CN102288692A

CN102288692A - 一种用高效液相色谱仪检测n6-苯甲酰基-5′-o-(4，4′-二甲氧基三苯基)-2′-脱氧腺苷的方法

Info

Publication number: CN102288692A
Application number: CN2011101627026A
Authority: CN
Inventors: 戴煦; 杨果; 李波; 朱平; 郭冰
Original assignee: Shenzhen Centre Testing Technology Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Centre Testing Technology Co Ltd
Priority date: 2011-06-16
Filing date: 2011-06-16
Publication date: 2011-12-21

Abstract

本发明涉及一种N6-苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯基)-2′-脱氧腺苷的检测方法，包括以下步骤：称取适量样品，选择合适的溶剂，使用索氏提取法进行前处理；用连接二极管阵列检测器的高效液相色谱仪对N6-苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯基)-2′-脱氧腺苷进行检测，检测波长为280nm，该仪器有机流动相的比例设定为60％，无机流动相的比例设定40％，流速设定为1ml/min，进样量设定为10μL，色谱柱选择C18反相色谱柱；将经过前处理的样品由所述高效液相色谱仪的流动相带入所述色谱柱中，将柱温箱的温度设定为20℃，样品的各组分被色谱柱分离；被色谱柱分离的样品各组分进入二极管阵列检测器进行检测。采用本发明所述检测方法准确度高，简便易行。

Description

一种用高效液相色谱仪检测N6-苯甲酰基-5′-O-(4,4′-二甲氧基三苯基)-2′-脱氧腺苷的方法

【技术领域】

本发明涉及一种N6-苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯基)-2′-脱氧腺苷的检测方法，特别是涉及一种用连接二极管阵列检测器的高效液相色谱技术检测N6-苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯基)-2′-脱氧腺苷的方法。

【背景技术】

N6-苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯基)-2′-脱氧腺苷是脱氧核苷的衍生物，在反义药物的合成步骤中是一个关键单体。目前反义药物已成为化学药的重要组成部分，每年世界各国需要大量的原料药和药物中间体用于化学药的合成。

研究发现，N6-苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯基)-2′-脱氧腺苷会刺激眼睛、皮肤、呼吸道和消化道，与其接触会造成眼睛和皮肤疼痛，加热时其分解会产生一氧化碳、二氧化碳、刺激性和毒性气体。由于其对生态环境会产生持久性和生物累积性的毒害，因此在2009年8月19日出版的《加拿大政府公报》中被作为增补条例列入《加拿大环境保护法1999》，即CEPA 1999。此外，在欧盟和美国，N6-苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯基)-2′-脱氧腺苷也被列入了管控目录，因此需要对产品中的N6-苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯基)-2′-脱氧腺苷进行定性和定量检测，使之符合法规要求。然而，我国目前尚没有N6-苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯基)-2′-脱氧腺苷的标准检测方法，文献中也未见对其检测方法的报导，在我国建立快速、准确、灵敏度高的N6-苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯基)-2′-脱氧腺苷的检测方法势在必行。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提出一种用常规的连接二极管阵列检测器的用高效液相色谱技术可准确定性定量产品中的N6-苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯基)-2′-脱氧腺苷的检测方法。

本发明解决所述技术问题可以通过采用以下技术方案来实现：

包括以下步骤：

①「称取适量样品，选择合适的溶剂，使用索氏提取法对样品进行萃取处理；

②「使用过滤法对萃取处理后的样品和萃取液进行分离，得到萃取清液；

③「利用旋转蒸发仪浓缩萃取清液，形成浓缩溶液；

④「将浓缩溶液用与萃取步骤相同的溶剂进行定容，用0.45um滤膜过滤后，形成待测溶液；

⑤「对高效液相色谱仪所用有机流动相的比例设定为60％，无机流动相的比例设定40％，流速设定为1ml/min，进样量设定为10uL，色谱柱选择C18反相色谱柱；

⑥「将经过前处理的样品由所述高效液相色谱仪的流动相带入所述色谱柱中，将柱温箱的温度设定为20℃，所述样品的各组分被色谱柱分离；

⑦「所述被色谱柱分离的样品各组分进入二极管阵列检测器进行检测，所述检测器的灯源采用氘灯，检测波长为280nm；所述C18色谱柱填充物粒径5um，规格250mm*4.6mm(I.D)。

优选的方案为：

溶剂为甲醇或乙腈。

使用索氏提取法对样品进行萃取处理的时间为4-8h。

有机流动相为乙腈。

无机流动相为水。

C18色谱柱填充物粒径5um，规格250mm*4.6mm(I.D)。

本发明的技术效果在于：

1、采用高效液相色谱仪—二极管阵列检测器技术HPLC-DAD进行检测，与 GC-MS相比，易于检测目标物质，分析方法准确、安全；

2、前处理方法准确、快速、回收率高；

3、通过选择合适的色谱柱，设定合适的流速，流动相比例和最大吸收波长，能对样品中各组分进行最优化的分离。

附图说明

图1是本发明实施例1所检测的N6-苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯基)-2′-脱氧腺苷的色谱图；

图2是本发明实施例1所检测的N6-苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯基)-2′-脱氧腺苷的标准曲线图。

具体实施方式

以下结合附图所示之最佳实施例作进一步详述。

实验条件：高效液相色谱仪和二极管阵列检测器，所用试剂均为色谱纯。高效液相色谱仪和二极管阵列检测器中有机流动相为乙腈，比例设定为60％；无机流动相为水，比例设定为40％；流速设定为1ml/min；进样量设定为10ul；二极管阵列检测器的最大吸收波长设定为280nm。计算机系统记录色谱图形，以目标物的峰面积作为目标物的响应值，对样品进行分析。

制作标准曲线：以乙腈为配制标准溶液的溶剂，配制N6-苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯基)-2′-脱氧腺苷系列标准溶液，按所述实验条件进行高效液相色谱仪和二极管阵列检测器联用HPLC-DAD分析检测。图1为N6-苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯基)-2′-脱氧腺苷色谱图。以总目标峰面积对浓度作图，根据标准溶液的3次平行测量结果，建立N6-苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯基)-2′-脱氧腺苷标准曲线，如图2所示，横坐标代表N6-苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯基)-2′-脱氧腺苷标准溶液的浓度，纵坐标代表液相色谱峰面积响应值，所得标准曲线的函数关系为 y＝18.067x-3.6972，其中y代表液相色谱峰面积响应值，x代表N6-苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯基)-2′-脱氧腺苷标准溶液的浓度，其线性相关系数为R²＝0.9998，这表明该标准曲线具有较好的线性相关性。

应用上述实验条件和标准化曲线所作的具体实施例如下：

实施例1

准确称取1g药品样品于圆底烧瓶中，向其中加入60ml溶剂甲醇。将圆底烧瓶置于水浴锅中进行索氏提取，时间为4h，然后过滤得到萃取清液，通过旋转蒸发仪将萃取清液浓缩至5ml左右，形成浓缩溶液，将浓缩溶液转移至10ml容量瓶内，用甲醇定容至刻度，用0.45um滤膜过滤后，形成待测溶液。将待测溶液用高效液相色谱方法进行检测，色谱柱为C18反相色谱柱，填充物粒径5um，规格250mm*4.6mm(I.D)，二极管阵列检测器检测波长设定为280nm，流动相设定为60％乙腈和40％的水，柱温箱温度设定为20℃，进样量设定为10ul，流速设定为1ml/min。对药物样品作了三个平行样品，试管编号分别为A-1、A-2和A-3，分析结果见表1，并对第一个平行样品(试管编号A-1)重复测定5次，分析结果见表2。由表1知，平行样的相对标准偏差(RSD)为2.05％。由表2知，重复性测试的相对标准偏差(RSD)为1.26％。

将定量的N6-苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯基)-2′-脱氧腺苷标准溶液加入到上述药品样品中，选择与上述的相同溶剂、前处理方法和仪器条件进行实验。作两个加标含量，每个加标含量的作品作3次平行测量取平均值，根据实际加入量和实测结果(该实测结果为扣除样品中N6-苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯基)-2′-脱氧腺苷的含量后的结果)，计算样品的加标回收率，实验结果见表3。由表3可知，样品的加标回收率达到85％以上，并在85％-110％之间。

表1药物样品中N6-苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯基)-2′-脱氧腺苷的测试含量

表2药物样品的测试重复性

表3样品的加标回收率

实施例2

将样品进行索氏提取的时间设定为6h，其它条件同实施例1，所得平行样的相对标准偏差＜8％，重复性测试的相对标准偏差＜5％，样品加标回收率在85％-110％之间。

实施例3

将样品进行索氏提取的时间设定为8h，其它条件同实施例1，所得平行样的相对标准偏差＜8％，重复性测试的相对标准偏差＜5％，样品加标回收率在85％-110％之间。

实施例4

用乙腈作溶剂，其它同实施例1，所得平行样的相对标准偏差＜8％，重复性测试的相对标准偏差＜5％，样品加标回收率在85％-110％之间。

以上所述实施例仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制；应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围；因此，凡跟本发明权利要求范围所做的均等变化与修饰，均应属于本发明权利要求的涵盖范围。

Claims

1.一种用高效液相色谱仪检测N6-苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯基)-2′-脱氧腺苷的方法，其特征在于分析方法如下：

①称取适量样品，选择合适的溶剂，使用索氏提取法对样品进行萃取处理；

②使用过滤法对萃取处理后的样品和萃取液进行分离，得到萃取清液；

③利用旋转蒸发仪浓缩萃取清液，形成浓缩溶液；

④将浓缩溶液用与萃取步骤相同的溶剂进行定容，用0.45um滤膜过滤后，形成待测溶液；

⑤利用连接二极管阵列检测器的高效液相色谱仪对待测溶液中的N6-苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯基)-2′-脱氧腺苷进行检测，对所述仪器有机流动相的比例设定为60％，无机流动相的比例设定40％，流速设定为1ml/min，进样量设定为10uL，色谱柱选择C18反相色谱柱；

⑥将经过前处理的样品由所述高效液相色谱仪的流动相带入所述色谱柱中，将柱温箱的温度设定为20℃，所述样品的各组分被色谱柱分离；

⑦所述被色谱柱分离的样品各组分进入二极管阵列检测器进行检测，所述检测器的灯源采用氘灯，检测波长为280nm。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述的溶剂为甲醇或乙腈。

3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：使用索氏提取法对样品进行萃取处理的时间为4-8h。

4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述的有机流动相为乙腈。

5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述的无机流动相为水。

6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述C18色谱柱填充物粒径5um，规格250mm*4.6mm(I.D)。