KR100437081B1 - 이산화탄소 농도를 조절하여 재조합 단백질의 생산성을증가시키는 동물세포의 배양방법 - Google Patents

이산화탄소 농도를 조절하여 재조합 단백질의 생산성을증가시키는 동물세포의 배양방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 동물세포 배양을 통한 재조합 단백질의 생산에 있어서 재조합 단백질의 생산량을 증가시키는 동물세포 배양방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 이산화탄소의 농도 조절이 가능한 세포 배양기를 사용하여 단계별로 다른 농도의 이산화탄소를 공급하여 세포배양을 함으로써 세포를 충분히 성장시킴과 동시에 대부분 세포의 세포주기를 특정영역에 머물게 하여 원하는 재조합 단백질의 생산량을 증가시키는 동물세포 배양방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법으로 동물세포를 배양하면 재조합 단백질의 생산성을 최소 2배 이상 증가시킬 수 있다.

Description

이산화탄소 농도를 조절하여 재조합 단백질의 생산성을 증가시키는 동물세포의 배양방법 {Animal cell culture method for increasing productivity of recombinant protein by controlling carbon dioxide level}
본 발명은 동물세포를 배양할 때 이산화탄소의 양을 시간적으로 조절하여 재조합 단백질의 생산성을 증가시키는 동물세포 배양방법에 관한 것이다.
보다 상세하게는, 세포를 성장시킬 때에는 혈청이 포함된 배지에 먼저 5%의 이산화탄소를 함유하는 공기(대기의 일반 조성에 해당하는 성분입니다)를 공급하고 그 다음 0.03%의 이산화탄소를 함유하는 공기를 공급하여 세포를 충분히 성장시킴과 동시에 대부분 세포의 세포 주기를 제1간기(G1 phase)에 있도록 유도한 후 재조합 단백질의 생산을 위하여 무혈청 배지를 사용하고 0.03%의 이산화탄소를 함유한 공기를 공급하여 배지에 분비되는 재조합 단백질의 양을 증가시켜 생산성을 증가시키는 동물세포 배양방법에 관한 것이다.
세포배양을 이용하여 재조합 단백질을 생산하는 방법으로는 크게 미생물을 이용하는 방법과 동물세포를 이용하는 방법이 있다. 이 중에서 미생물을 이용하는 방법은 비교적 그 생장속도가 빠르고 비용이 저렴하다는 장점이 있으나, 동물세포배양에서와 같이 당쇄부가반응(post-translational modification)등이 불가능함에 따라 단백질의 중첩이나 3차구조의 생성이 어려워 일부 생물의약품생산에 적합하지 않은 단점이 있었다.
이를 해결하기 위해, 유전자 재조합 기술의 발달에 따라 최근 수년동안 동물세포를 숙주(host)로 하여 재조합 동물세포를 만들고 이를 배양하여 재조합 단백질을 생산하는 동물세포배양에 관련된 기술분야에 많은 진보가 있었다.
동물세포 배양을 통하여 원하는 재조합 단백질 생산에 있어서 재조합 단백질의 생산량은 세포 수와 단위 세포당 단백질 생산량의 곱으로 결정된다. 따라서 원하는 단백질의 생산량을 높이기 위해서는 단백질을 생산하는 세포의 수를 늘이거나(고농도 세포배양), 단위 세포당 단백질 생산량을 높이는 방법이 있다.
고농도 세포배양을 위하여, 세포의 생장에 가장 중요한 최적화된 배지조성 및 이를 이용한 세포의 배양, 또는 관류(Perfusion) 배양과 같은 배양방법의 최적화 기술이 개발되어 왔고, 많은 기술적 발전이 이루어져 왔다.
단위 세포 당 단백질의 생산량을 높이기 위하여, 원하는 단백질의 생산성이 특히 높은 세포주를 메토트렉세이트(MTX, methotrexate)와 같은 유전자 증폭을 위한 저해제를 사용하여 고르거나, 배지에 소디움 부티레이트(sodium butyrate)와 같이 세포주기(cell cycle)를 특정 시기에 멈추게 하는 물질을 첨가하는 방법이 사용되어 왔다.
동물세포와 같은 진핵세포의 세포주기는 휴지기 및 제1 간기(G0/G1 phase ; 세포분열 후부터 DNA복제시작 전까지의 기간), 복제기(S phase ;DNA 복제기간), 제2간기(G2 phase; DNA 복제 후부터 세포분열 전까지의 기간), 분열기(M phase; 세포분열 기간)로 이루어져 있으며 지금까지의 연구에 의하여 단백질의 합성과 분비는 주로 G1 phase에서 이루어진다는 사실이 보고되었다(Buell DN and Fahey JL. Science, 164, 1524, 1969; Byars N and Kidson C, Nature, 226, 648, 1970를 참조). 따라서 세포를 배양할 때 세포주기를 G1 phase에 멈추게 한다면 단백질 생산량이 증가될 것이 예측 가능하다.
현재까지 세포 주기를 G1 phase에 멈추게 하기 위하여 소디움부티레이트(sodium butyrate)를 첨가하는 방법(Darzynkiewicz Z et al., Exp. Cell Res., 136, 279, 1981; Xue S and Rao PN, J. Cell. Sci., 51, 163, 1981를 참조), 암 억제 유전자를 다량 발현시키는 방법(Fussenegger M et al., Biotechnol. Bioeng., 55, 927, 1997를 참조), 고삼투압 배지를 사용하는 방법(Oh SKW et al., Presented at the 207th American Chemical Society Meeting, San Diego, CA., 1994를 참조), 세포를 37℃보다 저온인 30 내지 34℃에서 배양하는 방법(Jenkins N and Hovey, A, Biotechnol. Bioeng., 42, 1029, 1993; Moore A et al., Cytotechnology, 23, 47, 1997를 참조)이 사용되었고 이러한 방법을 사용하여 원하는 단백질의 생산량도 증가하였다.
일반적으로 동물세포는 5%의 이산화탄소(CO2)를 함유한 공기를 공급하는 배양기에서 배양하는데, 이것은 이산화탄소가 배지에 포함되어 있는 소디움 바이카보네이트(sodium bicarbonate)와의 평형반응으로 배지의 pH가 급격하게 변하는 것을 방지하여 줌으로써 동물세포의 성장에 최적인 pH 6.9 내지 7.4 범위로 조절하는 완충제(buffer)로서 역할을 하기 때문이다. 이러한 완충제로서의 역할뿐 아니라, 이산화탄소는 세포내에서 대사조절물질(metabolic regulator)로서의 역할을 하는 것으로 알려져 있다(McLimans, WF, The gaseous environment of the mammalian cell in culture. In: Rothbalt GH and Quitofalo VJ (eds.) Growth, Nutrition, and Metabolism of Cells in Culture (pp. 137-169), Academic, London, 1972를 참조). 구체적으로, 이산화탄소는 아르기닌(Arginine)과 피리미딘(Pyrimidine)의 생합성에관련되어 있고(Nazario Mand Reissing JL, Biochem. Biophys. Res. Commun., 16, 42, 1964를 참조), 지방산(fatty acid)의 생합성에도 중요한 역할을 하며(Kieler J and Gromek A, Arch. Immunol. Therap. Exp. 15, 109, 1967를 참조), 최소한의 이산화탄소 농도는 당분해(glycolysis)와 호흡(respiration)에 필요하지만 오히려 높은 농도의 이산화탄소는 이러한 대사 시스템(metabolic system)을 저해한다고 알려져 있다(Fleeger et al., Comp. Biochem. Physiol. 23, 475, 1967를 참조). 따라서 동물세포를 배양할 때 이산화탄소를 공급하면 세포의 성장(proliferation)이 원활하게 이루어지는 데 비하여 상대적으로 단백질 생산활동은 낮아질 것으로 예상할 수 있으며, 이산화탄소의 공급을 중단하면 세포성장에 필요한 인자들의 합성이 영향을 받게되어 세포의 분열이 원활하게 일어나지 않게 되어 세포의 성장은 저해되지만 많은 부분의 세포는 세포 주기가 G1 phase에 멈추게 되고 이때 원하는 단백질의 생산량이 증가하게 될 가능성이 있다.
이에 본 발명자들은 이산화탄소가 세포배양에 있어서 세포 주기의 진행에 중요한 대사과정을 조절하는 대사조절인자(metabolic regulator)로서 작용한다는 점에 착안하여 세포의 성장단계에서는 이산화탄소를 공급하여 세포를 고농도로 성장시키고 재조합 단백질의 생산단계에서는 이산화탄소의 공급을 중단하여 많은 세포들의 세포 주기를 단백질 생산에 유리한 G1 phase에 멈추게 함으로써 원하는 재조합 단백질의 생산량이 이산화탄소를 계속 공급하였을 때에 비하여 2배 이상 증가하고 결과적으로 2배 이상 재조합 단백질의 생산성이 증가하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 동물세포 배양을 통하여 재조합 단백질을 생산할 때 시간에 따라 다른 농도의 이산화탄소를 공급함으로써 재조합 단백질의 생산량을 획기적으로 증가시키는 동물세포 배양방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
도 1은 여러 농도의 이산화탄소(CO2)하에서 중국산 햄스터 난소(CHO, Chinese Hamster Ovary)세포를 배양하였을 때 배양시간에 따른 세포의 성장특성(가), 배지의 에리트로포이에틴(EPO) 생산량 변화(나), 세포내의 EPO 양의 변화(다)를 나타낸 그래프이다.
도 2는 이산화탄소의 농도 조절이 가능한 이산화탄소 배양기에서 CHO세포를 배양할 때 시간에 따라 사용한 배지와 공급한 이산화탄소의 농도를 나타낸 그래프이다.
도 3은 이산화탄소의 농도 조절이 가능한 이산화탄소배양기에서 CHO세포를 배양함에 있어 시간에 따라 다른 농도의 이산화탄소를 공급하였을 때의 결과를 나타낸 그래프로서 (가)는 세포의 성장특성을, (나)는 배지의 EPO 생산량 변화를 나타낸 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 세포를 충분히 성장시키고 세포 주기를 G1 phase에 멈추게 하는 단계(단계1)와 재조합 단백질 생산단계(단계2)의 두단계로 구성되며, 각 단계별로 사용하는 배지와 공급하는 이산화탄소의 농도를 달리 함으로써 배양 배지에 분비되는 목적 단백질의 양을 증가시키게 된다.
이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 단계 1에서 혈청이 포함된 배지를 사용하고 이산화탄소 배양기에 5%의 이산화탄소를 포함한 공기를 공급하여 2 내지 3일 동안 세포를 충분히 성장시킨 다음 이산화탄소 배양기에 공기(0.03%의 이산화탄소를 포함)를 2 내지 3일동안 공급하여 대부분 세포의 세포주기가 G1 phase에 멈추게 유도한다. 이어 단계 2에서 배지를 무혈청 배지로 교환하고 이산화탄소 배양기에 공기(0.03%의 이산화탄소를 포함)를 3내지 4일 동안 공급하여 배양 배지에 많은 양의 목적 단백질이 축적되도록 유도한다.
구체적으로 재조합 에리트로포이에틴(recombinant Erytropoietin. 이하 "EPO"로 한다)를 생산하는 유전자 재조합 세포주(수탁번호 KCTC 0220BP)를 10%의소태아혈청(fetal bovine serum, FBS, GIBCO)이 포함된 IMDM(Iscove's ModifiedDulbecco's Medium, GIBCO사 제품 카탈로그 번호 12200)배지를 사용하고 이산화탄소 배양기에 공기를 공급하여 대부분 세포의 세포주기가 G1 phase에 멈추도록 유도한다. 이어 배지를 무혈청 배지로 교환하고 이산화탄소 배양기에 공기를 공급하여 배지에 분비되는 EPO의 양을 증가시킨다.
상기 이산화탄소의 농도조절이 가능한 세포 배양기에서 이산화탄소의 농도조절은 세포 배양기내로 유입되는 공기중의 이산화탄소의 농도를 조절하는 수단을 포함하며, 이는 공기공급기와 이산화탄소공급기로부터 유출되는 공기와 이산화탄소의 유량의 수동조절로도 가능하며, 또한 공기공급기와 이산화탄소공급기로부터 유출되는 공기와 이산화탄소의 유량을 자동으로 제어하는 자동벨브에 의한 자동조절로도 가능하다. 자동벨브에 의한 자동조절의 경우, 통상의 프로그램 내장이 가능한 마이크로프로세서에 의해 동작되는 통상의 액츄에이터에 의한 밸브의 개폐 등 당업자에게 공지된 수단들로 구성이 가능함은 당연히 이해될 수 있는 것이다.
이때 공급하는 공기내의 이산화탄소의 농도는 단계 1에서는 0.03%(공기) 내지 7%, 단계 2에서는 0.03% 내지 0.1%가 바람직하고, 단계 1에서는 0.03%(공기) 내지 5%, 단계 2에서는 0.03%로 공급하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명에 사용되는 동물세포로는 중국산 햄스터 난소(CHO, Chinese hamster ovary, 이하 'CHO'라 한다)세포를 포함하여 외래 단백질의 생산을 위하여 유전자 조작된 동물세포이면 어느 것이든지 가능하며, 외래 단백질도 EPO에만 한정되지 않고 분비 단백질이면 어느 것이든지 사용될 수 있으나 당쇄를 가지고 분비되는 단백질이 사용되는 것이 더욱 바람직하다.
또한 무혈청 배지로는 이미 공지된 바 있는 LSF 배지(대한민국 특허출원 제97-7188호, 등록번호 220090)를 포함하여 상품명 CHO-S-SFM II, 또는 상품명 EX-CELLTM301 상과 같이 이미 상업적으로 이용 가능한 무혈청 배지 또는 무단백질 배지는 어느 것이라도 사용될 수 있다.
본 발명의 방법과 같이 단계별로 다른 농도의 이산화탄소를 공급하면서 CHO 세포를 배양하면 통상적인 배양조건으로 단계의 구분 없이 동일농도(통상적으로 총 공기중의 5%)로 이산화탄소를 공급하면서 배양하는 것 보다 EPO의 분비 양을 2배 이상 높일 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것으로 본 발명이 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
여러 농도의 이산화탄소 배양기에서 CHO세포의 성장과 EPO의 분비특성 시험
세포 배양시 공급되는 공기의 이산화탄소 농도에 따른 CHO세포의 성장과 목적 단백질인 EPO의 분비특성을 알아보기 위하여 여러 농도의 이산화탄소가 공급되는 배양기를 사용하여 CHO세포배양을 수행하였다.
먼저 EPO를 생산하도록 형질 전환된 CHO세포를 IMDM에 10%의 소 태아혈청(FBS)이 포함된 배지를 사용하여 40개의 T-25 플라스크(NUNC사 제품)에 포기세포농도가 5x105세포수/T-25 가 되도록 접종한 후, 온도는 37℃로 유지되며, 5%의 이산화탄소를 함유한 공기가 공급되는 배양기에 넣어 배양을 시작하였다.
배양후 세포농도가 1x106세포수/T-25 이 되었을 때 T-25 플라스크의 배지를 제거하고 PBS(GIBCO 사 제품) 완충액으로 한번 세척한 후 무혈청 배지인 LSF 배지를 4㎖씩 넣어주고 0.03%, 0.5%, 1%, 3%, 5%의 이산화탄소를 함유한 공기가 공급되는 배양기에 각각 8개씩의 T-25 플라스크를 넣어 배양하였다. 이때 각 배양기의 온도는 모두 37℃로 유지하였다. 배양 후 6, 22, 30, 46, 70, 80시간에 각각의 배양기에서 한 개씩의 T-25 플라스크를 꺼내어 먼저 배양액을 취하여 원심분리 후 상등액은 -75℃의 냉동고에 보관하였다.
T-25 플라스크의 세포는 트립신을 처리한 후 새로운 LSF 배지 4㎖로 재현탁하여 먼저 트립판블루 염색법으로 살아있는 세포수를 측정하고 에펜돌프 튜브에 1㎖를 취하여 원심분리하여 세포덩어리(pellet)를 얻었다. 여기에 세포분쇄용액 (Tris-HCl 50mM, EDTA 7.5 mM, 0.05% Triton X-100, pH8.4) 100㎕을 넣어 잘 섞은 후 4℃에서 2시간 처리 후 원심분리 하였다. 원심분리 후 상등액은 -75℃의 냉동고에 보관하였다.
실험을 완료 한 후 냉동고에 보관중인 상등액 시료들을 꺼내어 효소면역측정법(ELISA)을 사용하여 배지에 분비된 EPO의 양과 세포내의 EPO양을 정량하였다. 효소면역측정법은 EPO에 대한 단일클론항체와 디클론항체를 사용한 샌드위치법으로 이미 알고 있는 표준액으로 표준직선을 얻고 이 표준직선에 시료액의 흡광도를 대입하여 EPO의 양을 알 수 있는 단백질 정량법이다.
도 1의 (가), (나), (다)에 세포의 성장특성, 배지의 EPO 생산량 변화, 세포내의 EPO 양의 변화를 나타내었다. 0.03%의 이산화탄소가 함유된 공기가 공급된 배양기에서 세포를 배양한 경우, 배양시작 후 30시간까지는 세포성장이 완만히 진행되지만 30시간 이후에는 세포성장이 멈추었으며 세포수도 최대 5x106세포수/T-25 에 불과하였다. 반면에 0.5%, 1%, 3%, 5%의 이산화탄소를 함유한 공기가 공급된 배양기에서 세포를 배양한 경우 배양 시작 6시간 후부터 계속적으로 세포성장이 진행되어 세포수도 최대 15.5x106세포수/T-25 에 도달하였다. 즉 0.03%의 이산화탄소를 함유한 공기가 공급된 배양기에서 세포를 배양하였을 때 최대 세포수는 0.5%이상의 이산화탄소를 함유한 공기가 공급된 배양기에서 배양하였을 때에 비하여 약 1/3에 불과하였다. 반면에 배지에 분비된 EPO양을 비교하여 보면 0.03%의 이산화탄소를 함유한 공기가 공급된 배양기에서 세포를 배양하였을 때가 오히려 0.5%이상의 이산화탄소를 함유한 공기가 공급된 배양기에서 배양하였을 때에 비하여 EPO의 분비량이 많음을 알 수 있었다. 또한 세포내의 EPO양은 0.03%의 이산화탄소를 함유한 공기가 공급된 배양기에서 세포를 배양하였을 때가 0.5% 이상의 이산화탄소를 함유한 공기가 공급된 배양기에서 배양하였을 때보다 높은 수준을 유지하는 것을 알 수 있었다.
이상의 실험으로부터 0.5%이하의 이산화탄소를 함유한 공기의 공급은 세포성장을 억제하지만 0.5% 이상의 이산화탄소를 함유한 공기의 공급은 세포성장에 큰 차이를 나타내지 않았다. EPO의 생산 측면에서 0.5% 이하의 이산화탄소를 함유한공기를 공급하여 배양하는 것이 오히려 0.5% 이상의 이산화탄소를 함유하는 공기를 공급하여 배양하는 것보다 EPO 생산량이 많았다. 따라서 세포성장에는 0.5% 이상의 이산화탄소를 함유하는 공기를 공급하는 것이 유리하고 EPO 생산에는 0.5% 이하의 이산화탄소를 함유하는 공기를 공급하는 것이 유리함을 알 수 있었다.
<실시예 2>
0.03% 와 5%의 이산화탄소를 함유하는 공기가 공급되는 배양기에서 CHO 세포를 배양하였을 때 세포 주기의 변화
0.03%와 5%의 이산화탄소를 함유하는 공기가 공급되는 배양기에서 CHO 세포를 배양하였을 때, 시간의 경과에 따른 세포 주기의 변화를 비교하기 위한 실험을 수행하였다. EPO를 생산하도록 형질전환된 CHO 세포를 IMDM배지에 10%의 소 태아혈청(FBS)이 포함된 배지를 사용하여 10개의 T-25 플라스크(NUNC사 제품)에 초기 세포농도가 2.5x105세포수/T-25가 되도록 접종한 후 온도는 37℃로 유지되며, 5%의 이산화탄소를 함유한 공기가 공급되는 배양기에 넣어 배양을 시작하였다. 3일 배양 후 세포농도가 3x106세포수/T-25이 되었을 때 T-25 플라스크의 배지를 제거하고 PBS(GIBCO사 제품)완충액으로 한번 세척한 후 무혈청 배지인 LSF 배지를 4㎖씩 넣어주고 0.03%, 5%의 이산화탄소를 함유하는 공기가 공급되는 배양기에 각각 5개씩의 T-25 플라스크를 넣어 배양하였다. 이때 각 배양기의 온도는 모두 37℃로 유지하였다. 배양후 23, 48, 72시간에 각각의 배양기에서 한 개씩의 T-25 플라스크를 꺼내어 배지를 제거하고 PBS(GIBCO사 제품)완충액으로 한번 세척한 후 트립신을 처리하였다. 새로운 LSF 배지 4㎖로 재현탁한 후 에펜돌프 튜브에 1㎖를 취하여 원심분리하여 세포덩어리(pellet)를 얻었다. 여기에 PBS(GIBCO사 제품)완충액 1㎖를 넣고 잘 흔든 후 원심 분리하였다. 원심분리 후 상등액은 버리고 여기에 -20℃에 보관중인 75% 에탄올 1㎖를 천천히 넣어 세포를 고정시키고 -75℃의 냉동고에 보관하였다. 실험을 완료한 후 냉동고에 보관중인 시료들을 꺼내어 원심분리 하였다. 상등액을 버리고 여기에 PBS(GIBCO사 제품)완충액 1㎖를 넣고 재현탁한 후 세포의 DNA 염색을 위하여 1㎎/㎖의 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide, SIGMA사 제품) 50㎕를 넣고 암실, 상온에서 1시간동안 반응을 진행하였다. 세포 주기는 플로우 사이토메트리(Flow cytometry, Becton-Dickinson사 제품)를 사용하여 측정하였다.
하기의 표 1에 0.03%와 5% 이산화탄소를 함유한 공기가 공급된 배양기에 세포를 배양하였을 때 세포 주기의 변화를 나타내었다. 0.03%의 이산화탄소를 함유한 공기가 공급된 배양기에서 세포를 배양한 경우에는 배양시간이 지남에 따라 G1 Phase의 비율(percentage)이 점점 높아지고 S phase의 비율이 낮아지는데 비하여 5%의 이산화탄소를 함유한 공기가 공급된 배양기에서 세포를 배양한 경우에는 G1 phase와 S phase, G2/M phase의 비율이 큰 변화 없이 유지되는 것을 알 수 있었다. 즉 0.03%의 이산화탄소를 함유한 공기가 공급된 배양기에서 세포를 배양하였을 때 대부분 세포의 세포 주기가 G1 phase에 멈추는(G1 phase arrest)것을 알 수 있었다.
[표 1]
0.03%(공기) 및 5%의 이산화탄소에서 동물세포 배양시 세포주기의 비율 비교
시간(hrs) 세포주기의 다른 상에서의 비율(%)
공기(0.03% 이산화탄소) 5% 이산화탄소
G0/G1 S G2/M G0/G1 S G2/M
0 35.7 51.5 12.9 35.7 51.5 12.9
23 52.2 32.0 15.8 43.2 44.9 11.9
48 75.8 23.9 0.3 40.2 52.5 7.3
72 74.9 24.8 0.3 49.7 28.6 21.7
이상의 실험으로부터 <실시예 1>에서 본 바와 같이 0.03%의 이산화탄소를 함유한 공기가 공급된 배양기에서 세포를 배양하였을 때 오히려 0.5%이상의 이산화탄소를 함유한 공기가 공급된 배양기에서 배양하였을 때에 비하여 EPO의 분비량이 많았고, 세포내의 EPO양이 높았던 것은 0.03%의 낮은 농도의 이산화탄소를 함유한 공기가 공급된 배양기에서 세포를 배양하였을 때 많은 세포들의 세포주기가 G1 phase에 멈추게 되고 이때 재조합 단백질인 EPO의 생산이 크게 증가하기 때문인 것을 알 수 있었다.
<실시예 3>
0.03%와 5%의 이산화탄소를 함유한 공기가 공급되는 배양기에서 CHO세포를 배양하였을 때 분비된 EPO의 생체내 생활성(in vivobioactivity)
0.03%와 5%의 이산화탄소가 공급되는 배양기에서 CHO 세포를 배양하였을 때 배지로 분비된 EPO의 생체내 생활성을 비교하기 위한 실험을 수행하였다. EPO를 생산하도록 형질 전환된 CHO 세포를 IMDM배지에 10%의 소 태아혈청(FBS)이 포함된 배지를 사용하여 2개의 T-25플라스크(NUNC사 제품)에 초기 세포농도가 5x105세포수/T-25가 되도록 접종한 후 온도는 37℃로 유지하며, 5%의 이산화탄소를 함유한 공기가 공급되는 배양기에 넣어 배양을 시작하였다. 3일 배양 후 세포농도가 5x106세포수/T-25 이 되었을 T-25플라스크의 배지를 제거하고 PBS(GIBCO사 제품)완충액으로 한번 세척한 후 무혈청 배지인 LSF 배지를 4㎖씩 넣어주고 0.03%, 5%의 이산화탄소를 함유한 공기가 공급되는 배양기에 각각 1개씩의 T-25 플라스크를 넣어 배양하였다. 이때 각 배양기의 온도는 모두 37℃로 유지하였다. 48시간 경과 후 각각의 배양기에서 T-25 플라스크를 꺼내고 여기서 배양액을 취하여 원심분리 후 3㎖의 상등액을 취하였다. 상등액을 4℃ 저온실에서 PBS(GIBCO사 제품)완충액으로 투석(dialysis)하고 생체내 생활성 측정시험(in vivobioactivity assay)을 수행하였다. 생체내 생활성 측정시험은 레티큘로사이트(reticulocyte)측정법으로 수행하였다(Barbone AG et al., J. Pharmaceutical & Biomedical Analysis, 12, 515, 1994를 참조).
하기의 표 2에 0.03%와 5%의 이산화탄소를 함유한 공기가 공급된 배양기에 세포를 배양하였을 때 배지에 분비된 EPO의 생체내 생활성(in vivobioactivity)을 나타내었다. 0.03%의 이산화탄소를 함유한 공기가 공급된 배양기에 세포를 배양하였을 때 분비된 EPO의 양이 5% 이산화탄소를 함유한 공기가 공급된 배양기에 세포를 배양하였을 때보다 약 2배 이상 높았지만 EPO의 생체내 생활성은 공급된 이산화탄소 농도와 관계없이 비슷한 수준을 보였다.
[표 2]
0.03%(공기) 및 5%의 이산화탄소에서의 CHO세포로부터 분비된 EPO의 생체내생활성
이산화탄소(%) 배지의 EPO 농도(㎍/㎖) EPO의 생활성 (x105IU/㎎)
0.03(공기) 17.3±1.2 1.27±0.1
5 7.8±0.4 1.34±0.1
이상의 실험으로부터 0.03%의 이산화탄소를 함유한 공기가 공급된 배양기에 세포를 배양하였을 때 배지에 분비된 EPO의 생활성은 5%의 이산화탄소를 함유한 공기를 공급한 배양기에서 세포를 배양하였을 때와 같이 높은 것을 알 수 있었다.
<실시예 4>
단계별로 다른 농도의 이산화탄소를 공급하면서 CHO세포를 배양하였을 때 재조합 단백질의 생산성 증가 확인 실험
단계별로 다른 농도의 이산화탄소를 함유한 공기(0.03 또는 5%의 이산화탄소)를 공급하면서 CHO세포를 배양하였을 때 배지에 분비된 EPO의 양과 특성을 알아보는 실험을 수행하였다. 실험에 사용한 배지와 공급한 이산화탄소의 농도는 도2에 나타내었다. 배양은 크게 두 단계로 나누어지며 각 단계마다 공급되는 이산화탄소의 농도를 달리하면서 실험하였다. 단계 1에서는 혈청이 포함된 배지를 사용하고 이산화탄소 배양기에 5%의 이산화탄소를 함유하는 공기를 공급하여 2일 동안 세포를 성장시킨 후 다시 이산화탄소 배양기에 공기(0.03% 이산화탄소)또는 5%의 이산화탄소를 함유하는 공기를 3일 동안 공급하여 세포를 계속 성장시키거나 세포의 세포주기를 G1 phase에 멈추게 한다. 이어서 단계 2에서 배지를 무혈청 배지로 교환하고 이산화탄소 배양기에 공기(0.03% 이산화탄소)또는 5%의 이산화탄소를 함유한 공기를 3일 동안 공급하면서 배지에 축적되는 재조합 EPO의 양을 비교하였다.실험방법을 자세히 설명하면 먼저 EPO를 생산하도록 형질 전환된 CHO세포를 IMDM배지에 10%의 소 태아혈청(FBS)이 포함된 배지를 사용하여 50개의 T-25플라스크(NUNC사 제품)에 초기세포농도가 2.5x105세포수/T-25 가 되도록 접종한 후 온도는 37℃로 유지되며, 5%의 이산화탄소를 함유한 공기가 공급되는 배양기에서 배양을 시작하였다. 2일 배양 후 T-25 플라스크를 6개의 그룹으로 나누어 도 2에서와 같이 다른 농도의 이산화탄소를 함유한 공기(0.03 또는 5% 이산화탄소)가 공급되는 이산화탄소 배양기에서 배양을 실시하였다. 3일 동안 배양 후 배양중인 T-25 플라스크의 배지를 제거하고 PBS(GIBCO사 제품)완충액으로 한번 세척한 후 무혈청 배지인 LSF 배지를 4㎖씩 넣어주고 3일 동안 배양하였다. 총 8일 동안 배양하면서 매일 각 그룹의 배양기에서 한 개씩의 T-25플라스크를 꺼내어 배양액을 취하고 원심분리 후 상등액은 -75℃의 냉동고에 보관하였다. T-25 플라스크의 세포는 트립신으로 처리한 후 새로운 LSF 배지 4㎖로 재현탁하여 트립판블루 염색법으로 살아있는 세포수를 측정하였다. 실험을 완료한 후 냉동고에 보관중인 상등액 시료들을 꺼내어 효소면역측정법(ELISA)을 사용하여 배지에 분비된 EPO의 양을 정량하였다.
하기의 표3에 실험결과를 정리하였고, 도 3의 (가)와 (나)에 세포의 성장특성, 배지의 EPO 생산량 변화를 나타내었다.
[표 3]
최대생존 세포수, 배지의 EPO 농도, 특정 EPO 분비율 및 다른 이산화탄소환경에서 얻어진 EPO의 부피 생산성
실험번호 최대 생존 세포수(x106cells/T-25) 배지의 EPO 농도t=190hrs(㎍/㎖) 특정 EPO 분비율qEPO(㎍/106cells·hr) EPO의 부피생산성(㎍/㎖·hr)
1 23.2 32.9±4.4 0.08 0.17
2 20.0 64.4±2.4 0.20 0.34
3 16.7 71.1±1.7 0.24 0.37
4 8.6 62.4±5.4 0.47 0.33
5 3.1 25.5±3.4 0.45 0.13
6 9.0 22.6±4.0 0.19 0.12
상기 표 3에서 보는 바와 같이, 최대 세포농도는 최소 4일동안 계속해서 5%의 이산화탄소를 함유한 공기를 공급하는 것(실험번호 1과 2)이 그렇지 않은 경우에 비하여 2배 이상 높았다. 그러나 8일 배양 후 배지에 분비된 EPO의 양과 생산성은 단계 1에서 5%의 이산화탄소를 함유한 공기를 4일 이상 공급하여 세포를 충분히 성장시킨 후 다시 공기를 공급하여 배양하고, 단계 2에서 공기를 공급하여 배양하였을 때(실험번호 2, 3 및 4)가 단계 1과 2에서 계속 5%의 이산화탄소를 함유한 공기를 공급한 경우(실험번호 1)나 세포를 충분히 성장시키지 않고 공기를 공급하는 경우(실험번호 5), 5%의 이산화탄소를 함유한 공기와 0.03%의 이산화탄소를 함유한 공기를 교대로 공급한 경우(실험번호 6)보다 2배 이상 높았다.
이상의 실험으로부터, 높은 EPO 생산성을 얻기 위한 배양방법은 계속하여 5%의 이산화탄소를 함유하는 공기를 공급하는 것보다 배양을 2 단계로 구분하고 각 단계별로 시간에 따라 다른 농도의 이산화탄소를 공급하는 것임을 알 수 있었고 구체적으로는 먼저 5%의 이산화탄소를 함유하는 공기를 공급하여 세포를 충분히 성장시키고 다시 0.03%의 이산화탄소를 함유한 공기를 공급하여 대부분 세포의 세포 주기를 G1 phase에 멈추게 한 후(실시예 2 참조) 배지를 생산배지로 교환하고 공기를 공급하면서 배양하는 것이 가장 높은 EPO의 생산량을 얻을 수 있음을 확인하였다.
이상에서 살펴본 바와 같이 동물세포를 배양할 때 먼저 배양기에 5%의 이산화탄소를 함유한 공기를 공급하여 세포를 충분히 성장시킨 다음 공기(0.03% 이산화탄소)를 공급하여 세포를 배양하면 대부분 세포의 세포 주기가 G1 phase에 멈추게 되고 그 결과로서 배지에 분비되는 재조합 단백질의 생산량과 생산성을 최소 2배 이상 증가시킬 수 있어 재조합 단백질의 대량생산이 가능한 유용한 발명이다.

Claims (7)

  1. 이산화탄소 배양기에서 동물세포를 배양함에 있어, 성장배지를 사용하는 제 1단계와 생산배지를 사용하는 제 2단계로 이루어지고, 각 단계별로 다른 농도의 이산화탄소를 공급하여 재조합 단백질을 생산하는 것을 특징으로 하는 동물세포 배양방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 동물세포는 중국산 햄스터 난소 유래인 것을 특징으로 하는 상기 동물세포 배양방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 동물세포가 에리스로포이에틴(EPO)을 생산하는 동물세포임을 특징으로 하는 상기 동물세포 배양방법.
  4. 제 1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제 1 단계의 성장배지는 1 내지 20%의 소 태아 혈청(FBS)를 함유하고, 제 2단계의 생산 배지는 무혈청 배지인 것을 특징으로 하는 상기 동물세포 배양방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 이산화탄소 배양기가 각 단계에서 시간에 따라 공급되는 이산화탄소 농도를 조절할 수 있는 이산화탄소 배양기임을 특징으로 하는 상기 동물세포 배양방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 세포 배양으로 부착배양을 이용하는 것을 특징으로 하는 상기 동물세포 배양방법.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 제 1단계에서 먼저 0.5 내지 7%의 이산화탄소를 함유하는 공기를 공급하고, 상기 제 2단계에서 0.03% 내지 0.1%의 이산화탄소를 함유하는 공기를 공급하는 것을 특징으로 하는 상기 동물세포 배양방법.
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