KR100461709B1 - 5'-보호된 2'-데옥시푸린 뉴클레오사이드 정제 방법 - Google Patents

5'-보호된 2'-데옥시푸린 뉴클레오사이드 정제 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 종래 효과적인 생산이 어려웠던 5'-보호된 2'-데옥시푸린 뉴클레오사이드를 효과적으로 정제하는 방법에 관한 것이다. 5'-보호된 2'-데옥시푸린 뉴클레오사이드를 고순도로 정제하기 위해 니트릴 구조를 갖는 것과 같은 용매를 포함하는 내포 결정으로서 5'-보호된 2'-데옥시푸린 뉴클레오사이드를 수득함으로써 불순물을 분리할 수 있다. 본 발명은 종래 컬럼 크로마토그래피 방법으로 수행되어 왔던 고도로 정제된 보호된 데옥시푸린 뉴클레오사이드 합성을 대규모로 용이하게 할 수 있게 한다.

Description

5'-보호된 2'-데옥시푸린 뉴클레오사이드 정제 방법{Method for Purifying 5'-Protected 2'-Deoxypurine Nucleosides}
본 발명은 5'-보호된 2'-데옥시푸린 뉴클레오사이드 및 그의 유도체의 정제 방법 뿐만 아니라 상기 방법에 의해 수득된 그의 용매-내포 화합물에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 5'-보호된 2'-데옥시푸린 뉴클레오사이드의 제조에 유용한 이의 정제 방법 뿐만 아니라 이 정제 방법에 의해 수득된 5'-보호된 2'-데옥시푸린 뉴클레오사이드의 용매 내포 화합물에 관한 것이다.
5'-보호된 2'-데옥시-β-푸린 뉴클레오사이드는 최근 개발되고 있는 안티센스 DNA 등의 원료 물질로서 유용한 화합물이다.
최근, 게놈 약물 제조가 발전하면서 안티센스 DNA 약물 등이 급속히 개발되고 있다. 따라서, 원료 물질로 사용되는 DNA 올리고머 및 추가로 올리고머의 원료 물질로 사용되는 보호된 데옥시 뉴클레오사이드의 요구가 증대되고 있다. 제약학적 용도에 있어서, 매우 고순도의 중간 생성물을 사용하여 불순물에 의해 형성되는 부생성물의 생성을 최소화하는 것이 필요하다.
일본 특허 공개 공보 제58-180500호 및 제63-179889호, 국제 특허 출원의 일본 공보 제6-507883호 등에서 명백한 바와 같이, 5'-보호된 2'-데옥시푸린 뉴클레오사이드는 지금까지 컬럼 크로마토그래프 방법에 의해 정제되어 왔다. 이 방법에 의해, 극성 또는 구조가 크게 상이한 불순물들의 분리는 비교적 용이하게 수행될 수 있지만, 유사한 구조를 갖는 불순물들의 제거는 어렵다. 특히, 많은 경우에 특히 문제의 불순물인 3'-치환된 이성질체를 제거하는 것이 어렵다. 또한, 이 방법은 대규모의 정제 장치를 필요로 하므로, 미래의 대량 생산 및 대량 공급의 관점에서 이 방법은 큰 문제가 있다고 할 수 있다.
현재까지, 컬럼 크로마토그래프를 사용하지 않는 불순물의 제거에 관한 연구가 이루어져 왔다. 구체적으로, 재침전 방법에 의한 정제는 일본 특허 공개 공보 제60-152495호 및 PCT 출원 WO200075154호에 개시되어 있다. 재침전 방법은 조 화합물을 가용성 용매중에 용해시킨 후, 불용성 용매를 첨가하거나 또는 불용성 용매중에 떨어뜨려 화합물을 강제적으로 재침전시키는 방법이다. 결과적으로, 그의 정제력은 기본적으로 낮다. 또한, 가용성 용매 및 불용성 용매 사이의 양비를 적절히 조절하는 것은 산업적으로 어렵다. 또한, 이러한 용매의 양비를 부적절하게 설정한 경우에, 용이하게 오일화되거나 또는 점성 침전물을 생성하여 정제가 실패하기 쉽다. 실제로, 일본 특허 공개 공보 제60-152495호에 기재된 방법에 따르면, 어느 경우에, 정제된 생성물은 점성의 시럽과 같은 물질로서 수득되며, 산업적 관점에서, 이는 문제이다. 재침전에 의해 무정형을 형성하는 일부 방법이 현재까지 개시되었지만, 결정화 또는 재결정에 의해 결정을 수득하는 방법은 알려지지 않았다.
본 발명은 종래 문제점들을 고려하여 완성되었으며, 본 발명의 목적은 매우 고도로 정제된 5'-보호된 2'-데옥시푸린 뉴클레오사이드를 수득할 수 있는 효율적이고 특별한 설비가 필요없는 정제 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 위한 본 발명의 발명자들에 의한 집중적 연구의 결과로서, 아세토니트릴과 같은 니트릴 용매를 사용하여 5'-보호된 2'-데옥시푸린 뉴클레오사이드를 용매를 포함하는 결정으로서 수득한 후, 이를 결정화 또는 재결정화를 이용한 정제 방법에 의해 정제할 수 있다는 것을 발견하였으며, 이로써 본 발명이 완성되었다.
따라서, 본 발명은 하기 실시양태를 포함한다:
(1) 내포용 용매를 포함하는 액체 매질 중에서 하기 화학식 1의 화합물을 용매를 포함하는 내포 결정의 형태로 수득하는 단계, 및 액체 매질로부터 내포 결정을 회수하는 단계를 포함하는, 5'-보호된 2'-데옥시푸린 뉴클레오사이드 정제 방법.
식 중, R1은 4-메톡시트리틸기, 4,4'-디메톡시트리틸기 또는 트리페닐메틸기이고, B는 아미노기가 보호된 푸린기이다.
(2) 상기 (1)에 있어서, 내포용 용매가 저급 알킬기 또는 아릴기로 치환된 니트릴 화합물인 5'-보호된 2'-데옥시푸린 뉴클레오사이드 정제 방법.
(3) 상기 (2)에 있어서, 내포용 용매가 아세토니트릴인 5'-보호된 2'-데옥시푸린 뉴클레오사이드 정제 방법.
(4) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, 화학식 1의 화합물 및 하기 화학식 2의 화합물을 포함하는 조 제조물을 액체 매질 중에 용해시키고, 화학식 2의 화합물을 액체 매질중으로 제거하여 액체 매질로부터 화학식 1의 화합물을 내포 결정의 형태로 회수하는, 5'-보호된 2'-데옥시푸린 뉴클레오사이드 정제 방법.
식 중, R2는 수소 원자, 4-메톡시트리틸기, 4,4'-디메톡시트리틸기 또는 트리페닐메틸기이고, R1및 B는 상기된 바와 동일한 의미이다.
(5) 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서, 화학식 1의 화합물이 하기 화학식 3의 화합물 또는 하기 화학식 4의 화합물인 5'-보호된 2'-데옥시푸린 뉴클레오사이드 정제 방법.
(6) 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 있어서, 내포용 용매를 포함하는 화학식 1의 화합물의 내포 결정을 내포용 용매를 포함하는 액체 매질로부터 재결정화하는, 5'-보호된 2'-데옥시푸린 뉴클레오사이드 정제 방법.
(7) 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 있어서, 액체 매질이 단일 내포용 용매로 이루어지는, 5'-보호된 2'-데옥시푸린 뉴클레오사이드 정제 방법.
(8) 하기 화학식 5의 내포 화합물.
식 중, R1 및 B는 상기 기재된 바와 동일한 의미이며, m 및 n은 독립적으로 정수이며, R3은 저급 알킬기 또는 아릴기이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
화학식 1의 화합물의 B를 형성하는 푸린기는 천연 또는 비천연 뉴클레오사이드의 핵산 푸린 염기이다. 구체적인 예로는 아데닌 및 구아닌을 들 수 있다.
푸린기의 아미노기에 대한 보호기의 예로는 알킬기, 알킬아실기 및 벤조일기를 들 수 있다.
알킬기는 직쇄 또는 분지쇄일 수 있거나, 또는 보호기로서의 기능을 유지할 수 있는 한 다른 관능기가 이에 첨가될 수 있다. 알킬기의 예로는 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 2-프로필기, n-부틸기, 이소-부틸기 등을 들 수 있다.
알킬아실기는 직쇄 또는 분지쇄일 수 있거나, 또는 고리를 형성할 수 있거나, 또는 보호기로서의 기능을 유지할 수 있는 한 다른 관능기가 그에 첨가될 수 있다. 알킬아실기의 예로는 아세틸기, 프로피오닐기, n-부티릴기, 이소-부티릴기, 피발로일기, n-펜틸로일기, 이소-펜틸로일기, 시클로프로필카르보닐기, 페녹시아세틸기 등을 들 수 있다.
벤조일기는 비치환되거나 또는 보호기로서의 기능을 유지할 수 있는 한 치환될 수 있다. 치환체는 페닐기의 2, 3 및 4 위치 중 임의의 하나에 있을 수 있다. 또한, 치환체는 다수의 위치에 있을 수 있다. 치환체의 예로는 메틸기, 에틸기, 2-프로필기, n-부틸기 또는 tert-부틸기와 같은 알킬기, 히드록실기, 메톡시기, 에톡시기, n-프로필옥시기, 2-프로필옥시기 또는 n-부틸옥시기와 같은 알킬옥시기, 니트로기, 플루오로기, 클로로기, 브로모기 또는 요오드기와 같은 할로겐기, 아미노기, 메틸아미노기, 에틸아미노기, n-프로필아미노기, 디메틸아미노기, 디에틸아미노기 또는 디이소프로필아미노기와 같은 알킬아미노기, 아세틸기, 프로피오닐기 또는 벤조일기와 같은 아실기, 페닐기, 피리디닐기 등을 들 수 있다.
벤조일기의 구체적인 예로는 벤조일기, 2-클로로벤조일기, 3-클로로벤조일기, 4-클로로벤조일기, 2-브로모벤조일기, 3-브로모벤조일기, 4-브로모벤조일기, 2-플루오로벤조일기, 3-플루오로벤조일기, 4-플루오로벤조일기, 2-메톡시벤조일기, 3-메톡시벤조일기, 4-메톡시벤조일기, 2-니트로벤조일기, 3-니트로벤조일기, 4-니트로벤조일기, 2-아미노벤조일기, 3-아미노벤조일기, 4-아미노벤조일기, 2-메틸아미노벤조일기, 3-메틸아미노벤조일기, 4-메틸아미노벤조일기, 2-디메틸아미노벤조일기, 3-디메틸아미노벤조일기, 4-디메틸아미노벤조일기, 4-페닐벤조일기, 4-아세틸벤조일기 등을 들 수 있다.
내포 결정의 형성을 위한 용매로서 저급 알킬기 또는 아릴기를 갖는 니트릴 화합물의 바람직한 예는 화학식 R3-CN (식 중, R3은 저급 알킬기 또는 아릴기임)으로 표시되는 것들이다. 알킬기의 예로는 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 2-프로필기, n-부틸기 및 이소-부틸기를 들 수 있다. 아릴기의 예로는 페닐기, 4-메틸페닐기, 4-메톡시페닐기를 들 수 있다.
저급 알킬기 또는 아릴기를 갖는 니트릴 화합물의 예로는 아세토니트릴, 프로피오니트릴, n-부티로니트릴, 이소-부티로니트릴, n-펜탄니트릴, n-헥산니트릴, 벤조니트릴 등을 들 수 있다. 이러한 니트릴 화합물이 1 종 이상 사용될 수 있다.
화학식 5의 화합물의 m 및 n에 있어서, m은 바람직하게는 1 내지 5에서 선택된 정수일 수 있으며, n은 바람직하게는 1 내지 5에서 선택된 정수일 수 있다.
내포 결정의 형성을 위한 액체 매질은 결정에 포함될 용매만을 포함하거나 또는 내포용 용매와 내포 결정을 형성하지 않는 다른 용매(들)의 혼합물을 혼합 가능한 비율로 포함할 수 있다. 내포용 용매와 혼합가능한 다른 용매의 예로는 메탄올, 에탄올 및 이소프로판올과 같은 알콜, 에틸 아세테이트 및 부틸 아세테이트와 같은 에스테르, 아세톤, 메틸에틸케톤 및 메틸이소부틸케톤과 같은 케톤, 디에틸 에테르, 디이소프로필 에테르, 디옥산 및 테트라히드로푸란(THF)과 같은 에테르, 벤젠, 톨루엔, 쿠멘, 크실렌, 메시틸렌, 디이소프로필벤젠 및 트리이소프로필벤젠과 같은 방향족 탄화수소, 디클로메탄, 클로로포름 및 디클로로에탄과 같은 할로겐화 탄화수소, 피리딘, 루티딘 및 퀴놀린과 같은 피리딘, 트리에틸아민 및 트리부틸아민과 같은 3차 아민, 디메틸포름아미드(DMF), 디메틸 이미다졸리디논(DMI) 및 디메틸 술폭시드(DMSO)와 같은 극성 용매, 물 등을 들 수 있다. 1 종 이상의 이러한 용매가 다른 용매로 사용될 수 있다. 상기 열거된 다른 용매(들)의 혼합비는 내포용 용매에 대하여 100 중량% 이하, 바람직하게는 20 중량% 이하, 더욱 바람직하게는 10 중량% 이하이다.
본 명세서에서 용매를 포함하는 "내포 결정"이란 용어는, 용매가 결정 격자내에 갇히는 형태로 결정이 형성되거나, 또는 결정과 용매 사이의 약한 상호작용에 의해 착물이 형성되는 것과 같이 용매가 결정 구조를 형성하는 데 보조 역할을 하는 것을 의미한다. 내포 형태 및 결정 구조는 특별히 제한되지는 않는다.
결정화 및 재결정화시 니트릴 용매의 양은 정제되는 화합물의 용액에 대한 포화 용해도 미만인 한 특별히 제한되지는 않지만, 용매의 양이 화학식 1의 화합물 중량의 5 배 이상 내지 150 배 이하가 바람직하며, 화학식 1의 화합물 중량의 8 배 이상 내지 50 배 이하가 더욱 바람직하다.
결정화 및 재결정화를 위한 온도는 특별히 제한되지는 않지만, -10 ℃ 내지 용매 또는 액체 매질의 비점 범위의 온도가 바람직하다. 일반적으로, 1 회의 재결정화에 의해 충분히 정제될 수 있지만, 재결정화를 반복적으로 수행함으로써 보다 높은 순도의 정제가 실현될 수도 있다. 재결정화에 바람직한 액체 매질은 내포용 용매만으로 이루어지는 것이며, 결정화 및 재결정화 모두에 동일한 단일 내포용 용매를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 기술한 바와 같이, 본 발명에 따르면, 5'-보호된 2'-데옥시푸린 뉴클레오사이드를 효과적으로 정제하는 것이 가능해 진다.
<실시예>
이하, 본 발명은 하기 실시예로 구체적으로 설명될 것이다. 실시예는 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다.
<실시예 1: N2-이소부티릴-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-데옥시구아노신 및 아세토니트릴 (2:1) 착물의 제조>
N2-이소부티릴-2-데옥시구아노신 110 g (95 함량％)를 피리딘과 함께 공비 탈수시킨 다음, 피리딘 2.4 ℓ에 용해시켰다. 실온에서 4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드 118.3 g을 첨가한 후, 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 염산을 중탄산나트륨으로 중화시키고, 반응 용액을 약 400 g으로 농축시켰다. 거기에 에틸 아세테이트 1.5 ℓ 및 물 1.5 ℓ를 첨가한 후, 혼합된 용액을 분리한 다음, 원료 물질로서 N2-이소부티릴-2-데옥시구아노신이 유기층에서 발견될 때까지 물로 반복 세척하였다. 20％ 염화나트륨 용액 1 kg으로 세척한 후, 황산나트륨으로 건조시켰다. 여과한 후, 용매를 제거하고, 에틸 아세테이트를 첨가하여 총량이 700 g이 되었다.
이 용액을 강력 교반하면서 디이소프로필 에테르 3,200 g에 적가하고, 얻은 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 여과하여 얻은 고체를 50℃에서 진공 건조하고, 일정한 중량이 얻어진 것을 확인한 후, 실온에서 아세토니트릴 4.4 ℓ에 용해시켰다. 실온에서 4시간 동안 교반한 후, 석출된 고체를 여과하였다. 얻은 생성물을 실온에서 4시간 동안 진공 건조한 다음, NMR 분석하였다. 이 분석을 통해, 얻은 생성물이 정제되는 표적 화합물 1분자 당 아세토니트릴 2분자를 포함함을 확인하였다. 40℃에서 12시간 동안 진공 건조한 경우에는, NMR 분석 결과, 얻은 생성물이 정제되는 표적 화합물 1분자 당 아세토니트릴 1 분자를 포함함을 확인하였다.
50℃에서 15시간 동안 진공 건조한 경우에는, NMR 분석 결과, 얻은 생성물이정제되는 표적 화합물 1분자 당 아세토니트릴 0.67 분자를 포함함을 확인하였다. 또한, 55℃에서 일정한 중량이 얻어질 때까지 (24시간 동안) 진공 건조한 경우에는, NMR 분석 결과, 얻은 생성물이 정제되는 표적 화합물 1분자 당 아세토니트릴 0.5 분자를 포함함을 확인하였다. X-선 회절 (XRD)을 통해, 얻은 생성물이 상기 어떠한 건조 조건에서도 결정형임을 확인하였다. 또한, TG-DTA 분석을 통해, 일정한 중량이 얻어질 때까지 건조시켜 얻은, 정제되는 표적 화합물 1분자 당 아세토니트릴 0.5 분자 포함 결정의 경우에는, 온도를 흡열 반응을 위한 온도 (81℃ 내지 93℃)로 상승시킬 때까지 결정의 중량이 감소되지 않았고, 결정에는 용매가 부착되어 있지 않았다. 수득량은 168 g (수율 84.8％)이었다. HPLC (UV 254 nm) 분석 결과, 순도는 99.7 면적％였다. 최다량의 불순물은 N2-이소부티릴-3',5'-O-비스(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-데옥시구아노신 (0.17 면적％)였다.
1R(KBr) cm-1: 3398, 3238, 2935, 2838, 1679, 1609, 1561, 1509, 1252, 1178, 1034, 830 (니트릴로부터 유도된 아세토니트릴의 흡수는 약하였으며 관찰되지 않았음)
<실시예 2: N6-벤조일-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-데옥시아데노신의 제조>
N6-벤조일데옥시아데노신 45.0 g (0.127 mol)을 피리딘 500 ml에 용해시킨 후 공비 탈수시키고, 얻은 생성물을 피리딘 500 ml에 용해시켰다. 교반하면서 4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드 42.9 g (0.127 mol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 2.5시간 더 교반하였다. 중탄산나트륨 12.8 g을 첨가한 후, 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하고, 용매를 감압하에 제거하였다. 잔류물에 메틸이소부틸케톤 830 ml을 첨가하고, 교반하면서 물 830 ml을 첨가한 후, 10분 더 교반하였다. 이어서, 유기층을 수집하고, 염수 포화 용액으로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시킨 후, 용매를 감압하에 제거하였다. 잔류물을 강력 교반하면서 디이소프로필 에테르 800 ml에 적가하고, 생성된 침전물을 여과하여 수집하였다.
침전물을 아세토니트릴 750 ml로부터 재결정화하고, 결정 생성물을 여과하여 수집하였다. NMR 분석 결과, 생성물은 정제되는 표적 화합물 1분자 당 아세토니트릴 1 분자를 포함하였다. 결정 생성물을 진공 건조한 경우에는 아세토니트릴이 없었다. 중량은 66.7 g이었다. 얻은 생성물에 대해 UV 검출기 (254 nm)를 이용한 고성능 액체 크로마토그래피 [ODS: 옥타데실 실리카 겔 컬럼, 아세토니트릴/물 (8:2)]로 분석한 결과, 순도가 99.5％였다. N6-벤조일-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-데옥시아데노신의 수율은 79.4％였다. 최다량의 불순물은 N6-벤조일-3',5'-O-비스(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-데옥시아데노신 (0.15 면적％)이었다.
<참고예 1: N2-이소부티릴-3',5'-O-비스(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-데옥시구아노신의 제조>
실시예 1에서 재결정화하여 얻은 여액을 농축시킨 후, 농축 잔류물을 컬럼크로마토그래피 (에틸 아세테이트/헥산)으로 정제하였다. 정제된 분획을 농축하여 황색 오일 생성물을 수득하였다. 다음, 황색 오일 생성물을 디이소프로필 에테르에 적가하고, 형성된 침전물을 여과하여 회수하고 건조시킴으로써, 표제 화합물을 밝은 황색 분말로서 수득하였다.
<참고예 2: N2-이소부티릴-5'-O-(tert-부틸디메틸실릴)-2'-데옥시구아노신의 제조>
N2-이소부티릴-2'-데옥시구아노신 (20.5 g)을 DMF 200 ml에 용해시켰다. 이미다졸 18.5 g을 첨가하여 생성된 용액에 용해시킨 후, tert-부틸디메틸실릴 클로라이드 21.4 g을 첨가하였다. DMF (100 ml)을 더 첨가하고, 용액을 실온에서 교반하였다. 8시간 후, 클로로포름을 이용하여 추출하고, 유기층을 염화나트륨 포화 수용액으로 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 추출물을 농축시킨 후, 표적 화합물을 컬럼 크로마토그래피 (메탄올/클로로포름)로 분리하였다. 표적 화합물을 포함하는 분획 용액을 제조하고 농축하여, 표제 화합물 20.5 g을 수득하였다 (수율 74％).
<참고예 3: N2-이소부티릴-5'-O-(tert-부틸디메틸실릴)-3'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-데옥시구아노신>
N2-이소부티릴-5'-O-(tert-부틸디메틸실릴)-2'-데옥시구아노신 (19.8 g)을 무수 피리딘 100 ml에 용해시켰다. 4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드 (1.66 g)을 생성된 용액에 첨가하고, 무수 피리딘 140 ml을 더 첨가한 후, 40℃에서 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 탄산수소나트륨으로 중화시키고, 피리딘을 증류제거하였다. 클로로포름을 이용하여 추출하고, 추출물을 염화나트륨 포화 수용액으로 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 추출물을 농축시키고, 컬럼 크로마토그래피 (에틸 아세테이트/헥산)으로 정제하여 표제 화합물 25.8 g을 수득하였다 (수율: 78％).
<참고예 4: N2-이소부티릴-3'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-데옥시구아노신의 제조>
N2-이소부티릴-5'-O-(tert-부틸디메틸실릴)-3'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-데옥시구아노신 (25 g)을 건조 THF 200 ml에 용해시켰다. 테트라부틸암모늄 플루오라이드의 THF 용액 (40 ml)을 생성된 용액에 첨가하고, 건조 THF 100 ml을 더 첨가한 후, 실온에서 교반하였다. 8시간 후, 클로로포름을 이용하여 추출하고, 추출물을 염화나트륨 포화 용액으로 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 다음, 추출물을 농축시키고, 컬럼 크로마토그래피 (에틸 아세테이트/헥산/메탄올)로정제하여, 표제 화합물 12.9 g을 백색 분말로서 수득하였다 (수율 60％).
<비교예 1>
3'-치환 이성질체 [N2-이소부티릴-3'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-데옥시구아노신] 또는 3',5'-다치환 형태 [N2-이소부티릴-3',5'-O-비스(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-데옥시구아노신]과 같은 불순물을 제거하는 능력과 관련하여, 아세토니트릴 용매를 이용한 재결정화와 관련된 방법과, 가용성 용매로서 디클로로메탄을 불용성 용매로서 헥산 또는 톨루엔을 이용한 재첨전과 관련된 정제 방법을 비교하였다. 또한, 목적 생성물 [N2-이소부티릴-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-데옥시구아노신]의 수율을 두 방법에서 비교하고, 얻은 결정에 대해 열 분석 (DSC: 흡열 피크, 흡열 에너지)하였다. 얻은 결과를 표 1에 나타내었고, 표에서는 조 결정 제조물 및 각 용매를 이용하여 재결정화시킨 후의 결정 중에서 3' 이성질체 및 다치환 화합물의 함량을 나타냈다.
정제 용매
조 결정 아세토니트릴 디클로메탄/헥산 디클로로메탄/톨루엔
3'-이성질체 4.9％ 0.08％ 3.06％ 0.76％
다치환 형태 2.76％ 0％ 2.27％ 0.36％
수율 95％ 83％ 76％
흡열 피크 81℃ 명백한 흡열 피크는 나타나지 않음
흡열 에너지 28 J/g
％는 중량을 기준으로 함
DSC 결과로부터 명백한 바와 같이, 화합물들의 흡열 피크가 상이하기 때문에 화합물들의 결정 유형 또한 상이함이 밝혀졌다. 큰 흡열 에너지와 관련하여 아세토니트릴 단독으로부터 얻은 생성물이 결정형으로 형성되었다는 것 또한 밝혀졌다.
<참고예 5: N6-벤조일-3',5'-O-비스(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-데옥시아데노신의 제조>
실시예 2에서 재결정화시켜 얻은 여액을 농축시킨 후, 농축 잔류물을 컬럼 크로마토그래피 (에틸 아세테이트/헥산)으로 정제하였다. 정제된 분획을 농축하여 황색 오일 생성물을 수득하였다. 다음, 황색 오일 생성물을 디이소프로필 에테르에 적가하고, 형성된 침전물을 여과하여 회수하고 건조시켜, 표제 화합물을 밝은 황색 분말로서 수득하였다.
<참고예 6: N6-벤조일-5'-O-(tert-부틸디메틸실릴)-2'-데옥시아데노신의 제조>
N6-벤조일-2'-데옥시아데노신 (20.95 g)을 DMF 200 ml에 용해시켰다. 이미다졸 (15.7 g)을 첨가하여 생성된 용액에 용해시켰다. 다음, tert-부틸디메틸실릴 클로라이드 20.8 g을 첨가하였다. DMF (100 ml)을 더 첨가하고, 용액을 실온에서 교반하였다. 8시간 후, 클로로포름을 이용하여 추출하고, 유기층을 염화나트륨 포화 수용액으로 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 추출물을 농축시키고, 표적 화합물을 컬럼 크로마토그래피 (메탄올/클로로포름)으로 정제하여, 표제화합물 16.1 g을 수득하였다 (수율 61％).
<참고예 7: N6-벤조일-5'-O-(tert-부틸디메틸실릴)-3'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-데옥시아데노신의 제조>
N6-벤조일-5'-O-(tert-부틸디메틸실릴)-2'-데옥시아데노신 (16.1 g)을 무수 피리딘 100 ml에 용해시켰다. 4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드 (12.8 g) 및 무수 피리딘 (140 ml)을 더 첨가한 후, 45℃에서 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 탄산수소나트륨으로 중화시키고, 피리딘을 증류제거하였다. 클로로포름을 이용하여 추출하고, 추출물을 염화나트륨 포화 수용액으로 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 추출물을 농축시킨 다음, 컬럼 크로마토그래피 (에틸 아세테이트/헥산)으로 정제하여, 표제 화합물 16.7 g을 수득하였다 (수율 63％).
<참고예 8: N6-벤조일-3'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-데옥시아데노신의 제조>
N6-벤조일-5'-O-(tert-부틸디메틸실릴)-3'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-데옥시아데노신 (16.2 g)을 건조 THF 200 ml에 용해시켰다. 테트라부틸암모늄 플루오라이드의 THF 용액 (31 ml)을 생성된 용액에 첨가하고, 건조 THF 100 ml을 더 첨가한 후, 실온에서 교반하였다. 8시간 후, THF를 증류제거하고, 클로로포름을 이용하여 추출하였다. 다음, 추출물을 염화나트륨 포화 용액으로 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 다음, 추출물을 농축하고, 컬럼 크로마토그래피 (에틸 아세테이트/헥산/메탄올)로 정제하여, 표제 화합물 13.8 g을 백색 분말로서 수득하였다 (수율 98％).
<비교예 2>
3'-치환 이성질체 [N6-벤조일-3'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-데옥시아데노신] 또는 3',5'-다치환 형태 [N6-벤조일-3',5'-O-비스(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-데옥시아데노신]과 같은 불순물을 제거하는 능력과 관련하여, 아세토니트릴 용매를 이용한 재결정화와 관련된 방법과, 가용성 용매로서 디클로로메탄을 불용성 용매로서 t-부틸메틸 에테르와 톨루엔 (1:2)을 이용한 재첨전과 관련된 정제 방법을 비교하였다. 또한, 목적 생성물 [N6-벤조일-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-데옥시아데노신]의 수율을 두 방법에서 비교하고, 얻은 결정에 대해 열 분석 (DSC: 흡열 피크, 흡열 에너지)하였다.
얻은 결과를 표 2에 나타내었고, 표에서는 조 결정 제조물 및 각 용매를 이용하여 재결정화시킨 후의 결정 중에서 3' 이성질체 및 다치환 화합물의 함량을 나타냈다.
정제 용매
조 결정 아세토니트릴 디클로메탄/t-부틸메틸 에테르-헥산(1:2)
3'-이성질체 1.84％ 0.06％ 2.24％
다치환 형태 4.03％ 0％ 1.43％
수율 87％ 96％
흡열 피크 114℃ 125℃
흡열 에너지 34 J/g
％는 중량을 기준으로 함
DSC 결과로부터 명백한 바와 같이, 화합물들의 흡열 피크가 상이하기 때문에 화합물들의 결정 유형 또한 상이함이 밝혀졌다. 큰 흡열 에너지와 관련하여 아세토니트릴 단독으로부터 얻은 생성물이 결정형으로 형성되었다는 것 또한 밝혀졌다.
각 화합물에 대한 HPLC 조건은 다음과 같다:
(1) 비교예 1 및 2에서의 HPLC 조건 (다치환 형태의 양을 분석):
컬럼: 데벨로실 (Develosil) TMS-UG-5, 150 mm ×φ4.6
유속: 1.0 ml/분
컬럼 온도: 40℃
검출 파장: 254 nm
이동상: 구배 조건
시간 (분) 액체 B (％)
0 20
15 70
35 100
40 100
45 20
60 정지
[액체 A]
100 mM 트리에틸아민-아세트산 (pH 7) 100 ml/물 880 ml/아세토니트릴 20 ml
[액체 B]
100 mM 트리에틸아민-아세트산 (pH 7) 100 ml/아세토니트릴 900 ml
(2) 비교예 1 및 2에서의 HPLC 조건 (3'-이성질체의 양을 분석):
컬럼: 데벨로실 TMS-UG-5, 150 mm ×φ4.6
이동상: 아세토니트릴-물 (55:45)
유속: 1.0 ml/분
컬럼 온도: 40℃
검출 파장: 254 nm
열 분석 조건:
장치: DSC-7 (퍼킨엘머 (PerkinElmer))
온도 상승률: 10℃/분
XRD 조건:
장치: RAD-RVC (RIGAKU)
X-선 표적: Cu 50 kV 200 mA
본 발명에 따라, 대량 생산 가능한 방법으로 고도로 정제된 보호된 2'-데옥시푸린 뉴클레오시드를 종래 방법에 비해 보다 효과적으로 제조할 수 있다.

Claims (8)

  1. (a) 하기 화학식 1의 화합물 및 용매를 포함하는 내포 결정(inclusion crystal)을 형성하기 위한 용매를 포함하는 액체 매질 중의 화학식 1의 화합물의 용액을 제조하는 단계:
    <화학식 1>
    [식 중, R1은 4-메톡시트리틸기, 4,4'-디메톡시트리틸기 또는 트리페닐메틸기이고, B는 아미노기가 보호된 푸린기임];
    (b) 상기 용액만을 처리하여 상기 용액 중에서 화학식 1의 화합물 및 용매를 포함하는 내포 결정을 형성하는 단계; 및
    (c) 상기 용액의 액체 매질로부터 상기 내포 결정을 회수하는 단계
    를 포함하는 5'-보호된 2'-데옥시푸린 뉴클레오사이드 정제 방법.
  2. 제1항에 있어서, 내포용 용매가 C1-6알킬기 또는 아릴기로 치환된 니트릴 화합물인 5'-보호된 2'-데옥시푸린 뉴클레오사이드 정제 방법.
  3. 제2항에 있어서, 내포용 용매가 아세토니트릴인 5'-보호된 2'-데옥시푸린 뉴클레오사이드 정제 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 1의 화합물 및 하기 화학식 2의 화합물을 포함하는 조 제조물을 액체 매질 중에 용해시키고, 화학식 2의 화합물을 액체 매질중으로 제거하여 액체 매질로부터 화학식 1의 화합물을 내포 결정의 형태로 회수하는, 5'-보호된 2'-데옥시푸린 뉴클레오사이드 정제 방법.
    <화학식 2>
    식 중, R2는 수소 원자, 4-메톡시트리틸기, 4,4'-디메톡시트리틸기 또는 트리페닐메틸기이고, R1및 B는 상기된 바와 동일한 의미이다.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 1의 화합물이 하기 화학식 3의 화합물 또는 하기 화학식 4의 화합물인 5'-보호된 2'-데옥시푸린 뉴클레오사이드 정제 방법.
    <화학식 3>
    <화학식 4>
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 내포용 용매를 포함하는 화학식 1의 화합물의 내포 결정을 내포용 용매를 포함하는 액체 매질로부터 재결정화하는, 5'-보호된 2'-데옥시푸린 뉴클레오사이드 정제 방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 액체 매질이 단일 내포용 용매로 이루어지는, 5'-보호된 2'-데옥시푸린 뉴클레오사이드 정제 방법.
  8. 하기 화학식 5의 내포 화합물:
    <화학식 5>
    식 중, R1 및 B는 상기 기재된 바와 동일한 의미이며, m 및 n은 독립적으로 정수이며, R3은 C1-6알킬기 또는 아릴기이다.
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