KR100465011B1 - 스포츠 건강 음료 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 한방(韓方)의 오장(五臟)을 보하고 기를 순환시키며, 천연생약 고유의 신선한 맛과 향을 제공할 뿐 아니라, 지구력 증진 효과가 있는 새로운 스포츠 건강 음료 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 구기자 3 내지 5 중량부, 연자육 5 내지 7 중량부, 진피 2 내지 4 중량부, 더덕 3 내지 5 중량부, 토사자 7 내지 9 중량부, 및 사인 1 내지 3 중량부의 수추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 본 발명의 기능성 건강 음료는, 한방에서 간, 심, 비, 폐 및 신을 보하고 통기에 유효한 생약을 원료로 하여 종래의 생약 추출 방법을 개선함으로써 생약 음료가 갖는 고미를 없애고 현대인의 기호에 맞도록 하였으며, 생약 추출물 배합 음료의 문제점인 침전 생성 원인을 근본적으로 없애서 마실 때 텁텁함이 전혀 없을 뿐 아니라 장기간 유통시에도 문제점이 없고, 특히 임파구세포의 증식과 대식세포에서 NO의 조절, iNOS 유전자 발현 및 사이토카인 발현의 조절을 통하여 자양·강장 효과의 증강에 기여할 수 있으며, 이러한 세포적 조절을 통해 생체 내에서 수영 시간의 연장 등과 같은 지구력의 유지 및 증진 효과를 나타낼 수 있다.

Description

스포츠 건강 음료{HERBAL SPORTS DRINK}
본 발명은 한방(韓方)의 오장(五臟)을 보하고 기를 순환시키며, 천연생약 고유의 신선한 맛과 향을 제공할 뿐 아니라, 지구력 증진 효과가 있는 새로운 스포츠 건강 음료 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
우리나라 국민 한 사람이 작년 한해 동안 마신 음료는 1.5 ℓ 페트병으로 약 46 개에 해당하는 것으로 조사되었다. 소비된 음료는 주로 탄산 음료였고, 그 외 주스 음료가 주종을 이루는 것으로 나타났다. 한편, 기호성이 확실한 틈새 시장의 기타 음료군은 2001 년도에 전년 대비 43% 정도의 비약적인 시장 확대가 있었으며, 탄산 음료나 주스 시장에 비해 조금 큰 폭으로 확대될 전망이라고 한다(식품음료신문, 2002. 01. 31). 특히, 기타 음료군에 속하는 스포츠 음료는 국제적 행사에 발맞춰 시장이 대폭 증가하고 있는 추세로, 최근 스포츠 붐을 타고 생활 음료로서 자리 매김하고 있다. 이들 스포츠 음료는 기존 이온 음료가 갖는 수분과 전해질의 보급이라는 기본 기능 외에 이보다 한 단계 높은 고기능성 스포츠 음료로서의 개발이 기대되고 있다.
한의학에서 주로 이야기하는 자양·강장 효과라는 것은 생체의 항상성 유지와 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 최근에는 이러한 생체 항상성을 유지하고 증대시킬 수 있는 생물활성 조절자를 천연물에서 찾고자 하는 연구가 활발하게 이루어지고 있으며, 생물활성 물질이 첨가된 다양한 건강 보조 식품에 관해서도 관심이 모아지고 있다(표명윤, 양기숙, 현수미. 상황버섯 추출물이 정상 마우스와 cyclophosphamide로 처리된 마우스의 체액성 면역기능에 미치는 영향.응용약물학회지9, 194-200, 2001; 백남인, 김영숙, 경종수, 박기현. 황기(黃耆)의 간기능 보호 성분.생약학회지27, 111-116, 1996; 조성기, 문혜선, 윤연숙, 홍석일, 함용호, 정인성, 박은규. 당귀 추출물이 면역계에 미치는 영향.대한면역학회지12, 113-118, 1990; 조성기, 윤연숙, 박승용, 문은이, 박은규. 당귀 추출물이 면역계에 미치는 영향(II).대한면역학회지13, 71-78, 1991; 및 길영성, 정승기, 이형구. 어성초 및 상국음이 면역기능에 미치는 영향.대한한의학회지16, 295-318, 1995).
산화질소(nitic oxide; NO)는 생체내 신호전달 물질로 수많은 생리적 과정에 관여하며, 여러 조직과 세포에서 L-아르기닌(L-arginine)으로부터 NOS(nitric oxide synthase)에 의해 합성되는 것으로 알려져 있다. 이러한 NO는 혈압조절, 신경전달, 혈액응고, 종양세포 및 세포내 기생 생물에 대한 숙주 면역계의 방어기능 등의 역할을 하게 된다. NOS는 크게 두 종류로 나눌 수 있는데, 먼저 Ca2+/calmodulin 의존성이며 단시간에 소량의 NO을 생성하여 정상적인 생리기능을 담당하는 constituent NOS(cNOS)로, 신경세포에 존재하는 neuronal constituent NOS(ncNOS)와 내피세포에 존재하는 endothelial constitute NOS (ecNOS)가 이에 속한다. 이와 달리, 세포내 Ca2+의 농도에 비의존성이고 대식세포, 혈관평활근세포, 내피세포, 간세포와 심근세포 등 여러 세포에서 LPS(lipopolysaccharide), IFN-γ(interferon-γ), IL-1(interleukin-1) 및 TNFα (tumor necrosis factor-α) 등의 자극에 의해 활성화되어 장시간 다량의 NO를 생성하는 inducible NOS(iNOS)가 존재한다. 특히 대식세포는 생체 내에서 감염, 염증 등의 자극에 의해 NO를 생성하여 종양세포를 죽이거나 미생물에 의한 감염을 방어하여 생체를 지키는 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 그러나, NO가 필요 이상으로 생성되면 쇼크(shock)에 의한 혈관 확장, 염증 반응으로 유발되는 조직 손상, 돌연변이유발 (mutagenesis), 신경조직 손상 등을 일으켜 생체에 유해한 작용을 하는 것으로 보고되어 있다. 즉, NO는 상황에 따라 세포, 조직 혹은 개체에 이로울 수도 있고 해로울 수도 있어 상황에 맞게 NO 분비를 촉진시키거나 억제시킴으로써 인체 생리현상을 조절할 수 있다. 이와 같이, NO 생성을 조절할 수 있는 물질을 찾고자 많은 연구가 활발히 진행되고 있다(황광진. 산화질소(Nitric Oxide) 이로운가? 해로운가? 산화질소의 화학과 응용.대한화학회지39, 52-63, 1999; Seo WG, Pae HO, Oh GS, Chai KY, Yun YG, Kwon TO, Chung HT. Inhibitory effect of ethyl acetate fraction from Cudrania tricuspidata on the expression of nitric oxide synthase gene in RAW 264.7 macrophages stimulated with interferon and lipopolysaccharide.Gen. Pharmacol.35, 21-28, 2000; Chiou WF, Chou CJ, Chen CF. Camptothecin suppresses nitric oxide biosynthesis in RAW 264.7macrophages.Life Sci.69, 625-635, 2001; Ishihara T, Okura T, Kohno K, Tanimoto T, Ikegami H, Kurimoto M. Polygonum tinctorium extract suppresses nitric oxide production by activated macrophages through inhibiting inducible nitric oxide synthase expression.J. Ethnopharmacol.72, 141-150, 2000; Lee BG, Kim SH, Zee OP, Lee KR, Lee HY, Han JW, Lee HW. Suppression of inducible nitric oxide synthase expression in RAW 264.7 macrophages by two-carboline alkaloids extracted from Melia azedarach.Eur. J. Pharmacol.406, 301-309, 2000; Seo WG, Pae HO, Oh GS, Kim NY, Kwon TO, Shin MK, Chai KY, Chung HT. The aqueous extract of Rhodiola sachalinensis root enhances the expression of inducible nitric oxide synthase gene in RAW264.7 macrophages.J. Ethnopharmacol.76, 119-123, 2001; Kim NY, Kang TH, Song EK, Pae HO, Chung HT, Kim YC. Inhibitory effects of butanol fraction of the aqueous extract of Forsythia koreana on the nitric oxide production by murine macrophage-like RAW 264.7 cells.J. Ethnopharmacol.73, 323-327, 2000; Kawamata H, Ochiai H, Mantani N, Terasawa K. Enhanced expression of inducible nitric oxide synthase by Juzen-taiho-to in LPS-activated RAW264.7 cells, a murine macrophage cell line.Am. J. Chin. Med.28, 217-226, 2000; 및 Gow-Chin Yen, Hsi-Huai Lai, Hsin-Yi Chou. Nitric oxide-scavenging and antioxidant effects of Uraria crinita root.Food Chemistry74, 471-478, 2001).
사이토카인은 자연 및 특이면역의 활성화 단계 및 실행 단계에서 생산되어염증반응을 자극하거나 저해하는 자연면역 조절 매개자의 역할을 하는 것으로, 특정 항원을 인식하여 T 세포에 의해 분비되며, 염증반응을 강하게 하거나 특수화하는데 관여하는 특이면역 매개 조절자의 기능 등 면역반응 및 염증반응에서 다양한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Lee YS, Kim HS, Kim SK, Kim SD. IL-6 mRNA Expression in Mouse Peritoneal Macrophages and NIH3T3 Fibroblasts in Response to Candida albicans.J. Microbiol. Biotechnol.10, 8-15, 2000; Okamura S, Shimoda K, Yu LX, Omori F, Niho Y. A traditional Chinese herbal medicine, ren-shen-yang-rong-tang (Japanese name: ninjin-yoei-to) augments the production of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor from human peripheral blood mononuclear cells in vitro.Int. J. Immunopharmacol.13, 595-598, 1991; 김종수, 신상습, 김철호, 박선동, 박원환. 신수혈의 침자극과 황기약침이 실험용 생쥐의 면역활성물질인 cytokine의 IL-6 발현에 미치는 영향.대한침구학회지15, 147-155, 1998; 및 송봉근, 이언정, 김형균, 진선두, 김성재, 김동혁. 황기가 면역세포의 기능에 미치는 영향.대한본초학회지(본초분과학회지)13, 115-128, 1998).
이상과 같은 점을 고려할 때, 오장을 보하는 생약성분으로부터 기능성 스포츠 건강 음료를 개발함으로써, 단순한 갈증 해소에 그치지 않고, NO의 조절이나 사이토카인의 발현 조절을 통하여 자양·강장 효과 뿐 아니라 지구력 유지 및 증강에 기여하도록 하는 것도 가능할 것으로 사료된다.
본 발명의 목적은 지구력 증진 효과를 갖는 기능성 건강 음료를 제공하고자 하는 것으로, 고래로부터 오장을 보하는 생약성분의 추출방법을 개선함으로써 생약 추출물 함유 음료가 갖는 고미를 없애고 현대인의 기호에 맞도록 여러 가지 첨가제를 첨가하였을 뿐 아니라, 특히 고압멸균한 셀라이트를 이용하여 여과층을 만들어 열수추출한 생약 추출물을 다시 여과함으로써 생약성분의 침전 생성 원인 물질을 근원적으로 방지하면서 생약성분의 조화로운 배합으로 스포츠 음료에서 필수적인 갈증 해소와 청량감을 부여하고, 더불어 임파구세포의 증식과 대식세포에서 NO의 조절, iNOS 유전자 발현 및 사이토카인 발현의 조절을 통하여 자양·강장 효과의 증강 및 지구력의 증진에 효과가 있는 스포츠 건강 음료 및 이의 제조 방법을 제공하기 위한 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 건강 음료의 제조공정을 모식적으로 나타낸 것,
도 2는 RAW 264.7 세포의 증식에 대한 본 발명 건강 음료의 용량에 따른 반응을 나타낸 그래프,
도 3은 RAW 264.7 세포에서 NO 생성에 대한 본 발명 건강 음료의 용량-의존성 효과를 보여주는 그래프,
도 4는 LPS-자극된 RAW 264.7 세포에서 NO 생성에 대한 본 발명 건강 음료의 효과를 보여주는 그래프,
도 5는 RAW 264.7 세포에서 NO 생성에 대한 본 발명 건강 음료의 영향을 시간대별로 나타낸 그래프,
도 6은 LPS-자극된 RAW 264.7 세포에서 본 발명 건강 음료에 의한 iNOS mRNA 발현의 저해를 보여주는 도면,
도 7은 RAW 264.7 세포에서 본 발명 건강 음료에 의한 사이토카인 유전자 발현을 보여주는 도면,
도 8은 LPS-자극된 RAW 264.7 세포에서 본 발명 건강 음료에 의한 사이토카인 유전자 발현을 보여주는 도면,
도 9는 마우스 비장세포의 증식에 대한 본 발명 건강 음료의 용량에 따른 반응을 나타낸 그래프,
도 10은 마우스 수영 지구력에 대한 본 발명 건강 음료의 효과를 보여주는 그래프.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 지구력 증진 효과를 갖는 기능성 건강 음료는, 구기자 3 내지 5 중량부, 연자육 5 내지 7 중량부, 진피 2 내지 4 중량부, 더덕 3 내지 5 중량부, 토사자 7 내지 9 중량부, 및 사인 1 내지 3 중량부의 수추출물을 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 기능성 건강 음료의 제조방법은,
구기자 3 내지 5 중량부, 연자육 5 내지 7 중량부, 진피 2 내지 4 중량부, 더덕 3 내지 5 중량부, 토사자 7 내지 9 중량부, 및 사인 1 내지 3 중량부의 마쇄한 생약재료를 혼합한 후, 상기 생약재료의 약 5 내지 15 배량의 정제수를 넣어 2 내지 4 시간 열수 추출하고 여과한 여액(여액 1)과, 그 잔사에 다시 동량의 정제수를 넣어 2 내지 4 시간 열수 추출하여 여과한 여액(여액 2)을 혼합하여 1 내지 3 배량의 정제수에 현탁시키고, 고압 멸균한 셀라이트 여과층으로 다시 여과시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 기능성 건강 음료의 다른 제조방법은,
구기자 3 내지 5 중량부, 연자육 5 내지 7 중량부, 진피 2 내지 4 중량부, 더덕 3 내지 5 중량부, 토사자 7 내지 9 중량부, 및 사인 1 내지 3 중량부의 마쇄한 생약재료 각각에 약 5 내지 15 배량의 정제수를 넣어 2 내지 4 시간에 걸쳐 2 회 열수 추출하고, 각각의 여액을 혼합하여 1 내지 3 배량의 정제수에 현탁시키고, 고압 멸균한 셀라이트 여과층으로 다시 여과시키는 것을 특징으로 한다.
여기에서, 본 발명의 기능성 건강 음료에는, 만삼 5 내지 7 중량부 및/또는 오미자 1 내지 2 중량부가 더욱 포함될 수 있다.
본 발명에서는 한방에서 간(肝), 심(心), 비(脾), 폐(肺), 신(腎)을 보하는 생약과 통기(通氣)에 유효한 생약의 추출물을 유효성분으로 하는 스포츠 건강 음료를 제공하는데, 종래의 생약 추출법을 개선함으로써 생약이 갖는 고미를 없애 현대인의 기호에 맞도록 하였으며, 스포츠 음료에 필수적인 갈증 해소와 마실 때 상쾌함을 느낄 수 있도록 하였다. 특히, 제조방법에서는 추출여액을 다시 셀라이트 여과층을 만들어 여과함으로써 생약 추출물 배합음료의 문제점인 침전 생성 원인을 근본적으로 없앴기 때문에, 마실 때 텁텁함이 전혀 없으며 장기간 유통시에도 침전 등이 생기는 문제점이 발생하지 않는다.
본 발명에 사용되는 생약 성분은 고래로부터 아래와 같이 오장을 보하는 생약으로 알려져 있지만 이를 스포츠 건강음료에 이용한 경우는 없었다.
1) 간(肝): 구기자, 오미자
구기자는 간신(肝腎)을 평보(平補)하기 위한 상용 약재로, 보간신(補肝腎), 생정혈(生精血), 명목(明目), 자양, 강장 작용이 있으며, 실험에 의하면 간세포 내의 지방 침착을 억제하고 간세포의 신생을 촉진하는 작용이 있는 것으로 알려졌다.
2) 심(心): 연자육, 만삼
만삼은 보중익기(補中益氣)로 조혈작용과 말초혈관을 확장하고 부신피질을 억제하는 것에 의해 혈압을 강하시키며, 강장과 건위, 진해·거담 작용이 있는 생약이다. 연자육은 심화(心火)를 식히고 정신을 안정시킨다.
3) 비(脾): 진피
진피는 건위, 정장 작용이 있으며 소화 기능을 항진시킨다.
4) 폐(肺): 더덕
더덕은 윤폐(潤肺), 자양 작용이 있으며 폐허(肺虛)에 사용한다.
5) 신(腎): 토사자
토사자는 보신익정(補腎益精),명목(明目)의 약리작용이 있으며, 신허(腎虛)로 인체가 유약한 사람에게 유용하다.
6) 통기(通氣): 사인
사인은 상, 중, 하 삼초의 기체를 선행시키고 신산온통(辛散溫通)하고, 방향(芳香)하며 이기(理氣)한다
본 발명의 스포츠 건강 음료는 구기자 3 내지 5 중량부, 연자육 5 내지 7 중량부, 진피 2 내지 4 중량부, 더덕 3 내지 5 중량부, 토사자 7 내지 9 중량부, 및 사인 1 내지 3 중량부를 필수적으로 함유하며, 임의로 만삼 5 내지 7 중량부 및/또는 오미자 1 내지 2 중량부를 함유한다.
이하에서는 본 발명의 스포츠 건강 음료의 제조방법을 구체적으로 살펴본다.
잘 건조된 상기 생약 재료들을 #3.5 mesh 체를 통과할 정도로 마쇄하여 혼합한 후, 생약 재료 총중량의 약 5 내지 15 배량의 정제수를 넣어 2 내지 4 시간 동안 열수 추출하고 추출액을 여과지를 사용하여 여과한 여액(여액 1)과, 그 잔사에 다시 동량의 정제수를 넣어 열수 추출하여 여과한 여액(여액 2)을 혼합하거나, 또는 상기 마쇄한 생약 재료 각각에 약 5 내지 15 배 중량의 정제수를 넣고 2 내지 4 시간 동안 2 회 열수 추출한 후 각각의 여액을 혼합한다.
이들 혼합한 여액을 1 내지 3 배량의 정제수에 현탁시킨 다음, 고압 멸균한 셀라이트를 사용하여 셀라이트 여과층을 만들어 다시 여과하고, 여액에 정제수를 가하여 총량 500 중량부가 되도록 조정한다.
다음에, 총 중량을 기준으로 하여 첨가제로 액상 과당 4%, 백설탕 3%, 구연산 0.1%, 비타민 C 0.01%, 안식향산나트륨 0.03% 및 향료(Citrus flavor 0.07%, Menthol flavor 0.02%)를 가하고 캔 또는 병에 충전한 후, 92 내지 95 ℃에서 15 내지 30 초간 살균하여 건강 음료를 제조한다.
도 1은 본 발명에 따른 건강음료의 제조공정을 모식적으로 나타낸 것이다.
본 발명의 건강 음료 제조에 사용되는 셀라이트는 대부분 비정질의 실리카로 되어 있으며, 물리화학적으로 안정한 무기질로 다공성이고 가볍고 흡수성과 단열성이 뛰어나기 때문에 일반적으로 여과조제, 충전제, 흡수제 등으로 사용되는 재료이다. 천연물화학 연구분야에서는 주로 활성물질 분리시 추출 엑스의 여과제 또는 흡착제로 사용된다.
생약 성분으로부터 음료를 개발할 때 대두되는 문제점으로는, 장시간 보존으로 인한 생약성분의 침전 생성, 색상의 갈변 및 고미를 들 수 있다. 이는 주로 불용성 지질, 소수성 화학 성분의 침전, 탄닌에 의한 알칼로이드나 단백질의 침전, 그리고 고온 추출로 인한 소당류 혹은 셀룰로스, 전분 등의 폴리머화에 의한 색상의 변화 및 이러한 성분으로 인한 고미가 그 원인인 것으로 사료된다.
본 발명에서는 이상의 침전 생성 원인 물질을 근원적으로 방지하기 위하여, 종래 청량음료 제조시 적용한 바 없는 고압 멸균한 셀라이트를 여과층으로 사용함으로써 이와 같은 문제점을 해결하였다.
이하 실시예에 의거 본 발명을 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐, 이들만으로 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
잘 건조되고 #3.5 mesh 체를 통과할 정도로 마쇄한 오미자 1 g, 구기자 4 g, 만삼 6 g, 연자육 6 g, 진피 3 g, 더덕 4 g, 토사자 8 g 및 사인 2 g을 계량하여 모두 혼합한 후 정제수 500 g을 넣고 3 시간 열수 추출하였다. 추출물을 여지를 사용하여 여과하여 모으고(여액 1), 다시 잔사에 정제수 500 g을 넣고 3 시간 열수 추출하여 여과한 여액(여액 2)을 여액 1과 혼합하였다. 상기 추출액(여액 1+여액 2)을 2 배량의 정제수에 현탁시키고 고압 멸균한 셀라이트를 사용하여 셀라이트 여과층을 만들어 다시 여과한 후, 여과한 추출액에 정제수를 가하여 총량 500 g이 되도록 조정하였다. 이어서, 조성물의 총중량을 기준으로 하여 첨가제로 액상 과당 4%, 백설탕 3%, 구연산 0.1%, 비타민 C 0.01%, 안식향산나트륨 0.03% 및 향료(Citrus flavor 0.07%, Menthol flavor 0.02%)를 가하고 캔 또는 병에 충전한 후, 92 내지 95 ℃에서 15 내지 30 초간 살균하여 제품을 제조하였다.
실시예 2
잘 건조되고 #3.5 mesh 체를 통과할 정도로 마쇄한 오미자 1 g, 구기자 4 g, 만삼 6 g, 연자육 6 g, 진피 3 g, 더덕 4 g, 토사자 8 g 및 사인 2 g을 계량하여, 각각의 생약에 10 배량의 정제수를 넣고 별도로 3 시간씩 2 회 열수 추출하였다. 각각의 여액을 혼합하여 2 배량의 정제수에 현탁시키고 고압 멸균한 셀라이트를 사용하여 셀라이트 여과층을 만들어 다시 여과한 후, 여과한 추출액에 정제수를 가하여 총량 500 g이 되도록 조정하였다. 이하의 제조방법은 실시예 1과 동일하게 실시하였다.
비교예 1 및 2
추출 여액을 2 배량의 정제수에 현탁시킨 후 고압 멸균한 셀라이트 여과층으로 다시 여과하는 공정을 제외하고는 실시예 1 및 2와 동일하게 제조하여 각각 비교예 1 및 2의 제품을 제조하였다.
제품 실험예 1: 침전물 생성도 시험
실시예 1 및 2, 그리고 비교예 1 및 2에서 제조한 제품을 4 ℃ 냉장고에서 1, 3 및 7 일간 보존한 후, 분광광도계를 사용하여 UV 600 ㎚에서 흡광도를 측정하여 침전물 생성에 따른 흡광도의 변화를 평가하였다. 흡광도는 3 회 측정하여 평균치로 하였으며, 그 결과는 표 1과 같다. 표 1은 보존기간(4 ℃)에 따른 흡광도 변화이다.
4 ℃ 보존기간(일) 1 3 7
평균흡광도(UV 600 ㎚) 실시예 1 0.010±0.001 0.012±0.002 0.015±0.002
실시예 2 0.011±0.001 0.013±0.001 0.014±0.003
비교예 1 0.124±0.042 0.153±0.037 0.189±0.058
비교예 2 0.113±0.039 0.148±0.040 0.175±0.049
위 표 1에서 보듯이, 셀라이트 여과층을 사용하지 않은 경우(비교예 1 및 2)에는 많은 침전물이 생성되는 것을 알 수 있다(육안으로 보임). 이에 비해 셀라이트 여과층을 통과시켰을 경우(실시예 1 및 2)에는 비교예에 비해 흡광도 변화가 현저히 낮았다. 따라서, 셀라이트 여과층을 사용하여 다시 여과한 본 발명의 음료에서 침전물 생성이 현저히 방지됨을 알 수 있다(육안 관찰시 투명함).
실시예 3
생약 재료로 오미자를 제외하고 구기자 4 g, 만삼 6 g, 연자육 6 g, 진피 3 g, 더덕 4 g, 토사자 8 g 및 사인 2 g만을 사용하고, 제조방법은 실시예 1과 동일하게 실시하였다.
실시예 4
생약 재료로 오미자를 제외하고 구기자 4 g, 만삼 6 g, 연자육 6 g, 진피 3 g, 더덕 4 g, 토사자 8 g 및 사인 2 g만을 사용하고, 제조방법은 실시예 2와 동일하게 실시하였다.
실시예 5
생약 재료로 오미자와 만삼을 제외하고 구기자 4 g, 연자육 6 g, 진피 3 g, 더덕 4 g, 토사자 8 g 및 사인 2 g만을 사용하고, 제조방법은 실시예 1과 동일하게 실시하였다.
실시예 6
생약 재료로 오미자와 만삼을 제외하고 구기자 4 g, 연자육 6 g, 진피 3 g, 더덕 4 g, 토사자 8 g 및 사인 2 g만을 사용하고, 제조방법은 실시예 2와 동일하게 실시하였다.
제품 실험예 2: 관능검사
이상의 실시예와 비교예에서 제조한 각 음료에 대하여, 관능검사요원 20 명을 대상으로 기호도에 대한 관능검사를 2 회 반복 실시하고 결과를 표 2에 나타내었다. 표 2는 실시예 및 비교예 각각에서 제조된 음료의 관능검사 결과이다.
검사 방법은 5 점 척도법으로, 1은 아주 싫다, 2는 싫다, 3은 보통이다, 4는 좋다, 그리고 5는 아주 좋다로 평가한 것이다.
검사항목 실시예1 실시예2 실시예3 실시예4 실시예5 실시예6 비교예1 비교예2
색상 4.3 4.2 4.2 4.1 4.1 4.0 3.4 3.6
4.0 3.9 4.3 4.2 4.0 3.9 3.3 3.4
4.2 4.1 4.2 4.0 3.9 4.0 3.9 3.8
촉감(Mouthfeel) 4.0 3.9 4.3 4.2 3.9 3.8 3.0 3.2
갈증해소감 4.2 4.1 4.5 4.3 4.1 4.0 3.4 3.5
위 표 2의 결과에서 보듯이, 본 발명의 음료가 비교예에 비해 유의차 없이 갈증해소는 물론 기호도가 좋음을 알 수 있다. 특히, 건강 지향적인 사람, 도시 거주자들이 기능 및 관능 측면에서 선호할 수 있는 음료로 유리하게 사용될 수 있음을 보여준다.
제품 실험예 3: 자양·강장·면역 및 지구력 증강에 미치는 효과 실험
여기에서는 본 발명의 스포츠 건강 음료의 자양·강장 효과 및 지구력 증강에 미치는 효과를 살펴보기 위하여,in vitro실험으로는 마우스 비장세포의 증식능, RAW 264.7 대식세포의 산화질소(NO) 생성능, LPS에 의한 NO 생성의 억제능, iNOS 유전자 발현 및 염증 관련 사이토카인의 발현에 미치는 영향과,in vivo실험으로 마우스 수영 시간을 측정하였다.
(1) 시료의 조제
실시예 1에 따라 제조된 음료를 사용하였다. 이하, 본 발명의 건강 음료를 HSD(Herbal Sports Drink)로 약칭한다.
(2) 실험동물 및 처치
동물은 생후 6 주령 체중 28 g 정도의 웅성 ICR 마우스를 (주)대한 바이오링크로부터 구입하여, 경산대학교 한의과대학 동물사육실에서 일정한 조건(온도: 22±2 ℃, 습도: 50±5%, 명암: 12 시간 light/dark cycle)으로 1 주일간 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
실험군은 대조군, HSD 섭취군(시료 4, 8 및 16 g/kg을 20 ㎖/kg 체중이 되도록 생리식염수에 희석해서 사용)의 4 군으로 나누었으며 1 군당 각 5 마리씩 사용하였다. HSD 섭취군은 1 일 1 회 7 일간 연속적으로 체중 kg 당 4, 8, 및 16 g을 경구 투여하였으며, 대조군은 HSD 섭취군과 동일한 조건으로 생리식염수를 투여하였다. 실험 전 기간 동안 물과 사료(삼양유지사료(주), 강원도 원주시)는 제한 없이 공급하였다.
(3) 세포주 배양
마우스 대식세포 세포주인 RAW 264.7 세포주를 ATCC로부터 분양받아 2 mM 글루타민이 함유된 DMEM 배지에 5% FBS, 100 U/㎖ 페니실린-스트렙토마이신을 첨가한 배지에서 배양하여 실험에 사용하였다.
(4) 비장세포 분리
마우스를 에테르 마취 후 심장에서 혈액을 채취하고 70% 알코올로 분무한 후 무균적으로 비장을 적출하여 주위 조직을 제거하였다. 슬라이드 글라스로 부드럽게 압착하여 단일 비장세포로 만든 후 4 ℃, HBSS(GibcoBRL, NY, U.S.A.) 용액으로 2 회 세척하였다. ACK lysis 용액을 가하여 적혈구를 완전히 용혈시킨 후, RPMI 1640 (GibcoBRL, NY, U.S.A.) 배지로 1 회 더 세척하고 10% FBS가 첨가된 RPMI 1640 배지에 부유시켰다. 일정액을 취하여 0.4% 트리판 블루 염색액에 혼합한 후 혈구계산판을 이용하여 살아 있는 비장세포 수를 측정하여 사용하였다.
(5) 비장세포 증식능 실험
마우스 비장세포를 2×105/100 ㎕ 세포가 되도록 세포수를 조정하여 평평한 바닥의 96 웰 배양 플레이트의 각 웰에 분주하고, 여기에 시료를 농도별로 가해서 총량이 100 ㎕가 되도록 조정하여 37 ℃, 5% CO2배양기에 넣고 48 시간 배양하였다. 임파구 증식능을 측정하기 위하여 프로메가(Promega)사의 분석키트(CellTiter96RAQueousOne Solution Cell Proliferation Assay kit)를 사용하였다. 간략하게 기술하면, 배양액 100 ㎕에 시약 20 ㎕를 첨가하고 37 ℃, 5% CO2배양기에 넣어 1 시간 30 분 배양한 후 ELISA 판독기 490 ㎚에서 측정하였다. 임파구 증식 결과는 실험군의〔(평균 O.D.)-(평균 background O.D)±S.D〕값으로 표시하였다.
(6) 세포 독성효과 측정
RAW 264.7 대식세포에 대한 HSD 자체의 세포독성 효과를 살펴보기 위하여, 프로메가사의 분석키트(CellTiter 96RAQueousOne Solution Cell Proliferation Assay kit)를 사용하여 이들 대식세포의 증식도를 조사하였다. 즉, RAW 264.7 세포를 1×104cells/well이 되도록 세포수를 조정하여 평평한 바닥의 96 웰 배양 플레이트의 각 웰에 분주하고, 여기에 시료를 농도별로 가하여 총량이 100 ㎕가 되도록 조정해서 37 ℃, 5% CO2배양기에 넣고 48 시간 배양하였다. 48 시간 배양 후 배양액 100 ㎕에 시약을 20 ㎕ 첨가하고 37 ℃, 5% CO2배양기에 넣어 1 시간 30 분 배양한 후 ELISA 판독기 490 ㎚에서 측정하였다. 임파구 증식 결과는 실험군의 평균 O.D.에서 background O.D.를 뺀 값으로 표시하였다.
(7) Nitrite assay
RAW 264.7 세포주로부터 생성된 nitric oxide(NO)의 양은 세포 배양액 중에 존재하는 NO2 -의 형태로서 Griess 시약을 이용하여 측정하였다. 간단히 설명하면,세포배양 상등액 100 ㎕와 Griess 시약(1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid + 1% α-naphthylamide in H2O) 100 ㎕를 혼합하여 96 웰 플레이트에서 10분 동안 반응시킨 후 540 ㎚에서 ELISA 판독기로 흡광도를 측정하는 것이다. NO2 -의 농도는 질산나트륨(sodium nitrate)을 희석해서 흡광도를 측정하여 표준 곡선을 얻었다.
(8) RT-PCR(역전사 중합효소 연쇄반응)
RNA 분리는 TRIzol를 이용하여 다음과 같이 실시하였다: 비장세포에서 RNA를 분리하기 위해 0.1% DEPC가 첨가된 PBS로 비장세포를 3 회 세척한 후 TRIzol 900 ㎕를 첨가하여 균질화시키고, 여기에 클로로포름 100 ㎕를 넣고 15 분간 얼음에 정치시켰다. 4 ℃, 12,000 rpm에서 15 분간 원심분리하여 위층을 조심스럽게 취하고, 동량의 이소프로판올을 첨가하여 -20 ℃에서 45 분 정치한 후 원침하고, 70% DEPC-에탄올로 1 회 세척하였다. RNA를 실온에서 건조시킨 후 DEPC가 첨가된 증류수에 일정량 희석하여 스펙트로포토미터에서 농도를 결정하였다.
5× RT 완충액 2 ㎕, 10 mM dATP 0.25 ㎕, 10 mM dGTP 0.25 ㎕, 10 mM dTTP 0.25 ㎕, 10 mM dCTP 0.25 ㎕, MMLV 역전사효소(200 U/㎕) 0.25 ㎕, RNase inhibitor(28 U/㎕) 0.25 ㎕, 50 μM 올리고 dT 프라이머 0.5 ㎕ 및 DEPC-DW 4 ㎕를 PCR 튜브에 넣어 RT-혼합물을 만들고 여기에 총 RNA를 첨가하였다. 이 시험관을 PCR machine(PTC-100TMProgrammable Thermal Controllar; MJResearch, Inc.)에 넣어 42 ℃에서 60 분간 열처리하여 역전사 반응을 완료하였다.
PCR은 먼저 10× PCR 완충액 3 ㎕, 25 mM MgCl21.8 ㎕, 10 mM dATP 0.3 ㎕, 10 mM dGTP 0.3 ㎕, 10 mM dTTP 0.3 ㎕, 10 mM dCTP 0.3 ㎕, 50 μM 센스 및 안티센스 프라이머 0.25 ㎕, Taq 폴리머라제(5 U/㎕, Promega Co.) 0.25 ㎕를 혼합하고, 여기에 D.W.를 넣어 최종 용액량이 20 ㎕가 되게 하여 PCR 혼합물을 만들었다. PCR 혼합물을 PCR 튜브에 넣고, 여기에 역전사 반응물 5 ㎕를 넣어 혼합한 다음 PCR machine에 넣어 다음의 조건으로 PCR을 실시하였다. PCR 반응은 94 ℃에서 3 분간 1 사이클 반응 후, 94 ℃ 45 초, 57 ℃ 45 초, 72 ℃ 45 초간 35 사이클 반응시켰으며, 72 ℃에서 10 분간 extension을 시행한 후 반응을 완료시켰다. 증폭된 산물은 1.2% 아가로스 겔에 전기영동하여 UV transilluminater를 이용하여 DNA 밴드를 확인하였다.
RT-PCR에 사용한 프라이머는 (주)바이오니아사(Bioneer Co. Choongbook)에 의뢰하여 합성한 것으로, 이들 각 프라이머의 염기서열은 다음 표 3과 같다.
올리고뉴클레오티드 서열
G3PDH 5'-CCA CCC AGA AGA CTG TGG ATG GC-3'5'-CAT GTA GGC CAT GAG GTC CAC CAC-3'
IL-1α 5'-CAC TAT CTC AGC ACC ACT TG-3'5'-CTG GAA GTC TGT CAT AGA GG-3'
IL-1β 5'-CCG TGG ACC TTC CAG GAT GA-3'5'-GAT CCA CAC TCT CCA GCT GC-3'
IL-6 5'-AGA GGA GAC TTC ACA GAG GA-3'5'-ATC TCT CTG AAG GAC TCT GG-3'
GM-CSF 5'-GGA TGT GGC TGC AGA ATT TAC TT-3'5'-TCA TTT TTG GAC TGG TTT TTT GCA-3'
iNOS 5'-GAC AAG CTG CAT GTG ACA TC-3'5'-GCT GGT AGG TTC CTG TTG TT-3'
(9) 항 피로 효과 시험
대조군 및 HSD 섭취군의 수영 지구력(swimming endurance capacity) 측정을 통한 항 피로 효과(anti-fatigue capacity)를 평가하기 위하여, 아크릴 플라스틱 (20×20×45 ㎝)으로 제작한 마우스용 지구력 측정 장치를 이용하였다. 마지막 시료 투여 24 시간 후, 수온 25±0.1 ℃의 물을 수심 35 ㎝가 되도록 채우고 0.01%의 계면활성제를 첨가한 후 마우스의 수영 시간을 측정하였다. 마우스의 수영 기록은 수영을 시작한 시점부터 사망 시점까지를 수영 시간으로 간주하였다.
(10) 통계 처리법
실험 결과는 mean±S.D 또는 mean±S.E로 나타내었으며, ANOVA test의 통계처리방법으로 통계적 유의성 검정을 조사하였다. 유의수준은 p<0.05로 하였다.
1.HSD의 RAW 264.7 세포 증식능 및 NO 생성능에 미치는 효과
HSD의 RAW 264.7 대식세포 증식능에 미치는 영향을 살펴보기 위하여, RAW 264.7 대식세포를 HSD 각 용량별(1, 10, 100 ㎕)로 48 시간 배양한 후 그 영향을 조사하였다. 대조군은 DMEM 배지에서 배양되었으며, 결과는 3 회 배양에서 mean±S.D으로 나타내었다. 도 2는 RAW 264.7 세포의 증식에 대한 HSD의 용량에 따른 반응을 나타낸 그래프이다.
대식세포는 조직 내에 광범위하게 분포되어 있으며, 면역반응의 초기반응과 비특이적 면역반응을 담당하며, 생체내에서 감염, 염증 등의 반응에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 도 2에서 보듯이, HDS 첨가에 따른 대식세포의 세포증식은 관찰되지 않았으며, 세포증식능은 대조군과 큰 차이를 관찰할 수 없었다. 이러한 결과는 HSD 자체가 대식세포 증식능에는 영향이 미치지 않는 것으로 사료된다.
한편, 대식세포에서 생성되는 NO는 작고 불안정한 무기가스로 신경전달, 혈액응고, 혈압조절 및 종양세포나 세포 내 기생 생물에 대한 숙주의 방어기능 등에 관여하는 것으로 보고되어 있다. 낮은 농도에서 NO는 신경전달 물질 등과 같은 작용을 하나, 고농도에서는 숙주세포의 파괴와 염증조직의 상해를 초래할 수 있는 이중적 생물학적 성질을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 최근 이러한 NO의 조절을 유도함으로 숙주의 생리작용을 조절할 수 있는 천연물에 관한 다양한 연구가 수행되고 있다(Hibbs JB, Taintor RR, Vavrin Z, Granger DL, Drapier JC, Amber IJ, Lancaster JR. Synthesis of nitric oxide from a terminal guanidine nitrogen atom of L-arginine: a molecular mechanism regulating cellular proliferation that targets intracellular iron. In Nitric Oxide from L-arginine: A Bioregulatory System. S. Moncada and E.A. Higgs, (Ed). Amsterdam: Elservier Science publishers, p. 189. 1990; Moncada S, Palmer RM, Higgs EA. Nitric Oxide: Physiology, Pathophysiology, and Pharmacology.Pharmaceutical Research43, 109-142, 1990; Wang CN, Shiao YJ, Kuo YH, Chen CC, Lin YL. Inducible nitric oxide synthase inhibitors from Saposhnikovia divaricata and Panax quinquefolium.Planta Med66, 644-647, 2000; 박재승, 이정호, 하대유. Capsaicin 전처치가 마우스 대식세포의 기능에 미치는 영향.대한면역학회지22, 39-49, 2000.).
본 발명에 따른 건강음료 자체의 NO 생성능을 살펴보기 위해서, HSD를 농도별로 RAW 264.7 대식세포에 처리하여 생성되는 NO 양을 측정하였다. RAW 264.7 세포는 1 내지 100 ㎕/㎖의 HSD 농도에서 24 시간 동안 배양되었으며, 배지 중의 nitrite 축적량을 측정함으로써 NO 생성능을 평가하였다. 도 3은 RAW 264.7 세포에서 NO 생성에 대한 HSD의 용량-의존성 효과를 보여주는 그래프로, 결과는 3 회 평균치이고 막대는 표준편차를 나타낸다(비처리 샘플에 대하여 p<0.05).
도 3에서 보듯이, 대조군에서는 4.83±0.07 μM의 NO가 생성되었으며, HSD 농도 1, 10 및 100 ㎕에서는 각각 4.90±0.07, 5.15±0.04 및 5.42±0.17 μM로 HSD 농도 의존적으로 NO 생성이 증가되는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과는 HSD 자체가 NO 생성을 유도할 수 있음을 보여 주는 것으로 생각된다.
2.LPS로 자극된 RAW 264.7 세포에서 HSD의 NO 억제효과
RAW 264.7 세포에서 LPS의 자극에 의한 과다한 NO 생성 및 이에 미치는 HSD의 효과를 살펴보기 위해, RAW 264.7 세포를 LPS(1 ㎍/㎖)와 함께 또는 LPS 없이, HSD 존재 또는 부재중에 24 시간 동안 배양한 후 세포에 의해 유리된 NO의 양을 Greiss 방법에 의해 측정하였다. 결과는 3 회의 독립적인 실험의 mean±S.D로 하였다.
도 4는 LPS-자극된 RAW 264.7 세포에서 NO 생성에 대한 HSD의 효과를 보여주는 그래프이다. 여기에서 보면, LPS를 단독으로 처리하였을 경우 9.39±0.14 μM의 NO가 생성되었으나, LPS와 HSD을 혼합하여 배양한 세포에서의 NO 생성량은 HSD 1 ㎕, 10 ㎕ 및 100 ㎕에서 각각 8.75±0.08(7%), 8.44±0.25(10%) 및 5.85±0.07 (38%)로, HSD 용량 의존적으로 LPS 자극에 의한 NO 생성이 억제되는 것이 관찰되었다.
또한, HSD 100 ㎕를 LPS와 함께 처리하여 시간에 따른 NO 생성 효과를 관찰하기 위하여, RAW 264.7 세포를 1 ㎍/㎖ LPS 존재중 또는 부재중에 100 ㎕/㎖ HSD와 함께 1, 4, 8, 12 및 24 시간 동안 배양하였다. NO 생성량은 배지 중 nitrite 축적량을 측정하였고, 결과는 3 회의 평균으로 하였다.
도 5는 RAW 264.7 세포에서 NO 생성에 대한 HSD의 영향을 시간대별로 나타낸 그래프이다. 여기에서 보면, LPS 단독 처리군에서는 다른 실험군에 비해 배양 12 시간부터 NO 생성량이 증가하였으나, HSD와 함께 처리함으로써 NO 양의 증가가 억제되는 것이 관찰되었다. 이러한 결과로부터, HSD는 LPS로 자극된 RAW 264.7 대식세포주에서 과량 생성된 NO 양을 감소시킴으로 숙주의 생리작용을 조절할 수 있는 것으로 생각된다.
3.LPS로 자극된 RAW 264.7 세포에서 HSD에 의한 iNOS 유전자 발현 억제 효과
NO 생성 억제 기작에 관한 iNOS유전자 발현의 관련성을 조사하기 위하여 RT-PCR을 이용하여 iNOS 유전자 발현에 미치는 영향을 조사하였다. 즉, RAW 264.7 세포를 여러 가지 농도의 HSD 존재중 또는 부재중에 24 시간 동안 1 ㎍/㎖ LPS로 자극한 후, 총 RNA를 구하여 iNOS mRNA를 RT-PCR에 의해 분석하였다. G3PDH를 대조군 유전자로 사용하였다.
도 6은 LPS-자극된 RAW 264.7 세포에서 HSD에 의한 iNOS mRNA 발현의 저해를 보여주는 도면이다. 여기에서 보면, HSD 1 ㎕에서는 iNOS 유전자 발현이 관찰되지 않았으나, 10 ㎕부터 100 ㎕에서는 약하게 iNOS 유전자 발현이 관찰되었고, LPS 자극에 의해 iNOS 유전자 발현이 강하게 유도된 것을 알 수 있다. 그러나, LPS와 HSD을 동시 처리시 HSD 농도 의존적으로 iNOS 유전자 발현이 감소되는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과는 HSD의 NO 조절 작용에 iNOS 유전자 발현이 관여하고 있음을 보여주는 것이라 할 수 있다.
4.HSD의 염증관련 사이토카인 유전자 발현에 미치는 효과
대식세포는 LPS와 IFN-γ와 같은 물질에 의해 T 세포와 B 세포의 증식을 조절하고, 식균작용을 위한 대식세포의 활성, 미생물 감염에 대한 방어와 같은 2차 면역반응을 조절할 수 있는 IL-1, IL-6, GM-CSF(granulocyte-macrophage colony stimulating factor), TNF와 같은 사이토카인의 분비를 정확하게 조절하는 것에 의해 생리, 면역 반응에 기여하는 것으로 알려져 있다(Haslberger A, Romanin C, Koerber R. Membrane potential modulates release of tumor necrosis factor in lipopolysaccharide-stimulated mouse macrophages.Mol. Biol. Cell.3, 451-460, 1992; Shacter E, Arzadon GK, Williams JA. Stimulation of interleukin-6 and prostaglandin E2 secretion from peritoneal macrophages by polymers of albumin.Blood82, 2853-2864, 1993; Mizuno M, Yamada J, Terai H, Kozukue N, Lee YS, Tsuchida H. Differences in immunomodulating effects between wild and cultured Panax ginseng.Biochem. Biophys. Res. Commun.200, 1672-1678, 1994; 박종욱, 한인숙, 서성일, 백원기, 서민호, 배지현, 최병길. 인삼 사포닌이 인간면역계 사이토카인 유전자의 발현에 미치는 영향.고려인삼학회지20, 15-22, 1996.).
대식세포에서 염증관련 사이토카인 유전자 발현에 미치는 HSD의 효과를 조사하기 위해, RAW 264.7 세포를 여러 가지 양의 HSD로 24 시간 동안 자극하고, 각 샘플에서 총 RNA를 구하여 RT-PCR을 수행하였다. G3PDH가 대조군 유전자로 사용되었다.
도 7은 RAW 264.7 세포에서 HSD에 의한 사이토카인 유전자 발현을 보여주는 도면이다. 여기에서 보면, 대표적인 염증 관련 사이토카인 IL-1α, IL-1β 및 IL-6의 유전자 발현이 HSD 농도 의존적으로 유도되는 것을 관찰할 수 있다. 그러나, GM-CSF의 경우 HSD의 농도 1 ㎕에서 유전자 발현이 강하게 유도된 후, HSD 농도 10 ㎕과 100 ㎕에서는 유전자 발현이 감소되었다.
또한, HSD의 LPS 자극시 유도된 이들 사이토카인 발현에 미치는 영향을 살펴보기 위해, RAW 264.7 세포를 여러 가지 양의 HSD로 LPS(1 ㎍/㎖)와 함께 24 시간 동안 자극하고, 각 샘플에서 총 RNA를 구하여 RT-PCR을 수행하였다. G3PDH가 대조군 유전자로 사용되었다.
도 8은 LPS-자극된 RAW 264.7 세포에서 HSD에 의한 사이토카인 유전자 발현을 보여주는 도면이다. 여기에서 보면, IL-1α의 변화에는 영향을 미치지 못하였으나, IL-1β, IL-6 및 GM-CSF의 유전자 발현은 HSD 용량 의존적으로 억제됨이 관찰되었다.
즉, 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포주에서 HSD 처리에 의한 전 염증성 사이토카인 유전자 발현 조절의 관찰 결과, HSD의 생리 현상 조절에 이들 생리활성작용에 관여하는 인자들이 관여함을 나타내주는 것을 알 수 있다.
5.HSD의 비장세포 증식에 미치는 영향
HSD의 정상 면역 관련 세포의 증식에 미치는 영향을 조사하기 위하여 마우스 비장세포를 대상으로 하여 관찰하였다. 즉, 마우스 비장 세포(2×106cells/㎖)를 분리 후in vitro상에서 여러 가지 농도(0, 1, 10, 100 ㎕/well)의 HSD와 함께 48 시간 동안 배양한 후, 비장세포 증식능을 관찰하였다. 대조군은 RPMI1640 배지에서만 배양하였으며, 결과는 3 회 배양의 mean±S.D로서 나타내었다.
도 9는 마우스 비장세포의 증식에 대한 HSD의 용량에 따른 반응을 나타낸 그래프로, 상단의 다른 문자는 유의적으로 다른 것을 나타낸다(p<0.05). 여기에서 보면, HSD의 처리시 비장세포의 증식능이 대조군에 비해 각각 127, 155 및 167% 용량 의존적으로(p<0.05) 증가됨이 관찰되었다. 양성대조군으로 사용된 LPS(6 ㎍/㎖) 자극시 비장세포 증식능은 대조군에 비해 145% 증가하였는데, HSD 100 ㎕ 처리한 경우의 양성대조군 LPS(6 ㎍/㎖) 처리시에 비해서 세포증식능이 22% 증가된 것을 관찰할 수 있었다(p<0.05).
임파구의 증식은 각종 마이토젠(mitogen), 항원, 사이토카인, 성장인자 등 여러 종류의 자극에 의하여 초래된 새로운 DNA 합성과 더불어 세포분열의 결과로 나타나는 하나의 과정이고, 이러한 임파구 증식능의 측정은 세포활성의 지표로 여겨지므로(정태준, 김정목, 조양자, 정용훈, 임대철. 마이토젠 및 림포카인이 마우스 비장 세포 임파구 및 사람 말초 혈액 임파구 증식 반응에 미치는 영향.대한면역학회지11, 89-96, 1989.), 이상과 같은 결과는 HSD가 직접 마이토젠으로 작용될수 있음을 간접적으로 제시하는 결과라 할 수 있다.
6.수영 지구력 측정
마우스에서의 수영 지구력에 대한 본 발명의 스포츠 건강 음료가 미치는 효과를 측정하고, 이에 따른 항 피로 효과를 평가하였다.
도 10은 본 발명의 스포츠 건강 음료의 마우스 수영 지구력에 대한 효과를 보여주는 그래프로, 여기에서 각 막대는 5 마리 마우스 그룹의 mean±S.E.이다. 유의적으로 다르지 않은 평균치는 동일한 문자로 나타낸다(p<0.05). 도 10에서 보면, 본 발명의 스포츠 건강 음료를 1 일 1 회 7 일간 섭취(4, 8 및 16 g/kg)함으로써 대조군에 비해 각각 약 43%(p<0.05), 24% 및 71%(p<0.05)의 통계적으로 의미 있는 수영 지구력의 증가를 나타내었다. 특히 16 g 섭취군은 4 및 8 g 섭취군에 비해 각각 20% 및 38%(p<0.05) 정도의 수영 지구력 증가를 나타내었다. 이와 같이, 본 발명의 건강 음료를 섭취함으로써 수영 시간이 유의적으로 증가한 것은, 본 음료가 항 피로 효과를 발휘하여 실험동물의 수영 지구력을 증가시켜 나타난 결과로 사료된다.
이상의 실험 결과, 본 발명에 따른 스포츠 건강 음료의 자양·강장 및 지구력 증강에 미치는 효과는 다음과 같다:
(1) 본 발명 음료의 용량에 따른 RAW 264.7 대식세포의 세포증식 및 세포 독성 작용은 관찰되지 않았다.
(2) 본 발명 음료는 RAW 264.7 대식세포에서 농도 의존적으로 NO 생성을 증가시켰으며, LPS 자극에 의해 과다하게 생성된 NO 생성을 용량 의존적으로 억제시켰다.
(3) 본 발명 음료에 의한 NO 생성 조절에는 iNOS 유전자 발현의 조절이 관여하는 것으로 관찰되었다.
(4) 본 발명 음료는 마우스 대식세포에서 전염증성 사이토카인인 IL-1α, IL-1β 및 IL-6 mRNA 유전자 발현을 농도 의존적으로 유도하는 것으로 관찰되었다.
(5) 본 발명 음료는 비장세포의 증식능을 용량 의존적으로 증가시켰다.
(6) 본 발명 음료의 섭취에 의해 수영시 지구력 증가가 관찰되었다.
이상의 실험 결과로 볼 때 본 발명의 스포츠 건강 음료는 임파구세포의 증식과 대식세포에서 NO의 조절, iNOS 유전자 발현 및 사이토카인 발현의 조절을 통하여 자양·강장 효과의 증강에 기여할 것으로 생각되며, 이러한 세포적 조절은in vivo상에서 수영 시간의 연장 등과 같은 지구력의 유지 및 증진에 관여하게 되는 것으로 사료된다.
본 발명의 스포츠 건강 음료는 한방에서 간, 심, 비, 폐 및 신을 보하고 통기에 유효한 생약을 원료로 하여, 종래의 생약 추출 방법을 개선함으로써 생약 음료가 갖는 고미를 없애고 현대인의 기호에 맞도록 하였으며, 생약 추출물 배합 음료의 문제점인 침전 생성 원인을 근본적으로 없애서 마실 때 텁텁함이 전혀 없을 뿐 아니라 장기간 유통시에도 문제점이 없고, 특히 스포츠 음료에 필수적인 갈증 해소와 마실 때 상쾌함을 느낄 수 있다.
또한, 본 발명의 기능성 건강 음료는 임파구세포의 증식과 대식세포에서 NO의 조절, iNOS 유전자 발현 및 사이토카인 발현의 조절을 통하여 자양·강장 효과의 증강에 기여할 것으로 생각되며, 이러한 세포적 조절은 생체 내에서 수영 시간의 연장 등과 같은 지구력의 유지 및 증진 효과를 나타낼 수 있다.

Claims (7)

  1. 구기자 3 내지 5 중량부, 연자육 5 내지 7 중량부, 진피 2 내지 4 중량부, 더덕 3 내지 5 중량부, 토사자 7 내지 9 중량부, 및 사인 1 내지 3 중량부의 수추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 지구력 증진 효과를 갖는 기능성 건강 음료.
  2. 제 1 항에 있어서, 만삼 5 내지 7 중량부를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 건강 음료.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 오미자 1 내지 2 중량부를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 건강 음료.
  4. 구기자 3 내지 5 중량부, 연자육 5 내지 7 중량부, 진피 2 내지 4 중량부, 더덕 3 내지 5 중량부, 토사자 7 내지 9 중량부, 및 사인 1 내지 3 중량부의 마쇄한 생약재료를 혼합한 후, 상기 생약재료의 약 5 내지 15 배량의 정제수를 넣어 2 내지 4 시간 열수 추출하고 여과한 여액(여액 1)과, 그 잔사에 다시 동량의 정제수를 넣어 2 내지 4 시간 열수 추출하여 여과한 여액(여액 2)을 혼합하여 1 내지 3 배량의 정제수에 현탁시키고, 고압 멸균한 셀라이트 여과층으로 다시 여과시키는 것을 특징으로 하는 기능성 건강 음료의 제조방법.
  5. 구기자 3 내지 5 중량부, 연자육 5 내지 7 중량부, 진피 2 내지 4 중량부, 더덕 3 내지 5 중량부, 토사자 7 내지 9 중량부, 및 사인 1 내지 3 중량부의 마쇄한 생약재료 각각에 약 5 내지 15 배량의 정제수를 넣어 2 내지 4 시간에 걸쳐 2 회 열수 추출하고, 각각의 여액을 혼합하여 1 내지 3 배량의 정제수에 현탁시키고, 고압 멸균한 셀라이트 여과층으로 다시 여과시키는 것을 특징으로 하는 기능성 건강 음료의 제조방법.
  6. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 생약재료에 만삼 5 내지 7 중량부를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 생약재료에 오미자 1 내지 2 중량부를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
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