KR20190142111A - 혈액응고인자 VII/VIIa 또는 이의 융합단백질의 제조 방법 - Google Patents

혈액응고인자 VII/VIIa 또는 이의 융합단백질의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 재조합 인간 혈액응고인자 VII/VIIa 또는 이의 융합단백질의 제조방법과 활성분획의 분석 및 분리 방법에 관한 것으로, 구체적으로, 인간 혈액응고인자 VII/VIIa 또는 이의 융합단백질을 생산하는 세포의 배양단계에 있어 배양 온도 및 첨가물의 조절을 통해 단백질의 함량 및 활성분획의 비율을 증가시킬 수 있다. 또한, 본원은 상기 배양액 내에 활성분획의 함량 분석법을 제공하며, 음이온 교환수지 컬럼크로마토그래피를 사용하여 활성 정도가 상이한 활성분획의 분리 및 정제 방법을 제공한다. 이에 따라, 재조합 인간 혈액응고인자 VII/VIIa 또는 이의 융합단백질의 품질 및 생산성을 향상시킬 수 있다.

Description

혈액응고인자 VII/VIIa 또는 이의 융합단백질의 제조 방법 {Method for production of coagulation factor VII/VIIa or fusion proteins thereof}
본 발명은 재조합 인간 혈액응고인자 VII/VIIa 융합단백질 (human coagulation factor VII/VIIa)의 제조를 위한 세포의 배양 방법과 활성분획의 분석 및 분리 방법에 관한 것이다.
혈액응고인자 VII은 혈액응고의 외인성 경로 (extrinsic pathway)에 관여하는 인자이다 (J. Biol. Chem. (1980) 255:1242-1247; Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. (2007) 27:1687-1693). 혈액응고인자 VII은 간에서 단일가닥의 폴리펩티드로 만들어지고, 152번 아르기닌과 153번 이소류신 사이에 절단이 일어나 두 가닥의 폴리펩티드가 이황화 결합으로 연결되는 활성화 반응이 일어난다 (Thromb. Res. (1981)22:375?380; Proc. Natl. Acad. Sci. (1986) 83:2412-2416). 활성화된 재조합 인간 혈액응고인자 VIIa (human recombinant factor VIIa)는 혈액응고인자 VIII 또는 IX에 대해 항체가 형성된 혈우병 환자들의 치료제로 사용되고 있다 (Semin. Hematol. (2008) 45: S7-S11).
혈액응고인자 VII의 N-말단에 위치한 Gla 도메인의 10개의 글루탐산에 감마-카르복실화가 일어난다는 것이 알려져 있다. 이러한 감마-카르복실화는 이 영역에 대한 칼슘 이온의 결합에 중요한 역할을 하고, 이와 관련하여 혈액응고인자 VII의 세포막 결합에 필수적이기 때문에, 결과적으로 혈액응고인자 VII의 활성에 중요한 역할을 수행한다. 재조합 혈액응고인자 VII을 발현하는 세포 내에서 감마-카르복실화는 비타민 K에 의존하며, 비타민 K가 결핍된 배양 조건에서 발현된 혈액응고인자 VII의 활성은 그렇지 않은 경우에 비해 크게 낮다고 보고되었다 (Br. J. Haematol. (1996) 93:445-450). 포유동물 세포에서 재조합 혈액응고인자 VII을 다량으로 생산하고자 할 경우, Gla 도메인의 감마-카르복실화가 충분히 일어나지 못하여 불활성단백질을 생성하게 되는 문제가 발생한다. 이를 해결하기 위하여 감마-카복실화 과정에 관여하는 효소인 인간 비타민 K 에폭사이드 환원효소 소단위 1 (vitamin K reductase complex subunit 1, VKORC1)을 세포 내에 도입하여 발현함으로써 발현된 혈액응고인자 VII의 활성을 증가시킨 사례가 있다 (특허 10-2007-0110106 참조). 하지만, 현재까지 동물 세포에서 감마-카르복실화를 증가시킬 수 있는 배양 조건에 대한 사례는 알려져 있지 않다.
포유동물 세포에서 다량으로 생산된 재조합 혈액응고인자 VII에는 감마-카르복실화가 충분히 일어나지 않은 불활성 재조합 인간 혈액응고인자 VII이 혼합되어 있고, 이 혼합물에서 감마-카르복실화 정도에 따라 단백질을 분리 제거하여 충분히 감마-카르복실화된 단백질을 분리하는 방법이 요구된다. Gla 도메인에 감마-카르복실화가 일어나게 되면, 카르복실기의 특성에서 유래한 음전하가 증가하게 되고, 또한 Gla 도메인의 구조 변화를 통해 칼슘 결합력이 증가하게 된다. 이러한 특성을 이용한 정제 방법으로 세라믹 히드록시아파타이트 컬럼크로마토그래피가 사용된 사례가 있다 (특허 US20090047723 참조). 세라믹 히드록시아파타이트는 혼합 방식 크로마토그래피에 사용되는 물질로서, 음전하를 띠는 인산기와 양전하를 띠는 칼슘 이온을 모두 함유하고 있고, 이 레진에 결합된 인간 혈액응고인자는 고농도의 인산나트륨(sodium phosphate)과 염화나트륨을 사용하여 용출 가능하다. 이와 유사한 방법으로 세라믹 플루오르아파타이트 젤을 고정상으로 하는 혼합 방식 크로마토그래피를 사용하여 인간 혈액응고인자 VII를 포함하는 융합단백질의 분리 및 정제 사례가 있다 (공개 특허 10-2016-0103965).
활성을 지닌 재조합 인간 혈액응고인자 VIIa 제조에 대한 감마-카르복실화의 중요성을 고려하면, 감마-카르복실화를 증가시키는 배양 조건 및 이를 분석할 수 있는 분석법의 확립이 요구된다. 증가된 감마-카르복실화 효율은 전체 발현 단백질 중 활성을 지닌 재조합 인간 혈액응고인자 VIIa의 비율을 증가시켜, 해당 단백질의 제조 생산성을 높이는데 기여할 것이다. 또한, 세포 배양 과정에서 생성되는 비활성 재조합 인간 혈액응고인자 VII를 분리 제거하여 활성을 지닌 재조합 인간 혈액응고인자 VIIa를 확보할 수 있는 정제 방법의 개발도 아울러 요구된다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 인간 혈액응고인자 VII 융합단백질을 생산하는 포유동물 세포의 배양 조건을 최적화시킴으로써, 배양액 중에 활성을 지닌 인간 혈액응고인자 VII 융합단백질 함량이 증가되는 것을 확인하였다. 또한, 활성형 VII/VIIa 또는 이의 융합단백질의 분석법을 개발하였고, 이를 통해 재조합 혈액응고인자 VII/VIIa 또는 이의 융합단백질에서 활성을 향상시키는 배양 조건을 확인하였다. 아울러 활성형 혈액응고인자 VII/VIIa 또는 이의 융합단백질의 분리 정제 방법을 개발하였고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 인간 재조합 혈액응고인자 VII/VIIa 또는 이의 융합단백질의 제조 방법과 VII/VIIa의 분석 및 분리 정제법을 제공하는 것이다.
구체적으로, 인간 재조합 혈액응고인자 VII/VIIa 또는 이의 융합단백질이 생성되는 세포주 배양액에서 활성형 인간 재조합 혈액응고인자 VII/VIIa의 함량을 증가시킴으로써, 활성이 향상된 인간 재조합 혈액응고인자 VII/VIIa 또는 이의 융합단백질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다. 아울러, 활성형 혈액응고인자 VII/VIIa 또는 이의 융합단백질의 분석 방법 또는 분리 정제 방법을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이하에서는, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
한편, 본원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 할 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
상기 과제를 해결하기 위한 하나의 양태로서 본 발명은, 인간 혈액응고인자 VII/VIIa 또는 이의 융합단백질을 발현하는 세포를 34 내지 38℃ 의 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 인간 혈액응고인자 VII/VIIa 또는 이의 융합단백질의 제조 방법을 제공한다.
본원에서 용어 '인간 혈액응고인자'는 상처로 인한 출혈 시 혈액 응고를 통해 신체를 보호하는 작용을 하는 혈액응고 관련 단백질로, 혈액응고는 이러한 단백질의 12인자가 관여하여 일어나는 일련의 반응이다. 본 발명의 목적상 본 발명은 혈액 응고인자 중 VII인자를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, '인간 혈액응고인자 VII'는 프로콘버틴(Proconvertin)이라고도 하며, 간에서 합성하며 분자량은 50,000 Da를 갖는 열에 불안정한 단백질로 혈액 내 농도는 0.5 ㎍/㎖인 단백질이다(Bajaj SP et al. JBC (1981) 256:253 Bauer KA et al. Haemostatsis (1996) 26 (suppl 1):155). 이와 같은 혈액응고인자 VII는 VIIa로 활성화시켜 혈액 응고를 시킬 수 있는 혈액 응고제로 사용될 수 있다. 혈액응고인자 VII인자 및 혈액 응고인자 VIIa는 공지의 서열과 70%, 80%, 90%, 95% 바람직하게는 97%의 서열 상동성을 갖는 단백질이면 제한 없이 포함한다. 또한, 상기 단백질은 실질적으로 혈액응고인자 VIIa의 생물학적 활성을 보유하고 있는 한, 일부 변형된 아미노산 서열, 예를 들어, 말단 아미노산 결실 또는 부가를 포함하는 변형된 N-말단 또는 C-말단을 갖는 단백질을 포함한다.
본원에서 용어 'VII/VIIa'는 비활성화된 전구체 형태(혈액응고인자 VII), 활성화된 형태(혈액응고인자 VIIa), 또는 이의 혼합 형태로 이루어진 치료학적 단백질을 의미한다. 본원에서는 활성화 과정을 통해 다량의 VIIa가 생성되는 VII/VIIa을 제조하는 것을 목적으로 한다.
혈액응고인자 VII가 활성화된 형태 VIIa으로 변환되는 활성화 과정에 있어서, '감마-카르복실화'된 VII/VIIa의 양이 많을수록 유리하다. 여기에서 '감마-카르복실화'는 글루탐산의 감마 위치에 하나의 카르복실기가 공유결합으로 연결되는 반응을 의미한다. 본원의 제조방법에서 수득되는 배양액에는 활성분획의 함량이 많으므로, 혈액응고인자 VII의 '감마-카르복실화'가 높은 수준으로 나타난 것으로 볼 수 있다.
본원에서 인간 혈액응고인자 VII/VIIa 또는 이의 융합단백질은 당업계에서 사용되는 유전자 재조합 기술에 의해 세포주로부터 생산된다. 본원의 제조방법에서는 특히 세포주의 배양조건을 조절하여, 배양액 내에 활성분획의 함량을 증가시킨 점에 특징이 있다.
본원의 제조방법은, 인간 혈액응고인자 VII/VIIa 또는 이의 융합단백질을 발현하는 세포를 34℃ 내지 38℃의 온도에서 배양하는 단계를 포함한다. 구체적으로, 상기 온도는 35℃ 내지 37℃일 수 있다. 상기 범위의 온도 하에서 혈액응고인자 VII/VIIa의 생산량이 증가될 뿐만 아니라, 활성분획의 함량비가 증가된다.
관련하여 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 배양 온도 증가에 따라 재조합 인간 혈액응고인자 VII/VIIa의 융합단백질의 발현량이 증가됨을 확인하였다(실시예 1). 또한, 본 발명의 다른 일 실시예에서는, 35℃ 및 37℃의 온도 하에서 배양할 경우, 활성분획을 높은 비율로 분리함을 확인할 수 있었다(실시예 2). 한편, 38℃를 초과하는 온도에서는 단백질이 변성될 수 있으며, 35℃ 미만의 온도에서는 세포의 성장이 더디므로 인간 혈액응고인자 VII/VIIa의 융합단백질의 발현량이 적게 나타날 수 있다.
본원에서 배양법은 당업계에 공지된 방법이라면 제한되지 않고 사용될 수 있으며, 회분 배양법 (batch culture), 반복 회분 배양법 (repeated batch culture), 유가 배양법 (fed-batch culture), 반복 유가 배양법 (repeated fed-batch culture), 연속 배양법 (continuous culture) 및 관류 배양법 (perfusion culture)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법에 의해 배양될 수 있다.
구체적으로, 세포 배양 방법은 회분 배양법 (batch culture), 연속 배양법 (continuous culture), 유가 배양법(fed-batch culture) 으로 분류되는데, 이 중 회분 배양법은 배지에 소량의 종배양액을 첨가하고, 배양 중에 새롭게 배지를 추가하거나 또는 배양액을 배출하거나 하지 않고, 세포를 증식시키는 배양 방법이다. 연속 배양법은 배양 중에 연속적으로 배지를 추가하고, 또한 연속적으로 배출시키는 배양 방법이다. 또, 연속 배양법에는 관류 배양 (perfusion culture)도 포함된다. 유가 배양법은 회분 배양법과 연속 배양법의 중간에 해당되므로, 반(半) 회분 배양법 (semi-batch culture) 이라고도 불리고, 배양 중에 연속적으로 또는 축차적으로 배지가 추가되는데, 연속 배양법과 같은 연속적인 배양액의 배출이 실시되나 세포의 유출이 되지 않는 배양 방법이다. 본 발명에서 어느 배양 방법을 사용해도 되는데, 구체적으로 유가 배양법 또는 연속 배양법이 사용될 수 있고, 보다 구체적으로는, 유가 배양법이 사용될 수 있다.
상기 세포를 배양하는 배지는 세포가 증식하며 목적하는 단백질을 합성하기에 적합한 환경이 요구된다. 상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 탄소원의 예에는, 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유 및 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산 및 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤 및 에탄올과 같은 알코올 및 아세트산과 같은 유기산이 포함된다, 이들 탄소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원의 예에는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL) 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기질소원이 포함된다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 그 외에, 아미노산, 비타민 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다.
또한, 상기 배지는 염화칼슘을 포함할 수 있다. 인간 혈액응고인자 VII/VIIa 또는 이의 융합단백질을 발현하는 세포가 염화칼슘이 포함된 배지 내에서 배양될 경우, 활성분획이 높은 비율로 분리될 수 있다. 구체적으로, 배지는 염화칼슘을 0.5 내지 5 mM, 구체적으로 0.5 내지 4 mM, 보다 구체적으로 0.5 내지 3mM만큼 포함할 수 있다. 상기의 농도로 염화칼슘이 포함된 배지 하에서 배양될 때, 혈액응고인자 VII에 감마-카르복실화가 나타나며, 활성형 혈액응고인자 VIIa로의 변환이 증가된다. 상기 농도보다 높은 농도일 경우 세포의 생존율이 저하되어 생성되는 단백질의 양이 감소되는 문제가 발생할 수 있다. 본원의 일 실시예에 따르면, 염화칼슘이 1.0, 1.5, 2.0, 및 2.5 mM 포함된 배지 하에서 세포를 배양할 경우, 염화칼슘이 포함되지 않은 배지에서 배양하는 경우와 비교하여 배양액의 활성분획의 함량이 증대되었다(실시예 3).
본원에서 재조합 혈액응고인자 VII 융합단백질의 발현에 사용하는 동물 배양 세포는 포유동물 세포가 바람직하다. 구체적으로, CHO 세포, HEK 세포, COS 세포, 3T3 세포, 미엘로마 세포, BHK 세포, HeLa 세포, Vero 세포 등 일반적으로 사용되고 있는 동물 배양 세포를 사용할 수 있다. 보다 구체적으로, 대량 발현을 목적으로 하는 경우에는, 특히 CHO 세포가 바람직하다. 또한, 원하는 단백질을 제조하기 위해서는, 특히, DHFR 유전자를 결손한 CHO 세포인 dhfr- CHO 세포 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77:4216-4220)나 CHO K-1 세포 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60:1275-1281) 등 원하는 유전자를 도입하는 데에 적합한 세포인 것이 바람직하다. 상기 CHO 세포로는 특히, DG44 주, DXB-11 주, K-1 주 또는 CHO-S 주가 바람직하고, 특히 K-1 주가 바람직하고 숙주 세포로의 벡터의 도입은 인산칼슘법, DEAE 덱스트란법, 일렉트로 포레이션법, 리포펙션 등의 방법으로 실시하는 것이 가능하다.
상기 세포는 인간 혈액응고인자 VII/VIIa 또는 이의 융합단백질을 코딩하는 염기서열을 포함하는 벡터가 도입된 것일 수 있다. 본 발명에서 용어, '벡터'는 숙주 세포로 염기의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있다. 여기에서 '복제단위'란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제가능한, 임의의 유전적 단위 (예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. 상기 벡터는 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 숙주 세포로 염기를 도입하기 위한 바이러스 및 비 바이러스 매개물을 포함한다. 용어 '벡터'는 또한 미니구형 DNA를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 벡터는 박테리아 DNA 서열을 갖지 않는 플라스미드일 수 있다.
본원에서 '인간 혈액응고인자 VII/VIIa의 융합단백질' 또는 '인간 혈액응고인자 VIIa의 융합단백질'은 인간 혈액응고인자에 임의의 단백질이 연결된 융합단백질을 의미하는 것으로서, 혈액응고인자 VII의 활성을 보유하고 있는 단백질을 의미한다. 융합단백질은 단백질 연결에 따라 생체 내 지속성이 증대되거나 약리 활성이 증대될 수 있다.
구체적으로, 상기 융합단백질은 생체 지속성 캐리어와 혈액응고인자가 직접 연결되어 있거나, 펩타이드 링커를 통해 연결된 것일 수 있다. 생체 지속성 캐리어가 결합된 융합단백질은 혈액응고인자 단독물질과 비교하여 생체 내 반감기가 증대될 수 있다.
여기에서 '생체 지속성 캐리어'는 결합된 혈액응고인자의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 폴리펩타이드를 의미한다. 예를 들어, 알파-1 안티트립신 변이체, 면역 글로불린 Fc, 알부민, 항체나 이의 절편이 이에 해당될 수 있다. 본원의 일 실시예에서는 구체적으로 알파-1 안티트립신 변이체가 혈액응고인자 VII/VIIa에 결합된 융합단백질이 제조되었다.
상기 펩타이드 링커는 1 내지 10개의 아미노산, 1 내지 20개의 아미노산 및 구체적으로 1 내지 50개의 아미노산을 포함할 수 있다. 전형적으로, 링커는 표적 단백질 결합 도메인 또는 혈액응고인자의 기능을 방해하지 않도록 선택되거나 디자인된다. 상기 링커는 바람직하게 혈액응고인자의 발현 수준 및/또는 적절한 표적과의 결합을 증가시키기 위해 선택된다.
본원에서 '활성분획'이라 함은 상기 세포 배양액으로부터 얻을 수 있는 분획 중에 활성을 나타내는 것을 의미한다. 구체적으로, 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있는 분획 중에 활성을 나타내는 것을 의미한다. 보다 구체적으로, 고정상으로 강 음이온 교환수지를 사용하여 분리한 2개의 분획 중에, 높은 활성을 갖는 분획을 의미한다. 통상적으로 강 음이온 교환수지를 사용하였을 때 나중에 분리되는 분획을 의미할 수 있다. 이는 활성분획에 감마-카르복실화된 단백질 또는 당화된 단백질의 함량이 높아 강 음이온 교환수지와 강한 결합을 나타내는 점에 기인한다. 여기에서 강 음이온 교환수지는 당업계에서 사용되는 것이면 제한되지 않고 사용될 수 있다. 구체적으로, 강 음이온 교환 수지는 Q-세파로스ㅡFF 젤, DEAE-세파로스, Capto-Q, 및 Capto-DEAE에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 비활성분획이란 상기 세포 배양액으로부터 얻을 수 있는 분획 중에 활성분획을 제외한 분획을 의미한다.
본원의 일 실시예에 따르면, 배양액을 SAX-NP10 (Proteomix) 컬럼을 사용한 HPLC로 분리하였고, 활성분획인 B영역과 비활성분획인 A영역의 비율을 측정할 수 있었다(실시예 2 및 3).
인간 혈액응고인자 VII는 활성화되어 VIIa의 형태로서 인간 혈액응고인자 X를 활성화시키는 역할을 하므로, 활성분획이 나타내는 VIIa의 활성은 인간 혈액응고인자 X를 활성화시키는 능력에 따라 판단된다.
본원에서 활성분획은 비활성분획과 비교하여 10배 이상으로, 구체적으로 15 배 이상으로, 보다 구체적으로 16배 이상으로 인간 혈액응고인자 X에 대한 활성을 나타낼 수 있다.
본원의 일 실시예에서 활성분획인 B 분획과 비활성분획인 A 분획이 갖는 VIIa의 활성을 측정 하였다(Proc. Natl. Acad. Sci. (2001) 98:13583-13588). 그 결과 B 분획의 활성이 A 분획과 비교하여 16.2배의 활성이 나타났다(실시예 4).본원의 제조방법에서는 활성분획의 비율을 증가시킴에 따라 우수한 품질의 인간 혈액응고인자 VII/VIIa 또는 이의 융합단백질을 제공할 수 있다. 본원에서 활성분획은 감마-카르복실화 및/또는 당화된 단백질을 많이 포함하고 있어, 활성화 단계에 있어 인간 혈액응고인자 VII가 VIIa로 용이하게 변환될 수 있다.
본원의 제조방법은 상기 '활성분획'의 함량을 분석하는 단계를 포함할 수 있다. 구체적으로, 음이온 컬럼크로마토그래피나 HPLC와 같은 컬럼크로마토그래피에 의해 활성분획을 분리하여 함량을 분석할 수 있다. 보다 구체적으로, 고정상으로 강 음이온 교환수지를 갖는 컬럼크로마토그래피를 사용하여 활성분획을 분리할 수 있고 이의 함량을 분석할 수 있다. 여기에서 강 음이온 교환수지는 당업계에서 사용되는 것이면 제한되지 않고 사용될 수 있다. 구체적으로, 강 음이온 교환 수지는 Q-세파로스ㅡFF 젤, DEAE-세파로스, Capto-Q, 및 Capto-DEAE에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
이와 같이 활성분획을 분석하는 상기 단계는 본원에서 배양하는 단계와 함께 수행될 수도 있으나, 이와 독립적으로 수행될 수도 있다.
본원의 제조방법은, 상기 활성분획으로부터 재조합 인간 혈액응고인자 VII/VIIa 융합단백질을 정제하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 과제를 해결하기 위한 하나의 양태로서 본 발명은, 인간 혈액응고인자 VII/VIIa 또는 이의 융합단백질을 발현하는 세포를 34 내지 38℃의 배지에서 배양하는 제1단계; 및 제1단계에서 수득되는 배양액으로부터 활성분획을 분리 및 정제하는 제2단계를 포함하는, 인간 혈액응고인자 VII/VIIa 또는 이의 융합단백질의 제조 방법을 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 앞서 설명한 바와 같다.
제2단계를 통하여, 활성분획을 수득할 수 있다.
활성분획의 분리에는 전술한 바와 같이, 상기 배양액을 음이온 컬럼크로마토그래피 및/또는 고성능액체크로마토그래피(HPLC)가 사용될 수 있다. 상기 음이온 컬럼크로마토그래피 및 고성능액체크로마토그래피(HPLC)에서 고정상은 강 음이온 교환수지일 수 있으며, 구체적으로, 강 음이온 교환 수지는 Q-세파로스ㅡFF 젤, DEAE-세파로스, Capto-Q, 및 Capto-DEAE에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.보다 구체적으로, 상기 음이온 컬럼크로마토그래피에서 pH 5.0 내지 8.0의 수성 완충액을 사용할 수 있으며, 구체적으로 pH 6.5 내지 7.0의 수성 완충액을 사용할 수 있다.
제2단계에서 분리되는 활성분획으로부터 추가적으로 재조합 인간 혈액응고인자 VII/VIIa를 정제할 수 있다. 구체적으로, 친화성 컬럼크로마토그래피 등의 추가 정제 공정을 거쳐 혈액응고인자 VII/VIIa를 분리할 경우 순도는 95% 이상일 수 있다.
활성분획을 분리하는 상기의 제2단계는 본원에서 배양하는 제1단계와 함께 수행될 수도 있으나, 이와 독립적으로 수행될 수도 있다.
본원의 재조합 인간 혈액응고인자 VII/VIIa 융합단백질 배양 방법에 따르면, 재조합 단백질의 함량을 증가시킬 뿐만 아니라 활성분획을 높은 비율로 수득할 수 있다. 또한, 본원의 활성분획을 분리하거나 분석하는 방법을 통해 재조합 인간 혈액응고인자 VII/VIIa 융합단백질의 생산성을 증가시키고 품질을 확인할 수 있다. 이에 따라, 융합단백질의 대량 제조 및 공급이 가능하다.
도 1은 재조합 인간 혈액응고인자 VII/VIIa 융합단백질을 생산하는 세포에 대한 배양 온도에 따른 세포 성장 및 세포 생존율의 변화를 분석한 그래프이다.
도 2는 배양 온도에 따른 발현양 변화를 SDS-PAGE에서 분석한 그림이다.
도 3은 재조합 인간 혈액응고인자 VII/VIIa 융합단백질을 생산하는 세포 배양액을 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)로 분석한 그래프이다.
도 4의 (a)는 배지의 염화칼슘 농도에 따른 활성분획의 비율을 HPLC로 분석한 그래프이다.
도 4의 (b)는 배지의 염화칼슘 농도와 활성 분획의 비율 간에 관계를 나타내는 그래프이다.
도 5는 Q-세파로스 FF 컬럼크로마토그래피로 분리한 정제 분획의 활성을 분석한 그래프이다. A, B는 각각 정제된 분획 A 또는 분획 B를 사용한 반응을 나타낸다. Control은 단백질 분획을 사용하지 않은 반응 완충용액의 결과를 나타낸다.
도 6은 재조합 인간 혈액응고인자 VII 융합단백질을 생산하는 세포 배양액을 음이온 교환수지 컬럼크로마토그래피 (Q-세파로스 FF 컬럼크로마토그래피)로 분리한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 배양 온도별 활성분획의 비율과 생산성의 관계를 나타낸 그래프이다. B 분획 비율은 HPLC 분석 그래프에서 활성분획의 비율을 나타낸다. 생산성은 배양액 단위 부피당 활성분획의 함량을 나타낸다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.
제조예 : 재조합 인간 혈액응고인자 VII/ VIIa 융합단백질 발현 벡터 및 발현 세포주의 제조
pSGHV0(GenBank Accession No. AF285183)에서 shGH, His tag, TEV site를 제거한 개량 벡터를 이용하여 재조합 인간 혈액응고인자 VII/VIIa 융합단백질을 클로닝하였으며, 단백질 고유의 신호 서열(signal sequence)을 이용하여 세포 외로 분비되도록 하였다. 제조예와 아래 기술한 실시예에서 융합 파트너로는 변형된 인간 유래 알파-1 안티트립신 변이체을 사용하였다 (특허출원공개공보 10-2013-0029713 A호 참조).
또한, 상기 융합단백질을 지속적으로 발현하는 세포주(stable cell line) 구축을 위한 선별마커로 DHFR 시스템을 도입하였으며, 이를 위하여 차이니즈 햄스터의 디히드로엽산 환원효소(Chinese Hamster's dihydrofolate reductase) 유전자를 벡터에 삽입하였다. 발현량 증대를 위해 신호 서열에 Kozac 서열을 추가로 삽입하였다. 그 다음, 이렇게 제조된 클론을 CH0-DG44 세포주에 유전자 도입을 하여, 메토트렉세이트(methotrexate, MTX) 선별을 진행하여, 안정한 세포주를 확보하였다. 다만, 이 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 주어진 상황에 따라 통상적으로 사용되는 벡터 및 세포주를 적절히 선택하여 적용할 수 있다.
실시예 1 : 배양 온도별 재조합 인간 혈액응고인자 VII/ VIIa 융합단백질 발현
재조합 인간 혈액응고인자 VII 융합단백질을 과발현하는 세포를 3개의 125 mL 삼각 플라스크(Erlenmeyer flask)에서 비타민 K와 식물 유래의 가수분해 단백질이 첨가된 배지에 동일한 농도 및 조건으로 접종하고 플라스크는 각각 37℃, 35℃, 32℃ CO2 인큐베이터(incubator)에서 진탕 배양하였다. 실험 조건에 대한 공급 스케줄은 [표 1]에 요약되어 있다. 표 1에서 유가 공급물 부피는 생물반응기 내의 배양 시작 부피의 백분율로서 기재되어 있다.
세포 샘플은 배지에서 매일 취하여 생존 세포수, 세포 생존율, 발현양의 수준을 측정하였다. 생존 세포수와 세포 생존율은 트리판 블루로 염색하여 현미경으로 측정하는 세포 밀도 검사를 이용하여 측정함으로써 계산하였고 발현양은 SDS-PAGE에서 CS Analyzer (ATTO) 분석 프로그램을 사용하여 계산하였다.
실험 조건 37℃ 35℃ 32℃
3일 1.5% 1.5% 1.5%
4일 1.5% 1.5% 1.5%
5일 1.5% 1.5% 1.5%
6일 1.5% 1.5% 1.5%
7일 1.5% 1.5% 1.5%
8일 1.5% 1.5% 1.5%
9일 1.5% 1.5% 1.5%
10일 1.5% 1.5% 1.5%
11일 1.5% 1.5% 1.5%
배양 온도 증가에 의해 세포 생존율은 변화 없지만, 세포 성장이 증가하여 재조합 인간 혈액응고인자 VII/VIIa의 융합단백질 발현량을 증가시켰다(도 1, 도 2 참조).
이와 같은 결과로부터, 배양 온도 증가에 의해 재조합 인간 혈액응고인자 VII/VIIa의 융합단백질의 발현량이 증가됨을 알 수 있었다.
실시예 2 : 배양 온도 조건에 따른 배양액 중에 활성분획의 함량 분석
실시예 1의 배양을 통해 수득되는 배양액에서 활성분획의 함량 분석을 위하여, Alpha-1 Antitrypsin Select (GE Healthcare) 레진을 사용한 컬럼크로마토그래피로 배양액을 정제하였다. 완충용액 A (50 mM Tris-Cl, 150 mM NaCl, pH 7.5)를 사용하여 평형화시킨 Alpha-1 Antitrypsin Select 레진이 채워진 컬럼에 배양액을 로딩하고 동일한 완충용액으로 컬럼을 충분히 씻어 주었다. 단백질 용출은 완충용액 B (50 mM Tris-Cl, 1 M MgCl2, pH 7.5)를 사용하였고, 용출된 단백질의 완충용액 조성을 20 mM Tris-Cl, pH 8.5의 조성으로 교환하였다. 준비된 시료를 SAX-NP10 (Proteomix) 컬럼을 사용한 HPLC로 분리하였다.
SAX-HPLC 컬럼 완충용액의 조건은 하기의 표 2와 같이 진행하였다. 컬럼 완충용액 C의 조성은 20 mM Tris-Cl, pH 8.5이고, 완충용액 D의 조성은 20 mM Tris-Cl, 500 mM NaCl, pH 8.5이다. 배양 온도별 배양액의 SAX-HPLC 분석 결과는 도 3에 나타내었다. SAX-HPLC 결과의 분석은 LabSolution (Shimadzu)을 사용하여 수행하였고, 해당 피크의 영역값을 측정하여 각 분획의 양을 결정하였다 (표 3 참조). 표 3에 나타낸 바와 같이 배양 온도에 따라 A 영역과 B 영역의 비율이 달라지는 것을 확인하였고, 37℃의 배양 조건에서 B 영역의 비율이 가장 높았다. 따라서, SAX-HPLC를 사용하여 각 배양 조건에 따른 활성분획의 함량 차이를 분석할 수 있음을 확인하였다.
Retention time (분) 완충용액 D (%)
0 - 5 20
5 - 85 20 -100
85 - 95 100
95 - 100 20
100 - 115 20
배양 온도 분획 A 영역
(%)		 분획 B 영역
(%)
37℃ 40.1 59.9
35℃ 53.1 46.9
32℃ 37.0 63.0
이와 같은 결과로부터, 인간 혈액응고인자 VII/VIIa 또는 이의 융합단백질을 발현하는 세포를 배양하는 온도가 35℃ 및 37℃인 경우, 배양액 중 활성분획의 비율이 증가함을 알 수 있었다. 분획 B 영역의 활성에 대해서는 실시예 4에서 후술한다.
실시예 3 : 염화칼슘 첨가시 배양액 중에 활성 분획의 함량 분석
재조합 인간 혈액응고인자 VII 융합단백질을 과발현하는 세포를 5개의 125 mL 삼각 플라스크(Erlenmeyer flask)에 동일한 농도 및 조건으로 접종하였다. 플라스크의 배지는 비타민 K와 식물 유래의 가수분해 단백질이 첨가되었고, 각각 0, 1.0, 1.5, 2.0, 및 2.5 mM 염화칼슘을 첨가하여 제조하였다. 세포 접종 후 37℃ CO2 인큐베이터(incubator)에서 진탕 배양하면서, 세포를 회분 배양으로 성장시켰다. 유가 공급물 부피는 실시예 1의 방법으로 결정하였다.
배양액 중에 활성분획의 함량 분석을 위한 시료는, 실시예 2의 방법에 따라 준비하였다.
SAX-HPLC 컬럼크로마토그래피는 실시예 2의 방법으로 진행하였다. 배양 염화칼슘 농도별 배양액의 SAX-HPLC 분석 결과는 도 4에 나타내었다. SAX-HPLC 결과의 분석은 LabSolution (Shimadzu)을 사용하여 수행하였고, 해당 피크의 영역값을 측정하여 각 분획의 양을 결정하였다 (표 4 참조). 표 4에 나타낸 바와 같이 배지 내 염화칼슘 농도에 따라 A 영역과 B 영역의 비율이 달라지는 것을 확인하였고, 2.5 mM 농도 조건에서 B 영역의 비율이 가장 높았다.
배지 내 염화칼슘 농도 (mM) 분획 A 영역
(%)		 분획 B 영역
(%)
0 45.5 54.5
1.0 49.3 50.7
1.5 51.0 49.0
2.0 43.3 56.7
2.5 37.6 62.4
이와 같은 결과로부터, 인간 혈액응고인자 VII/VIIa 또는 이의 융합단백질을 발현하는 세포가 염화칼슘이 포함된 배지 내에서 배양될 경우, 배양액 중에 활성분획의 비율이 높음을 알 수 있었다. 분획 B 영역의 활성에 대해서는 실시예 4에서 후술한다.
실시예 4 : 활성분획의 비활성분획 대비 VIIa 활성 분석
실시예 3에서 분리한 분획 A와 분획 B를 각각 Alpha-1 Antitrypsin Select 컬럼크로마토그래피로 정제하였다. 분획 A 또는 분획 B를 완충용액 A (50 mM Tris-Cl, 150 mM NaCl, pH 7.5)을 사용하여 평형화시킨 Alpha-1 Antitrypsin Select 레진이 채워진 컬럼에 배양액을 로딩하고 동일한 완충용액으로 컬럼을 충분히 씻어 주었다. 단백질 용출은 완충용액 B (50 mM Tris-Cl, 500 mM MgCl2, pH 7.5)를 사용하였고, 완충용액 G (20 mM Tris-Cl, 5 mM NaCl, pH 8.0)를 사용하여 버퍼 교환을 하였다. 인간 혈액응고인자 VII의 활성화는 완충용액 G에 5 mM CaCl2를 첨가한 용액상에서 자동활성화 반응을 이용하여 수행하였다 (Biochem. (1989) 28:9331-9336). 이와 같은 방법으로 준비된 재조합 인간 혈액응고인자 VIIa의 활성은 색소형성 분석법 (chromogenic assay)을 통해 분석하였다 (Proc. Natl. Acad. Sci. (2001) 98:13583-13588).
반응 완충용액 (50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 0.1% BSA, pH 7.4) 상에서 10 nM 농도의 활성화된 분획 A 또는 활성화된 분획 B를 50 nM soluble tissue factor (Abcam)와 함께 37℃ 에서 30 분간 항온 처리한 후, 0.5 μM 농도의 혈액응고인자 X (Haemotologic Technologies)을 첨가하고 37℃에서 30분 간 추가 반응시켰다. 20 mM EDTA를 사용하여 반응 종료 후, 0.5 mM S-2765 (Chromogenix)를 첨가하고 405 nm 흡광도를 측정하였다 (도 5). 분획 A 또는 분획 B의 활성은 반응 시간 600초까지의 초기 속도 (그래프의 기울기 값)를 사용하여 분석하였다. 하기 표 5에서 나타낸 바와 같이 활성화된 분획 A의 활성은 활성화된 분획 B에 비해 16.2배 낮은 것으로 분석되었다. 따라서, 실시예 3에서의 분리 정제 방법을 사용하여 활성화 단계에 의해 우수한 활성을 나타내도록 하는 활성분획의 분리가 가능함을 확인하였다.
시료 활성 (A405nm/sec) 비활성(분획 B/분획 A)
분획 A 1.3x10-4 1
분획 B 2.1x10-3 16.2
이와 같은 결과로부터, 실시예 2 및 3에서와 같이 고성능크로마토그래피를 이용하여 배양액을 분획 A 및 분획 B로 분리하고 이들의 양을 측정함에 따라, 활성분획의 함량을 분석할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 5 : 음이온 교환수지 컬럼크로마토그래피를 사용한 재조합 인간 혈액응고인자 VII 융합단백질의 분리 정제
제조예에서 제시한 방법으로 제조한 CHO-DG44 세포주를 통해 수득한 배양액을 완충용액 E (10 mM Tris-Cl, 100 mM NaCl, pH 8.0)로 평형화시킨 Q-세파로스 FF (GE Healthcare) 레진이 채워진 컬럼에 로딩하였고, 동일 완충용액으로 충분히 씻어 주었다. 분획 A의 용출을 위하여 완충용액 F (10 mM Tris-Cl, 208 mM NaCl, pH 8.0)를 사용하였고, 분획 B의 용출을 위하여는 10 mM Tris-Cl, pH 8.0의 존재하에 208-325 mM NaCl의 선형구배(linear gradient)를 사용하였다 (도 6).
실시예 6 : 활성분획의 함량으로 측정되는 재조합 인간 혈액응고인자 VII 의 배양 온도별 생산성 비교
실시예 5의 방법으로 분리한 B 분획 비율을 이용하여 세포 배양액 단위 부피 당 활성분획의 함량을 측정하고, 이를 생산성으로 정의하였다. 37℃, 35℃, 32℃ 의 배양 온도별 각각 3회의 독립된 실험을 수행하였고, 이 결과를 표 6에 나타내었다.
배양 온도 B 분획 비율 (%) 생산성 (mg/L)
평균 표준편차 평균 표준편차
37℃ 65.2 4.6 131 25
35℃ 51.3 3.8 108 13
32℃ 66.0 2.8 23 4
실시예 3의 방법으로 측정한 B 분획 비율과 실시예 5의 방법으로 측정한 생산성을 배양 온도별로 비교한 결과, 배양 온도 37℃, 35℃, 32℃ 중 37℃의 경우에 가장 높은 생산성을 보였다 (도 7). 따라서, 배양 온도 최적화를 통해 활성분획의 비율을 증가시킬 수 있고, 활성분획의 분리 정제 및 분석법 개발을 통하여 재조합 인간 혈액응고인자 VII의 제조 생산성을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (16)

  1. 인간 혈액응고인자 VII/VIIa 또는 이의 융합단백질을 발현하는 세포를 34 내지 38℃ 의 배지에서 배양하는 단계를 포함하는,
    인간 혈액응고인자 VII/VIIa 또는 이의 융합단백질의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 배지는 염화칼슘을 포함하는 것인, 제조 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 염화칼슘은 0.5 mM 내지 5 mM 의 농도로 포함되는 것인, 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 세포는 인간 혈액응고인자 VII/VIIa 또는 이의 융합단백질을 코딩하는 염기서열을 포함하는 벡터가 도입된 것인, 제조 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 세포는 CHO 세포, HEK 세포, COS 세포, 3T3 세포, 미엘로마 세포, BHK 세포, HeLa 세포, 및 Vero 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 동물 배양세포인 것인, 제조 방법.
  6. 제1항에 있어서, 인간 혈액응고인자 VII/VIIa의 융합단백질은, 생체 지속성 캐리어와 혈액응고인자 VII/VIIa가 직접 연결되어 있거나, 펩타이드 링커를 통해 연결된 것인, 제조 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 생체 지속성 캐리어는 인간 유래 알파-1 안티트립신 변이체인 것인, 제조 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 펩타이드 링커는 1 내지 50개의 아미노산을 포함하는 것인, 제조 방법.
  9. 제1항에 있어서, 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 상기 단계에 의해 수득된 배양액의 활성분획의 함량을 분석하는 단계를 추가로 포함하는, 제조 방법.
  10. 제9항에 있어서, 고성능액체크로마토그래피의 고정상은 강 음이온 교환수지인 것인, 제조 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 활성분획은 비활성분획과 비교하여 10배 이상으로 인간 혈액응고인자 X에 대한 활성을 나타내는 것인, 제조 방법.
  12. 인간 혈액응고인자 VII/VIIa 또는 이의 융합단백질을 발현하는 세포를 34 내지 38℃ 의 배지에서 배양하는 제1단계; 및
    제1단계에서 수득되는 배양액으로부터 활성분획을 분리하는 제2단계를 포함하는,
    인간 혈액응고인자 VII/VIIa 또는 이의 융합단백질의 제조 방법.
  13. 제12항에 있어서, 제2단계에서 상기 배양액이 음이온 컬럼크로마토그래피에 의해 분리되는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 음이온 컬럼크로마토그래피에서 고정상은 강 음이온 교환수지인 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 음이온 컬럼크로마토그래피는 pH 5.0 내지 8.0 의 수성 완충액을 사용하는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
  16. 제12항에 있어서, 상기 활성분획은 비활성분획과 비교하여 10배 이상으로 인간 혈액응고인자 X에 대한 활성을 나타내는 것인, 제조 방법.
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