KR100398317B1 - 녹차카테킨(ｇｔｃ)을 유효성분으로 하는 세포보호제 - Google Patents

녹차카테킨(ｇｔｃ)을 유효성분으로 하는 세포보호제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 녹차카테킨(Green tea catechins, GTC)을 유효성분으로 하는 세포보호제에 관한 것이다. 본 발명의 GTC는 녹차(Theae sinensisL.,Theaceae)로부터 추출되며, 에피갈로카테킨 갈레이트를 33 내지 89%(w/w), 에피갈로카테킨을 8 내지 27%(w/w), 에피카테킨 갈레이트를 3 내지 7%(w/w) 함유한다. 전기 GTC가 블레오마이신, 사이클로포스파마이드, 자외선, 과산화수소 또는 과산화칼륨에 의하여 유도된 세포독성에 대하여 세포 보호작용의 효과를 나타내고, 주성분인 EGCG보다 세포보호작용이 월등함을 확인하였는 바, 녹차로부터 분리한 GTC는 약제학적으로 허용되는 부형제, 결합제, 윤활제, 붕해제, 희석제 등의 담체와 함께 세포보호제의 유효성분으로서 사용될 수 있을 것이다.

Description

녹차카테킨(ＧＴＣ)을 유효성분으로 하는 세포보호제{Cytoprotective Agent Comprising Green Tea Catechins as an Active Ingredient}
본 발명은 녹차카테킨(Green tea catechins, GTC)을 유효성분으로 하는 세포보호제에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 녹차(Theae sinensisL.,Theaceae)로부터 추출되며, 에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate, EGCG) 33 내지 89%(w/w), 에피갈로 카테킨(epigallocatechin, EGC) 8 내지 27%(w/w) 및 에피카테킨 갈레이트(epicatechin gallate, ECG) 3 내지 7%(w/w) 함유하는 GTC를 유효성분으로 하는 세포보호제에 관한 것이다.
친전자물질, 자외선, 활성산소라디칼 등의 인체에 독성을 나타내는 물질들은 세포, 조직, 장기 등에 영향을 미쳐 DNA 합성 및 세포복제의 증가 또는 DNA의 수복의 억제로 유전자의 변화를 초래하거나, 세포의 손상 복구를 방해하여 세포독성을 유발한 후, 인체의 기능을 저하시켜서 결국, 암이나 다른 질병을 유발시킨다. 예를 들어, 당펩티드 항종양성 항생물질인 블레오마이신(bleomycin)은 2가의 철분 (Fe(II))과 착제를 형성하여 산소의 존재하에 DNA를 절단하며, 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide)는 나이트로겐무스타드(nitrogen mustard) 계통의 세포독성 알킬화제로 DNA의 알킬화를 유발하고, 320 내지 400nm의 자외선 A, 280 내지 320nm의 자외선 B 또는 200 내지 280nm의 자외선 C는 DNA 사슬 위의 인접한 피리미딘 염기 사이에 생기는 피리미딘 이합체를 형성하여 색소성 건피증(xeroderma pigmentosum) 등의 질병을 유발시킨다.
한편, 녹차는 차나무(Theae sinensisL.,Theaceae)의 잎을 말린 것으로서 혈압강하작용(참조: Hara Y. et al.,Nippon Nogeikagaku Kaishi, 61:803, 1987), 충치예방(참조: Otake S. et al.,Cancer Res., 25:438, 1991) 및 혈소판응집저해활성(참조: Sagesaka-Mitane Y. et al.,Chem. Pharm. Bull., 38:790, 1990) 등 다양한 생리활성이 연구되었고, 최근에는 항암작용에 대한 연구가 많이 보고 되었다. 예를 들어, 피부암의 개시(initiation), 촉진(promotion) 또는 진행(progression) 단계를 녹차 카테킨이 예방할 수 있고, 녹차의 탄닌이 간의 S9 대사효소와 함께 작용하여 발암물질에 의한 DNA 손상을 감소시킨다는 것이 제시되었다. 아울러, 녹차의 카테킨 중 에피갈로카테킨 갈레이트가 사람의 위암세포인 KATO Ⅲ, 결장암세포 또는 폐암세포에서 세포사멸을 유도하여 종양의 성장을 억제하며(참조: Hibasami H. et al.,Oncol. Rep., 5(2):527, 1998), 상술된 에피갈로카테닌 갈레이트의 암세포 사멸 기전은 혈관내에서 단백질을 분해시키는 유로키나아제(urokinase)의 활성을 억제함으로써 일어난다고 보고되었다(참조: Yang G.Y. et al.,Carcinogenesis, 19(4):611, 1998).
한편, 리놀레산 하이드로퍼옥사이드(linoleic acid hydroperoxide, LOOH) 유도 세포독성에 대하여 녹차의 (+)-카테킨이 세포보호작용을 할 수 있는데 비하여 (-)-카테킨인 에피카테킨, 에피갈로카테킨, 에피카테킨 갈레이트 또는 에피갈로카테킨 갈레이트는 LOOH 유도 세포독성 보호작용이 없다는 것이 밝혀졌고(참조: Kaneko T. et al.,Chem. Biol. Interact., 114:109, 1998), 자외선 B에 의하여 유도된 사람의 각질세포(keratinocytes)와 형질전환된 쥐(transgenic mouce) 모델에서 에피갈로카테킨 갈레이트가 AP-1(activator protein-1)의 활성을 억제하며(참조: Barthelman M. et al.,Carcinogenesis, 19(12):2201, 1998), 대장균에서 254nm 파장의 자외선 C 유도 돌연변이율을 감소시킨다고 알려져왔다(참조: Shimoi K. et al.,Mut. Res., 173:239, 1986). 아울러, 녹차의 에피갈로카테킨 갈레이트, 갈라긴 및 바이 칼레인을 유효성분으로 하는 활성산소류에 대한 세포보호제가 보고되었다(참조: 일본 特開(平)3-93782호).
전술한 바와 같이, 현재까지 녹차 카테킨이 여러 암에서 종양의 성장을 억제시킴으로써 항암효과를 가진다는 보고가 많이 되었으나, 항암제, 자외선 A 또는 자외선 C의 세포독성 및 산소라디칼 발생제 유도 세포독성에 대하여 세포의 생존율을 증가시켜 세포보호작용을 함으로써 항암효과를 유도하는지에 대한 여부에 대하여는 아직까지 밝혀진 바가 없고, 한국에서 많이 생산되는 녹차인 테아에 시넨시스(Theae sinensis) 보다는 동류 생약인 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis)에서 분리된 조롱차(鳥龍茶) 추출물에 대한 연구가 대부분이었다. 아울러, 상기 기술된 세포독성에 대한 보호작용이 녹차 이외의 다른 식물의 추출물과 혼합작용으로 이루어진다는 보고는 많았으나, 녹차추출물 단독의 세포보호작용에 대한 연구는 전무하였고, 순수한 녹차 카테킨을 유효성분으로 함유하는 세포보호제에 대한 다양한 약제학적 제제에 대한 연구도 미흡한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 한국산 녹차로부터 세포보호제를 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 녹차(Theae sinensisL.,Theaceae)로부터 에피갈로카테킨 갈레이트 33 내지 89%(w/w), 에피갈로카테킨 8 내지 27%(w/w) 및 에피카테킨 갈레이트 3 내지 7%(w/w) 함유하는 GTC를 분리하여, 전기 GTC가 세포독성에 대하여 보호작용이 있으며, GTC의 주성분인 EGCG에 비하여 상술된 조성의 GTC가 세포보호작용이 월등함을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 목적은 녹차로부터 에피갈로카테킨 갈레이트 33 내지 89%(w/w), 에피갈로카테킨 8 내지 27%(w/w) 및 에피카테킨 갈레이트 3 내지7%(w/w) 함유하는 녹차카테킨(GTC)을 유효성분으로 하는 세포보호제룰 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명의 GTC의 성분 중 에피갈로카테킨 갈레이트의 HPLC 스펙트럼이다.
도 2는 본 발명의 GTC의 성분 중 에피갈로카테킨의 HPLC 스펙트럼이다.
도 3은 본 발명의 GTC의 성분 중 에피카테킨 갈레이트의 HPLC 스펙트럼이다.
도 4는 본 발명의 GTC의 HPLC 스펙트럼이다.
본 발명의 GTC는 녹차(Theae sinensisL.,Theaceae)의 잎에서 추출하여 만든 건조엑스로서 1g이 원생약 10g에 상당하며, 에피칼로카테킨 갈레이트(C22H18O11; 458.4) 33 내지 89%(w/w), 에피갈로카테킨(C15H14O7; 306.3) 8 내지 27%(w/w) 및 에피카테킨 갈레이트(C22H18O10; 442.5) 3 내지 7%(w/w)를 함유하는 물질로서, 녹차를 유기용매로 추출한 후, 농축하여 정제과정을 거쳐 얻은 액을 동결건조하여 황색결정의 상태로 수득되었다. 전기 수득된 GTC 및 GTC의 주요 성분인 EGCG에 대하여 차이니즈햄스터 폐세포주를 대상으로 블레오마이신 및 사이클로포스파마이드 등의 발암물질에 의하여 유도된 세포독성에 대한 세포보호작용의 여부를 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetra-zolium bromide) 분석법으로 확인하고, 자외선 A, B 또는 C, 과산화수소 유도 세포독성에 대한 세포보호작용을 섬유아세포주인 NIH3T3를 대상으로 MTT 분석한 다음, 차이니즈햄스터의 폐섬유아세포 및 마우스의 비장세포를 대상으로 과산화수소 및 과산화칼륨의 세포독성에 대한 세포보호작용을 MTT 분석법한 결과, EGCG를 함유한 GTC가 상기 세포독성물질에 대하여 세포보호작용이 있음을 확인하고, EGCG, EGC 및 ECG를 포함하는 GTC가 주성분인 EGCG 보다 세포보호작용이 우수함을 확인하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 녹차로부터 GTC의 수득
녹차(Theae sinensis L.,Theaceae-var. bohea 中 yabugida, 제주도산) 1000g에 70%(v/v) 에탄올수용액 10ℓ를 가하고 85 내지 90℃에서 3시간 동안 1차 추출한 다음, 동일한 용매 5ℓ로 동일한 조건하에 2차 추출을 완료하여, 진공회전증발기에서 약 1000㎖이 될 때까지 농축하였다. 전기 농축액을 물로 2 내지 3배 희석시키고 14,000rpm에서 20분간 원심분리하여 고형성분을 완전히 제거한 다음, 모아진 상등액을 1.2배의 클로로포름으로 2회 추출하였다. 그런 다음, 클로로포름층을 제거하고, 수층을 1.2배의 에틸아세테이트로 4회 추출하여 얻은 액을 합하여, 추출용매가 완전히 없어질 때까지 감압건조하였다. 이어서, 전기 건조물을 소량의 물로 용해시키고 동결건조하여 GTC 분말을 수득하였다.
실시예 2: GTC 중 EGCG, EGC 또는 ECG 정성 및 정량
실시예 2-1: GTC 중 총카테킨의 정량
GTC 분말 25㎎에 열수 80㎖을 가하고 80℃ 이상의 수욕조에서 30분간 추출하고, 물을 가하여 부피를 100㎖로 조정한 후, 초류액 20㎖를 제외하고 여과한 액을 시험용액으로 사용하였다. 그런 다음, 2개의 25㎖ 용량 플라스크에 물 5㎖를 각각 가하고, 이에 주석산 철시약 5㎖씩을 첨가한 다음, 인산완충용액을 가하여 최종 부피를 25㎖로 하고 충분히 혼합하였다. 이때, 사용된 주석산철시약은 황산 제 1철(7수화물) 0.1g 및 주석산칼륨나트륨 0.5g을 물에 용해시켜 부피를 100㎖로 하였고, 인산완충용액은 0.066M 인산이나트륨용액 및 0.066M 인산일칼륨용액을 잘 혼합하여 pH 7.5로 조정하였다. 그리고, 물을 사용한 것을 대조액으로 하여 액층 1㎝, 파장 540㎚에서 흡광도를 측정한 후, 표준용액의 농도(㎎/㎖)에 대한 흡광도를 하기와 같은 방법으로 측정하였다: 즉, 표준품인 몰식자산에틸 100㎎을 취하여 물을 첨가하여 100㎖로 한 후, 전기 액 5, 10, 15, 20 및 25㎖를 각각 취하여 물을 가하여 최종 부피가 100㎖이 되도록 표준액을 제조하고, 물을 사용한 것을 대조액으로 액층 1㎝, 파장 540㎚에서 흡광도를 측정하였다. 이어, 함량(%) = C × 1.5×(100/검체의 채취량(㎎))×100 의 식에 따라서 총카테킨의 함량을 구하였다. 이때, C는 표준곡선에서 얻어진 시험용액의 몰식자산에틸의 농도(㎎/㎖)를 나타내고, 1.5는 몰식자산에틸 1㎎이 나타내는 흡광도가 차카테킨 1.5㎎의 흡광도에 상당함을 나타내는 수치이다.
실시예 2-3: GTC 중 EGCG, EGC 또는 EGC의 정성 및 정량
GTC 분말 25㎎을 50㎖ 용량의 갈색 플라스크에 가하고 이동상의 용매인 메탄올과 6% 아세테이트 15:85(v/v)의 혼합액으로 용해시켜 최종액이 50㎖이 되도록 조정한 후, 검액으로 사용하였다. 그런 다음, EGCG, EGC 또는 ECG 표준품(Sigma Chemical Co., U.S.A.)을 2 내지 3㎎을 25㎖ 용량의 갈색 플라스크에 가하고, 이동상의 용매로 용해시켜 표선을 채워 표준액으로 사용하였다. 검액 및 표준액 각 3㎕씩을 취하여, 하기의 HPLC 분석조건에 따라 시험하였다:
<HPLC 측정조건>
측정기기: HP 1050 series(Hewlett-Packard, U.S.A.)
분리컬럼: Hypersil BDS C18(250×4mm, 5㎛)
컬럼온도: 40℃
측정파장: 280nm
이동상: 메탄올과 6% 아세테이트 15:85(v/v)의 혼합액
잔류시간: 15분
검액 및 표준액의 피크 면적으로부터 하기 식을 이용하여 EGCG, EGC 및 ECG의 함량을 구하였다.
함량(%) = 표준액의 농도(㎎/㎖)××표준품의 순도(%)
아울러, 도 1, 2, 3 및 4는 각각 본 발명의 GTC의 성분 중 에피갈로카테킨갈레이트의 HPLC 스펙트럼, 본 발명의 GTC의 성분 중 에피갈로카테킨의 HPLC 스펙트럼, 본 발명의 GTC의 성분 중 에피카테킨 갈레이트의 HPLC 스펙트럼 및 본 발명의 GTC의 HPLC 스펙트럼을 나타낸다.
실시예 3: GTC 또는 EGCG의 세포 생존율에 대한 영향
GTC 또는 그의 주성분인 EGCG가 세포 생존율에 영향을 미치는지 확인하기 위하여, MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 분석법에 따라서 마이크로플레이트리더로 측정하였다. 이때, 96웰에 웰 당 10%(w/v) FBS, 2%(w/v) L-글루타민 및 2%(w/v) 페니실린-스트렙토마이신이 함유된 최소필수배지(MEM) 80㎕에 차이니즈햄스터 폐세포를 2.5×104개로 분주하여 37℃의 5% CO2조건의 배양기에서 24시간 배양한 후, 과산화수소 또는 과산화칼륨 10㎕와 함께 GTC, EGCG(Sigma Chemical Co., U.S.A.) 또는 비타민 E 10㎕를 첨가하여 20시간 배양하였다. 이어, MTT 시약을 15㎕씩 첨가하고 4시간 배양한 다음, DMSO를 200㎕로 용해시켜 570nm에서 흡광도를 측정하였다.
표 1은 차이니즈햄스터 폐세포에서 GTC 또는 EGCG의 세포 생존율을 나타낸 것이다. 표 1에서 보듯이, GTC와 EGCG는 비타민 E와 마찬가지로 그 자체는 차이니즈햄스터세포 또는 마우스비장세포에서 세포독성을 전혀 나타내지 않았고, 처리 농도 증가에 따라 용량의존적 세포증식효과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 이와 같은 경향은 EGCG가 가장 큰 것으로 나타났으며, 이러한 결과는 GTC 또는 EGCG가 배양시에 배지에서 발생하는 각종 산소라디칼 등 세포증식을 저해하는 물질들을 소거하기 때문인 것으로 판단되므로, 각종 산소라디칼 뿐만 아니라 블레오마이신, 사이클로포스파마이드, 자외선 등의 세포독성을 유발하는 물질에 대해서도 세포보호작용을 가지는지 여부에 대하여 하기 실시예들을 시행하였다.
차이니즈햄스터 폐세포에서 GTC 또는 EGCG의 세포 생존율
처리농도(㎍/㎖ ) 570nm에서의 흡광도(각각의 흡광도) 570nm에서의 흡광도(Mean ± S.D.) 세포 생존율(%)
GTC 01050100250500 0.106 0.098 0.0990.097 0.099 0.0990.115 0.122 0.1160.137 0.142 0.1340.204 0.194 0.1870.216 0.260 0.258 0.101±0.0040.098±0.0010.118±0.004**0.138±0.004**0.195±0.009**0.245±0.025** 10097117137193243
EGCG 00.454.545 0.111 0.101 0.1100.106 0.106 0.1080.119 0.119 0.1240.204 0.166 0.175 0.107±0.0060.107±0.0010.121±0.003*0.182±0.020** 100143113170
Vit-E 00.434.343 0.098 0.100 0.1000.103 0.098 0.1000.109 0.104 0.1050.124 0.117 0.122 0.099±0.0010.100±0.0020.106±0.002*0.121±0.003** 100101107122
* P〈 0.05 , ** P〈 0.01
실시예 4: 블레오마이신 유도 세포독성에 대한 GTC 또는 EGCG의 세포보호작용
DNA 절단제인 블레오마이신의 세포독성에 대한 GTC 또는 그의 주성분인 EGCG의 효과를 MTT 분석법에 따라, 96웰에서 마이크로플레이트 리더를 사용하여 전기한 실시예 3과 동일한 방법으로 시행하였다. 표 2는 차이니즈햄스터 폐세포에서 블레오마이신 유도 세포독성에 대한 GTC 또는 EGCG의 세포보호작용을 나타낸다. 표 2에서 보듯이, GTC는 DNA 절단제인 블레오마이신 유도 세포독성에 대하여 10 내지 100㎍/㎖의 처리농도에서 150%까지의 생존율의 증가를 나타내고, 주성분 EGCG 단독 처리한 경우보다도 세포독성에 대한 보호작용이 뛰어나며, 비타민 E보다 높은 생존율의 증가를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
차이니즈햄스터 폐세포에서 블레오마이신 유도 세포독성에 대한 GTC 또는 EGCG의 세포보호작용
처리농도(㎍/㎖ ) 570nm에서의 흡광도(각각의 흡광도) 570nm에서의 흡광도(Mean ± S.D.) 세포 생존율(%)
GTC 01050100 0.862 1.076 0.5771.020 0.793 0.8031.466 1.215 1.0901.326 1.218 1.242 0.838±0.2040.872±0.1041.257±0.1561.262±0.046* 100104149150
EGCG 01050100 0.862 1.076 0.5771.359 1.020 0.9810.813 1.489 1.2470.597 0.943 1.316 0.838±0.2041.120±0.1691.183±0.2790.952±0.293 100143141113
Vit-E 01050100 0.698 0.529 0.2270.444 0.378 0.2830.536 0.525 0.3740.664 0.569 0.378 0.485±0.1950.368±0.0660.478±0.0740.537±0.119 1007598110
* P〈 0.05 , ** P〈 0.01
실시예 5: 사이클로포스파마이드 유도 세포독성에 대한 GTC 또는 EGCG의 세포보호작용
알킬화제인 사이클로포스파마이드 유도 세포독성에 대한 GTC 또는 EGCG의 세포보호작용 여부를 확인하기 위하여, 실시예 3과 동일한 방법으로 MTT 분석법을 시행하였다. 표 3은 사이클로포스파마이드 유도 세포독성에 대한 GTC 또는 EGCG의 세포보호작용을 나타낸다. 표 3에서 보듯이, 알킬화제인 사이클로포스파미아드 유도 세포독성에 대하여 GTC는 10 내지 100㎍/㎖의 처리농도에서 무처리군에 비하여 128%의 세포 생존율의 증가를 나타내었다. 특이하게도, GTC는 비타민 E보다는 세포 생존율이 낮았으나, 단일물질인 EGCG에 비하여 월등한 세포보호작용을 나타냄을 확인할 수 있었다.
사이클로포스파마이드 유도 세포독성에 대한 GTC 또는 EGCG의 세포보호작용
처리농도(㎍/㎖ ) 570nm에서의 흡광도(각각의 흡광도) 570nm에서의 흡광도(Mean ± S.D.) 세포 생존율(%)
GTC 01050100 1.746 1.576 1.1531.915 2.010 1.8192.729 1.316 1.5793.295 1.444 0.983 1.493±0.2471.914±0.0781.875±0.6141.907±0.614 100128125127
EGCG 01050100 1.746 1.576 1.1532.200 0.861 0.4971.369 0.860 0.6491.868 0.892 1.004 1.492±0.2491.186±0.7320.959±0.3021.255±0.436 100796484
Vit-E 01050100 0.135 0.254 0.4020.598 0.316 0.5540.240 1.185 0.6250.210 0.833 1.156 0.263±0.1090.489±0.1240.683±0.3880.733±0.393 100185259278
* P〈 0.05 , ** P〈 0.01
실시예 6: 자외선에 의한 세포독성에 대한 GTC 또는 EGCG의 세포보호작용
자외선 A(320-400nm), 자외선 B(280-320nm), 자외선 C(200-280nm)의 세포독성에 대한 GTC 또는 EGCG의 효과를 MTT 분석법에 따라 하기와 같은 방법으로 96웰에서 마이크로플레이트리더로 측정하였다. 섬유아세포인 NIH 3T3(ATCC CCL163)를 섬유아세포용 배지인 둘베코의 변형된 이글스 불완전(DMEM Incomplete) 배지에 송아지 태아혈청(FBS) 2%(v/v), L-글루타민 2%(v/v) 및 페니실린-스트렙토마이신 2%(v/v)가 함유된 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2조건의 배양기에서 배양하였다. 이어, 배양된 세포를 트립신으로 분리하고 1500rpm에서 10분간 원심분리하여 세포를 수득한 다음, 배지 1㎖당 1×105의 세포농도로 세포 현탁액을 조제하였다. 그런 다음, 96웰에 세포현탁액 90㎕를 가하고 24시간 배양하여, 각각의 DMSO 농도로 조제된 시료용액을 10㎕씩 가한 뒤, UV-A,B 또는 C를 강도 1.0㎽/㎠에서 10분간 조사 또는 조사하지 않고 20시간 배양하였다. 이어, MTT 시약을 15㎕씩 가하여, 4시간 후에 96웰에 있는 배지를 제거한 다음, 100% DMSO를 200㎕씩 첨가하여 570㎚에서 흡광도를 측정하였다.
실시예 6-1: 자외선 A 유도 세포독성에 대한 GTC 또는 EGCG의 세포보호작용
표 4는 섬유아세포(NIH 3T3)에서 자외선 A 유도 세포독성에대한 GTC 또는 EGCG의 세포독성에 대한 세포보호작용을 나타낸다. 표 4에서 보듯이, GTC는 자외선 A에 의한 세포독성에 대하여 10 내지 500㎍/㎖ 처리군에서 무처리군에 비하여 178%까지의 세포 생존율 증가를 나타내었으며, EGCG는 100 내지 500㎍/㎖에서는 290%까지의 세포 생존율의 증가를 확인할 수 있었다. 그에 반하여, Vit-E는 낮은 처리농도에서 활성이 없었으나, 250 내지 500㎍/㎖에서는 137%까지의 세포 생존율의 증가를 나타내었다. 따라서, GTC 및 EGCG는 자외선 A에 의한 세포독성에 대하여 보호작용을 나타냄을 확인할 수 있었다.
섬유아세포에서 자외선 A 유도 세포독성에 대한 GTC 또는 EGCG의 보호작용
처리농도(㎍/㎖ ) 570nm에서의 흡광도(각각의 흡광도) 570nm에서의 흡광도(Mean ± S.D.) 세포 생존율(%)
GTC 01050100250500 0.159 0.127 0.1070.146 0.151 0.1510.163 0.142 0.1430.127 0.148 0.1390.216 0.178 0.1730.247 0.207 0.248 0.131±0.0260.149±0.0020.149±0.0110.138±0.0100.189±0.023*0.234±0.023** 100113113105144178
EGCG 01050100250500 0.188 0.097 0.1080.104 0.103 0.0990.118 0.136 0.1250.175 0.176 0.1510.223 0.257 0.3120.481 0.353 0.307 0.131±0.0490.102±0.0020.126±0.0090.167±0.0140.264±0.044*0.380±0.090* 1007796127201290
Vit-E 01050100250500 0.085 0.088 0.0940.121 0.097 0.1030.092 0.098 0.1880.105 0.113 0.1040.146 0.157 0.1490.190 0.158 0.194 0.089±0.0040.107±0.0120.126±0.0530.107±0.004**0.150±0.005**0.180±0.019** 100819681115137
* P〈 0.05 , ** P〈 0.01
실시예 6-2: 자외선 B 유도 세포독성에 대한 GTC 또는 EGCG의 세포보호작용
표 5는 섬유아세포(NIH 3T3)에서 자외선 B 유도 세포독성에 대한 GTC 또는 EGCG의 세포보호작용을 나타낸다. 표 5에서 보듯이, GTC는 자외선 B에 의한 세포독성에 대하여 500㎍/㎖ 농도에서 247%의 세포 생존율의 증가를, EGCG는 250㎍/㎖농도에서 230%까지의 세포 생존율의 증가를, 그리고 Vit-E는 500㎍/㎖의 농도에서 213%까지의 세포 생존율의 증가를 나타내었다. 따라서, GTC는 주성분인 EGCG 보다 자외선 B 유도 세포독성에 대하여 보호작용이 크게 나타남을 확인할 수 있었다.
섬유아세포에서 자외선 B 유도 세포독성에 대한 GTC 또는 EGCG의 세포보호작용
처리농도(㎍/㎖ ) 570nm에서의 흡광도(각각의 흡광도) 570nm에서의 흡광도(Mean ± S.D.) 세포 생존율(%)
GTC 01050100250500 0.111 0.106 0.1260.094 0.125 0.2230.104 0.216 0.2280.130 0.141 0.2880.270 0.209 0.2810.381 0.307 0.284 0.114±0.0100.147±0.0670.182±0.0680.186±0.0880.253±0.038*0.324±0.050** 100112139142193247
EGCG 01050100250500 0.116 0.113 0.1230.216 0.207 0.1560.258 0.253 0.2370.240 0.257 0.2160.265 0.428 0.2110.303 0.284 0.274 0.117±0.005*0.193±0.032*0.249±0.010**0.237±0.020**0.301±0.112*0.287±0.014** 100147190181230219
Vit-E 01050100250 0.111 0.098 0.1610.275 0.244 0.1750.444 0.184 0.2120.206 0.182 -0.185 0.265 0.244 0.123±0.0330.231±0.051*0.218±0.1420.194±0.0160.231±0.041* 100176213148176
* P〈 0.05 , ** P〈 0.01
실시예 6-3: 자외선 C 유도 세포독성에 대한 GTC 또는 EGCG의 세포보호작용
표 6은 섬유아세포(NIH 3T3)에서 자외선 C 유도 세포독성에 대한 GTC 또는 EGCG의 세포보호작용을 나타낸다. 하기 표 6에서 보듯이, GTC는 자외선 C유도 세포독성에 대하여 10 내지 500㎍/㎖ 처리군에서 무처리군에 비하여 290%까지의 세포 생존율의 증가를 나타내고, EGCG는 10 내지 500㎍/㎖ 농도범위에서는 315%까지의 세포 생존율의 증가를 보인데 비하여, 비타민 E는 10 내지 500㎍/㎖ 농도범위에서는 483%까지의 세포 생존율의 증가를 확인할 수 있었다.
섬유아세포에서 자외선 C 유도 세포독성에 대한 GTC 또는 EGCG의 세포보호작용
처리농도(㎍/㎖ ) 570nm에서의 흡광도(각각의 흡광도) 570nm에서의 흡광도(Mean ± S.D.) 세포 생존율(%)
GTC 01050100250500 0.106 0.119 0.1410.171 0.274 0.3590.214 0.137 0.3060.188 0.219 0.2090.282 0.247 0.3460.393 0.373 0.375 0.122±0.0170.268±0.0940.219±0.0840.205±0.015**0.291±0.050**0.380±0.011** 100204167156222290
EGCG 01050100250500 0.109 0.104 0.1120.179 0.208 0.1850.198 0.214 0.211- 0.263 0.2780.240 0.278 0.2660.541 0.394 0.306 0.108±0.0040.190±0.015**0.207±0.008**0.333±0.108**0.261±0.019**0.413±0.118* 100145158254199315
Vit-E 01050100250500 0.196 0.190 0.1540.242 0.235 0.2270.210 0.211 0.2500.247 0.229 0.2740.535 0.731 -0.603 0.678 0.545 0.180±0.0220.234±0.007*0.223±0.0220.250±0.022*0.633±0.138**0.608±0.066 100179170190483464
* P〈 0.05 , ** P〈 0.01
실시예 7: 산소라디칼 발생제 유도 세포독성에 의한 GTC 또는 EGCG의 세포보호작용
과산화수소는 하이드록시라디칼을 생성함으로써, 과산화칼륨은 수퍼옥사이드를 생성함으로써, 세포에 대하여 독으로 작용을 하므로, 차이니즈햄스터 폐섬유아세포 또는 마우스 비장세포를 대상으로 독성 유발제인 과산화수소 또는 과산화칼륨의 세포독성에 대하여 GTC 또는 EGCG의 세포보호작용을 MTT 분석법에 따라 마이크로플레이트리더로 측정하였다. 이때, 96웰에 웰 당 차이니즈햄스터 폐섬유아세포를 10%(w/v) FBS, 2%(w/v) L-글루타민 및 2%(w/v) 페니실린-스트렙토마이신이 함유된 최소필수배지(MEM) 80㎕에 세포를 2.5×104개로 분주하여 37℃의 5% CO2배양기에서 24시간 배양한 후, 과산화수소 또는 과산화칼륨 10㎕와 함께 GTC, EGCG 또는 비타민 E 를 농도별로 첨가하여 20시간 배양하였다. 이어, MTT 시약을 15㎕씩 첨가하여 4시간 배양한 다음, DMSO 200㎕로 용해시켜에 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 한편, 림프구는 10%(w/v) FBS, 2%(w/v) L-글루타민 및 2%(w/v) 페니실린-스트렙토마이신이 함유된 RPMI 배지 중에서 웰 당 7.5×105개로 분주하고, 과산화수소 또는 과산화칼륨 10㎕와 함께 GTC, EGCG 또는 비타민 E 10㎕ 를 최종농도가 0 내지 100㎍/㎖이 되도록 첨가하여 20시간 배양하여 MTT 분석법으로 실시예 3과 동일한 방법으로 시행하였다.
실시예 7-1: 하이드록시라디칼유도 세포독성에 대한 GTC 또는 EGCG의 세포보호작용
표 7은 차이니즈햄스터 폐세포에서 과산화수소에 의해 생성된 하이드록시라디칼 유도 세포독성에 대한 GTC 또는 EGCG의 세포보호작용을 나타내며, 표 8은 마우스 비장세포에서 과산화수소에 의해 생성된 하이드록시라디칼 유도 세포독성에 대한 GTC 및 EGCG의 세포보호작용을 나타낸다. 표 7 및 표 8에서 보듯이, 과산화수소 유도 세포독성에 대하여 차이니즈햄스터 폐섬유아세포 및 마우스 비장세포에서 GTC, EGCG, 비타민 E는 억제작용을 나타내며, 과산화수소를 단독으로 처리했을때의 세포 생존율을 100%로 하여 대조군으로 삼고, GTC, EGCG 또는 비타민 E의 처리농도에서 비교하였을 때, 차이니즈햄스터 폐세포 또는 마우스 비장세포에서 모두 GTC가 EGCG보다 세포 생존율이 월등히 높아 GTC가 EGCG 보다 세포보호작용이 우수함을 확인할 수 있었다.
차이니즈햄스터 폐세포에서 과산화수소(10-4M) 유도 세포독성에 대한 GTC 또는 EGCG의 세포보호작용
처리농도(㎍/㎖ ) 570nm에서의 흡광도(각각의 흡광도) 570nm에서의 흡광도(Mean ± S.D.) 세포 생존율(%)
GTC 01050100 0.055 0.055 0.0530.066 0.066 0.0600.091 0.085 0.1080.108 0.128 0.109 0.054±0.0010.064±0.004*0.095±0.012**0.115±0.011** 100118176213
EGCG 00.454.545 0.059 0.055 0.0610.064 0.065 0.0570.069 0.073 0.0710.125 0.126 0.122 0.058±0.0030.062±0.0040.071±0.002**0.124±0.002** 100107122214
Vit-E 00.434.343 0.054 0.058 0.0580.060 0.056 0.0580.065 0.061 0.0610.118 0.102 0.100 0.057±0.0020.058±0.0020.062±0.001*0.107±0.009** 100102109188
* P〈 0.05 , ** P〈 0.01
마우스비장세포에서 과산화수소(10-4M) 유도 세포독성에 대한 GTC 또는 EGCG의 세포보호작용
처리농도(㎍/㎖ ) 570nm에서의 흡광도(각각의 흡광도) 570nm에서의 흡광도(Mean ± S.D.) 세포 생존율(%)
GTC 01050100 0.145 0.183 0.1510.189 0.246 0.2700.326 0.349 0.3060.451 0.488 0.490 0.159±0.0200.235±0.041*0.327±0.021**0.476±0.022** 100148206299
EGCG 00.454.545 0.085 0.088 0.0860.106 0.102 0.1070.131 0.118 0.1360.184 0.190 0.215 0.086±0.0020.105±0.003**0.128±0.009**0.196±0.016** 100122148228
Vit-E 00.434.343 0.091 0.098 0.1010.119 0.110 -0.102 0.104 0.1010.169 0.140 0.152 0.097±0.0050.115±0.006*0.102±0.0010.154±0.014** 100118105159
* P〈 0.05 , ** P〈 0.01
실시예 7-2: 수퍼옥사이드 유도 세포독성에 대한 GTC 또는 EGCG의 세포보호작용
표 9는 차이니즈햄스터 폐세포에서 과산화칼륨 유도 세포독성에 대한 GTC 또는 EGCG의 세포보호작용을 나타내며, 표 10은 마우스 비장세포에서 과산화칼륨 유도 세포독성에 대한 GTC 또는 EGCG의 세포보호작용을 나타낸 것이다. 표 9 및 표 10에서 보듯이, 차이니즈햄스터 폐섬유아세포 및 마우스 비장세포에서 과산화칼륨 유도 세포독성에 대해서도 마찬가지로 GTC, EGCG, 또는 비타민 E는 처리농도 증가에 따라 농도 의존적으로 세포독성 억제작용을 나타냄을 확인할 수 있었다. 즉, 과산화칼륨 10-3M을 단독 처리했을 때의 세포 생존율을 100%로 하고, GTC, EGCG 또는 비타민 E의 처리농도에서 비교하였을 때, 차이니즈햄스터 폐섬유아세포 및 마우스 비장세포에서 세포생존율이 GTC가 가장 높고, EGCG, 비타민 E의 순이었다.
차이니즈햄스터 폐세포에서 과산화칼륨(10-3M) 유도 세포독성에 대한 GTC 또는 EGCG의 세포보호작용
처리농도(㎍/㎖ ) 570nm에서의 흡광도(각각의 흡광도 값) 570nm에서의 흡광도(Mean ± S.D.) 세포 생존율(%)
GTC 01050100 0.048 0.049 0.0480.051 0.050 0.0520.073 0.084 0.0860.095 0113 0.094 0.048±0.0010.051±0.001*0.081±0.007**0.101±0.011** 100106169210
EGCG 00.454.545 0.051 0.050 0.0490.053 0.053 0.0510.056 0.058 0.0580.090 0.091 0.095 0.050±0.0010.052±0.0010.057±0.001**0.092±0.003** 100104114184
Vit-E 00.454.545 0.049 0.049 0.0500.050 0.053 0.0540.051 0.051 0.0570.070 0.064 0.074 0.049±0.0000.052±0.0020.053±0.0030.069±0.005** 100106108141
* P〈 0.05 , ** P〈 0.01
마우스비장세포에서 과산화칼륨(10-3M) 유도 세포독성에 대한 GTC 또는 EGCG의 세포보호작용
처리농도(㎍/㎖ ) 570nm에서의 흡광도(각각의 흡광도) 570nm에서의 흡광도 (Mean ± S.D.) 세포 생존율(%)
GTC 01050100 0.101 0.097 0.1020.116 0.115 0.1230.244 0.252 0.2580.363 0.291 0.295 0.100±0.0030.118±0.004**0.251±0.007**0.316±0.041** 100118251316
EGCG 00.454.545 0.097 0.095 0.0990.117 0.115 0.1010.145 0.147 0.1410.253 0.250 0.243 0.097±0.0020.111±0.0090.144±0.003**0.249±0.005** 100114148257
Vit-E 00.434.343 0.117 0.118 0.1180.185 0.170 0.1980.191 0.182 0.1750.184 0.193 0.192 0.118±0.0000.184±0.014**0.183±0.008**0.190±0.004** 100156155161
* P〈 0.05 , ** P〈 0.01
본 발명의 GTC는 통상의 부형제, 결합제, 윤활제, 붕해제, 희석제의 담체와 혼합하여 약학적 제제를 제조할 수 있다.
이하에서는 제제의 제조예를 실시예로서 예시하였다.
실시예 1: 정제의 제조
다음의 원료를 균질하게 혼합하여 약전 제제총칙 중 정제 제조방법에 따라서, 1정이 200㎎이 되도록 타정하였다.
GTC 60㎎
비타민 C 4㎎
유당 77㎎
미결정셀룰로오스 50㎎
경질무수규산 1㎎
크로스포비돈 6㎎
스테아린산마그네슘 2㎎
실시예 2: 캅셀제의 제조
다음의 원료를 균질하게 혼합하여 약전 제제총칙 중 캅셀제 제조방법에 따라서, 1캅셀에 270㎎이 함유되도록 충진하였다.
GTC 60㎎
구연산 4㎎
유당 196㎎
비타민 C 4㎎
경질무수규산 4.8㎎
스테아린산마그네슘 1.2㎎
실시예 3: 연질캅셀제의 제조
다음의 조성물들을 약전 제제총칙 중 연질캅셀제 제조방법에 따라서, 1 캅셀중 695㎎이 함유되도록 충진하였다.
1) 충진조성물
GTC 60㎎
레시틴 20㎎
콩기름 149.4㎎
야자경화유 38㎎
황납 12㎎
2) 건조한 외피조성물
젤라틴 247.2㎎
농글리세린 78㎎
디소르비톨액 70% 90.05㎎
파라옥시안식향산메틸 0.28㎎
파라옥시안식향산프로필 0.07㎎
에틸바닐린 적당량
청색 1호 적당량
황색 203호 적당량
산화티탄 적당량
분획야자 적당량
실시예 4: 액제의 제조
다음의 원료를 약전 제제총칙 중 액제 제조방법에 따라서 제조하고, 100㎖ 용량의 갈색병에 충진, 밀봉하여 저온살균처리 하였다.
GTC 100㎎
구연산 4㎎
벌꿀 20㎎
비타민 C 4㎎
액상과당 58㎎
니코틴산아미드 20㎎
안식향산나트륨 70㎎
포비돈 적당량
황색 203호, 청색 1호 적당량
멘톨후라보노향MSW 적당량
정제수 적당량
실시예 5: 연고제의 제조
다음의 원료를 약전 제제총칙 중 연고제 제조방법에 따라서 제조하고, 1g 중 조성은 아래와 같고 30g, 50g 단위로 포장하였다.
GTC 30㎎
백색바세린 370㎎
경질유동파라핀 220.9㎎
세탄올 70㎎
스테아릴알콜 70㎎
모노스테아린산소르비탄 85㎎
폴리옥시에틸렌경화피마자유 55㎎
에데트산나트륨 0.1㎎
폴리소르베이트60 67㎎
파라옥시안식향산메틸 1.8㎎
파라옥시안식향산프로필 0.2㎎
구연산 적당량
수산화나트륨 적당량
정제수 적당량
실시예 6: 주사제의 제조
다음의 원료를 약전 제제총칙중 주사제 제조방법에 따라서 제조하고, 2㎖ 의 앰플에 충진, 밀봉하여 멸균하였다.
GTC 5㎎
등장화제(염화나트륨) 적당량
메타중아황산나트륨 적당량
주사용증류수 적당량
GTC의 급성독성실험
6 내지 7주령 된 비설치류 비글견을 대상으로 본 발명의 GTC를 경구투여하여 24시간내의 개체사망율을 조사하였으며, 이때 암컷은 6 내지 8㎏인 개체를, 수컷은 7 내지 9㎏인 개체를 각각 8마리 사용하였다. 그 결과, 5g/kg 까지 죽은 개체가 발생하지 않아, 본 발명의 GTC는 kg당 5g까지도 급성독성을 관찰할 수 없을만큼 안전하므로, DNA 산화적 손상 억제제로서 생체내에 안전하게 투여할 수 있다.
한편, 본 발명의 세포보호제의 유효성분으로 함유되는 GTC는 약학적으로 허용가능한 결합제(예, 폴리비닐피롤리돈, 하이드록시프로필셀룰로오스), 붕해제(예, 카복시메틸셀룰로오스칼슘, 전분글리콜산나트륨), 희석제(예, 옥수수전분, 유당,콩기름, 결정셀룰로오스, 만니톨), 활택제(예, 스테아린산 마그네슘, 탈크), 감미제(예, 백당, 과당, 솔비톨, 아스파탐), 안정제(카복시메틸셀룰로오스나트륨, 알파 또는 베타 싸이클로덱스트린, 비타민 C, 구연산, 백납), 보존료(예, 파라옥시안식향산메틸, 파라옥시안식향산프로필, 안식향산나트륨) 및 향료(예, 에틸바닐린, 마스킹후레바, 멘톨후라보노, 허브향)와 혼합하여 정제, 캅셀제, 연질캅셀제, 액제, 연고제 또는 주사제등의 약학적 제제로 제조될 수 있다.
본 발명에 있어서의 약제조성물 중 유효성분인 GTC의 투여량은 환자의 연령, 성별, 증상, 투여방법 또는 예방목적에 따라 체중 kg 당 5 내지 50㎎을 일일 1회 내지 3회 분복할 수 있다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 녹차(Theae sinensisL.,Theaceae)로부터 에피갈로카테킨 갈레이트 33 내지 89%(w/w), 에피갈로카테킨 8 내지 27%(w/w) 및 에피카테킨 갈레이트 3 내지 7%(w/w) 함유하는 GTC를 추출하여, 이 GTC가 블레오마이신, 사이클로포스파마이드, 자외선, 과산화수소 또는 과산화칼륨 유도 세포독성에 대하여 세포 보호작용의 효과를 나타냄을 확인하였다. 따라서, 녹차로부터 분리한 GTC는 약제학적으로 허용되는 부형제, 결합제, 윤활제, 붕해제, 희석제 등의 담체와 함께 세포보호제의 유효성분으로서 사용될 수 있을 것이다.

Claims (7)

  1. 녹차를 에탄올 수용액으로 열수 추출하고, 이를 농축한 다음, 클로로포름으로 추출하여 수득한 수층을 에틸아세테이트로 추출하며, 추출물을 농축시키고, 물에 용해시킨 후, 동결건조시켜서 제조되며, 에피갈로카테킨 갈레이트(C22H18O11: 458.4) 66 내지 89%(w/w), 에피갈로카테킨(C15H14O7: 306.3) 8 내지 27%(w/w) 및 에피카테킨 갈레이트(C22H18O10: 442.5) 3 내지 7%(w/w)를 함유하는 녹차카테킨(Green tea catechins, GTC)을 유효성분으로 하고, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 세포보호제.
  2. 제 1항에 있어서,
    정제인 것을 특징으로 하는
    세포보호제.
  3. 제 1항에 있어서,
    캅셀제인 것을 특징으로 하는
    세포보호제.
  4. 제 1항에 있어서,
    연질캅셀제인 것을 특징으로 하는
    세포보호제.
  5. 제 1항에 있어서,
    액제인 것을 특징으로 하는
    세포보호제.
  6. 제 1항에 있어서,
    연고제인 것을 특징으로 하는
    세포보호제.
  7. 제 1항에 있어서,
    주사제인 것을 특징으로 하는
    세포보호제.
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