KR100481356B1

KR100481356B1 - 2'-ｏ-치환된 뉴클레오시드의 제조 방법

Info

Publication number: KR100481356B1
Application number: KR10-2002-0063485A
Authority: KR
Inventors: 박병욱; 장학순
Original assignee: 이수화학 주식회사
Priority date: 2002-10-17
Filing date: 2002-10-17
Publication date: 2005-04-07
Also published as: KR20040034852A

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1의 2'-O-치환된 뉴클레오시드의 제조 방법에 관한 것으로서, 상기 제조 방법은 하기 화학식 2의 화합물을 ROH(여기서 R은 각각 선택적으로 치환될 수 있는 C_1-4의 알킬, C_1-4의 알콕시알킬, C_2-4의 알케닐 또는 C_2-4의 알키닐임의 알콜 용매 중에서 하기 화학식 4와 반응시키는 공정을 포함한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 4]

Ti(OR')₄

(상기 식에서, X₁ 및 X₂는 각각 독립적으로 H 또는 보호기이고,

B는 염기이며,

R은 각각 선택적으로 치환될 수 있는 C_1-4의 알킬, C_1-4의 알콕시알킬, C_2-4의 알케닐 또는 C_2-4의 알키닐이고, ROH의 알콜 용매 R과 동일하고,

R1은 메틸 또는 H이고,

R'은 C1-4의 저급 알킬이다)

상기 제조 방법은 2'-O-치환된 뉴클레오시드를 간단하고 효과적으로 제조할 수 있다.

Description

2'-Ｏ-치환된 뉴클레오시드의 제조 방법{METHOD OF PREPARING 2'-O-SUBSTITUTED NUCLEOSIDE}

[산업상 이용 분야]

본 발명은 2'-O-치환된 뉴클레오시드의 제조 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 간단하고 효과적으로 제조할 수 있는 2'-O-치환된 뉴클레오시드의 제조 방법에 관한 것이다.

[종래 기술]

변형된 염기를 포함하는 새로운 뉴클레오시드 유사체들은 가치있는 안티센스 프로브임이 잘 알려져 있다. 올리고뉴클레오티드 내에 2'-O-알킬리보뉴클레오시드가 존재하게 되면 상보적인 표적 배열의 식별력을 유지 또는 증가시키는 반면, 올리고뉴클레오디드의 화학적 및 효소적 분해는 감소시킨다(Cummins et al., Nucleic Acids Research 23:2019, 1995; Lesnick et al., Biochemistry 32:7832, 1993; Kawai, et al., Biochemistry 31:1040, 1992). 2'-O-알킬리보뉴클레오시드의 이러한 특성에 따라 리보자임과 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제조하는데 매우 유용하다.

2'-O-메틸뉴클레오시드의 제조 방법으로는 디아조메탄으로 뉴클레오시드를 부분적으로 메틸화 하거나 또는 우리딘을 부분적으로 트리틸화한 후 메틸화하고 N-알킬화된 이성질체를 제거하는 방법(Haines, Tetrahedron 29:2807-2810, 1973), 또는 트리메틸술포늄하이드록시드와 트리메틸술포늄아이오다이드를 높은 온도 조건에서 반응시켜 2'-O-알킬뉴클레오시드를 제조하는 방법(Yamauchi, Perkin I , 2787-2792, 1980)이 알려져 있다. 그러나 이 방법은 목적 생성물인 2'-O-알킬뉴클레오시드 이외에 부생성물로 3'-O-알킬뉴클레오시드가 형성되므로 분리 정제 과정을 더욱 실시하여야하므로 공정이 복잡해지는 문제점이 있다.

2'-O-메틸리보뉴클레오사이드를 제조하는 다른 방법으로는 미국 특허 제 5,214,135 호(Suresh and Saroj)에 N-보호된 3',5'-비스실릴레이티드 뉴클레오시드와 메틸아이오다이드를 실버옥사이드의 존재 하에서 반응시키는 방법이 기술되어 있다. 이 방법은 메틸레이션 반응 단계에서는 수율이 우수하나, 추가적으로 여과, 증류, 세척, 건조 및 증류의 5단계의 공정을 더욱 실시하여야 함에 따라 결과적으로 수율이 감소되는 문제점이 있다.

또 다른 제조 방법으로는 주석 촉매 하에서 보호되지 않은 우리딘과 알킬할라이드를 반응시키거나(Wagner et al., J. Org. Chem. 39:24, 1974) 또는 주석 촉매 하에서 보호되지 않은 우리딘과 디아조메탄을 반응시키는 방법(Robbins et al., J. Org. Chem. 39:1891, 1974)은 2'-과 3'-O-알킬 뉴클레오시드를 직접 높은 수율로 제조할 수 있다. 그러나 이러한 방법들은 2'-O-알킬화에 선택적이지 못하기 때문에 원하는 2'-O-알킬뉴클레오시드를 얻기 위하여 크로마토그래피나 다른 분리방법이 요구된다. 따라서 시간과 비용이 많이 들고 효율성과 수율을 감소시킨다.

또한, Sproat와 Lamond는 Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach(F. Eckstein, Ed., Oxford University Press 1991)에서 3'과 5'위치를 차단하는 실릴기를 사용해서 2'-O-메틸리보뉴클레오시드의 다단계 합성에 관하여 보고하였는데, 이때 차단기로 사용하는 1,3-디클로로-1,1,3,3-테트라이소프로필디실록산은 가격이 매우 비싸기 때문에 공업적인 대량생산에는 유용하지 못하다.

최근에 McGee와 Zhai가 Nucleosides & Nucleotides(15:1797-1803, 1996)에 5'-O-디메톡시트리틸(DMT) 언하이드로 우리딘과 마그네슘 알콕사이드 혹은 칼슘 알콕사이드를 디메틸포름아마이드 중에서 반응시켜 선택적인 알킬화를 진행한 방법을 보고하였다. 그러나 보호되지 않은 우리딘을 동일 조건에서 마그네슘 메톡사이드와 반응시킬 경우에는 2'-O-메틸우리딘이 제조되지 않았다.

또한 1997년 Ribozyme pharmaceuticals Inc.에서 국제특허 WO 9726270에 출원한 내용에 따르면, 트리메틸보레이트를 루이스산으로 사용하고 약한 친핵성 시약을 반응시켜 간단하면서도 효율적인 방법으로 2'-O-메틸 뉴클레오시드를 제조하는 예도 있다.

그러나 안티센스 올리고뉴클레오티드에서 2'-O-치환된 뉴클레오시드의 사용에 대한 관심이 증가하기 때문에 2'-O-치환된 뉴클레오시드를 합성하기 위한 더 빠르고 효과적인 방법이 여전히 요구되고 있다.

본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명의 목적은 간단하고 효과적으로 2'-O-치환된 뉴클레오시드의 제조 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 2의 화합물을 ROH(여기서 R은 각각 선택적으로 치환될 수 있는 C_1-4의 알킬, C_1-4의 알콕시알킬, C _2-4의 알케닐 또는 C_2-4의 알키닐임의 알콜 용매 중에서 하기 화학식 4와 반응시키는 공정을 포함하는 하기 화학식 1의 2'-O-치환된 뉴클레오시드 화합물의 제조 방법을 제공한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 4]

Ti(OR')₄

B는 염기이며,

R1은 H 또는 에틸이고,

R'은 C_1-4의 저급 알킬이다).

이하 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 하기 화학식 1의 화합물을 제조하는 방법을 제공한다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서, X₁ 및 X₂는 각각 독립적으로 H 또는 보호기로서, 산 불안정성 보호기 특히 디메톡시트리틸 및 9-페닐잔텐-9-일기와 같은 트리틸 및 치환된 트리틸기; 산-불안정성 아세탈 보호기, 바람직하게는 1-(2-플로로페닐)-4-메톡시피페리딘-4-일; 및 라우로일기와 같은 특정 선형 또는 분지된 C_3-16알카노일기를 포함하는 에타노일기 또는 지방산 알카노일기 같은 일반적으로 16개까지의 탄소 원자를 포함하는 산 불안정성 보호기; 벤조일 및 알킬, 바람직하게는 C_1-4알킬 및 할로겐, 특히 클로로 또는 플로로로 치환된 벤조일기이고,

B는 염기를 나타내며, 뉴클레오 염기, 특히 피리미딘, 특히 우라실(U) 또는 티민(T) 및 치환된 우라실 유도체를 나타내고,

R은 각각 선택적으로 치환될 수 있는 알킬, 알콕시알킬, 알케닐 또는 알키닐로서, 바람직하게는 C_1-4알킬기, 보다 바람직하게는 메틸 또는 에틸기의 알킬; 바람직하게는 C_1-4알콕시 C_1-4알킬기, 보다 바람직하게는 메톡시 에틸기의 알콕시알킬; 바람직하게는 C_2-4의 알케닐기, 보다 바람직하게는 알릴 또는 크로틸기의 알케닐기; 바람직하게는 C_2-4알키닐기, 보다 바람직하게는 프로파길기이고, 또한, 알킬, 알케닐, 알키닐 및 알콕시알킬기는 하나 또는 그이상의 치환기, 특히 할로겐, 특히 F, Cl 또는 Br 및 아미노 치환기로 치환될 수 있다.

본 발명의 제조 방법은 하기 화학식 2의 화합물을 화학식 4의 화합물과 반응시키는 공정을 포함한다.

[화학식 2]

(상기 화학식 2에서 R1는 H 또는 메틸이며, X₁, X₂ 은 상기에서 정의된 것과 같다.)

[화학식 4]

Ti(OR')₄

(상기 화학식 4에서, R'은 C_1-4알킬이며, 바람직하게는 메틸, 에틸 또는 이소프로필이다.)

상기 반응 공정에서 사용되는 용매는 R에 상응하는 알콜로서, 약한 친핵성 시약이다. 즉, 상기 화학식 1에서, R이 메틸이면 용매는 메탄올이고, 에틸이면 에탄올이고, 프로필이면 프로판올, 이소프로필이면 이소프로판올, 부틸이면 부탄올, 메톡시에틸이면 메톡시에탄올이다.

상기 반응을 하기 반응식 1을 참조하여 보다 상세하게 설명한다.

[반응식 1]

상기 반응식 1에서 X₁, X₂, R 및 R'은 상기에서 정의된 것과 같다.

상기 화학식 2의 화합물을 R에 상응하는 무수 알콜에 첨가하여 용해하고, 이 용액에 탄산수소나트륨, 탄산수소칼슘, 탄산칼륨 등의 촉매를 촉매량 첨가한다. 이어서, 상기 혼합물에 상기 화학식 4의 화합물을 첨가한다. 이 혼합물을 교반하여 상기 화학식 2의 화합물과 상기 화학식 4의 화합물을 반응시킨다.

상기 반응 온도는 50 내지 150℃가 바람직하며, 보다 바람직하게는 120 내지 140℃이다. 반응 시간은 12시간 내지 48시간, 바람직하게는 24 내지 36 시간이나, 온도에 따라 조절할 수 있으므로 수일이 걸릴 수도 있다.

상기 반응은 밀폐된 환경에서 실시하는 것이 바람직하며, 온도 상승에 따른 압력은 사용하는 용매에 의존하며, 수 기압 내지 수십 기압에 이를 수 있다. 즉, 반응 온도에 따라 압력이 조절되며, 예를 들어 반응을 130℃에서 실시하면 압력이 4기압 정도가 된다.

이어서, 상기 생성물을 냉각하고, 냉각 생성물에 물을 첨가하고 교반하여 생성된 침전물인 티타늄 옥사이드를 여과하여 제거한다. 여액을 감암 농축 한 다음결정화 용매 하에서 결정화하고 여과하여 화학식 1의 화합물을 제조한다. 이 결정화 용매로는 메탄올, 에탄올 또는 이소프로판올을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 메탄올을 사용할 수 있다.

본 발명에서 출발 물질로 사용된 상기 화학식 2의 화합물은 미국 특허 제 3,856,777 호에 기재된 것과 같이 공지된 방법으로 제조할 수 있다. 이 제조 방법을 하기 반응식 2를 참조하여 설명한다.

[반응식 2]

상기 반응식 2에서 R1는 H 또는 메틸이고, X₁는 상기에서 정의된 것과 같다.

제 1 유기 용매에 상기 화학식 3의 화합물과 카보네이트 화합물, 탄산수소나트륨을 넣고 90 내지 110℃로 승온한 다음 7시간동안 교반하고 서서히 냉각한다. 얻어진 생성물에 제 2 유기 용매를 넣고 30분간 교반한 다음 초산을 소량 첨가 후 60℃에서 1시간동안 환류 교반한다. 0 내지 5℃로 냉각 후 2시간동안 교반한 다음 진공 여과하여 화학식 2의 화합물을 얻을 수 있다.

상기 제 1 유기 용매로는 디메틸포름아미드, C_2-5 니트릴, 디메틸술폭시드, 디메톡시에탄 등을 사용할 수 있다. 상기 제 2 유기 용매로는 디클로로메탄, 클로로포름, 디클로로에탄 등을 사용할 수 있다. 상기 카보네이트 화합물로는 디페닐카보네이트, 에틸렌카보네이트, 디에틸카보네이트 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 제조 방법으로 제조된 상기 화학식 1의 화합물은 다른 뉴클레오시드 또는 올리고뉴클레오티드(본 발명을 이용하여 제조된 것일 수 있는)와 당업계에 공지된 방법을 통하여 커플링하여 원하는 올리고뉴클레오티드의 조립에 삽입될 수 있고, 상기 화학식 1의 화합물을 이용하여 2'-O-메틸시티딘을 합성하는데 이용할 수도 있다.

본 발명은 다음의 실시예로 추가로 설명되며, 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

(실시예 1)

2'-O-메틸우리딘의 제조

스테인레스 스틸 반응기에 안하이드로우리딘 5g과 탄산수소나트륨 0.02g을 넣고 메탄올 30ml를 넣었다. 이 혼합물에 티타늄 이소프로폭사이드 20ml를 넣은 다음 상기 반응기의 마개를 닫아 완전히 밀폐하고 130℃에서 30시간동안 교반하였다. 교반된 생성물을 냉각하여, 반응이 완결됨을 확인하고 냉각 생성물에 물 30ml를 천천히 넣어준 후 1시간동안 교반하였다. 얻어진 생성물을 여과하여 고체를 제거하고 여액을 감압 농축하였다. 감압 농축물에 메탄올 7ml를 넣고 다시 감압 농축하고, 여기에 다시 메탄올 7ml를 넣고 5℃에서 2시간동안 교반하고 여과하여 2'-O-메틸우리딘 4.6g(수율 80%)을 얻었다.

¹H-NMR(DMSO-d6) δ(ppm) : 11.33(br, 1H), 7.93(d, 1H, J=8.06Hz), 5.85(d, 1H, J=5.13Hz), 5.65(d, 1H, J=8.06Hz). 5.18(2s, 2H, OH), 4.11(ddd, 1H, J=4.76, 5.13Hz), 3.85(ddd, 1H, J=2.93, 6.96Hz), 3.78(ddd, 1H, J=4.76, 5.12Hz) 3.52-3.67(m, 2H) 3.35(s, 3H)

(실시예 2)

2'-O-메틸-5-메틸우리딘의 제조

스테인레스 스틸 반응기에 안하이드로-5-메틸 우리딘 20g을 넣고 탄산수소나트륨 0.07g과 메탄올 56ml를 넣었다. 이 혼합물에 티타늄 이소프로폭사이드 71g을 넣고 반응기를 완전히 밀폐시킨 후, 130℃에서 36시간동안 교반하였다. 반응 완결 후 상기 교반 생성물에 물을 100ml를 넣고 30분간 교반한 다음 여과하여 고체를 제거하였다. 여액을 감압 농축한 후 이소프로필알콜 20ml를 넣고 추가 농축하였다. 감압 농축 생성물에 메탄올 45ml를 넣고 1시간동안 환류 교반하였다. 교반 생성물을 5℃로 냉각한 다음 3시간 동안 교반하였다. 얻어진 생성물을 여과한 후 5℃ 이소프로판올 30ml로 세척한 후, 건조하여 2'-O-메틸-5-메틸우리딘 19.0g(수율 84%)을 얻었다.

¹H-NMR(DMSO-d6) δ(ppm) : 11.34(s, 1H, NH), 7.79(d, 1H, J=1.1Hz), 5.86(d, 1H, 5.50Hz), 5.16(2s, 2H, OH), 4.14(ddd, 1H, J=5.13Hz), 3.77-3.85(ddd and ddd , 2H, J=4.4Hz 5.13Hz), 3.50-3.65(m, 2H), 3.35(s, 3H), 1.77(d, 3H, J=1.1Hz)

(실시예 3)

2'-O-메틸우리딘의 제조

스테인레스스틸 반응기에 안하이드로우리딘 5g과 탄산수소나트륨 0.02g을 넣고 메탄올 30ml를 채웠다. 이 혼합물에 티타늄메톡사이드 11.4g을 넣은 다음 마개를 닫고 완전히 밀폐한 다음 130℃에서 30시간 내지 40시간 동안 교반하였다. 냉각 후 반응이 완결됨을 확인하고 물 30ml를 천천히 넣어준 다음 1시간동안 교반하였다. 교반 생성물을 여과하여 고체를 제거하고 여액을 감압 농축하였다. 감압 농축 생성물에 메탄올 7ml를 넣고 다시 감압 농축하였다. 얻어진 생성물에 메탄올 7ml를 넣고 5℃에서 2시간동안 교반한 다음 여과하여 2'-O-메틸우리딘 3.5g(수율61%)을 얻었다.

(비교예 1)

우리딘 0.73g(3.0mmol)과 틴클로라이드디하이드레이트(SnCl₂·2H₂O) 0.068g(0.3mmol)을 메탄올 300ml에 녹이고, 디아조메탄 제조액 110ml를 2시간 동안 상온에서 적가하였다. 반응 완결 후 용매를 감압 농축 후 잔류물을 메탄올에 녹이고 6개의 알루미나 TLC판(20 × 40 cm)에 점적하였다. 각각의 TLC 판을 클로로포름-메탄올-아세톤-물(120:60:23:14) 용매에서 8시간 동안 전재하였다. 15분간 건조하고 다시 동일한 용매에서 2시간 동안 전개하였다. 빠르게 이동하는 주 띠의 표면을 긁어 모은 다음 고체 추출 기구를 이용하여 200ml의 메틸아세테이트-메탄올(4:1) 용매로 24시간 동안 3회 추출하였다. 추출액을 모아 감압농축하여 0.45g(58%)의 2'-O-메틸우리딘을 얻었다. 느리게 이동하는 주 띠를 위와 같은 방법으로 처리하여 0.22g(28%)의 3'-O-메틸우리딘을 얻었다.

상기 실시예 1 및 비교예 1의 방법의 수율 및 특성을 하기 표 1에 나타내었다. 또한, 참조로 종래 기술인 미국 특허 제 5,214,135 호의 방법과 테트라헤드론 방법(Haines, Tetrahedron 29: 2807-2810, 1973)의 수율 및 특성도 비교예 2 내지 3으로 하기 표 1에 함께 나타내었다.

	수율	3'-O-메틸뉴클레오시드	공정수	기타
실시예 1	80%	생성안됨	2단계	정제과정 필요없음
비교예 1	58%	28% 생성	1단계	컬럼 분리
비교예 2(미국 특허 제5,214,135호)	< 80%	생성안됨	6단계	공정이 길다
비교예 3(테트라헤드론 방법)	24%	생성안됨	7단계	공정이 길다

상기 표 1에 나타난 것과 같이, 실시예 1의 방법이 부생성물인 3'-O-메틸뉴클레오시드를 생성시키지 않으면서, 비교예 1 내지 3의 방법에 비해 간단한 공정을 이용하여 고수율로 목적 생성물을 제조할 수 있음을 알 수 있다.

본 발명의 제조 방법은 2'-O-치환된 뉴클레오시드를 간단하면서도 효과적으로 제조할 수 있다.

Claims

하기 화학식 2의 화합물을 ROH(여기서 R은 각각 선택적으로 치환될 수 있는 C_1-4 알킬, C_1-4 알콕시알킬, C_2-4 알케닐 또는 C_2-4 알키닐임)의 알콜 용매 중에서 하기 화학식 4와 반응시키는 공정

을 포함하는 하기 화학식 1의 2'-O-치환된 뉴클레오시드 화합물의 제조 방법.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 4]

Ti(OR')₄

(상기 식에서, X₁ 및 X₂는 각각 독립적으로 H 또는 보호기이고,

B는 염기이며,

R은 각각 선택적으로 치환될 수 있는 C_1-4의 알킬, C_1-4의 알콕시알킬, C_2-4의 알케닐 또는 C_2-4의 알키닐이고, ROH의 알콜 용매 R과 동일하고,

R1은 메틸 또는 H이고,

R'은 C_1-4의 저급 알킬이다)
제 1 항에 있어서, 상기 R'은 메틸, 에틸 또는 이소프로필인 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 R은 메틸인 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 반응은 50 내지 150℃의 온도에서 실시하는 것인 제조 방법.
제 4 항에 있어서, 상기 반응은 120 내지 150℃의 온도에서 실시하는 것인 제조 방법.