본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 베르게닌 (Bergenin)을 유효성분으로 포함하는 섬유아세포의 콜라겐 합성 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 베르게닌을 유효성분으로 포함하는 섬유아세포의 인테그린 β1의 발현 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명의 유효 성분으로 포함되는 베르게닌은 하기 화학식 1의 구조를 갖는 물질로, 분자량은 대략 328이다.
본 발명의 베르게닌은 암백채, 노루풀 또는 예덕나무 등의 자연원으로부터 분리할 수 있으며, 화학적으로 합성될 수 있다 (Lim et al.,J Ethnopharmacol. 70(1):69-72 2000 Apr).
한편, 본 발명에서 사용된 베르게닌를 분리하는 데 이용된 암백채 (Bergenia crassifolia)는 호이초과 (Saxifrigae)의 다년생 초본으로 높이가 20-30 ㎝이며, 잎이 크고 두껍다. 꽃 색상은 분홍색에서 흰색까지 있다. 주로 사천성, 운남성 및 티벳 등에서 서식하고 해발이 약 1590 m 지점의 돌 틈에서 성장한다. 암백채는 중국 소수 민족사이에서 민간 약초로 사용되며 주로 뿌리 및 줄기를 사용하고 있다. 맛은 달고 떫으며, 해열, 해독, 지혈, 기침 및 피토함 등에 효능이 있다.
본 발명의 베르게닌은 피부세포의 단백질 합성을 촉진하는 효과가 있으며, 특히, 콜라겐 합성 및 인테그린의 발현을 증진시키는 효과가 있다.
상기 피부세포는 피부에 존재하는 세포를 의미하며, 바람직하게는 섬유아세포이다. 상기 단백질은 피부세포의 구조 형성 및 기능에 필요한 단백질을 포함한다. 바람직하게는 콜라겐, 엘라스틴 및 인테그린이다.
본 발명의 조성물은 단백질 특히, 콜라겐 합성을 증진하거나 인테그린의 발현을 증진시킬 수 있는 유효량의 베르게닌을 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 베르게닌의 함량은 전체 조성물에 대하여 0.000001-15.0 중량%이다.
한편, 베르게닌의 수화물 및 베르게닌의 염으로 인테그린 발현 증진 및/또는 콜라겐 생합성 증진 활성을 나타내는 화합물은 본 발명의 범위에 포함된다는 것은 당업계의 기술수준을 고려하여 당업자에 명확하다.
또한, 상기 화학식 1의 베르게닌 화합물은 당업계에서 통상적으로 실시되는 치환기의 부가 또는 치환 반응을 하여 얻어지는 유도체 중 인테그린 생합성 증진 및/또는 콜라겐 생합성 증진을 나타내는 유도체도 본 발명의 범위에 포함된다는 것은 당업계의 기술수준을 고려하여 당업자에 명확하다.
본 발명은 또 다른 양태에 따르면 본 발명은 베르게닌을 유효성분으로 포함하는 피부 노화 방지를 목적으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 화장료 조성물은 상술한 베르게닌을 유효성분으로 포함하기 때문에, 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 중복된 내용은 그 기재를 생략한다.
본 발명의 화장료 조성물은 피부 노화 방지의 용도를 갖는다. 피부와 관련하여 언급되는 용어 "노화 방지"는 피부 노화 예방 및 치료를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖는다.
본 발명의 베르게닌을 포함하는 화장료 조성물은 진피의 매트릭스를 구성하는 단백질, 특히 콜라겐의 합성을 증진하고 진피의 매트릭스 및 세포간의 상호작용에 관여하는 인테그린의 발현을 증진함으로써, 주름 및 피부의 탄력을 개선하여 피부 노화를 방지한다. 따라서, 본 발명의 용도인 피부 노화 방지는 주름 개선 및 피부 탄력 개선 용도를 포함하는 것으로 해석된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 베르게닌의 함량은 전체 조성물에 대하여 0.000001-15.0 중량%이며, 바람직하게는 0.0001-10.0 중량%이며, 가장 바람직하게는 0.001-5.0 중량%이다. 상기 베르게닌의 함량이 0.000001 중량% 미만인 경 우에는 효과를 나타내는데 문제점이 있고, 15.0 중량%를 초과하는 경우에는 피부 자극 및 제품의 안정성에 문제점이 있다.
본 발명의 피부노화 방지 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸 글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
제조예 1:
베르게닌의 분리 및 확인
본 발명에 사용된 베르게닌은 다음과 같은 방법으로 분리 및 확인되었다.
암백채 200 g을 에틸 알코올 1.2 ℓ에 3 일간 침적시킨 후 여과하고 상기 여액을 감압건조하였다. 상기 농축물을 실리카 230-400메쉬가 충진된 컬럼관에 로드하고 전개용매로서 메틸렌클로라이드와 메탄올을 30:1에서 10:1 구배로 흘러주면서 20 ㎖씩을 분획하였다. 얇은막크로마트그래프로 정성분석하여 Rf=0.35-4.0까지의 분획을 농축하였으며, 검출기로는 UV 램프를 사용하였다. 기기분석기 (varian 300 M 1H NMR 및 LC-mass)을 이용하여 구조를 동정하여 베르게닌임을 확인하였다.
분리된 베르게닌의 물성은 다음과 같았다.
mp : 235℃
UV λmax : 220, 275 ㎚
실험예 1: 베르게닌의 단백질 합성 촉진 효과 실험
인체 정상 섬유아세포 (한국 세포주 은행)를 48-웰 마이크로 플레이트의 각 웰에 1 x 106 세포가 되도록 접종하고, DMEM 배지에서 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 그 다음, 배지를 제조예 1에서 얻은 베르게닌의 최종 농도가 각각 5, 10, 20, 50 및 100 ppm이 되도록 제조한 혈청이 없는 DMEM 배지 (실험군) 및 베르게닌이 포함되지 않은 혈청이 없는 DMEM 배지 (대조군)로 교체하고 24시간 동안 추가로 배양하였다. 배양 후, 각 웰의 상층액을 모아 단백질 분석 키트 (Protein assay kit, 바이오 래드사, 미합중국)를 이용하여 새로 합성된 단백질의 양을 측정하였다. 그 결과는 하기 표 1에 나타나 있다.
농도 (㎍/㎖) |
단백질 생성량 (㎍/㎖) |
0 |
61.7 |
5 |
94.2 |
10 |
95.3 |
20 |
90.2 |
50 |
108.3 |
100 |
109.2 |
표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 베르게닌을 첨가한 실험군에서 생성된 단백질의 양이 대조군에서 생성된 단백질의 양보다 월등히 많았다. 따라서, 본 발명의 베르게닌은 섬유아세포의 단백질 합성을 촉진함을 확인하였다.
실험예 2: 베르게닌의 진피층 콜라겐 합성 증진 효과
인체 정상 섬유아세포 (한국세포주 은행)를 48-웰 마이크로 플레이트의 각 웰에 1 x 106 세포가 되도록 접종하고, DMEM 배지에서 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이어, 배지를 베르게닌의 최종 농도가 각각 5, 10, 20, 50 및 100 ppm되도록 제조한 혈청이 없는 DMEM 배지 (실험군) 및 베르게닌이 포함되지 않은 혈청이 없는 DMEM 배지 (대조군)로 교체하고 24시간 동안 추가로 배양하였다. 배양 후, 각 웰의 상층액을 모아 키트 (PICP collagen assay kit, Takara, 일본국)를 이용하여 새로 합성된 프로콜라겐 타입 I의 C-펩타이드 (PICP) 양을 측정하였다. PICP 양은 ng/㎖으로 환산하였으며, 그 결과는 하기 표 2에 나타나 있다.
농도 (㎍/㎖) |
콜라겐 합성량 (ng/㎖) |
0 |
227.8 |
5 |
545.8 |
10 |
661.8 |
20 |
416.5 |
50 |
428.6 |
100 |
361.8 |
표 2에서 나타난 바와 같이 본 발명의 베르게닌을 첨가한 실험군에서 생성된 콜라겐의 양이 대조군에서 생성된 콜라겐의 양보다 월등히 많았으며, 따라서, 본 발명의 베르게닌은 섬유아세포의 콜라겐 합성을 촉진함을 확인하였다.
실험예 3: 인테그린 β1 발현 증진 효과
인체 정상 섬유아세포를 48-웰 마이크로 플레이트의 각 웰에 1 x 106 세포가 되도록 접종하고, DMEM 배지에서 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이어, 상기 베르게닌의 최종 농도가 각각 5, 10, 20, 50 및 100 ppm되도록 제조한 혈청이 없는 DMEM 배지 (실험군) 및 베르게닌이 포함되지 않은 혈청이 없는 DMEM 배지 (대조군)로 교체하고 24시간 동안 추가로 배양하였다. 배양 후, EIA (Enzyme immnoassay)법에 따라 인테그린 β1의 발현 정도를 측정하였다 (MK008 키트, Takara, 일본국). 상술하면, 원심분리로 세포를 회수하고 세포추출액을 제조한 후 항-인테그린 β1 항체가 코팅되어있는 웰에 상기 세포추출액을 처리하였다. 이차 항체 를 첨가하고 4℃에서 45분간 반응시킨 후 OPD (ο-Phenylenediamine-HCl)로 검출하였다. 염색되어있는 OPD를 OPD 용해액으로 용해한 후 530nm에서 엘라이자 리더로 흡광도를 측정하였다.
농도 (㎍/㎖) |
O.D.530
|
0 |
0.605 |
0.5 |
0.632 |
1 |
0.685 |
2 |
0.773 |
5 |
0.897 |
10 |
1.056 |
표 3에 나타난 바와 같이 본 발명의 베르게닌은 농도 의존적으로 세포의 접착에 중요한 작용을 수행하는 인테그린 β1의 합성을 촉진하는 것을 확인하였다.
실험예 4
본 발명의 베르게닌을 함유하는 크림 화장료 및 베르게닌을 함유하지 않은 크림 화장료를 사용하여 피부 주름 및 탄력 개선 효과에 대한 임상 시험을 실시하였다. 임상시험에 사용된 크림은 하기의 표 4와 같이하여 제조하였다.
성분 |
함량 (중량%) |
실시예 1 |
비교예 1 |
베르게닌 |
2.0 |
- |
글리세린 |
4.0 |
4.0 |
바셀린 |
3.5 |
3.5 |
트리에탄올아민 |
2.1 |
2.1 |
유동파라핀 |
5.3 |
5.3 |
스쿠알란 |
3.0 |
3.0 |
밀납 |
2.6 |
2.6 |
토코페릴 아세테이트 |
5.4 |
5.4 |
폴리솔베이트 60 |
3.2 |
3.2 |
카르복실비닐 폴리머 |
1.0 |
1.0 |
솔비탄세스퀴올레이트 |
3.1 |
3.1 |
향 |
미량 |
미량 |
방부제 |
미량 |
미량 |
정제수 |
잔량 |
잔량 |
계 |
100 |
100 |
실험예 4-1: 피부 주름 개선 효과 실험
30세 이상의 여성 30명 (평균 연령 33.7세)을 A 및 B 그룹으로 나누고, A 그룹에는 상기 실시예 1을 B 그룹에는 상기 비교예 1을 각각 주름이 있는 눈가를 중심으로 12주 동안 도포하고, 숙련자의 객관적 평가와 피검자의 주관적 평가를 수행하였다. 평가기준은 극히 심하게 악화된 것은 -3, 매우 개선된 것은 3으로 하고, 7등급 (-3, -2, -1, 0, 1, 2, 3)으로 하여 피부 주름의 개선정도를 측정하였다. 객관적 평가의 결과는 하기 표 5에 나타나 있고, 주관적 평가의 결과는 하기 표 6에 나타나있다.
피부주름 개선정도 (숙련자의 객관적 평가) |
실시예 1 |
비교예 1 |
2.67*
|
1.87*
|
*: 숙련자에 의해 평가된 각 피검자들의 개선정도를 평균한 값으로 각 피검자들의 점수차이 (12주-0주)의 값을 평균한 값.
두 그룹사이의 유의수준은 p<0.05이다.
피부주름 개선정도 (피검자의 주관적 평가) |
실시예 1 |
비교예 1 |
2.97*
|
1.36*
|
*:각 피검자에 의해 평가된 피검자들의 피부 주름 개선정도를 평균한 값으로 각 피검자들의 점수차이 (12주-0주)의 값을 평균한 값.
두 그룹사이의 유의수준은 p<0.05이다.
상기 표 5 및 6에서 알 수 있듯이 숙련자의 객관적 평가 및 피검자의 주관적 평가 모두에서 베르게닌 함유 크림의 주름 개선 효과가 베르게닌을 함유하지 않은 크림에 비해 월등함을 알 수 있었다.
실험예 4-2: 피부 탄력 개선 효과
22℃ 및 상대습도 45%의 항온 항습실에서 상기 실시예 1 및 비교예 1의 크림 화장료를 건강한 여성 30명 (평균 연령 33.7세)의 눈가에 일정량 (0.03 g/16 ㎠)을 12주 동안 도포 하였다. 그 후, 피부탄력측정기 (Cutometer SEM 575, C+K Electronic Co., 독일연방국)를 이용하여 각 군의 피부 탄력을 측정하였다. 그 결과는 하기 표 7에 나타나있다.
피부탄력 개선정도(%) |
실시예 1 |
비교예 1 |
32.6 |
12.8 |
상기 표 7의 결과에서 알 수 있듯이, 실시예 1의 본 발명의 베르게닌을 함유한 크림 화장료의 피부 탄력 개선도가 비교예 1보다 훨씬 증가하는 것을 확인할 수 있었다.