KR100441566B1 - 간암 억제 효능을 갖는 메밀 및/또는 메밀껍질 추출물, 및이를 포함하는 간암 억제용 약제 조성물 - Google Patents
간암 억제 효능을 갖는 메밀 및/또는 메밀껍질 추출물, 및이를 포함하는 간암 억제용 약제 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 메밀, 메밀껍질, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 물질의 추출물 및 이를 유효성분으로 포함하는 간암 억제용 조성물에 관한 것으로, 별도의 정제 과정 없이 안전하게 섭취할 수 있고, 간암을 효과적으로 억제할 수 있는 조성물, 가공식품, 기능성식품, 식품첨가제를 제공하는 동시에, 메밀껍질을 재활용함으로써 경제성을 향상시킬 수 있다.
Description
본 발명은 간암 억제 효능을 갖는, 메밀 및 메밀껍질 추출물에 관한 것이다.
최근 우리나라는 경제 수준이 높아짐에 따라 생활환경의 개선, 풍요한 식생활, 서구적인 식생활의 보급에 따라, 불균형하고 과다한 영양의 섭취 등이 원인이 되는 것으로 추정되는 암, 동맥경화, 뇌졸증, 당뇨병, 고혈압 등의 만성적인 성인병 질환이 크게 늘어나고 있는 추세이다.
특히 한국인의 간암 발병율은 세계 1 위이고, 한국인에서 간암 발생율은 위암, 폐암에 이어 3 위라고 알려져 있다(통계청, 1998년 사망통계 및 원인, 1999). 지난 수십년 동안 간암을 치료하는 방법으로 수술, 방사선요법, 화학요법 등이 이루어져 왔고, 동시에 간암 치료제, 간염 치료제, 간염 백신 등의 연구 개발과 상품화가 진행되어 왔으나, 간암의 발생률 및 사망률은 크게 줄어들지 않았다. 이러한 이유는 지난 수십년 동안 간암을 예방하는 차원보다 치료하는 방법에 대해 연구해왔기 때문이다(Sporn, M. B., Lancet, 347:1377-1381, 1996).
특히 간은 모든 물질의 대사에 관여하는 특성이 있어 간암 치료제를 개발하는 것은 매우 어렵지만, 정상세포에는 최소한의 독성작용을 가지면서 간압의 진행과정을 막는 선택적 활성 물질을 얻을 수 있으면, 간암억제제로서 유용하게 사용될 수 있을 것이다. 따라서, 이미 밝혀진 대로 수십년 동안 지속되는 암의 다단계적 발생을 효과적으로 저해하거나, 늦출 수 있는 성분 또는 식품을 섭취하는 것은 암의 발생 및 사망률을 낮추는데 보다 실질적인 결과를 가져올 수 있을 것이다(강진석 외, 화학적 암예방, 고려의학, 2000; Surh, Mutat. Res., 428:305-327, 1998; Sporn, M. B., Lancet, 347:1377-1381, 1996).
암화 과정은 다단계로 되어있으며, 크게 개시, 촉진, 진행의 세 단계로 분류된다. 최근에는 암 예방 및 억제제를 찾는데 있어서, 비가역적이고 짧은 시간에 이루어지는 암의 개시 단계에 대한 저해제 보다는 실질적인 암 예방 및 억제제로서 암의 촉진 및 진행 단계의 저해 효과를 갖는 물질에 관한 연구가 집중되고 있다(강진석외, 화학적 암예방, 고려의학, 2000; Surh, Y. J., Mutat. Res, 428:305-327, 1999; Sporn, M. B., Lancet, 347:1377-1381, 1996). 특히, 약제와 달리, 식품 추출물 및 분획물에 의한 암의 예방 및 억제는, 가역적이고 20 년 이상의 장시간에 걸쳐 진행되는 촉진 단계의 저해 효능을 갖는 것이 비가역적이고 짧은 기간에 걸쳐 진행되는 촉진 단계보다 훨씬 현실적일 것이다(강진석 외, 화학적 암예방, 고려의학, 135-136, 2000; Yamasaki, H. et al, Carcinogenesis 11:1051-1058, 1999; Kelloff. G. J. et al., Eur. J. Cancer, 35:1755-1762, 1999; Surh, Y. J., Mutat. Res, 428:305-327). 갭 정션 세포간 신호전달(gap junctional intercellular communication)의 억제는, 다단계의 암화 과정 중, 특히, 암의 촉진 단계에서 발생하는 중요한 생화학적 지표로 인정되고 있으며, 이러한 과정을 저해하는 물질은 암의 촉진 단계를 저해함으로써 암의 예방 및 억제 효과를 갖는 것으로 인정되고 있다(강진석 외, 화학적 암예방, 고려의학, 135-136, 2000; Yamasaki, H. et al, Carcinogenesis 11:1051-1058, 1999; Kelloff. G. J. et al., Eur. J. Cancer, 35:1755-1762, 1999; Surh, Y. J., Mutat. Res, 428:305-327, 1999;Trosko, J. E., Cancer Res. 53, 3475-3485, 1993).
우리나라의 전통식품 중 하나인 메밀은 단백질과 필수 아미노산, 니아신, 각종 비타민류, 칼슘, 철분 등이 풍부한 영양 생화학적 가치가 높은 것으로, 메밀국수, 메밀묵, 메밀부침, 메밀당수, 및 메밀산자 등 다양한 식품과 조리법으로 이용되고 있다(유태종, 음식궁합, 1996). 이러한 메밀을 이용한 전통식품은 민간요법으로 고협압, 당뇨병, 비만 등의 예방 및 치료에 효과가 있는 것으로 알려져 있다(정동효 외, 식품의 생리활성, 선진문화사, 1998).
한편, 종래 메밀 추출물의 생리활성에 관한 연구로서는, 혈압 조절 효능(최면, 한국영양식량학회지, 20:300-305, 1991), 당뇨병 치료 효능(최면, 한국영양식량학회지, 21:478-483, 1992), 항돌연변이 효능(함승시, 메밀잎 에탄올 추출물의 항돌연변이원성에 관한 연구보고서, 32:1141-1148, 1994), 신장개선에 대한 효능(Yokozawa,Biosci. Biotechnol. Biochem., 65:396-400, 2001)이 보고되었을 뿐, 그밖에 다른 생리활성에 대한 연구 보고는 전무하다. 특히, 여러 식품으로 이용되어 온 메밀 및 메밀껍질 추출물들의 간암 예방 및 억제 효능에 대한 연구보고는 전혀 없었다.
따라서, 별도의 정제 과정 없이 안전하게 섭취 가능한 간암 억제제, 및 이를 포함하는 식품 또는 음료 등을 제공할 필요가 있다.
본 발명은 간암 억제 효능을 가지는, 메밀, 메밀껍질, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 물질의 추출물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또다른 목적은 간암 억제 효능을 가지는, 메밀, 메밀껍질, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 물질의 추출물의 용매추출물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 간암 억제 효능을 가지는, 메밀, 메밀껍질, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 물질의 추출물의 용매추출물에 대해 흡착 크로마토그래피를 수행하여 간암 억제 효능이 더욱 증강된 분획추출물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 간암 억제 효능을 갖는, 메밀, 메밀껍질, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 물질의 추출물을 포함하는 약학적 조성물, 가공식품, 기능성 식품, 식품첨가제, 기능성 음료, 또는 음료첨가제를 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 메밀 또는 메밀껍질 분획추출물이 간 세포에서 생체내에 존재하는 주요한 암 촉진 물질인 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2)에 의해 발생되는 갭 정션 세포간 신호전달(gap junctional intercellular communication)의 억제를 저해하는 효능을 나타내는 사진이다.
도 2는 본 발명에 따른 메밀 또는 메밀껍질의 분획추출물이 간 세포에서 과산화수소에 의해 발생되는 갭 정션 세포간 신호전달의 억제시 발생하는 커넥신43의 고인산화를 저해시키는 효능을 측정한 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 메밀 분획추출물이 간암 세포의 증식을 저해하는 효능을 측정한 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 메밀껍질 분획추출물이 간암 세포의 증식을 저해하는 효능을 측정한 그래프이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 간암 억제 효능을 갖는, 메밀, 메밀껍질, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 물질의 추출물, 및 이를 유효성분으로 포함하는 약제, 가공식품, 기능성 식품, 식품첨가제, 기능성 음료, 또는 음료첨가제를 제공한다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명자들은 인체에 안전성이 확보된 천연 식품 유래의 간암 억제제에 대하여 연구하던 중, 메밀, 메밀껍질, 또는 이들 혼합물의 용매추출물이 간 세포의 갭 정션 세포간 신호전달을 더욱 증가시킴으로써 간암 촉진을 억제하고 간암 세포의 증식을 억제시킴으로써 간암 억제 효능에 우수한 효과가 있음을 확인하고, 이를 토대로 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 메밀, 메밀껍질, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 물질의 추출물을 유효성분으로 포함하는 간암 억제용 조성물에 관한 것이다. 또한, 상기 추출물은 용매 추출물일 수 있으며, 바람직하게는 메밀, 메밀 껍질, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 물질의 용매추출물에 흡착 크로마토그래피를 수행하여 얻어진 분획추출물이다.
상기 용매추출물과 관련하여, 본 기술분야의 전문가에게 알져진 통상의 용매추출법을 메밀, 메밀껍질, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 물질을 추출하기 위해서 사용할 수 있다. 바람직하게는 용매가 아세톤, 에탄올, 또는 메탄올인 것이며, 식품에 적용하기 위해서는 용매가 에탄올인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한 상기 용매추출물은 에탄올, 아세톤, 또는 메탄올 등의 용매를 20 내지 80 %로 포함하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 50 %의 용매를 포함하는 수용액이다.
상기 분획 추출물과 관련하여, 상기 용매 추출물을 흡착 칼럼에 로딩하여 용매로 용출하여 분획추출물을 얻을 수 있으며, 본 기술분야의 전문가에게 알려진 통상의 흡착 크로마토그래피를 모두 적용할 수 있다. 예컨대, 흡착 칼럼은 스틸렌계다공성 흡착수지, 소수성 충진제인 XAD-4 또는 HP-20을 사용할 수 있다. 본 발명의 일례에서, 상기 용매추출물을 흡착 칼럼에 충진시킨 후, 10 내지 30 % 에탄올 용액으로 세척하여, 40 내지 80 % 에탄올로 용매분획하여 제조할 수 있다. 더욱바람직하게는 본 발명의 분획추출물은 20 % 에탄올로 세척하고, 40 % 에탄올로 용매 분획하여 제조할 수 있다.
또한, 본 발명은 간암 억제 효능을 갖는, 메밀, 메밀껍질, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 물질의 추출물을 유효성분으로 포함하는 간암 억제용 조성물을 제공하는 것이다. 상기 간암 억제용 조성물은 약제, 가공식품, 기능성 식품, 식품첨가제, 기능성 음료, 또는 음료첨가제 등으로 사용될 수 있다.
상기 메밀, 메밀껍질, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 물질의 추출물은 조성물 전체에 대하여 0.01 내지 10 중량%로 포함되는 것이 바람직하다.
상기 간암 억제 효능을 갖는, 메밀, 메밀껍질, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 물질의 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 경구투여가 바람직하며, 약제로 사용할 경우 약제학적 분야에서 공지의 방법에 의하여 제조될 수 있으며, 그 형태로서는 산제, 과립제, 정제, 캄셀제, 환제, 트로키(troche), 내용액제, 현탁제, 유제, 및 시럽제 등의 경구제로 사용할 수 있다. 음식물로 사용할 경우, 메밀, 메밀껍질, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 물질의 추출물을 그대로, 또는 종래 식품에 사용되던 각종 성분과 혼합하여 식품으로 제조할 수 있다. 제조되는 음식물의 형태로서는 고형식품, 크림상, 또는 잼상의 반(半)유동식품, 겔상식품, 음료 등 온갖 식품형태로 제조할 수 있으며, 캅셀제, 과립제, 정제, 드링크제 등의 형태나, 상용되고 있는 임의의 기재를 사용하여 청량음료, 쥬스, 커피, 홍차, 리큐르, 우유, 유청음료, 유산균음료, 사탕, 츄잉검, 초콜렛, 구미, 요구르트, 아이스크림, 푸딩, 물양갱 등으로 제조할 수 있다.
본 발명의 간암 억제 효능을 갖는 메밀, 메밀껍질, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 물질의 추출물을 유효성분으로 포함하는 가공식품으로 국수를 제조할 수 있으며, 소맥분, 물, 식염을 혼합하고 반죽하여 제조된 통상의 국수에 있어서, 국수 전체 중량부에 대하여 본 발명의 메밀 분획추출물 또는 메밀껍질 분획추출물을 1 내지 70 중량부로 가하여 제조할 수 있다.
간을 비롯한 여러 조직에서 발생하는 갭 정션 세포간 신호전달(gap-junctional intercellular communication)의 억제 및 암 세포의 증식은, 다단계의 암화 과정 중, 암의 촉진 및 진행 단계에서 발생하는 중요한 생화학적 지표로 인정되고 있으며, 이러한 과정을 저해하는 물질은 암의 촉진과 진행단계를 저해함으로써 암의 억제 효과를 갖는 것으로 인정되고 있다(강진석 외, 화학적 암예방, 고려의학, 135-136, 2000; Yamasaki, H. et al, Carcinogenesis 11:1051-1058, 1999; Kelloff. G. J. et al., Eur. J. Cancer, 35:1755-1762, 1999; Surh, Y. J., Mutat. Res, 428:305-327, 1999; Trosko, J. E., Cancer Res. 53, 3475-3485, 1993).
따라서, 본 발명의 추출물이 간암 억제 효능 갖는지를 확인하기 위해서, 간 세포에서 생체내에 존재하는 주요한 암 촉진 물질인 과산화수소에 의해 발생하는 갭 정션에서 세포간 신호전달 억제, 커넥신43 단백질의 고인산화, 그리고 간암 세포의 증신 억제에 대한 본 발명의 추출물이 미치는 효과를 조사하였다.
하기 표 1 및 2에서 알 수 있듯이, 메밀과 메밀껍질 용매 추출물은 모두 20 ㎍/mL 이상의 농도에서 과산화수소에 의해 발생하는 갭 정션 세포간 신호전달의 억제를 저해하는 효과가 있음을 알 수 있었다. 따라서, 메밀 및 메밀껍질의 용매추출물 및 분획추출물은, 주로 간암의 촉진과정에서 발생하는 현상인 갭 정션 세포간 신호전달의 억제를 방지함으로써 간암 억제 효과가 있는 것을 알 수 있다. 또한 상기의 메밀 및 메밀껍질의 용매추출물을 크로마토그래피에 수행하여 얻은 분획추출물은, 용매추출물에 비하여 약 10 배 이상 갭 정션 세포간 신호전달을 증가시키는 효능을 나타냄으로써, 간암 억제 효능을 월등히 증강시킬 수 있음을 알 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 메밀 및 메밀껍질 분획추출물이 쥐 간 상피 세포(rat liver epithelial cell)에서 생체 내에 존재하는 주요한 암 촉진제인 과산화수소(H2O2)에 의해 발생되는 갭 정션 세포간 신호전달(gap junctional intercellular communication)의 억제를 저해하는 효능을 나타내는 사진이다(a: 대조군, b: 400 ㎛ H2O2처리군, c: 10 ㎍/mL 메밀 분획추출물 + 400 ㎛ H2O2처리군, d: 10 ㎍/mL 메밀 분획추출물 + 400 ㎛ H2O2처리군).
도 2는 본 발명에 따른 메밀 및 메밀껍질의 분획추출물이 쥐 간 상피 세포에서 과산화수소에 의해 발생되는 갭 정션 세포간 신호전달을 조절하는 주요한 단백질인 커넥신43의 고인산화를 저해시키는 효능을 측정한 것이다(a: 대조군, b: 400 ㎛ H2O2처리군, c: 10 ㎍/mL 메밀껍질 분획추출물 + 400 ㎛ H2O2처리군, d: 10 ㎍/mL 메밀껍질 분획추출물 + 400 ㎛ H2O2처리군).
상기 결과를 통하여, 메밀과 메밀껍질의 용매추출물 및 분획추출물이 간 세포의 갭 정션 세포간 신호전달을 증진시킴으로써 간암 촉진을 저해하는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 하기 표 3과 4를 통하여, 메밀 및 메밀껍질의 용매추출물과 분획추출물은 간암 세포의 DNA 합성을 억제시킴으로써, 간암 세포의 증식을 저해시키는 것을 알 수 있다. 특히, 메밀 및 메밀껍질의 간암 세포 증식을 억제시키는 분획추출물은 상기 서술한 갭 정션 세포간 신호전달의 증가 효능이 뛰어난 분획추출물과 일치함을 알 수 있었다.
또한 도 3과 4를 통하여, 간암 억제 효능을 증강시킨 메밀 및 메밀껍질 분획추출물의 농도가 점차 증가할수록 간암 세포의 증식이 억제되는 것을 관찰함으로써, 간암 세포의 증식 저해율이 처리한 메밀 및 메밀껍질 분획추출물의 농도에 의존적인 것을 알 수 있다.
결론적으로 메밀 및 메밀껍질의 용매추출물과 분획추출물은 간세포에서 갭 정션 세포간 신호전달의 증가시킴과 동시에 간암 세포 증식 저해하는 효능을 나타냄으로써 간암의 촉진 및 진행 단계를 저해하였으며, 또한 본 발명에 따른 메밀과 메밀껍질의 분획추출물은 용매추출물보다 월등히 높은 간암 억제 효능을 나타내었다.
본 발명에 따른 메밀, 메밀껍질, 또는 이들의 혼합물의 용매추출물과 분획추출물을 포함하는 간암 억제제를 식품으로 사용할 경우, 독성을 제거하기 위한 별도의 정제 과정 없이 안전하게 섭취함으로써 간암 억제 효능을 얻을 수 있다. 또한간단한 분리 공정만으로 높은 간암 억제 효능을 나타내는 물질을 분리할 수 있어 종래의 간암 억제제들에 비하여 생산원가를 낮출 수 있으며, 특히 버려지고 있는 막대한 양의 메밀껍질을 재활용함으로써 경제성을 향상시킬 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1: 메밀 분획추출물의 제조
건조된 메밀 1 중량부에 물, 50 % 아세톤, 50 % 에탄올, 또는 50 % 메탄올(Duksan, Korea) 수용액을 약 6 배정도 첨가하여 실온에서 교반기를 이용하여 6 시간 동안 환류추출하였다. 이를 8,000 rpm에서 30 분간 원심분리(Vision, Korea)하여 얻어진 상등액을 모으고, 잔류물은 동일한 방법으로 1 회 반복 추출하였다. 이렇게 얻어진 추출물을 여과지(whatmann 41)로 여과시킨 후, 냉동 건조하여 메밀 용매추출물(이하, "메밀 용매추출물"이라 함)을 얻었다.
상기 얻어진 메밀 용매추출물을 흡착 크로마토그래피를 수행하여 메밀 용매추출물의 분획추출물(이하, "메밀 분획추출물"이라 함)을 제조하였다. 구체적으로, 상기 메밀 용매추출물을 소수성 충진제인 XAD-4(Sigma, USA) 또는 HP-20(Mitsbish, Japan)에 흡착시킨 후, 20 % 에탄올을 흘려서 단백질이나 당과 같은 영양성분을 포함하는 분획을 제거하였다. 여기서 남은 분획에 다시 40 % 에탄올을 흘려서 메밀 분획추출물을 얻었다.
실시예 2: 메밀 껍질의 분획추출물 제조
메밀껍질을 출발물질로 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여 메밀 껍질의 용매추출물(이하, "메밀 껍질 용매추출물"이라 함)을 얻고, 메밀껍질의 용매추출물로부터 흡착 칼럼 크로마토그래피에 의해 메밀 껍질의 분획추출물(이하, 메밀 껍질 분획추출물)을 제조하였다.
실시예 3 : 간암 촉진 및 진행 과정의 저해 효과
간 세포의 갭 정션 세포간 신호전달을 측정하는 실험을 통해 간암 촉진의 저해 활성을 측정하였다. 이를 측정하기 위하여, 공지의 방법인 Scrape Loding/Dye Transfer (SL/DT) assay(Upham, B. L., Kang, K. S., Cho, H. Y., & Trosko, J. E. Carcinogenesis 18:37-42, 1997)를 수행하였다.
세포간 신호전달을 측정하기 위한 간 세포로 쥐 간 상피 세포(rat liver epithelial cell)인 WB-F344 세포를 사용하였다. D-배지에 FBS를 10 %로 첨가하고, 페니실린(penicillin) 100 IU/mL와 스트렙토마이신(streptomycin) 100 ㎍/mL을 첨가한 배지를 이용하여, 5 % CO2, 37 ℃ 배양기(Forma Scientific Co., Marjetta, OH, USA)에서 상기 WB-F344 세포를 배양하였다. 세포 배양에 사용한 배지 조성물들은 모두 GIBCO BRL(Grand Island, NY, USA)사 제품을 사용하였다. 상기 배양한 간 세포는 2 mL 플라스틱 접시에 mL 당 1 ×105개로 분주하고 44 시간 동안 배양하였다.
상기 세포 배양액을, 실시예 1 및 2에서 제조된 메밀 및 메밀껍질의 용매추출물과 분획추출물을 넣어 각각 1, 5, 10, 20 ㎍/mL의 농도가 되도록 만든 배양액으로 바꾸고, 4 시간 후 동일한 농도의 메밀 및 메밀껍질의 용매추출물 및 분획추출물을 생체 내에 존재하는 주요한 암 촉진 물질인 400 μM 과산화수소와 함께 세포 배양물에 첨가하고, 1 시간 후 루시퍼 옐로우(lucifer yellow) 염색액을 이용하여 갭 정션 세포간 신호전달(gap-junctional intercellular communication)의 회복 정도를 콘포컬 현미경(BioRad, Hercules, CA, USA)으로 측정하였다. 대조군으로서 메밀 및 메밀껍질의 용매추출물 및 분획추출물을 포함하지 않고 과산화수소만을 배양액에 첨가하여 배양한 세포를 사용하였다.
메밀 용매추출물 및 분획추출물이 갭 정션 세포간 신호전달을 증가시키는 효과는 하기 표 1과 도 1에 나타내었으며, 메밀껍질 용매추출물 및 분획추출물의 동일한 효과는 하기 표 2와 도 1에 나타내었다. 갭 정션 세포간 신호전달의 증가율은 대조군을 100 %로 하고 과산화수소만을 처리한 군을 0 %로 하여 시료 처치군이 사진에서 나타내는 형광의 밝기와 길이를 측정하여 계산하였으며, 20 % 이하의 활성은 거의 효과가 없는 것으로 나타내었다.
| 구분 | 갭 정션 세포간 신호전달 증가율(%) | ||||
| (1 ㎍/mL) | (5 ㎍/mL) | (10 ㎍/mL) | (20 ㎍/mL) | ||
| 메밀 용매추출물 | |||||
| 추출 용매 | 물 | < 20 | < 20 | < 20 | < 20 |
| 50% 메탄올 | < 20 | < 20 | < 20 | 100 | |
| 50% 에탄올 | < 20 | < 20 | 30 | 100 | |
| 50% 아세톤 | < 20 | < 20 | 60 | 100 | |
| 메밀 분획추출물 | |||||
| 50% 아세톤 추출물을 스티렌 다공성 수지에 흡착시켜 얻은 용매 분획 | 20% 에탄올 분획추출물 | < 20 | < 20 | < 20 | < 20 |
| 20% 에탄올 분획 후 40% 에탄올로 용매 분획한 분획추출물 | 40 | 100 | 100 | 100 | |
| 40% 에탄올 분획 후 60% 에탄올로 용매 분획한 분획추출물 | < 20 | < 20 | < 20 | 100 | |
| 60% 에탄올 분획 후 80% 에탄올로 용매 분획한 분획추출물 | < 20 | < 20 | < 20 | < 20 | |
| 80% 에탄올 분획 후 100% 에탄올로 용매 분획한 분획추출물 | < 20 | < 20 | < 20 | < 20 |
| 구분 | 갭 정션 세포간 신호전달 증가율(%) | ||||
| (1 ㎍/mL) | (5 ㎍/mL) | (10 ㎍/mL) | (20 ㎍/mL) | ||
| 메밀 껍질 용매추출물 | |||||
| 추출 용매 | 물 | < 20 | < 20 | < 20 | < 20 |
| 50% 메탄올 | < 20 | < 20 | < 20 | 100 | |
| 50% 에탄올 | < 20 | < 20 | < 20 | 100 | |
| 50% 아세톤 | < 20 | < 20 | 40 | 100 | |
| 메밀 껍질 분획추출물 | |||||
| 50% 아세톤 추출물을 스티렌 다공성 수지에 흡착시켜 용매 분획 | 20% 에탄올 분획추출물 | < 20 | < 20 | < 20 | < 20 |
| 20% 에탄올 분획 후 40% 에탄올로 용매 분획한 분획추출물 | 60 | 100 | 100 | 100 | |
| 40% 에탄올 분획 후 60% 에탄올로 용매 분획한 분획추출물 | < 20 | < 20 | 30 | 100 | |
| 60% 에탄올 분획 후 80% 에탄올로 용매 분획한 분획추출물 | < 20 | < 20 | < 20 | < 20 | |
| 80% 에탄올 분획 후 100% 에탄올로 용매 분획한 분획추출물 | < 20 | < 20 | < 20 | < 20 |
실시예 4: 커넥신43 단백질의 고인산화 억제 효과
간 세포에서 생체 내에 존재하는 주요한 암 촉진 물질인 과산화수소(H2O2)에 의해 발생하는 갭 정션 세포간 신호전달의 억제는, 갭 정션 채널을 조절하는 주요한 단백질인 커넥신43(connexin43)의 고인산화(hyperphosphorylation) 때문인 것으로 알려져 있다(Upham, B. L., Kang, K. S., Cho, H. Y., & Trosko, J. E. Carcinogenesis 18:37-42, 1997). 따라서, 상기 실시예 1 또는 2에서 제조한 메밀 또는 메밀껍질 분획물이 쥐 간 상피세포에서 과산화수소에 의해 발생되는 커넥신 43의 고인산화를 저해하는 효과를 측정하기 위하여, 공지된 방법(Upham, B. L., Kang, K. S., Cho, H. Y., & Trosko, J. E. Carcinogenesis 18:37-42, 1997)에 따라 웨스턴 블랏 분석법으로 분석하였다.
즉, 실시예 3과 동일하게 배양된 간 세포로부터 1 mM 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF:phenylmethylsulfonyl fluoride)를 포함하는 20 % 소디움 도데실 설페이트(Sodium Dodecyl Sulfate, SDS)로 단백질을 추출하였다. 이렇게 추출된 단백질을 DC assay kit(Bio-Rad Corp., Richmond, CA, USA)를 이용하여 단백질 함량을 결정하였다. 각 단백질 추출물 중 약 15 ㎍에 해당하는 단백질을 12.5 % SDS-PAGE에 넣고 전기영동하여 분리하였다. 분리된 단백질들은 커넥신43 단백질의 단일클론 항체(Zymed, South San Francisco, CA, USA)를 이용하여 반응시킨 후, ECL 키트 (Amersham, Life Science, Denver, USA)를 이용하여 탐지하였고, 그 결과를 도 2에 나타냈다. 대조군으로서 메밀 또는 메밀껍질 용매추출물 및 분획추출물을 포함하지 않고 과산화수소만을 배양액에 첨가하여 배양한 세포로부터 상기와 동일한 방법에 의해 얻어진 커넥신43 단백질을 사용하였다.
실시예 5: 간암 세포의 증식 저해 효과
메밀 및 메밀 껍질의 용매추출물 및 분획추출물이 간암 세포의 증식 저해효과를 확인하기 위해서, 공지의 방법(Marshall, E. S. et al. European J. Cancer, 30A: 1370-1376, 1994)에 따라3H-티미틴 업테이크 어세이(3H-thymidine uptake assay)를 실시하여, 간암 세포의 DNA 합성 저해 정도를 측정하였다.
RPMI-1640 배지에 FBS를 10 %로 첨가하고, 페니실린(penicillin) 100 IU/mL, 스트렙토마이신(streptomycin) 100 ㎍/mL을 첨가한 배지를 이용하여, 5 % CO2, 37 ℃ 배양기(Forma Scientific Co., Marjetta, OH, USA)에서 간암 세포인, HepG2를 배양하였다. 세포 배양에 사용한 배지 조성물들은 모두 GIBCO BRL(Grand Island,NY, USA)사 제품을 사용하였다.
상기 배양한 간암 세포를 96-웰 플레이트(well plate)에 1 ×104개 세포를 분주하고, 메밀 및 메밀껍질 추출물과 분획추출물을 100 ㎍/mL, 200 ㎍/mL, 400 ㎍/mL, 및 800 ㎍/mL 농도로 첨가하여 72 시간 동안 배양하였다. 세포를 회수하기 6 시간 전에 웰당 1 μCi를 첨가하여 배양하였다. 세포 회수 기구(Cambridge Scientific Inc., cambridge, MA, USA)를 이용하여 세포를 유리 섬유 필터(Brandel Inc., Gaithersburg, MA, USA)에 회수하고, 회수된 세포에 신틸레이션 칵테일(scintillation cocktail, Wallac, Turku, Finland) 3 mL를 혼합하여 액체 신틸레이션 카운터(liquid scintillation counter, Wallac, Turku, Finland)로 방사능을 측정하였다. 본 실시예에 따라 3 회 반복 실험하였다. 대조군으로서 메밀 및 메밀껍질의 용매추출물 및 분획추출물을 포함하지 않은 배양액만으로 배양한 세포를 사용하였다. 대조군에 대한 본 발명에 따른 메밀 및 메밀껍질의 용매추출물 및 분획추출물의 간암 세포 증식 저해율을 계산하여 하기 표 3과 4 및 도 3과 4에 나타내었다. 도 3은 본 발명에 따른 메밀 분획추출물을 농도별로 간암 세포인 HepG2에 처리한 후3H-티미딘 업테이크 어세이(thymidine uptake assay)를 이용하여 간암 세포의 증식을 저해하는 효능을 측정한 그래프이다. 도 4는 본 발명에 따른 메밀껍질 분획추출물을 농도별로 간암 세포인 HepG2에 처리한 후3H-티미딘 업데이크 어세이를 이용하여 간암 세포의 증식을 저해하는 효능을 측정한 그래프이다.
| 구분 | 간암 세포 증식 억제율 (%) | ||||
| (100 ㎍/mL) | (200 ㎍/mL) | (400㎍/mL) | (800㎍/mL) | ||
| 메밀 용매 추출물 | |||||
| 추출 용매 | 물 | < 20 | < 20 | < 20 | < 20 |
| 50% 메탄올 | < 20 | < 20 | < 20 | 36 | |
| 50% 에탄올 | < 20 | < 20 | < 20 | 66 | |
| 50% 아세톤 | < 20 | < 20 | < 20 | 78 | |
| 메밀 분획추출물 | |||||
| 50% 아세톤 추출물을 스티렌 다공성 수지에 흡착시켜 용매 분획 | 20% 에탄올 분획추출물 | < 20 | < 20 | < 20 | 26 |
| 20% 에탄올 분획 후 40% 에탄올로 용매 분획한 분획추출물 | < 20 | 79 | 87 | 93 | |
| 40% 에탄올 분획 후 60% 에탄올로 용매 분획한 분획추출물 | < 20 | < 20 | < 20 | 36 | |
| 60% 에탄올 분획 후 80% 에탄올로 용매 분획한 분획추출물 | < 20 | < 20 | < 20 | < 20 | |
| 80% 에탄올 분획 후 100% 에탄올로 용매 분획한 분획추출물 | < 20 | < 20 | < 20 | < 20 |
| 구분 | 간암 세포 증식 억제율 (%) | ||||
| (100 ㎍/mL) | (200 ㎍/mL) | (400㎍/mL) | (800㎍/mL) | ||
| 메밀 껍질의 용매추출물 | |||||
| 추출 용매 | 물 | < 20 | < 20 | < 20 | < 20 |
| 50% 메탄올 | < 20 | < 20 | < 20 | 36 | |
| 50% 에탄올 | < 20 | < 20 | < 20 | 66 | |
| 50% 아세톤 | < 20 | < 20 | < 20 | 78 | |
| 메밀 껍질의 분획추출물 | |||||
| 50% 아세톤 추출물을 스티렌 다공성 수지에 흡착시켜 용매 분획 | 20% 에탄올 분획추출물 | < 20 | < 20 | < 20 | 26 |
| 20% 에탄올 분획 후 40% 에탄올로 용매 분획한 분획추출물 | < 20 | 66 | 88 | 92 | |
| 40% 에탄올 분획 후 60% 에탄올로 용매 분획한 분획추출물 | < 20 | < 20 | < 20 | 41 | |
| 60% 에탄올 분획 후 80% 에탄올로 용매 분획한 분획추출물 | < 20 | < 20 | < 20 | < 20 | |
| 80% 에탄올 분획 후 100% 에탄올로 용매 분획한 분획추출물 | < 20 | < 20 | < 20 | < 20 |
상기 표 3과 4 및 도 3과 4를 통하여, 메밀 및 메밀껍질의 용매추출물 및 분획추출물은 간암 증식 저해 효능이 우수하고 농도 의존적으로 효능이 증가함을 확인할 수 있었으며, 이 분획추출물은 상기 서술한 간 세포에서 갭 정션 세포간 신호전달의 증가 효능이 뛰어난 분획추출물과 일치함을 알 수 있었다.
실시예 6: 독성실험
본 발명의 메밀 및 메밀껍질의 용매추출물과 분획추출물에 대하여 독성실험을 다음과 같이 수행하였다. 구체적으로 상기 용매추출물 및 분획추출물 각각을 디메틸설폭사이드(DMSO; dimethylsulfoxide)에 용해하고 물로 희석한 후 이를 쥐(군당 10 마리)에 각각 1 g/㎏을 투여한 다음, 7 일간 관찰하였으나 사망하는 쥐는 없었다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 간암 억제 효능을 갖는, 메밀, 메밀껍질, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 물질의 용매추출물 및 분획추출물은 간 세포의 갭 정션에서 세포간 신호전달을 증가시켜 간암 촉진을 억제시키고, 간암 세포의 DNA 합성을 저해함으로써 증식을 억제시킬 수 있다. 또한 상기 추출물은 식품 등급으로 사용할 수 있어, 독성을 제거하기 위한 별도의 정제 과정 없이 안전하게 섭취함으로써 간암 억제 효능을 얻을 수 있을 뿐만 아니라, 버려지고 있는 막대한 양의 메밀껍질을 재활용함으로써 경제성을 향상시킬 수 있는 장점이 있다.
Claims (5)
- 간암 억제 효능을 가지는 메밀, 메밀껍질, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 물질이 20∼80%의 물을 포함하는 에탄올, 아세톤, 또는 메탄올 수용액의 용매로 추출된 것인 추출물.
- 제 1 항에 있어서,상기 추출물이 용매추출물에 흡착 크로마토그래피를 수행하여 얻어진 분획추출물임을 특징으로 하는 추출물.
- 제 2 항에 있어서,상기 용매추출물을 흡착 크로마토그래피에 충진시킨 후, 10∼30 % 에탄올 수용액으로 세척하고, 40∼100 % 에탄올로 용매분획하여 추출된 것임을 특징으로 하는 추출물.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 메밀, 메밀껍질, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 물질의 추출물을 유효성분으로 포함하는 간암 억제용 약제 조성물.
- 제 4 항에 있어서, 상기 약제 조성물의 제형이 산제, 과립제, 정제, 캄셀제,환제, 트로키(troche), 내용액제, 현탁제, 유제, 및 시럽제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
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| KR10-2004-0018777A KR100441566B1 (ko) | 2004-03-19 | 2004-03-19 | 간암 억제 효능을 갖는 메밀 및/또는 메밀껍질 추출물, 및이를 포함하는 간암 억제용 약제 조성물 |
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|---|---|---|---|---|
| KR20060038010A (ko) * | 2004-10-29 | 2006-05-03 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | 니코틴산을 포함하는, 갭 결합을 통한 세포간 정보전달의억제 및 항상성의 불균형과 관련된 질환의 예방 또는치료용 조성물 |
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