KR100376282B1 - 은행잎 엑기스로부터 리그난의 분리 및 정제방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 리그난의 분리 및 정제방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 은행잎 엑기스를 유기용매로 추출하고 분말화한 다음 이 분말을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 및 C18 역상 크로마토그래피를 실시하여 혈관확장 작용을 가진 리그난(lignan)을 고순도로 분리 정제하는 방법에 관한 것이다.

Description

은행잎 엑기스로부터 리그난의 분리 및 정제방법

본 발명은 리그난의 분리 및 정제방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 은행잎 엑기스를 유기용매로 추출하고 분말화한 다음 이 분말을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 및 C18 역상 크로마토그래피를 실시하여 혈관확장 작용을 가진 리그난(Iignan)을 고순도로 분리 정제하는 방법에 관한 것이다.

리그난(lignan)은 식물 세포벽을 구성하는 리그닌(lignin)의 전구체로서 나자식물(裸子植物), 피자식물(被子植物)등에서 발견되고 있다. 최근에는 리그난중 일부 화합물이 위산분비억제 효과가 있어 위궤양, 십이지장궤양, 식도염 등의 치료효과가 있다고 입증되어 소화기계 질환의 예방 및 치료제로서 개시된 바 있다[일본특허공고 평3-120,217호].

본 발명에서 분리 정제하고자하는 리그난(lignan)은 다음 구조식(1)로 표시되는 1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-2-[2-메톡시-4-(3-히드록시 프로필)-페녹시]-프로판올으로서 케이. 슈도(K. Sudo)등에 의해 가문비나무로부터 분리되어, 그 구조가 결정되었다[K. Sudo and A. Sakakibara, Mokuzai Gakkaishi, 1974, p.331].

예로부터 은행나무는 많은 유효생리활성 물질을 함유하고 있는 것으로 이미 잘 알려져 있는바, 예컨대 은행나무 열매에는 페놀성 화합물계, 징코올(ginkgol), 빌로볼(bilobal), 징코올산(ginkgolic acid) 등이 함유되어 있고, 은행나무 씨에는 청산 배당체(cyanogenetic glycosides), 아미노산 등이 함유되어 있고, 은행잎에는 방향족 화합물, 특히 페놀성 화합물계, 플라보노이드 배당체(flavonoid glycosides) 및 단순 플라보노이드인 캄프페롤(kaempferol), 퀴세틴(quercetin), 아이소람네틴(isorhamnetin), 루테오린(luteolin) 등과 테페노이드(terpenoid) 화합물로서 징코라이드(ginkgolides) 및 빌로발리드(biloballd) 등이 함유되어 있다. 또한, 은행잎에서 추출된 엑기스는 노인성 치매, 뇌혈관 및 말초혈관 혈류장애 치료약으로 사용되고 있고, 혈관확장 작용을 가지는 것으로 알려져 있다.

그러나, 현재까지 은행잎 엑기스로 부터 리그난이 분리 보고된 적은 없으며, 은행잎 엑기스중 혈관확장 작용을 가지는 성분이 구체적으로 어떠한 물질인지도 명확히 밝혀진 바 없다.

이에 본 발명의 발명자들은 은행잎 엑기스에서 혈관확장 작용을 가지는 성분을 규명하기 위해 연구 노력한 결과 리그난 화합물을 고순도로 분리하고, 이 물질이 혈관확장 작용을 가짐을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 은행잎으로부터 혈관확장 작용을 가지는 리그난 성분을 고순도로 분리·정제하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 은행잎 엑기스 수용액을 유기용매로 추출하여 분말화하고, 그 분말을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하고, 연속하여 C18 역상 크로마토그래피를 실시하여 은행잎 엑기스로부터 상기 구조식(Ⅰ)로 표시되는 리그난을 분리·정제하는 방법을 그 특징으로 한다.

이와같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 상기 구조식(Ⅰ)로 표시되는 리그난을 은행잎 엑기스로 부터 분리·정제함에 있어서, 먼저 대한민국특허공고 제 90-5318호와 제 90-5319호에 개시된 기지의 방법으로 제조된 은행잎 엑기스를 10% 메탄올로 녹이고 저급 알킬아세테이트로 교반 분리한 후, 저급 아세테이트 층을 감압 농축하여 분말을 얻는다. 이 분말을 저급 케톤에 녹인 후 활성탄을 넣고 교반하고 여과한 다음, 여액을 감압 농축하고 이를 다시 30% 메탄올로 녹여서 12시간 방치 후에 여과하여 디클로로메탄으로 분리하고 이를 감압 농축하여 분말을 얻는다.

이 분말을 분리 정제하기 위해 클로로포름과 메탄을 혼합용매 또는 에틸아세테이트와 헥산 혼합용매를 용출액으로 사용한 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 이용한다. 정제된 분획을 다시 증류수와 아세토니트릴 혼합용매를 용출액으로 사용한C18 역상 크로마토그래피를 이용하여 고순도의 리그난을 얻는다.

상기와 같이 본 발명에 의해 고순도로 분리 정제된 리그난은 토끼 대동맥을 이용한 혈관확장 실험을 실시한 결과, 혈관확장 작용을 가지고 있음이 밝혀져 혈관확장제 또는 고혈압 치료제의 유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거 상세히 설명하면 다음과 같은 바, 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예

기지의 방법(대한민국특허공고 제90-5318, 5319호)으로 제조된 은행잎 엑기스(2㎏)를 10% 메탄올 수용액(10ℓ)에 녹이고, 동일 부피의 에틸 아세테이트의 5회 액체분배 추출을 하였다. 그 다음 에틸 아세테이트 층을 감압 농축한 후 다시 아세톤에 녹이고 활성탄(200g)을 첨가하여 실온에서 1시간동안 교반시키고 여과하고 농축하였다. 농축된 아세톤 여액에 30% 메탄올 수용액(2ℓ)을 첨가하고 50℃에서 1시간동안 교반하였고 12시간 방치한 후 여과하고 여액은 디클로로메탄으로 액체 분배추출을 하였다. 그리고 나서 이 유기용매 층을 감압 농축하여 리그난의 혼합분말(70g)을 얻었다.

상기에서 얻은 분말에서 리그난을 고순도로 분리 정제하기 위해 이 분말의 25배에 해당하는 실리카겔을 사용하고 메탄올과 클로로포름을 부피비 1 : 10 또는 에틸 아세테이트와 헥산을 부피비 1 : 3으로 혼합한 용액을 용출액으로 하여 1차 컬럼 크로마토그래피를 실시하였다.

상기 방법으로 각 분획을 분리하면서 클로로포름과 메탄올을 부피비 20 : 1로 혼합한 용액을 전개용매로 하여 박층 크로마토그래피법(TLC, 실리카겔 60F254, Merck 제품)으로 전개하여 표준품과 비교 확인하는데 이때 확인방법은 아니스알데하이드 설퍼릭애시드 발색시약으로 청색 반점이 생기는 것으로 확인하였으며 전개율(Rf)은 0.3 이었다.

그 다음, 주요 물질인 리그난 분획만을 모아 농축 건조하고, 이를 다시 물과 아세토니트릴을 부피비 4 : 1로 혼합한 용매를 용출액으로 사용하여 C18 역상 크로마토그래피를 실시하였으며, 그 결과 순도 99%의 리그난(100 ㎎)을 얻었다.

¹H-NMS(300 MHz, CDCl₃)δ : 7.50(2H, t, H-7'), 6.6∼6.9(6H, m, 페닐기),

4.2(2H, m, H-8), 3.84, ,1.85(6H, s, OCH₃), 3.65(4H,

m, H-9, H-9'), 2.90, 3.03(1H, dd, J=13.8, 6.9Hz, H-

7), 1.86(2H, m, H-8').

¹³C-NHR(300 MHz, CDCl₃) δ : 129.7(C-1), 112.2(C-2), 146.4(C-3),

145.5(C-4), 114.4(C-5), 119,8(C-6), 37.3(C-7),

85.2(C-8), 63.4(C-9), 137.2(C-1'). 112.3(C-2'),

150.9(C-3'), 144.2(C-4'), 122.1(C-5'), 120.9(C-6'),

31.8(C-7'), ,14.2(C-8'), 62.1(C-9').

실험예

약효검색은 토끼의 흉부 대동맥 혈관을 이용하여 이루어지며, 먼저 무게 1.5∼ 2 ㎏되는 토끼의 두부를 강타하여 실신시킨 후 흉부 대동맥혈관을 적출하여 지방과 결합조직을 제거한 후 직경 3 mm 정도의 링을 만들었다. 크렙스링거 액상에서 조직홀드에 고정하고 아이소메트릭 트렌스튜스에 연결한 후, 2g의 장력하에서 37℃로 90분간 안정화시켰다. 놀에피네프린 10^-6M을 첨가하여 수축을 유도하고 아세틸콜린으로 이완시켜 내피 세포의 존재를 확인한 후 링을 실험에 사용하였다. 그리고 나서, 3번 세척하고 30분간 안정화시킨 후, 놀에피네프린 10^-6M로 다시 수축을 유도하고 상기 실시예에서 분리·정제한 리그난을 첨가하여 이완효과를 피지오그래피로 확인하였다. 상기 실험결과 리그난은 1 mg/㎖ 에서 혈관이완율이 81.9%이었다.

기존의 베라파밀(verapamil)은 칼슘이온 블로커(blocker)의 일종으로, 가장 널리 사용되는 고혈압 치료제로서 1 mg/㎖에서 혈관이완율이 57.2%이었다. 본 발명에서 분리한 리그난과 기존의 베라파밀(verapamil)의 혈관확장능을 비교하여 첨부도면에 나타냈는 바, 본 발명에서 분리한 리그난이 보다 우수한 혈관이완을 나타냄을 알 수 있다.

따라서 상기 구조식(Ⅰ)로 표시되는 리그난이 혈관확장 능력이 우수함이 밝혀졌고, 이로써 혈관확장제 또는 고혈압 치료제의 유효성분으로 유용하다.

첨부도면은 기존의 베라파밀(verapamil)과 본 발명에서 분리·정제한 리그난의 시간에 따른 혈관이완율의 변화를 나타낸 그래프이다.

Claims (4)

1. 은행잎 엑기스 수용액을 유기용매로 추출하여 분말화하고, 그 분말을 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 실시하고, 연속하여 C18 역상 크로마토그래피를 실시하여 분리·정제하는 것을 특징으로 하는 은행잎 엑기스로부터 다음 구조식(Ⅰ)로 표시되는 리그난을 분리·정제하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 추출시 유기용매로는 에틸 아세테이트와 디클로로메탄을 사용하는 것을 특징으로 하는 은행잎 엑기스로부터 리그난을 분리·정제하는 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 실리카겔 컬럼 크로마토그래피의 용출액으로는 에틸 아세테이트와 헥산의 혼합용매 또는 클로로포름과 메탄올의 혼합용매를 사용하는 것을 특징으로 하는 은행잎 엑기스로부터 리그난을 분리·정제하는 방법.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 C18 역상 크로마토그래피의 용출액으로는 증류수와아세토니트릴의 혼합용매를 사용하는 것을 특징으로 하는 은행잎 엑기스로부터 리그난을 분리·정제하는 방법.