KR100474228B1 - 파크리탁셀의분리방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 파크리탁셀과 세팔로만닌의 혼합물에서 파크리탁셀을 효율적으로 분리하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 파크리탁셀과 세팔로만닌의 혼합물을 N-할로숙신이미드 존재하에서 지방족알콜 또는 아민과 반응시켜 얻은 혼합물로부터 파크리탁셀을 분리하는 것을 특징으로 하는 파크리탁셀의 분리방법에 관한 것이다.

Description

파크리탁셀의 분리방법
본 발명은 하기 화학식1로 표시되는 파크리탁셀(Paclitaxel)의 분리방법에 관한 것이다.
파크리탁셀은 와니(Wani,M.C. et al., JACS, 93, 2325, 1971) 등에 의해 주목으로부터 분리되어, 임상학적 실험에 의해 미국 FDA가 1992년과 1994년에 자궁암과 유방암에 대한 치료제로 사용을 승인한 바 있는 항암제이다.
그러나 주목으로부터 파크리탁셀을 분리, 정제하는 과정은 주목에 함유되어 있는 파크리탁셀의 양이 매우 소량이며, 파크리탁셀과 유사한 구조를 가진 하기 화학식 2의 세팔로만닌(Cephalomannine)과의 분리가 어렵기 때문에 매우 고가인 것이 문제점으로 지적되고 있다.
특히 파크리탁셀과 세팔로만닌의 분리는, 정제과정 중 가장 어려운 문제로 이 두 물질의 손쉬운 분리 방법이 절실히 요구되고 있다.
파크리탁셀과 세팔로만닌은 곁사슬에서의 구조가 서로 다르다는 구조적 차이를 가지고 있다. 즉, 파크리탁셀은 벤조일기를 가진 반면, 세팔로만닌은 티그로일기를 가지고 있다. 따라서 이들의 극성 차이는 미미하여, 일반적인 크로마토그래피 방법으로는 분리가 어려우며, 결국 고가 장비인 HPLC에 의한 분리가 필요하게 되어, 파크리탁셀의 생산시 고비용을 초래한다는 문제점이 있다.
본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 많은 연구를 수행해 온 결과, 파크리탁셀의 구조를 변화시키지 않고 세팔로만닌만 선택적으로 반응을 일으켜 새로운 세팔로만닌 유도체를 합성함과 동시에 파크리탁셀을 효율적으로 분리할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 파크리탁셀과 세팔로만닌의 혼합물로부터 파크리탁셀을 효율적으로 분리하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 파크리탁셀(Paclitaxel)과 세팔로만닌(Cephalomannine)의 혼합물을 N-할로숙신이미드 존재하에서 지방족알콜 또는 아민과 반응시켜 얻은 혼합물로부터 파크리탁셀을 분리하는 것에 관한 것이다.
본 발명의 파크리탁셀의 분리방법을 반응식으로 나타내면 하기 반응식 1 및 하기 반응식 2와 같다.
(식중, R1은 또는 이며, R2는 1차, 2차 또는 3차 지방족 알킬기이고, X는 할로겐원소를 나타낸다.)
상기 반응식 1 및 반응식 2중 화학식 3 및 화학식 4의 화합물은 신규화합물로서 잠재적인 항암제로서 사용할 수 있으며, 특히 화학식 3의 화합물은 2"-알콕시-3"-할로세팔로만닌과 3"-알콕시-2"-할로세팔로만닌의 이성체 혼합물로 얻어지며, 화학식 4의 화합물은 2",3"-디할로세팔로만닌 형태로 얻어진다.
(식중, R1, R2 및 X는 상기 정의한 바와 같다.)
상기 반응(반응식 1 및 2)은 디클로로메탄 등의 유기용매 존재하에서 수행되는 것이 바람직하며, N-할로숙신이미드로는 N-브로모숙신이미드 또는 N-요오도숙신이미드가 바람직하다. 또한 상기 반응(반응식 1 및 2)의 반응온도는 -20~40℃가 바람직하다.
상기 반응식 1에서 지방족 알콜로는 1차, 2차 또는 3차 지방족 알콜이 바람직하며, 그 예를 들면 메탄올, 에탄올, t-부탄올, n-부탄올, n-프로판올, 또는 2-메틸-1-프로판올 등을 사용할 수 있다. 또한 지방족 알콜을 반응시키는 단계는 황산 등의 산을 가하여 산성조건하에서 수행되는 것이 바람직하다.
상기 반응식 2에서 아민으로서는 1차, 2차 또는 3차 지방족 또는 방향족 아민이 바람직하며, 그 예를 들면 에탄올아민 또는 디메틸아민 등을 사용할 수 있다.
상기 반응(반응식 1 및 2)로부터 얻어진 세팔로만닌 유도체와 파크리탁셀의 혼합물은 TLC의 Rf와 HPLC의 유지시간으로 쉽게 확인할 수 있어, 후레쉬(Flash) 크로마토그래피를 사용하여 헥산과 에틸아세테이트 혼합액을 용출시켜 효과적으로 파크리탁셀을 분리할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 들어 상세히 설명하나, 본 발명이 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
하기 실시예의 반응은 표준물질을 사용하여 TLC와 HPLC로 관찰하였다. TLC에서의 전개 용매는 헥산/에칠아세테이트(v/v=2/3), 발색제로는 p-아니스알데히드와 UV 램프를 사용하였으며, HPLC는 히타치 L-7100 펌프와 L-7400 UV검출기가 부착된 히타치 7000 모델을 사용하였다. HPLC 컬럼은 Capcell-pak C18 (4.6×250), 용매는 50% 아세토니트릴을 사용하여 분석하였다. 후레쉬 크로마토그래피에 사용한 실리카겔은 230-400메쉬를 사용, 분리하였다.
실시예 1
100mg의 세팔로만닌, 50mg의 N-브로모숙신이미드를 5㎖의 디클로로메탄에 녹여 -10℃로 유지시킨후, 여기에 1㎖의 메탄올과 황산 한방울을 넣고 4시간동안 반응시켰다.
반응중에 TLC상에서 새로운 스팟(Rf 0.41)이 관찰 되었다(세팔로만닌 Rf 0.32). 세팔로만닌이 완전히 소모된 것을 확인하고 반응물에 물을 첨가하고, 분리한 유기층을 농축하여 2"-메톡시-3"-브로모세팔로만닌 과 2"-브로모-3"-메톡시세팔로만닌 혼합물 91.3mg을 얻었다. 이 생성물의 HPLC 유지시간은 18.68, 19.59, 20.51 그리고 21.05였다(세팔로만닌 RT 11.06).
NMR(CDCl3) δ3.43(s,3H,-OCH3),δ3.45(s,3H,-OCH3 곁사슬 프로톤 )
Mass (FAB) [M+H+]=943
실시예 2
100mg의 파크리탁셀과 세팔로만닌이 함유된 주목추출물 (HPLC 정량 : 파크리탁셀 44.5%, 세팔로만닌 31.5%), 50mg의 N-브로모숙신이미드를 5ml의 디클로로메탄에 녹이고, 이 용액을 0℃에 유지시켰다. 1ml의 무수 에탄올과 황산 1방울을 반응용액에 넣어 주고, 1시간동안 저어주며 반응시켰다. TLC로 세팔로만닌이 완전히 소비된 것을 확인한 후, 반응용액에 물을 넣고 유기층을 분리, 감압하에서 농축하여 얻은 생성물을 HPLC로 정량하였다. HPLC 분석에서 42.5mg의 파크리탁셀이 회수되었다(95.5%). 세팔로만닌으로부터 얻어진 생성물들은 HPLC의 유지시간이 31.55, 33.49와 37.03에서 나타났고, TLC의 Rf는 0.52 였다.
파크리탁셀 TLC Rf 0.35, HPLC RT 12.60
세팔로만닌 TLC Rf 0.32, HPLC RT 11.06
실시예 3
150mg 세팔로만닌(순도 약90%), 200mg의 N-브로모숙신이미드와 0.05ml의 에탄올아민을 5ml의 디클로로메탄에 넣고, 실온에서 2일간 저어주며 반응시켰다. 반응이 완결된 후 반응용액에 물을 넣고 분리된 유기층을 농축하여 181mg의 2",3"-디브로모세팔로만닌을 얻었다.
HPLC RT= 25.43, 26.57, TLC Rf 0.43
NMR(CDCl3) δ 1.96(d, 3H, CBrH-CH 3 - 곁사슬 프로톤)
NMR(CDCl3) δ 1.97(d, 3H, CBrH-, CH 3 - 곁사슬 프로톤)
NMR(CDCl3) δ 4.60(q, 1H, CBrH 곁사슬 프로톤)
Mass (FAB) [NH4 +] = 1007
[Na+] = 1012
[K+] = 1028
[M+H+]= 990:992:994=1:2:1
실시예 4
100mg의 파크리탁셀과 세팔로만닌의 혼합물(파크리탁셀 44.5%, 세팔로만닌 31.0%), 100mg의 세팔로만닌, 0.05ml의 디메틸아민을 5ml의 디클로로메탄에 넣고, 실온에서 3일간 반응시켰다. 반응물에 물을 넣고 분리된 유기층을 농축하여 38.5mg의 파크리탁셀(수율 86.7%)이 회수되었고, 2", 3"-디브로모세팔로만닌이 생성물로 얻어졌다.
실시예 5
100mg의 파크리탁셀과 세팔로만닌의 혼합물(파크리탁셀 44.5%, 세팔로만닌 31.0%), 50mg의 N-브로모숙신이미드와 1ml의 t-부탄올을 사용하여 -10℃에서 4시간 반응시켰다. 반응물을 실시예 1과 동일한 방법으로 처리하여 세팔로만닌으로부터 얻어진 생성물은 TLC Rf가 0.65, HPLC 유지시간은 52.52, 55.79 와 62.16에서 관찰되었으며 42.3mg의 파크리탁셀이 회수되었다(수율 95%).
실시예 6
100mg의 파크리탁셀과 세팔로만닌의 혼합물(파크리탁셀 44.5%, 세팔로만닌 31.0%), 50mg의 N-브로모숙신이미드, 1ml의 n-프로판올을 사용하여, 실시예 1과 동일한 방법으로 반응시켰다. 새로이 얻어진 생성물은 TLC Rf가 0.58, HPLC 유지시간은 47.68, 49.09, 51.16과 56.16에서 관찰되었고, 44.0mg의 파크리탁셀이 회수되었다(수율 99.0%).
실시예 7
100mg의 파크리탁셀과 세팔로만닌의 혼합물(파크리탁셀 44.5%, 세팔로만닌 31.0%), 100mg의 N-요오도숙신이미드, 1ml의 무수에탄올을 사용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 반응시켰다. 세팔로만닌으로부터 얻어진 생성물은 TLC Rf가 0.51, HPLC 유지시간은 34.29, 36.01, 38.84 그리고 45.05에서 관찰되었다{Mass(FAB) [M+H+]=1004}. HPLC정량에 의해 42.5mg의 파크리탁셀이 회수되었다(수율 95.5%).
실시예 8
1.0g의 파크리탁셀과 세팔로만닌 혼합물 (HPLC 정량, 파크리탁셀 44.5%, 세팔로만닌 31.5%), 0.5g의 N-브로모숙신이미드, 5ml의 n-부탄올, 0.1ml의 황산과 50ml의 디클로로메탄을 사용하였다. 세팔로만닌으로부터 얻어진 생성물은 TLC Rf가 0.62, HPLC 유지시간은 73.07, 78.37, 84.91에서 관찰되었다. 얻어진 생성물을 실리카겔 (230-400메쉬)을 사용하여 헥산/에틸아세테이트(v/v=3:1) 혼합 용매를 용출시켜 710mg의 고체를 얻었다. 얻어진 고체를 아세톤/헥산 혼합 용매 (v/v=1:1.5)에서 재결정하여 394mg의 파크리탁셀을 회수하였다(HPLC 순도 90%, 수율 88.5%).
실시예 9
3.005g의 파크리탁셀과 세팔로만닌 혼합물(HPLC 정량: 파크리탁셀 47.3%, 세팔로만닌 32.0%), 1.5g의 N-브로모숙신이미드, 15ml의 2-메틸-1-프로판올, 0.1ml의 황산과 150ml의 디클로로메탄을 사용하여 5±5℃를 유지하며 6시간동안 반응시켰다.
새로운 생성물은 TLC의 Rf값이 0.57, HPLC유지시간은 74.29, 80.29, 87.33 에서 관찰되었다. 헥산/에틸아세테이트 혼합액을 용출시켜 분리된 고체를 헥산/아세톤 혼합용매로 재결정하여 1.348g의 파크리탁셀을 회수하였다(HPLC 순도 89%, 회수율 95.0%).
상기와 같은 본 발명의 분리방법에 따라 파크리탁셀과 세팔로만닌의 혼합물로부터 파크리탁셀을 분리할 경우, 파크리탁셀의 구조를 변화시키지 않고 세팔로만닌만 선택적으로 반응시킴으로써 효과적으로 파크리탁셀을 분리할 수 있다.
도1은 실시예2의 반응에 사용된 파크리탁셀과 세팔로만닌의 혼합물에 대한 HPLC 크로마토그램,
도2는 실시예 2에서 얻어진 파크리탁셀에 대한 HPLC 크로마토그램,
도3은 본 발명의 2",3"-디브로모세팔로만닌의 1H-NMR 크로마토그램,
도4는 본 발명의 2"-브로모-3"-메톡시세팔로만닌과 2"-메톡시-3"-브로모세팔로만닌의 혼합물에 대한 1H-NMR 크로마토그램을 나타낸다.

Claims (8)

  1. 파크리탁셀(Paclitaxel)과 세팔로만닌(Cephalomannine)의 혼합물을 N-할로숙신이미드 존재하에서 지방족알콜과 반응시켜 얻은 혼합물로부터 파크리탁셀을 분리하는 것을 특징으로 하는 파크리탁셀의 분리방법.
  2. 제1항에 있어서, N-할로숙신이미드가 N-브로모숙신이미드 또는 N-요오도숙신이미드임을 특징으로 하는 파크리탁셀의 분리방법.
  3. 제1항에 있어서, 지방족 알콜이 1차, 2차 또는 3차 지방족 알콜임을 특징으로 하는 파크리탁셀의 분리방법.
  4. 제3항에 있어서, 지방족 알콜이 메탄올, 에탄올, t-부탄올, n-부탄올, n-프로판올 및 2-메틸-1-프로판올로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 파크리탁셀의 분리방법.
  5. 제1항에 있어서, 산성조건하에서 지방족 알콜을 반응시키는 것을 특징으로 하는 파크리탁셀의 분리방법.
  6. 제1항에 있어서, 유기 용매존재하에서 반응이 수행됨을 특징으로 하는 파크리탁셀의 분리방법.
  7. 제6항에 있어서, 유기용매가 디클로로메탄임을 특징으로 하는 파크리탁셀의 분리방법.
  8. 제1항에 있어서, 반응온도가 -20~40℃임을 특징으로 하는 파크리탁셀의 분리방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US5334732A (en) * 1992-07-02 1994-08-02 Hauser Chemical Research, Inc. Oxidation of cephalomannine with ozone in the presence of taxol
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