KR100378091B1

KR100378091B1 - 항혈전 효과를 나타내는 찰콘 유도체, 그를 포함하는약학적 조성물 및 그의 제조방법

Info

Publication number: KR100378091B1
Application number: KR10-2000-0037951A
Authority: KR
Inventors: 신국현
Original assignee: 신국현
Priority date: 2000-07-04
Filing date: 2000-07-04
Publication date: 2003-03-29
Also published as: KR20020004236A

Abstract

본 발명은 신규한 찰콘 유도체(chalcone derivatives), 그의 제조방법 및 그를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 혈전증 관련 질환에서혈소판 응집에 의한 혈전형성에 대하여 항혈전 효과가 뛰어난 하기 화학식 1로 표시되는 신규의 찰콘 유도체 및 그의 약학적으로 허용되는 염, 그의 제조방법 및 상기 화합물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 찰콘 유도체 및 그를 포함하는 약학적 조성물은 혈전증 관련 질환 저해제 또는 발병율 저하제로서 유용하게 사용할 수 있다.

상기 식에서 R₁, R₂는 명세서에 기재된 바와 같다.

Description

항혈전 효과를 나타내는 찰콘 유도체, 그를 포함하는 약학적 조성물 및 그의 제조방법{Chalcone derivatives showing anti-platelet aggregation effect, pharmaceutical compositions containing the said derivatives and process for preparation thereof}

본 발명은 신규한 찰콘 유도체(chalcone derivatives), 그의 제조방법 및 그를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 혈전증 관련 질환에서혈소판 응집에 의한 혈전형성에 대하여 항혈전 효과가 뛰어난 하기 화학식 1로 표시되는 신규의 찰콘 유도체 및 그의 약학적으로 허용되는 염, 그의 제조방법 및 상기 화합물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

화학식 1

상기 화학식 1에서,

R₁은 5'-염소기(5'-Cl)이고, R₂는 4-하이드록시기(4-OH) 또는 3-하이드록시기(3-OH)이다.

혈전은 혈액 인자의 응집물로서, 주로 혈소판 및 피브린의 응집물 또는 혈소판 응집물로 이루지며 혈전은 통상적으로 손상된 혈관의 과도한 출혈을 막기 위해서 형성된다. 혈전 형성을 위해서는 혈관의 내피가 중요한 역할을 담당하게 되는데, 혈관의 내피는 체내를 통해 연속적으로 순환하는 혈액내에 생성된 혈소판과 주로 콜라겐(collagen) 성분으로 구성된 응집전 내피하층 성분 사이의 차단벽으로서 작용한다. 혈관 내피는 물리적 장벽으로서 작용하는 것 뿐만 아니라 내피 내층의 세포막이 음으로 하전된 성분들을 함유하고 있어 혈소판 및 혈관의 내층 사이의 정전 반발력을 유발시킨다. 혈관이 상해를 입게 되면 상기의 내피 내층이 파괴되어 혈소판이 하부에 존재하는 콜라겐 및 피브리노넥틴(fibrinonectin)과 접촉하게 되고 이로 인하여 혈소판은 내피 하층의 표면에 응집된다. 이러한 초기 응집 반응으로 인하여 이들 혈소판으로부터 방출된 아데노신 디포스페이트(adenosine diphosphate), 세로토닌(cerotonin) 및 트롬복산(thromboxane) A2와 같은 다수의 화학 물질들이 응집전으로 작용하여 초기에 혈소판이 응집을 유도하며 기타 순환하는 혈소판이 이 응집을 자극한다. 혈소판의 응집이 진행될수록 이들로부터의 응집 전구 화학물질들의 방출이 자극되어 혈소판 응집이 추가적으로 유발된다. 따라서, 상기와 같은 체내의 자체-연속적인 사이클에 의하여 응집물의 성장이 촉진된다.

상처입은 혈관벽에 부착하여 응집물을 형성하는 것 이외에, 활성화된 혈소판은 혈장 단백질인 피브리노겐(fibrinogen)을 피브린(fibrin)으로 전환시켜 혈전을 안정화시키고 그의 성장을 촉진하도록 작용하는 트롬빈의 생성을 가속화시킨다.. 혈소판으로부터 생성된 트롬빈에 의해 혈소판 표면에서 일련의 효소적 전환 반응이 유도되어 피브리노겐으로부터 피브린이 형성된다. 구체적으로, 혈소판 표면 상의 음으로 하전된 인지질 및 칼슘에 의해 활성화된 인자 X는 프로트롬빈을 활성형의 트롬빈으로 전환시키고, 상기 트롬빈에 의해 피브리노겐이 피브린으로 절단되며 인자 XⅢ가 활성화된다. 활성화된 인자 XⅢ는 피브린의 가교 결합 반응을 촉매하여 혈소판 덩어리를 안정화시키고 트롬빈은 강력한 혈소판 활성화제로 작용하여 이 과정이 지속시킨다.

따라서, 상술한 바와 같이 혈소판이 내피하층의 표면과 접촉하게 되면 다수의 양성 피이드백 제어 기구(feed-back control system)가 혈전을 생성시킴으로써 상처입은 혈관계를 차단시키는 반응이 개시되는데, 이러한 일련의 과정(즉, 혈소판 응집, 피브린 생성 및 중합화)을 지혈이라 일컬으며 상처 부위로부터 과도한 출혈을 막는데 있어서 중요한 과정이다.

한편, 혈전은 과도한 출혈을 방지하기 위하여 혈관내에서 형성되는 것은 바람직하나, 손상되지 않은 혈관에 형성되어 혈류의 순환을 저해함으로써 병의 원인이 될 수 있다. 이러한 손상되지 않은 혈관에서 발생하는 혈전은 내피 세포 표면에 있어서의 작은 변화 또는 내피 내층의 파괴를 초래하는 부상에 기인하는데, 비교적 작은 변형에 의해서도 혈소판이 콜라겐과 접촉하여 상기의 과정이 개시된다. 혈관 내피 세포 표면에 있어서의 작은 변형은 여러 가지의 원인에 의해 발생하는데, 이러한 원인들중 하나인 울체(즉, 심방 또는 혈관에 있어서 혈액의 감소된 운동)는 산소의 결핍으로 유발된 손상에 의해 심방 또는 혈관의 전단력을 감소시킴으로써 통상적으로 혈소판의 상호작용을 억제한다. 또 다른 변형 원인으로 아테롬성 동맥경화증의 과정은 병변 부위의 내피 내층을 파괴시킴으로써 내피 내층상에 손상을 유발하는 것으로 알려져 있다.

상기와 같이 내피의 내층에서 흔히 발견되는 이러한 작은 변형에 기인하여 혈소판이 응집됨으로써 유발되는 혈전증 관련 질환으로는 급성 혈전증, 특히 관상 동맥의 혈전증이 대표적이며, 이외에도 혈전과 관련된 질환으로 당뇨병성 만성합병증이 있다. 생체외 실험에서 당뇨병 환자들로부터 얻은 혈소판은 응집유도 물질들에 매우 민감하며 트롬복산의 합성도 증가하였다. 또한, 당뇨병 환자들의 생체내 실험에서도 이들 환자들의 혈액내 혈소판 분비 단백질의 농도, 인자 Ⅷ, 피브린 및 피브린노겐의 분해 산물등의 농도가 증가 되었음이 보고되었다. 이와 같은 당뇨병 환자들에서 발견되는 비정상적인 혈소판 응집능의 항진에 의한 혈전은 당뇨병성 만성합병증을 유발하는 주요 원인중 하나이다.

따라서, 상술한 관상 동맥의 혈전증과 같은 급성 혈전증 및 혈전에 의한 당뇨병성 만성합병증을 효과적으로 예방하기 위하여, 혈소판 응집을 저해하는 항혈전 기능을 가진 화합물의 개발이 요구되어 왔고, 이에 따라 항혈전 효과를 보이는 화합물을 개발하기 위한 많은 연구들이 집중되고 있다. 이러한 연구의 일환으로, 혈소판이 초기에 응집하기 시작할 때 방출되는 응집 전구 물질중 하나인 세로토닌의 길항제가 발견되었다. 세로토닌은 비교적 약한 응집 전구 인자이나, 일차 응집 전구 응고 인자인 ADP의 응집 전구 효과를 증폭시키는 것으로 밝혀졌다. 대표적인 세로토닌 길항제로서, 케탄세린[Bushet al, Drug Development Research,Vol, 7. 319-340, 1986]과 페리디닐 유도체들(한국특허 등록번호: 특0184641)이 개발되었다.

또한, 기존의 항혈전 효과를 나타내는 항응집성 물질로는 아스피린(asprin),디피리다몰, 티클로피딘, 와르파린, 히루딘, MDL28,050 및 트롬복산 합성효소 억제제(예, 오자그렐, 다즈메그렐, SQ 29,548 또는 SQ 30741)등이 개발되어 이용되고 있다.

더불어, 생약 성분으로 감초에서 분리한 성분중 플라보노이드 계열에 속하는 찰콘 성분인 이소리퀴리티제닌(isoliquilitigenin)은 생체외 및 생체내에서 혈소판 응집 저해활성을 나타내는 화합물로 이미 보고되어 있으며(Kauro, A.et al., Planta Med.56, 255, 1990), 상기 화합물의 혈소판 응집 저해 작용의 메카니즘은 아라키돈산(arachidonic acid)에 의한 일련의 과정(cascade)을 거쳐 사이클로옥시게나제(cyclooxygenase) 뿐만 아니라 리포옥시게나제(lipoxygenase) 또는 퍼록시다제(peroxidase)의 활성을 저해함으로써 항혈전 효과를 나타낸다고 알려져 있다(Baynes, J.W., Thorpe, S.R.,Current Opinion Endocrinol 3,277-284, 1996).

본 명세서에 사용되는 항혈전성이란 급성병리학적인 혈전 또는 색전의 형성을 방해하거나 또는 감소시키는 능력을 의미하는 것이다. 이미 형성된 혈전을 용해하는 능력으로서 이해되어서는 안된다.

이에, 본 발명자들은 상기한 연구결과를 토대로 하여 혈전증 관련 질환을 예방 또는 발병율을 저하시킬 수 있는 항혈전제의 개발을 목적으로 혈소판 응집 기능에 대하여 저해효과를 보이는 화합물을 탐색하기 위하여 노력하던 중, 플라보노이드계 이소리퀴리티제닌을 출발물질로 하여 상기 화학식 1로 표시되는 찰콘 유도체를 합성하였고, 이 유도체가 혈소판 응집 기능의 항진으로 인한 혈전 형성에 대하여 기존에 항혈전 기능을 보이는 것으로 알려진 아스피린 또는 이소리퀴리티제닌 보다 우수한 항혈전 효과를 보임을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 혈전증 관련 질환 저해제 또는 발생율 저하제로서 항혈전 효과를 나타내는 새로운 찰콘 유도체, 약학적으로 허용되는 그의 염 및 그의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 화합물을 유효 성분으로 하며 부작용이 적고 약리효과가 높은 혈전증 관련 질환 저해 또는 발생율 저하를 위한 항혈전용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 렛트(rat)에서 혈소판 응고에 대한 찰콘 유도체 및 여러 비교물질의 저해효과를 나타내는 그래프로서 A는 ADP(adenosine diphosphate), B는 콜라겐에 의해 유도되는 렛트의 혈소판 응고 결과를 나타내는 그래프이다.

↓ : 혈소판의 유도가 시작되는 시간

Ep : 에팔레스타트(epalrestat)

As : 아스피린(aspirin)

Iso : 아이소리퀴리티제닌(isoliquiritigenin)

3e : 5'-클로로-3,2'-디하이드록시찰콘(5'-chloro-3,2'-dihydroxychalcone)

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 새로운 찰콘 유도체 및 약학적으로 허용되는 그의 염을 제공한다.

화학식 1

상기 화학식 1에서,

R₁은 5'-염소기(5'-Cl)이고, R₂는 4-하이드록시기(4-OH) 또는 3-하이드록시기(3-OH)이다. 상기 화학식 1의 화합물들 중 특히 바람직한 찰콘 유도체는 5'-클로로-4,2'-디하이드록시찰콘(5'-chloro-4,2'-dihydroxychalcone) 및 5'-클로로-3,2'-디하이드록시찰콘(5'-chloro-3,2'-dihydroxychalcone)이다.

본 발명의 화학식 1의 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 화학식 1의 화합물은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 약제학적으로 형용되는 산 부가염을 형성할 수 있다. 유리산으로는 유리산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 인산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 구연산(citric acid), 초산, 젖산, 주석산(tartaric acid), 말레인산, 푸마르산(fumaric acid), 포름산, 프로피온산(propionic acid), 옥살산, 트리플루오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메탄술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산 또는 아스파르트산 등을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 화학식 1의 찰콘 유도체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 제조 방법은

1) 히드록시벤즈알데히드(hydroxybenzaldehyde)를 탄산칼륨과 메톡시메틸클로라이드(methoxymethylchloride)를 이용하여 아세톤(acetone) 용매하에서 환류(reflux)시켜 메톡시메틸기로 보호된 벤즈알데히드를 제조하는 단계(단계1); 및

2) 상기 단계 1에서 제조된 화합물과 5'-클로로-2'-히드록시아세토페논(5'-chloro-2'-hydroxyacetophenone) 화합물에 포타슘히드록시드(potassium hydroxide)를 가하여 축합반응을 수행한 후 산성화하여 찰콘 유도체를 제조하는 단계(단계2);로 이루어진다.

상기 단계 1, 2 에서 출발물질 및 반응물질로 사용되는 5'-클로로-2-히드록시아세토페톤, 벤즈알데히드, 메톡시메틸클로라이드, 아세톤, 탄산칼륨, 포타슘히드록시드 및 알데히드 화합물은 상업적으로 시판되는 물질로서 용이하게 구입하여 사용할 수 있다.

상기 단계 1을 구체적으로 설명하면, 여러 가지 플라보노이드 계열 화합물들이 수산기들을 포함하고 있는데, 이 수산기들은 생성물들의 수득률과 선택성을 떨어뜨리는 결과를 가져온다. 이를 보완하기 위하여, 일반적으로 메톡시메틸클로라이드를 이용하여 메톡시메틸기로 수산기를 보호하는 방법이 사용되고 있다. 본 발명에서도 찰콘의 합성에 앞서 히드록시벤즈알데히드를 1 당량의 클로로메톡시메틸 에테르를 이용하여 아세톤 용매하에서 환류시켜 메톡시메틸기로 보호된 벤즈알데히드를 제조한다. 상기 단계 1에서 히드록시벤즈알데히드는 3-히드록시벤즈알데히드또는 4-히드록시벤즈알데히드가 바람직하다. 아세톤은 반응물질을 용해시키는 용매로서 사용되며 TLC(Thin layer chromatography)로 기질이 소실된 것을 확인하고 감압농축하여 아세톤을 제거한다.

상기 단계 2를 구체적으로 설명하면, 단계 1에서 제조된 3'-(메톡시메톡시)벤즈알데히드 혹은 4'-(메톡시메톡시)벤즈알데히드를 5'-클로로-2'-히드록시아세토페톤 화합물과 혼합하고, 상기 혼합물을 96% 에탄올에서 포타슘히드록시드를 첨가한 후 축합 반응(Claisen-Schmidt 방법)(Claisen, L. and claparrede A.et al.,Ber.14, 2460 (1881))을 수행하여 찰콘 유도체를 합성한다. 상기 반응액을 TLC상에서 반응물이 없어질 때까지 교반한 후 물을 첨가하여 반응을 종결 시킨다. 반응이 종결된 후 메탄올 상에서 염산을 가하고 교반하여 메톡시메틸기를 제거한다.

또한, 본 발명에서는 화학식 1의 찰콘 유도체 및/또는 약학적으로 허용되는 그의 염을 유효 성분으로 포함하는 혈전증 관련 질환 저해 또는 발생율 저하를 위한 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 화학식 1로 표시되는 찰콘 유도체는 혈전증 관련 질환의 병인인 혈전의 형성을 저해하는 항혈전 효과를 나타낸다.

화학식 1의 화합물은 임상 투여시에 경구 또는 비경구로 투여, 예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소 적용할 수 있으며, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 투여용 제형, 예를 들면 정제, 트로치제(troches), 로렌지(lozenge), 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제(elixirs)로 제제화된다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제하기 위해 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제; 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유가 함유된다. 캡슐제형의 경우는 상기에서 언급한 물질 이외에도 지방유와 같은 액체 담체를 함유한다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 상기 화학식 1의 화합물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제한다.

본 발명의 화학식 1로 나타내는 화합물은 병리학적 급성 혈전 또는 색전증의 발생을 예방하는데 사용될 수 있으며, 이 결과를 얻기 위해서는, 상기 화합물을 항혈전량으로 환자에 투여하는 것이 필요하다. 본 발명의 화합물들이 항혈전성 효과를 나타내는 투여량 범위는 투여되는 특정 화합물, 혈전증의 심도, 개개 환자가 고통을 겪고 있는 기타 기초 질병 상태 및 환자에 동시 투여될 수 있는 기타 의약에 따라 변화된다.

일반적으로 볼 때, 화학식 1의 화합물의 유효 용량은 일반적으로 성인 환자 체중 1 kg 당 50 내지 200 mg/일이고, 바람직하기로는 50 내지 100 mg/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1일 수회, 바람직하기로는 하루 2 회 내지 3 회 분할 투여될 수 있다.

필요할 경우, 화학식 1의 화합물은 기타 항응집성 물질과 조합하여 투여할 수 있으며, 이것들의 예로는 아스피린(300-1200 mg/일), 디피리다몰(300-400 mg/일), 티클로피딘(50-500 mg/일), 와르파린(25-300 mg/일), 히루딘(0.1-100 mg/kg/일) 또는 MDL28,050이 있다. 또한, 상기 화학식 1의 화합물은 트롬복산 합성효소 억제제(예, 오자그렐, 다즈메그렐, SQ 29,548 또는 SQ 30741)와 조합하여 투여될 수 있다. 이들 트롬복산 합성효소 억제제는 통상 0.5 내지 50 mg/kg/일의 투여량 범위로 투여될 수 있으며, 화학식 1의 화합물 및 트롬복산 합성효소 억제제는 단일 투여 형으로 화합되어 조합물로서 투여될 수 있다. 이들 투여형을 제조하는 방법들은 당업계에 잘 알려져 있다.

화학식 1의 화합물에 대하여 급성독성 실험을 한 결과, MLD(mouse lethal dosage) 값이 1000 mg/kg 이상으로 매우 안정하였다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

＜제조예 1＞ 메톡시메톡시벤즈알데히드의 제조

4-하이드록시벤즈알데히드(10 g, 82.0 mmol) 또는 3-히드록시벤즈알데히드 (10 g, 82.0 mmol)와 무수의 탄산칼륨(76 g)을 아세톤 300 ㎖에 용해시킨 후, 10 분간 교반시킨 다음 아세톤 하에서 클로로메톡시메틸 에테르(7.9 ㎖, 102.5 mmol)를 천천히 가하면서 30 분간 환류하였다. TLC 상에 기질이 소실된 것을 확인한 후, 침전물을 여과하고 감압농축하여 아세톤을 제거하였다.

<실시예 1> 5'-클로로-4,2'-디하이드록시찰콘의 제조

포타슘 하이드록시드(0.85 g, 15.05 mmol)를 95% 에탄올 20 ㎖에 녹인 후 5'-클로로-2'-히드록시아세토페논(0.56g, 3.30 mmol)을 가하여 용해시켰다. 완전히 용해된 것을 확인한 후 상기 제조예 1에서 얻은 4-메톡시메톡시벤즈알데히드(0.61 g, 3.30 mmol)를 가하여 축합 반응을 실행하였고, TLC 상에 기질이 없어질 때까지 교반하였다. 반응액에 증류수를 첨가하여 반응을 종결시킨 후, 1 N 염산으로 산성화하였다. 상기의 산성화된 반응 용액을 에틸아세테이트(ethyl acetate)로 희석하고 유기층을 브린(brine)으로 세척한 후 무수망초로 건조, 여과하였다. 여과액을 감압농축하여 얻은 잔사를 핵산으로 33v/v%이 되도록 희석한 에틸아세테이트를 용매로 이용하는 실리카 젤 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 5'-클로로-2'-히드록시-4-메톡시메톡시찰콘(5'-Chloro-2'-hydroxy-4-methoxymethoxychalcone, 0.82 g, 수득률 81.9%) 화합물을 용출하였다. 상기 5'-클로로-2'-히드록시-4-메톡시메톡시찰콘(0.82 g, 2.70 mmol)을 20 ㎖의 메탄올 용매 하에서 2 ㎖의 3 N 염산을 가하여 환류시키면서 3 시간 동안 교반하였다. 상기 반응액을 에틸아세테이트로 희석하고 유기층을 브린으로 세척한 후 무수망초로 건조, 여과한 다음 실리카 젤 크로마토그래피를 수행하여 목적화합물(0.32 g, 수득률 43.2%)을 용출하였다.

수득률: 43.2%. Yellow needle. IR (KBr) 3368, 1637cm^-1.¹H-NMR(아세톤-d₆) : δ8.24(d, J=8.7, 1H), 7.93(d, J=15.3, 1H), 7.88(d, J=15.3, 1H), 7.79(dd, J=2.1, 8.7, 2H), 7.50(dd, J=2.1, 8.7, 2H), 6.98(d, J=8.4, 1H), 6.92(dd, J=2.1, 8.4, 1H).¹³C-NMR(에세톤-d6): δ125.1(C-1'), 162.9(C-2'), 118.2(C-3'), 132.7(C-4'), 127.9(C-5'), 131.0(C-6'), 190.9(C-O), 125.0(C-α), 146.6(C-β), 127.3(C-1), 127.6(C-2,6), 115.4(C-3,5), 161.2(C-4). Tlc, Rf0.43(5:3 핵산/에틸아세테이트); mp 155-157℃(CH₃OH-H₂O); EI-MS(70eV) m/z 274(M⁺, 35), 155(27), 120(100), 107(16); HR-MS(EI) C₁₅H₁₁O₃Cl(M⁺)의 질량:274.0397 (정확한 질량: 274.0372).

<실시예 2> 5'-클로로-2,3'-디하이드록시찰콘의 제조

포타슘 하이드록시드(0.85 g, 15.05 mmol)를 95% 에탄올 20 ㎖에 녹인 후 5'-클로로-2'-히드록시아세토페논(0.56g, 3.30 mmol)을 가하여 용해시킨다. 완전히 용해된 것을 확인한 후 제조예 1에서 얻은 3-메톡시메톡시벤즈알데히드(0.61 g, 3.30 mmol)를 가하여 축합 반응을 실행하였고, TLC 상에 기질이 없어질 때까지 교반하였다. 반응액에 증류수를 첨가하여 반응을 종결시킨 후, 1 N 염산으로 산성화하였다. 상기의 산성화된 반응 용액을 에틸아세테이트로 희석하고 유기층을 브린으로 세척한 후 무수망초로 건조, 여과하였다. 상기 여과액을 감압농축하여 얻은 잔사를 핵산으로 33v/v%이 되도록 희석한 에틸아세테이트를 용매로 이용하는 실리카 젤 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 5'-클로로-2'-히드록시-3-메톡시메톡시찰콘

(5'-Chloro-2'-hydroxy-3- methoxymethoxychalcone, 0.79 g, 수득률 71.1%) 화합물을 용출하였다. 상기에서 얻은 5'-클로로-2'-히드록시-3-메톡시메톡시찰콘을 20 ㎖의 메탄올 용매하에서 2 ㎖의 3 N 염산을 가하여 환류시키면서 3 시간 동안 교반하였다. 상기 반응액을 에틸아세테이트로 희석하고 유기층을 브린으로 세척한 후 무수망초로 건조, 여과한 다음 실리카 젤 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 목적화합물(0.22 g, 수득률 48.5%)을 용출하였다.

수득률: 48.5%. Yellow needle. IR (KBr): 3344, 1641cm^-1.¹H-NMR(아세톤-d6) : δ8.28(d, J=8.7, 1H), 7.99(d, J=15.3, 1H), 7.86(d, J=15.3, 1H), 8.63(s,1H) 7.01(dd, J=2.1, 8.7, 1H), 7.2-7.4(m, 1H), 7.53(dd, J=2.1, 8.7, 1H), 6.96(d, J=8.7, 1H), 6.94(dd, J=2.1, 8.7, 1H).¹³C-NMR(아세톤-d₆): δ123.4(C-1'), 158.0(C-2'), 118.6(C-3'), 136.3(C-4'), 129.7(C-5'), 130.2(C-6'), 205.6(C-O), 121.3(C-α), 146.6(C-β), 136.2(C-1), 115.7(C-2), 163.0(C-3), 120.3(C-4), 121.0(C-5), 120.1(C-6). Tlc, Rf0.41(5:3 핵산/에틸아세테이트). mp 149-150℃(CH₃OH). EI-MS(70 eV) m/z(%): 274(M⁺, 82), 181(70), 155(95), 147(18), 120(100), 91(84). HR-MS(EI): C₁₅H₁₁O₃Cl(M⁺)의 질량: 274.0397 (정확한 질량: 274.0454).

＜실험예 1＞ 생체외( in vitro )에서 혈소판 응집 저해효과

(1-1) 혈소판 함유 혈장(platelet-rich plasma, PRP) 및 혈소판 비함유 혈장(platelet-poor plasma, PPP)의 준비

체중 180-250 g의 SD계 웅성 렛트를 디에틸 에테르(diethyl ether)로 흡입 마취시키고 2.2% 트리소디움 시트레이트(trisodium citrate)를 함유한 플라스틱 주사기로 심장에서 상기 용액 9 배 부피의 혈액을 채취하여 흔들어 섞은 후 상온에서 1200 X g로 10 분간 원심분리하여 PRP를 얻었다. PRP를 취하고 남은 층을 3000 X g에서 15 분간 다시 원심분리하여 PPP를 얻었다.

(1-2) 혼탁측정 방법(Turbidometric method)을 이용한 항혈전 효과 확인

혈소판 응집에 따른 투과도의 차이를 응집 측정기(aggregometer)를 사용하여 측정하는 기존의 혈소판 응집 검색법인 Born과 Cross의 혼탁측정 방법(turbidometry method, Born, G.V.R. and Cross,et al., Nature194, 927-929, 1962)에 기초하여 혈소판 응집 효과를 측정하였고, 표준 비교물질로 기존의 항응집제인 아스피린과 현재 일본에서 개발되어 시판되고 있는 당뇨병성 합병증 억제제로서 항혈전 효과를 나타내는 에팔레스타트를 사용하였다.

본 발명에 사용된 생체외에서의 혈소판 응집 저해활성을 측정하는 방법은 하기와 같다.

먼저, 트롬보카운터(thrombocounter)를 사용하여 PRP의 혈소판 수를 측정하고, PPP를 이용하여 혈소판의 수를 100 만/mm²로 맞추었다. 이를 0.9% 생리 식염수(saline)로 혈소판의 수가 50 만/mm²가 되도록 희석하여 사용하였다. PRP 0.49 ㎖를 플라스틱 마이크로-피펫(plastic micro-pipette)을 사용하여 플라스틱 큐빗(plastic cuvette)에 옮기고 37^oC로 유지된 응집 측정기에서 반응시킨 다음, 800-1200 rpm으로 교반시키면서 검액 0.005 ㎖를 가하고 1 분 후 응집 유도제(ADP: 2.5 μM 또는 콜라겐 : 10.0 μg/㎖) 0.005 ㎖를 첨가하였다. 이 때, PPP를 음성 대조군(blank)으로 이용하였고 4 분 내지 6 분간 600 nm에서 투과도의 변화를 측정하였다.

혈소판 응집에 대한 저해율은 시험 화합물을 넣지 않은 대조군의 응집에 대한 저해효과를 기준으로 계산하였으며, 그 결과를 백분율로 환산하여 하기 표 1에 나타내었다.

<표 1> 찰콘 유도체의 혈소판 응집 저해효과

화합물	치환기	농도(㎎/㎖)	렛트 혈소판 응집 저해 효과
			ADP	콜라겐
			저해율(%)	IC₅₀(μM)	저해율(%)	IC₅₀(μM)
5'-클로로-4,2'-디하이드록시찰콘	5'-Cl	0.15	76.5	0.10	84.5	0.044
이소리퀴리티제닌	4-OH	0.3	60.2	0.12	83.5	0.021
5'-클로로-3,2'-디하이드록시찰콘	3-OH	0.15	92.5	0.06	89.7	0.016
에팔레스타트	_	0.3	71.3	0.19	93.3	0.14
아스피린	_	0.3	77.2	0.14	73.2	0.026

저해율(%) : 화합물의 농도가 0.075 mg/ml일 경우의 %저해율

상기 표 1에 나타나 있듯이, ADP-유도 혈소판 응집의 경우 5'-클로로-4,2'-디하이드록시찰콘 및 5'-클로로-3,2'-디하이드록시찰콘의 혈소판 응집 저해 농도(IC₅₀, 50%의 혈소판을 응집하는데 요구되는 농도)는 각각 0.10, 0.06 μM로 0.12 μM인 이소리퀴리티제닌, 0.19 μM인 에팔레스타트 및 0.14 μM인 아스피린보다 우수한 ADP-유도 혈소판 응집 저해효과를 나타내었다. 특히, 5'-클로로-3,2'-디하이드록시찰콘의 경우 표준 비교물질인 이소리퀴리티제닌, 에팔레스타트 및 아스피린보다 두 배 이상의 저해효과를 보여 탁월한 항혈전 효과를 나타내었다.

또한, 콜라겐-유도 혈소판 응집의 경우도 마찬가지로 5'-클로로-4,2'-디하이드록시찰콘 및 5'-클로로-3,2'-디하이드록시찰콘의 혈소판 응집 저해 농도(IC₅₀)각각 0.04, 0.016 μM로 0.14 μM인 에팔레스타트보다 우수한 콜라겐-유도 혈소판 응집 저해효과를 나타내었다. 특히, 5'-클로로-3,2'-디하이드록시찰콘은 이소리퀴리티제닌 및 아스피린보다 우수한 콜라겐-유도 혈소판 응집 저해효과를 나타내어 상기 ADP-유도시와 유사한 결과를 얻었다.

(1-3) 찰콘 유도체의 구조에 따른 활성 분석

본 발명의 찰콘 유도체들의 구조-활성 관계를 살펴보면, R₁5' 번 위치에 염소를 함유하는 화합물인 5'-클로로-4,2'-디하이드록시찰콘은 상기의 두 가지 유도물질(ADP, 콜라겐) 모두에 대하여 강력한 항혈전 효과를 가지는 것으로 나타났다. 이에 본 발명자들은 화합물의 구조와 활성의 관계를 규명하기 위하여, 화합물의 구조를 변형하여 이들의 항혈전 효과를 조사하였다. 그 결과, 화학식 1로 표시되는 찰콘 유도체의 R₁4' 번 위치의 하이드록시기를 메톡시기로 치환했을 경우 혹은 4' 번 위치의 하이드록시기를 5' 위치로 옮겼을 경우에 이들의 항혈전 활성이 감소하였는, 이는 4' 번 위치의 하이드록시기가 및 5' 위치의 염소기가 활성에 중요한 요소임을 의미한다.

또한, R₁5' 번 위치에 염소를 고정하고 R₂에서 4 번 위치의 하이드록시기를 3번 위치로 옮겨 제조된 5'-클로로-3,2'-디하이드록시찰콘은 이소리퀴리티제닌은 물론, 표준비교물질로 사용하는 아스피린보다 ADP나 콜라겐 유도-혈소판 응집에 대한 강력한 저해활성을 보여 5' 번 위치의 염소 및 3 번 위치의 하이드록시기가 활성에 중요한 요소임을 알 수 있었다.

(1-4) 동일 농도에서의 찰콘 유도체와 표준 비교물질간의 혈소판 응집저해 활성 비교

본 발명의 화합물인 5'-클로로-3,2'-디하이드록시찰콘의 우수한 혈소판 응집 저해활성을 여러 가지 비교물질의 활성과 비교하기 위하여, 동일 농도에서의 저해활성을 혼탁측정법을 이용한 응집측정기의 다이아그램을 통하여 측정 결과를 나내내었다(도 1).

ADP에 의해 유도된 렛트의 혈소판 응집에 대한 5'-클로로-3,2'-디하이드록시찰콘의 저해활성을 출발물질인 이소리퀴리티제닌, 표준 비교물질들(에팔레스타트 및 아스피린) 및 화합물을 함유하지 않은 대조군과 비교하기 위하여, ADP는 2.5 μM, 각 화합물의 농도는 75 ㎍/㎖을 이용하여 저해효과를 측정하였다. 상기의 농도에서 각 화합물의 응집저해 활성을 측정해보면 5'-클로로-3,2'-디하이드록시찰콘이 67.3%, 이소리퀴리티제닌이 41.5%, 비교물질인 아스피린이 30.7%의 저해율을 나타내었고, 알도즈 환원효소 저해제인 에팔레스타트는 75 ㎍/㎖의 농도에서도 저해율이 매우 낮음을 알수 있었다(도 1a).

또한, 콜라겐에 의해 유도된 렛트의 혈소판 응집에 대한 5'-클로로-3,2'-디하이드록시찰콘의 저해활성을 출발물질인 이소리퀴리티제닌, 표준 비교물질들(에팔레스타트 및 아스피린) 및 화합물을 포함하지 않은 대조군과 비교하기 위하여, 콜라겐(10.0 ㎍/㎖), 각 화합물들(20 ㎍/㎖의 농도)을 이용하여 저해활성을 측정하였다. 상기의 결과와 마찬가지로 5'-클로로-3,2'-디하이드록시찰콘이 52.1%, 아이소리퀴리티제닌은 41.5%, 아스피린이 21.3%의 저해율을 나타내었고, 에팔레스타트는 20 ㎍/㎖의 농도에서 매우 낮은 저해율을 나타내었다(도 1b). 상기 결과로부터, 5'-클로로-3,2'-디하이드록시찰콘은 ADP 및 콜라겐-유도 혈소판 응집에 대하여, 동일 농도의 아스피린이나 이소리퀴리티제닌 보다 우수한 응집 저해활성을 나타냄을 확인하였다.

상기에서 확인한 바와 같이, 본 발명의 찰콘 유도체는 우수한 항혈전 효과를 나타내어 혈전증 관련 질환의 치료를 위한 약학적 조성물로 제제화될 수 있다.

<제제예 1> 시럽제의 제조방법

본 발명의 찰콘 유도체 및 약학적으로 허용되는 그의 염을 유효성분 2%(중량/부피)로 함유하는 시럽은 다음과 같은 방법으로 제조한다.

찰콘 유도체의 산부가염, 사카린, 당을 온수 80 g에 용해시켰다. 이 용액을 냉각시킨 후, 여기에 글리세린, 사카린, 향미료, 에탄올, 소르브산 및 증류수로 이루어진 용액을 제조하여 혼합하였다. 이 혼합물에 물을 첨가하여 100 ㎖가 되게 하였다. 상기 부가염은 실시예에 의한 다른 염으로 대치시킬 수 있다.

상기 시럽제의 구성성분은 다음과 같다.

5'-클로로-3,2'-디하이드록시찰콘 또는 5'-클로로-2,3'-디하이드록시찰콘· 염산염 ························ 2 g

사카린 ······················· 0.8 g

당 ························ 25.4 g

글리세린······················ 8.0 g

향미료 ······················ 0.04 g

에탄올 ·······················4.0 g

소르브산 ······················0.4 g

증류수 ·······················정량

<제제예 2> 정제의 제조방법

유효성분 15 mg이 함유된 정제는 다음과 같은 방법으로 제조한다.

5'-클로로-3,2'-디하이드록시찰콘 또는 5'-클로로-2,3'-디하이드록시찰콘·염산염 250 g을 락토오스 175.9 g, 감자전분 180 g 및 콜로이드성 규산 32 g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160 g, 활석 50 g 및 스테아린산 마그네슘 5 g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

상기 정제의 구성성분은 다음과 같다.

5'-클로로-3,2'-디하이드록시찰콘 또는 5'-클로로-2,3'-디하이드록시찰콘· 염산염··················· 250 g

락토오스 ···················175.9 g

감자전분 ····················180 g

콜로이드성 규산 ················ 32 g

10% 젤라틴 용액

감자전분 ····················160 g

활석 ······················ 50 g

스테아르산 마그네슘 ··············· 5 g

<제제예 3> 주사액제의 제조방법

유효성분 10 mg을 함유하는 주사액제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

5'-클로로-3,2'-디하이드록시찰콘 또는 5'-클로로-2,3'-디하이드록시찰콘·염산염 1 g, 염화나트륨 0.6 g 및 아스코르브산 0.1 g을 증류수에 용해시켜서 100 ㎖을 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20℃에서 30 분간 가열하여 멸균시켰다.

상기 주사액제의 구성성분은 다음과 같다.

5'-클로로-3,2'-디하이드록시찰콘 또는 5'-클로로-2,3'-디하이드록시찰콘

·염산염·····················1 g

염화나트륨···················0.6 g

아스코르브산··················0.1 g

증류수·····················정량

상기에서 살펴 본 바와 같이, 본 발명에 의한 상기 화학식 1로 표시되는 찰콘 유도체는 혈전증 관련 질환에서 혈소판 응집에 의한 혈전형성에 대하여 항혈전 효과를 나타내므로, 혈전으로 인한 혈전증 관련 질환 저해제 또는 발생율 저하제로 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 찰콘 유도체를 제조하는데 있어서, 출발 화합물로 사용한 찰콘 성분인 이소리퀴리티제닌은 독성이 적은 플라보노이드 계열 화합물이므로 본 발명의 찰콘 유도체들도 부작용이 적은 화합물이다. 따라서, 5'-클로로-3,2'-디하이드록시찰콘을 포함하는 본 발명의 찰콘 유도체는 기존의 항응집제로 이용되고 있는 아스피린 보다 높은 항혈전 효과를 나타내어 약리효과가 높을 뿐만 아니라, 독성도 적어 혈전증 관련 질환 저해제 또는 발생율 저하제로 유용하게 이용할 수 있다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 항혈전 효과를 나타내는 찰콘 유도체 및 약학적으로 허용되는 그의 염.

화학식 1

상기 화학식 1에서,

R₁은 5'-염소기(5'-Cl)이고, R₂는 4-하이드록시기(4-OH) 또는 3-하이드록시기(3-OH)이다.
제 1항에 있어서, 화학식 1의 화합물은 5'-클로로-4,2'-디하이드록시찰콘 또는 5'-클로로-3,2'-디하이드록시찰콘인 것을 특징으로 하는 찰콘 유도체 및 약학적으로 허용되는 그의 염.
1) 벤즈알데히드(hydroxybenzaldehyde)를 탄산칼륨과 메톡시메틸클로라이드(methoxymethylchloride)를 이용하여 아세톤(acetone) 용매하에서 환류(reflux)시켜 메톡시메틸기로 보호된 벤즈알데히드를 제조하는 단계(단계1); 및

2) 상기 단계 1에서 제조된 화합물과 5'-클로로-2'-히드록시아세토페논(5'-chloro-2'-hydroxyacetophenone) 화합물에 포타슘히드록시드(potassium hydroxide)를 가하여 축합반응을 수행한 후 산성화하여 찰콘 유도체를 제조하는 단계(단계2);로 이루어지는 것을 특징으로 하는 찰콘 유도체 및 약학적으로 허용되는 그의 염의 제조방법.
제 3항에 있어서, 단계 1의 히드록시벤즈알데히드는 3-히드록시벤즈알데히드 및 4-히드록시벤즈알데히드로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 찰콘 유도체 및 약학적으로 허용되는 그의 염의 제조방법.
제 1항의 찰콘 유도체 또는 약학적으로 허용되는 그의 염을 유효 성분으로 함유하는 항혈전제용 약학적 조성물.
제 1항의 찰콘 유도체 또는 약학적으로 허용되는 그의 염을 유효 성분으로 함유하는 혈전증 관련 질환 저해제 또는 발생율 저하제용 약학적 조성물.