부터, 플라티코딘 D에 대한 농도 의존적으로 DNA 조각이 많이 배출되어 형광물질이 결합이 증가되었음을 볼 수 있다. 상기 결과는 DNA 절단 확인을 통한 실시예 5의 결과와 일치하며 이로부터 피부암 세포주 HaCaT 세포 에서 플라티코딘 D의 처리에 의하여 세포 사멸이 유도됨을 확인할 수 있다.

<실시예 7> 세포 사멸과 관련된 단백질의 발현 및 활성화 확인

플라티코딘 D를 처리한 세포에서 세포사멸과 관련된 단백질 즉, Fas, Fas 리간드, 카스파제-8, 또는 카스파제-3가 발현 또는 활성화됨을 확인하기 위하여 각각의 단백질에 대한 Western Blot 실험을 수행하였다.

구체적으로, 배양한 HaCaT 세포에 플라틴코딘 D 30 μM을 처리한 후, 원심분리로 수득한 세포에 용해 완충액을 처리하여 단백질을 추출하였다. 상기 추출된 세포융해 단백질의 양은 BSA를 표준액으로 하여 단백질 정량용액을 이용해 Bradford법으로 측정하였다. 10% SDS 폴리 아크릴아미드 젤의 각 웰에 각각 20 ㎍의 단백질을 loading한 후 전기영동을 실시하였다. 전기영동이 끝난 젤로부터 PVDF 멤브레인에 단백질을 blotting한 후에 TBST(Tris-buffered saline-Tween^TM 20)용액으로 세척하였다. blocking 용액(5% skim milk + 0.02% Tween^TM 20)으로 1 시간 동안 blocking시키고 TBST 용액으로 3회 세척하였다. 이어서 TBST 용액에 anti-caspase-3, caspase-8, Fas 및 Fas 리간드 항체를 각각 1:1000배 희석하여 20시간동안 4℃에서 반응 후 TBST 용액으로 3회 세척하였다. Hoseradish peroxidase 융합 항 토끼 IgG 항체를 1:10000배 희석하여 1시간동안 반응시킨 후 TBST용액으로 3회 세척하였다. 결과를 확인하기 위하여 ECL plus kit(Amersham phamacia, USA)를 이용해 발색시키고 x-ray 필름에 30 초 동안 노출시킨 후 현상하였다.

도 7에 제시된 결과에서 보는 바와 같이, Fas 와 Fas 리간드의 발현 수준은 시간이 경과함에 따라 증가하고, 카스파제-3와 카스파제-8의 비활성형인 프로카스파제-3와 프로카스파제-8은 감소함을 보이며, 활성형인 카스파제-3와 카스파제-8의 발현 수준은 시간이 경과함에 따라 확실하게 증가되는 것을 알 수 있다.

이러한 상기 실험 결과는 이미 알려진 세포사멸의 경로 중 외인적 경로와 일치하는 것으로서 Fas, FADD에 의한 조절에 의해서 카스파제-8을 활성화시키고 이어 카스파제-3를 활성화시켜 결국 세포사멸로 이어지는 외인적 경로를 거쳐 플라티코딘 D에 의한 세포사멸이 일어난다는 것을 추정할 수 있다. 또한 Fas 리간드는 NF-κB 활성화에 의해서 유도되는 것으로 알려졌다. 한편 내인적 세포사멸 경로에 관여되는 단백질과의 관계를 규명하기 위하여 내인적 경로에 관여한다고 알려진 Bcl-2, Bax 등의 단백질에 대한 영향도 Western Blot 실험을 통하여 수행하였지만 뚜렷한 연관성을 가진다는 증거는 발견하지 못했다.

<실시예 8> Fas and Fas 리간드 유전자의 발현 확인

본 발명자들은 플라티코딘 D가 Fas와 Fas 리간드 유전자의 발현을 유도한다는 것을 mRNA 수준에서 증명하기 위하여 플라티코딘 D를 처리한 세포를 이용하여 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR, Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction)을 수행하였다.

구체적으로, 배양한 HaCaT 세포에 플라틴코딘 D 30 μM을 처리한 후, Total RNA의 추출을 위하여 5×10⁶ 세포에 1 ml의 TRI REAGENT^TM(Sigma, USA)을 첨가하였다. 클로로포름 0.2 ml을 가하고 15초 동안 잘 혼합한 다음 얼음에 10분간 방치하였다. 12,000 ×g에서 15분 동안 원심분리하고 상층액을 분리하고 1/2 volume의 이소프로판올을 가한 후, 15분 동한 원심분리 한 후, 전체 RNA를 추출하였다. RNA 농도의 측정은 260/280 nm 흡광도로 측정하였다. 플라틴코딘 D를 처리한 HaCaT 세포로부터 total RNA를 분리하고, 분리한 RNA에 역전사효소를 이용하여 cDNA를 만든 후, 필요한 유전자 cDNA의 일부분을 증폭하기 위한 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응을 시행하여 cDNA의 일부를 대량으로 증폭하였다. 구체적으로, 전체 RNA 10 ㎍에 역전사 반응액(MgCl₂ 5 mM, 1×RNA PCR buffer, dNTP 1mM, RNase inhibitor 0.5 unit/㎕, oligo dT 0.125 μM, AMV RTase 0.5 unit/㎕)와 혼합하여 37℃에서 1 시간 반응시킨 후, cDNA를 합성하였다. 형성된 cDNA를 중합효소연쇄반응 자동화기계에서 주형(template)으로 cDNA 30 ㎕, Taq polymerase 0.5 unit, 2.5 mM dNTP 1 ul, 센스(sense) 프라이머 10 pmole 1 ㎕, 안티센스(antisense) 프라이머 10 pmole 1 ㎕, 10×buffer 5 ㎕ 및 탈이온수를 첨가하여 50 ㎕의 반응액을 제조하였다. 94℃에서 5분간 1회, 94℃에서 60초, 53℃에서 60초, 72℃에서 60초씩 20회 반응시키고, 72℃에서 10분간 1회 중합효소연쇄반응을 시행한 후 1% 아가로스 겔에서 전기영동하였다. 상기의 실험에서 사용한 프라이머를 하기의 표1에 기재하였다.

이름	염기서열	비고
β-actin sense	5'-AATCTGGCACCACACCTTCTACA-3'	서열번호 1
β-actin antisense	5'-CGACGTAGCACAGCTTCTCCTTA-3'	서열번호 2
FasL sense	5'-CAACTCAAGGTCCATGCCTC-3'	서열번호 3
FasL antisense	5'-AGATTCCTCAAAATTGACCAG-3'	서열번호 4
Fas sense	5'-GACAAAGCCCATTTTTCTTCC-3'	서열번호 5
Fas antisense	5'-ATTTATTGCCACTGTTTCAGG-3'	서열번호 6

도 8에 제시된 결과에서 보는 바와 같이 플라티코딘 D를 처리한 후 시간이 경과함에 따라 Fas 리간드 및 Fas 유전자의 발현이 증가됨을 볼 수 있다.

상기 실시예의 실험 결과들을 종합해 볼 때, 플라티코딘 D를 처리하면 우선 NF-κB가 활성화되며, 이어 Fas와 카스파제-8, 카스파제-3의 활성화로 이어지는 외인적 경로를 통하여 세포사멸이 일어나 DNA 절단, 단편화 등의 형태적 특징이 나타난다는 것을 알 수 있다.

<실시예 9> DMBA 및 TPA로 유도된 마우스 피부암에 대한 플라디코딘 D의 암세포 성장 억제 효과 확인

본 발명자들은 플라티코딘이 항암활성을 가져서 마우스 피부암세포의 성장을 억제한다는 것을 증명하기 위하여 DMBA(9,10-Dimethyl-1, 2-benzanthracene) 및 TPA(12-O-Tetradecanoyl phorbol 13-acetate)로 유도된 마우스 피부암에 대하여 플라티코딘 D(100 nmol)를 처리하여 피부암의 억제를 20주간 관찰하였다. 구체적으로, 마우스의 등쪽을 제모한 후 DMBA를 처리하여 피부암을 유발시켰다. 일주일 후에 프로모터로서 한 군은 TPA(1.7nmol)를 일주일에 두 번 처리하였으며, 또 다른 군은 TPA(1.7 nmol)와 플라티코딘 D(100 nmol)를 역시 일주일에 두 번씩 처리하여 20주간 반복 실험한 후, 마우스의 등쪽에 있는 유두종(papillomas) 수와 유두종을 가지는 마우스의 퍼센트를 계산하였다.

피부암 억제에 대한 결과를 도 9의 A와 B에 제시하였다. 도 9의 A는 유두종을 갖고 있는 마우스의 비율을 비교함으로써 플라티코딘 D의 피부종양의 억제율을 추적하였다. TPA만 단독 처리한 경우 10주에 약 70%, 20주에는 100%의 마우스가 유두종을 갖게되는 반면, TPA와 플라티코딘 D를 함께 처리한 경우에는 10 주에는 약 30%정도, 15주 이후 20주까지 약 60%의 마우스에서만 유두종이 관찰되었다. 도 9의 B에서는 마우스 개체 당 발생하는 유두종의 수를 비교 관찰하였다. 20주 차의 실험 결과를 비교해 볼 때, TPA와 플라티코딘 D를 함께 처리한 경우 TPA만을 처리한 경우와 비교할 때 유두종의 발생수가 약 50% 정도임을 확인하였다. 상기 실험결과로 볼 때 플라티코딘 D가 마우스에 유도된 피부암 세포의 성장을 억제하는 효과가 있음을 알 수 있다.

<실시예 10> 랫트에 대한 경구투여 급성 독성실험

본 발명은 플라티코딘 D의 급성 독성을 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 6주령의 특정병원부재(SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 플라티코딘 D를 0.5 % 메틸셀룰로오스 용액에 현탁하여 5 g/㎏/15 ㎖의 용량으로 단회 경구 투여하였다. 시험물질 투여후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중 변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적검사를 실시하였으며, 부 검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상 여부를 관찰하였다. 시험 결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성 변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과 화학식 1의 플라티코딘 D는 랫트에서 600 mg/㎏까지 독성 변화를 나타내지 않으며 경구 투여 최소 치사량 (LD₅₀)은 600 mg/㎏ 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

<제조예 1> 주사액제의 제조방법

유효성분 10 ㎎을 함유하는 주사액제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

플라티코딘 1 g, 염화나트륨 0.6 g 및 아스코르브산 0.1 g을 증류수에 용해시켜서 100 ㎖을 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.

상기 주사액제의 구성성분은 다음과 같다.

플라티코딘 ·················· ·1 g

염화나트륨···················0.6 g

아스코르브산··················0.1 g

증류수·····················정량

<제조예 2> 시럽제의 제조방법

본 발명의 플라티코딘을 유효성분 2% (중량/부피)로 함유하는 시럽은 다음과 같은 방법으로 제조된다.

플라티코딘, 사카린, 당을 온수 80 g에 용해시켰다. 이 용액을 냉각시킨 후, 여기에 글리세린, 사카린, 향미료, 에탄올, 소르브산 및 증류수로 이루어진 용액을 제조하여 혼합하였다. 이 혼합물에 물을 첨가하여 100 ㎖이 되게 하였다.

상기 시럽제의 구성성분은 다음과 같다.

플라티코딘 ···················· 2 g

사카린 ····· ·················0.8 g

당 ························ 25.4 g

글리세린······················ 8.0 g

향미료 ······················ 0.04 g

에탄올 ·······················4.0 g

소르브산 ······················0.4 g

증류수 ·······················정량

<제조예 3> 정제의 제조방법

유효성분 15 ㎎이 함유된 정제는 다음과 같은 방법으로 제조한다.

플라티코딘 250 g, 락토오스 175.9 g, 감자전분 180 g 및 콜로이드성 규산 32 g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10 % 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160 g, 활석 50 g 및 스테아린산 마그네슘 5 g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

상기 정제의 구성성분은 다음과 같다.

플라티코딘 ··················· 250 g

락토오스 ···················175.9 g

감자전분 ····················180 g

콜로이드성 규산 ················ 32 g

10% 젤라틴 용액

감자전분 ····················160 g

활석 ······················ 50 g

스테아르산 마그네슘 ··············· 5 g

상기에서 살펴본 바와 같이, 플라티코딘은 암 세포에 처리했을 때 NF-κB 활성화 및 이를 통한 세포 사멸(apoptosis)을 유발한다. 또한 마우스에서 암세포의 성장을 억제하는 효과를 가진다. 이러한 효과로 인해 본 발명의 플라티코딘은 암에 대한 새로운 치료제의 개발에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

<110> JOOSIN R&D Co., LTD. <120> Anti-cancer agent comprising platycodin as an effective ingredient <130> 3p-07-01 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin sense <400> 1 aatctggcac cacaccttct aca 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin antisense <400> 2 cgacgtagca cagcttctcc tta 23 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FasL sense <400> 3 caactcaagg tccatgcctc 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FasL antisense <400> 4 agattcctca aaattgacca g 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fas sense <400> 5 gacaaagccc atttttcttc c 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fas antisense <400> 6 atttattgcc actgtttcag g 21

Claims (4)

1. 화학식 1로 표시되는 플라티코딘 D 또는 화학식 2로 표시되는 플라티코딘 D₃를 유효성분으로 함유하는 항암제.

   <화학식 1>

   

   <화학식 2>

   
2. 삭제
3. 제 1항에 있어서, 암은 피부암, 위암, 폐암, 간암 및 유방암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항암제.
4. 제 3항에 있어서, 암은 피부암인 것을 특징으로 하는 항암제.

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