KR100357804B1

KR100357804B1 - 미립형물질함유리포좀,이의제조방법및이를함유하는리포좀제제

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Publication number: KR100357804B1
Application number: KR1019960701802A
Authority: KR
Inventors: 그레고리아디스 그레고리; 죠오지 안티미시아리스 소피아; 구르셀 이산
Original assignee: 더 시크리터리 오브 스테이트 포 디펜스 인 허 브리태닉 마제스티스 거번먼트 오브 디 유나이티드 킹덤 오브 그레이트 브리튼 앤드 노던 아일랜드
Priority date: 1993-10-07
Filing date: 1994-10-07
Publication date: 2004-06-14
Also published as: ATE209029T1; DE69429186D1; CN1108789C; AU7790794A; EP0722317A1; EP0722317B1; RU2145212C1; ES2164714T3; WO1995009610A1; GB2297907B; CN1200668A; GB9607359D0; US6451338B1; AU687893B2; JPH09503225A; BR9407769A; DE69429186T2; GB9320668D0; US20020041895A1; NZ274006A

Abstract

(a) 리포좀을 형성하고, 이의 제조에 사용된 유기 용매를 거의 전량을 제거하고,

(b) 이렇게 형성된 리포좀을 동결 건조시킨 후

(c) 이를 미립형 물질과의 균질 혼합물 중에서 재수화시킴을 포함하는, 비용해된 또는 수불용성 미립형 물질을 함유하고 단일 라벨라 또는 다중 라벨라 구조를 갖는 직경 0.1㎛ 내지 50㎛의 리포좀의 제조방법이 제공된다. 바람직한 캡슐화 물질은 미립형 물질, 가장 바람직하게는 미생물, 식물 또는 동물 세포 또는 유기 용매에 불활성인 생화학적 또는 면역학적 활성을 갖는 수불용성 구조물이지만, 어떠한 수불용성 미립자도 이 방법을 이용하여 캡슐화할 수 있다. 예를 들어, 약간 가용성인 촉매 또는 약제는 또한, 환자의 체내에 서방출되는 반면에 많은 리포좀 제제 프로토콜에 포함된 청정제의 방출은 방지되도록, 혼입될 수 있다.

Description

미립형 물질 함유 리포좀, 이의 제조방법 및 이를 함유하는 리포좀 제제

본 발명은 유기 용매에 불안정한 물질(예: 완전한 생세포 또는 약화된 세포)을 사람 또는 동물에게 투여하는데 사용할 수 있는 리포좀 제제에 관한 것이다. 이러한 제제는 불안정한 생체 활성 물질을 운반시킴으로써, 서방성을 제공하여 특정 신체 부위에 표적화할 수 있는데 유용성이 있다. 이러한 제제의 제조방법 또한 제공된다.

백신 제제 투여에 있어 리포좀의 용도가 널리 공지되어 있고, 이들의 보조 활성이 다양한 박테리아성, 바이러스성, 원생 동물성, 단백질 및 펩타이드 백신의 면역 강화에 대한 수 많은 연구에 의해 입증되었다[참조: Gregoriandis G(1990) Immunol Today, 11. 89-97 and Alving C R (1991) J Immunol Meth, 140, p 1-13].

이들 연구는 모두, 펩타이드 및 단백질을 제공할 수 있으나 보다 큰 백신을 효율적으로 운반할 수는 없는, 마이크론 이하의 평균 직경을 갖는 소포(vesicle)를 생성시키는 기술로 제조되는 리포좀을 사용하여 수행해 왔다[참조: Gregoriadis G(ed) (1993) Liposome Technology, 2nd Edition, Volumes I-III CRC Press, Boca Raton, 1993]. 이러한 보다 큰 백신은, 홍역, 폴리오 바이러스, 보데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis), 바실 칼메트-구에린(Bacille Calmette-Guerin) 및 살모넬라 티피(Salmonella typhi)와 같은 다수의 약화되거나 사멸된 바이러스및 박테리아를 포함한다[참조: Mimms C A et al(1993) Medical Microbiology, Chapter 36, Mosby].

대부분 이들 백신은 고도로 면역원성이지만, 충분히 큰 리포좀내에서 이들의 투여가 바람직한 대안이 될 수 있는 상황이 존재한다. 예를 들면, 가용성이고 미립형(예: 미생물성)인 항원의 혼합물로 구성된 다수의 백신 또는, 사이토킨을 또한 함유하는 백신 제형의 경우, 통상의 리포좀 담체를 통해 면역적격 세포(immunocompetent cell)에서 모든 물질이 동시에 나타나도록 하는 것이 항원에 대한 면역원성을 향상시키는 측면에서 유리할 수 있다.

추가로, 이들의 수성상 중에 항원 물질을 혼입시킨 리포좀은 예비-면역화 동물에서 항원과 이의 항체가 상호작용하여 알러지 반응 또는 항원 중화를 초래하는 것을 방지하는 것으로 공지되어 있다[참조: Gregoriadis and Allison(1974) FEBS Lett., 45, 71-74]. 따라서, 모체 항체가 존재하는(예: 홍역) 제제에 대한 예방을 위해 유아에게 또는 백신 오염에 대한 과감작성 개체에게 백신을 투여하기 위한 담체로서 사용되는 경우 리포좀이 유리할 수 있음을 알 수 있다.

작은 수적을 포함하는 소구체내에 클로로포름과 같은 용매를 형성시키는 방법에 의해 평균 직경이 9.2㎛ 미만인 큰 리포좀내에 미립형 물질을 혼입시키는 것은 공지되어 있다[참조: Kim and Martin(1981) Biochimica et Biophysica Acta, 646, 1-9]. 상기 기술을 사용하여 콜라겐, DNA 및 박테리아[스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius)]와 같은 물질을 포착할 수 있었지만, 혈청 난백 및 헤모글로불린과 같은 불안정한 구형 단백질은 아마도 표면 변성으로 인하여 리포좀을 형성할 수 없고 단백질 변성이 일어날 수 있다는 것이 주목된다. 이와 같은 방법은 유기 용매의 손상 및 세포독성 효과에 기인한 불안정한 물질의 캡슐화용으로는 부적합하며, 특히 완전(생) 또는 약화된 박테리아, 원생동물, 바이러스 또는 다세포 동물 세포 또는 식물 세포 캡슐화용으로 부적합하다.

캡슐화 단계에서 유기 용매를 사용하지 않고 리포좀내에 가용성 물질을 포획시키는 방법은 수년간 공지되어 왔으며[참조: Kirby and Gregoriadis (1984) Liposome Technology, Vol I, Gregoriadis G(ed). CRC Press, Inc Boca Raton, FL, pp 19-28; Deamer and Uster (1983) Liposomes, Ostro M J(ed) Marcel Dekker, Inc, NY. pp 27-51; Deamer and Barchfield (1982) J Mol Evol 19, 203-206], 이 방법은 예비형성된 리포좀을 탈수시킨 다음, 이들을 가용성 물질의 존재하에서 재수화시키는 방법을 기본으로 한다. 이 방법에서 가용성 물질은 리포좀 퓨즈(fuse)로서 물과 함께 도입되어 물질이 다중층 리포좀(multilamella liposome) 내에 포획되도록 한다. 사용된 리포좀의 직경은 동결 건조 전에 40 내지 80nm이고, 수득되는 다중층 생성물 소포의 용적은 더욱 작다. 이와 같은 용적 및 구조는 마이크로미터 크기 및/또는 생물질의 캡슐화용으로 부적합하며, 가용성 약물의 포획 수준은 소포 내에 도입시키기 위한 비교적 저표면적으로 인해 단일층 리포좀(unilamella liposome)에 대해서 만큼 높지 않다. 수용액의 캡슐화 목적을 위해 동일한 기술을 또한 작은 단일층 리포좀에 적용시켜 왔다(참조: EP 제0171710호).

전술한 공정은 상대적으로 온화하여 인자 VIII[참조: Kirby and Gregoriadis (1984) Biotechnology, 2, 979-984] 및 파상풍 톡소이드[참조: Gregoriadis etal(1987) Vaccine, Vol 5, p 145- 151]와 같은 불안정한 용질을 성공적으로 캡슐화시키는데 사용되어 왔다. 이는 물이 도입되는 재수화 단계 동안 형성되는 리포좀 내로 도입되는 용질에 의존한다. 용질에 대한 이러한 작용에도 불구하고, 박테리아, 원생동물, 바이러스 또는 기타의 것을 손상시키지 않으면서, 완전(생) 또는 약화된 유기체, 세포 또는 전체적으로 불안정한 다른 불용성 구조물을 캡슐화하는 방법은 여전히 제공되지 않았다.

또한, 단일층 또는 다중층에 상관 없이, 큰 리포좀 내에 불안정한 수용성 물질을 캡슐화하여 특이 조직에서 대량의 물질을 표적화하는 방법은 아직까지 제공되지 않았다.

본 발명자는 본 발명에 이르러, 놀랍게도 탈수/재수화로 완전 생 유기체 또는 약화된 유기체, 세포, 또는 유기 용매에 대해 불안정한 활성을 지닌 현미경적 수불용성 구조물과 같은 불용성 미립자들을 성공적으로 캡슐화할 수 있음으로 해서, 유기체가 사멸되지 않고 활성이 보유된다는 것을 밝혀내었다. 본 발명은 선행분야의 리포좀과는 대조적으로, 마이크로미터 크기 및/또는 생 물질을 포획할 수 있고, 비교적 큰 용량의 내부 소포를 지닌, 크기가 단일층 거대 리포좀의 경우의 외부 직경과 유사한 마이크로미터 크기의 단일층 및 다중층 리포좀(즉, 0.1 내지 50㎛ 직경)이 생성되도록 한다.

(i) 마이크로미터 크기의 리포좀을 상기 방법으로 탈수시킨 다음, 재수화시킬 때, 상기 기술된 미립자를 보유하는 능력 뿐만 아니라 가용성 물질에 대한 개선된 용량을 제공하는 단일층 리포좀 구조가 유지되고,

(ii) 불용성이거나 용해되지 않은 물질을 함유하는 다중층 리포좀이 형성되는 조건이 사용될 경우, 이들이 이전에 수득한 직경 40 내지 80nm이 아닌 마이크론 크기를 갖는다는 것은 특히 놀랍다.

따라서, 본 발명의 제1 국면에서 (a) 단일층 리포좀을 형성하는 단계, (b) 이렇게 형성된 리포좀을 동결 건조시키는 단계 및 (c) 이들을 그 속에 함유될 용해되지 않거나 불용성인 물질과의 친밀한 혼합물 중에서 재수화시키는 단계를 포함하는, 직경이 0.1㎛ 이상이고, 바람직하게는 1㎛ 이상이며, 용해되지 않거나 불용성의 미립형 생물학적, 화학적 또는 물리학적 활성 물질을 함유하는 리포좀의 형성방법이 제공된다.

단일층 리포좀을 제조하는 단계(a)는 직경이 0.1㎛ 이상인 리포좀을 형성하고, 단계(b)에 이들을 이용한다. 제조되는 다중층 리포좀의 크기는 단계(a)에서 결정할 필요는 없으나, 단계(c)의 재수화 전에, 바람직하게는 단계(b)에서 함께 동결 건조되는 용해되지 않거나 불용성인 물질에 의해 결정된다.

동결 건조 단계는, 단일층 및 다중층 리포좀 모두의 경우에 있어서, 바람직하게는 리포좀과 포획될 물질의 혼합물 상에서 수행하고, 동결 건조 리포좀에 대한 공지된 방법으로 수행할 수 있다. 재수화 단계는 바람직하게는 수포내로 들어가는 물에 의해 발생하는 용질 농도에 의해 유도되는 삼투압에 의해 파괴되는 리포좀의 수가 최소화될 수 있도록 조절된다.

제2 국면에서, 본 발명은 또한 본 발명의 제1 국면의 방법에 의해 제조되는 리포좀을 제공하고, 특히 직경이 0.1㎛ 이상, 바람직하게는 1㎛ 이상이고, 유기 용매와 접촉되어 활성이 손상되거나 파괴되는 생물학적, 화학적 또는 물리학적 활성 물질을 함유함을 특징으로 하는 리포좀을 제공한다.

리포좀 제조 단계(a)에 이용되는 실질적으로 모든 유기 용매는 재수화 단계(c) 전에, 가장 편리하게는 동결 건조 단계(b) 전에 제거되는 것이 특히 바람직하다.

바람직한 미립형 물질은 박테리아, 원생동물 및 바이러스, 식물 또는 동물 세포 또는 유기 용매에 불안정한 생화학적 또는 면역학적 활성을 갖는 불용성 구조물을 포함하는 미생물이다. 그러나, 불용성 미립자가 상기 방법을 이용하여 캡슐화될 수 있다는 것을 주지해야만 한다. 예를 들어, 약간 가용성인 촉매 또는 약물이 또한 환자의 체내로 서방출되도록 혼입될 수 있다. 그러나, 유기 용매가 이들 물질에 역 효과를 일으키지 않을 것으로 기대되므로, 상기 방법은 단지 공지된 방법 대신에 이용될 수 있는 선택 사항이고; 본 발명의 방법에 있어서의 상기 바람직한 양태의 주요 장점은 유기 용매 민감성 미생물, 세포 및 물질에 적용될 수 있다는 것과 다중층 리포좀으로 용량을 증가시킬 수 있다는 것이다.

리포좀을 형성하는 단계(a)는 중공체(hollow body)를 남길 정도로 용매를 제거하는 것과 같이 제조에 용매를 사용하는 방법을 포함하여 공지된 모든 방법을 사용할 수 있고; 중공은 용액, 미생물, 세포 또는 불용성 구조물이 포획후 위치해야될 소포를 형성한다. 전형적으로, 단일층 리포좀을 생성하기 위해, 단계(a)는 단계(c)에 가해지는 물질을 캡슐화하기에 적합한 크기의 소위 "거대 리포좀"을 형성하는 방법을 포함하고; 이러한 방법은 적합하게는 예를 들어 상기 기술된 Kim 및Martin의 방법이다. 가장 바람직하게는, 이것은 "마이크로미터" 또는 "마이크론" 크기, 즉 본원에 정의된 바와 같이 직경 0.1㎛ 내지 50㎛, 더욱 바람직하게는 1㎛ 내지 30㎛이다. 다중층 리포좀 생성을 위해, 표준 탈수화/재수화 소포(DRV)를 형성할 수 있다.

가장 만족할 만한 캡슐화율을 위해, 동결 건조 단계(b)의 단계는 리포좀과 이미 친밀하게 혼합되어 있는 캡슐화시키고자 하는 물질로 수행한다. 이 방법으로 비교적 높은 캡슐화율이 달성되는 반면에, 리포좀 및 캡슐화용 물질의 혼합물이 충분히 친밀하지 않을 경우, 거의 또는 전혀 혼입되지 않을 것이다. 이는 선행 기술에서와 같이 용액을 혼입시키는 경우에는 제외된다.

단계(c)는 리포좀이 캡슐화시키고자 하는 물질을 허용하도록 하는 모든 재수화 방법으로 수행할 수 있다. 편의상, 이는 쉽게 이용가능한 모든 형태(예: 증류수 또는 수돗물 또는 완충 용액)을 리포좀 및 캡슐화시키고자 하는 물질의 동결 건조된 혼합물에 조절된 방법으로 가하는 절차를 포함하는 것으로 밝혀졌다. 리포좀 구조에 대한 추가의 삼투성 응력을 피하기 위해 증류수를 먼저 가하는 것이 바람직하다. 편의상, 이를 현탁액을 형성하기에 충분한 소량으로 가하고, 수분, 바람직하게는 20 내지 40분(예: 30분) 후에 캡슐화시키고자 하는 물질이 목적하는 활성을 보유하기에 적합한 유사량의 완충액을 가하고; 이러한 적합한 하나의 완충액은 pH 7.4의 인산염 완충된 염수(PBS)이다. 또한, 건조 단계 전에 존재하는 물질이 서서히 재수화되기 때문에 리포좀의 소포에서 형성하는 용액의 높은 삼투압의 균형을 맞추기 위해 이 단계에서 완충액을 가하는 것이 바람직하다.

이렇게 수득된 현탁액은 추가의 기간 후, 바람직하게는 20 내지 40분 후에, 바람직하게는 약 30분 동안 대용적의 완충액(예: PBS)과 혼합하는 것이 바람직하다. 전형적으로, 리포좀은 리포좀의 현탁액으로부터 동결 건조되고, 재수화시 가해진 물 및 염수의 총 용적은, 특별히 제한되지는 않지만, 현탁액 용적의 1 내지 10배 용적을 제공하기에 충분한 것이 편리하다.

재수화 단계는 캡슐화될 물질의 목적 활성의 존속가능성 또는 보유성에 적합한 특정 온도에서 수행될 수 있다. 따라서, 통상적으로 고융점 지질이 리포좀에 사용되고 캡슐화될 물질이 이 온도에 내성이 있는 경우에 0℃ 내지 60℃의 온도가 선택될 수 있다. 생물질 또는 단백질이 사용되는 경우 0℃ 내지 40℃, 바람직하게는 10℃ 내지 30℃가 더욱 보편적이다. 그러나, 특정 유기체 및 단백질을 보다 고온에서 처리할 수 있다는 것이 인식될 것이다.

저장중 리포좀의 불안정한 활성 및 완전성의 존속을 극대화하기 위해, 동결 및 물 손실의 영향을 극복하기 위해 동결방지제를 삽입하는 것이 유리할 수 있다. 이는 바람직하게는 재수화 단계(c)가 수행된 후 첨가된다. 통상적인 상기 방지제는 당 및 이의 유도체, 특히 당업자에게 잘 공지된 것들을 사용하는 기술에서 사용된 트레할로즈와 같은 당이다[참조: Crowe and Crowe in Liposome Technology (1993) V. Vol I, pp 229-249, CRC Press Inc, Boca Raton].

단계 (a)에서 제공된 예비형성된 리포좀의 조성은 또한 특별히 제한되지는 않으나, 캡슐화될 물질을 지지할 수 있는 충분한 용량을 갖는 리포좀이 안정하게 형성될 수 있도록 해야 한다. 소위 '거대 리포좀' 및 DRV 형성용으로 사용되는 통상적인 지질 조성물은 포스파티딜콜린(PC) 또는 디스테아로일포스파티딜 콜린(DSPC)을 포함하고, 이들은 임의로 콜레스테롤, 포스파티딜 글리세롤(PG) 및/또는 트리올레인(TO)과 같은 성분으로 보충된다. 당업계에 공지된 기타 성분 또는 리포좀 안정성을 제공하거나 소포 형성을 유도하는 이의 개발물이 또한 사용될 수 있다.

이들 성분의 클로로포름 용액을 슈크로즈 용액과 혼합하여 에멀젼을 형성한 다음, 이를 유사한 에테르 수 에멀젼과 혼합하여 수-중-유-중-수 에멀젼을 제공하고, 이로부터 유기 용매를 제거하여 리포좀을 생성함으로써 이들 혼합물로부터 거대 리포좀을 편리하게 형성할 수 있다. 동일몰의 PC 또는 DSPC 및 콜레스테롤을 클로로포름에 용해시키고, 혼합물을 회전 증발시켜 플라스크 벽상에 지질 박막을 남김으로써 DRV를 편리하게 형성할 수 있다. 이 막을 4℃(PC의 경우) 또는 60℃(DSPC의 경우)에서 2ml 증류수로 파쇄한 다음, 2분 동안 프로브 초음파 처리하여 작은 단일층 소포(SUV, small unilamella vesicle)를 수득한다. 이어서, 이 현탁액은 캡슐화될 물질과 함께 동결 건조시킴으로써 직경이 0.1㎛를 초과하는 다중층 DRV를 형성하기에 적합하다.

본 발명의 제3 국면에서, 2개의 혼합물을 밀도 구배상에 두고 이를 원심분리시키고, 구배 분획을 제거하고, 분리된 리포좀을 함유하는 것을 수집하고, 리포좀을, 유리 물질이 통상적으로 저분획내에서 수집되고 리포좀이 상층 분획에서 수집되는 통상적인 방법으로, 이들로부터 분리함을 특징으로 하여, 본 발명의 리포좀을 비-포획된 미생물, 세포 또는 수불용성 구조물로부터 분리하는 방법이 제공된다.바람직하게, 구배는 0.4M 내지 4M 슈크로즈 구배 또는 등가의 밀도 범위 또는 유사한 당을 포함하는 구배이다. 가용성 물질로부터의 분리가 또한 필요한 경우, 리포좀을 완충액(예: PBS) 중에서 대략 600xg로 원심분리하여 펠렛으로 이들을 수집한다.

따라서, 본 발명의 제4 국면은 본 발명의 리포좀은 이들이 함유하는 용해되지 않거나 불용성인 미립자의 비-포획된 형태를 함유하지 않는 본 발명의 리포좀 형태로 제공된다. 물론, 이러한 형태는 주어진 투여량 측정에 유익하다.

상기 도입 부분에서 기술한 바와 같이, 환자의 표적 부위에 하나 이상의 제제를 동시에 제공하는 것이 종종 유리하므로, 본 발명은 본 발명의 리포좀, 이의 제조방법 및 비-포획 물질로부터 이의 분리 방법 모두가 수용성 제제를 취급하기 위해 혼입하거나 제공하는 이점을 제공한다. 따라서, 본 발명의 제2 국면의 방법에 의해 제조된 리포좀은 수용성 제제, 예를 들면, 백신, 항체, 항원 또는 효소와 함께 살아있거나 약화된 미생물, 세포 및/또는 수불용성 구조물을 함유할 수 있다.

따라서, 가용성 물질이 또한 혼입되는 경우 본 발명의 리포좀을 제조하는 당해 방법은 재수화 단계, 바람직하게는 동결 건조 단계에서 가용성 물질을 불용성 물질 및 리포좀과 함께 포함하며, 비-포획 물질을 리포좀으로부터 분리하는 방법은 밀도 구배 방법 및 완충액 원심분리 방법 둘다를 이용한다.

상기한 국면의 독특한 이점에 따른 본 발명의 추가 국면은 완전히 살아있거나 약화된 미생물, 식물 또는 동물 세포, 또는 유기 용매 불안정성의 생화학적 또는 면역학적 활성을 갖는 수불용성 비-생존 구조물을 함유함을 특징으로 하는 신규한 리포좀을 제공한다. 후자는 유기 용매 처리에 불안정한 목적하는 활성을 유지하는 사멸된 유기체를 포함한다. 본 발명의 리포좀은 이의 내용물을 방출시켜 배양하고/하거나 생화학적 또는 면역학적 반응을 금지하는 능력이 보유된다는 것을 증명할 수 있다는 점에서 용이하게 식별할 수 있다. 본 발명의 리포좀은 박테리아, 원생동물, 세포 또는 바이러스 이외에, 지지재, 예를 들면, 라텍스 비이드 또는 기타 중합체 지지체를 포함하는 불활성 구조물, 예를 들면, 사이토킨, 효소, 항원 또는 항체를 포함할 수 있다.

본 국면의 바람직한 형태에서, 리포좀 및 이들 소포의 대략적인 크기는 직경이 0.1 내지 50㎛, 바람직하게는 1 내지 30㎛, 통상적으로는 1 내지 14㎛이고, 편리한 평균 직경은 5.5㎛ ± 2.2이지만; 필요한 소포 크기는 필수적으로 캡슐화시키고자 하는 용액, 미생물, 세포 또는 수용성 구조물의 양 또는 크기에 따른다. 리포좀을 초기에 형성시키는 수단은 상기 목적에 중요하지 않고, 따라서 소포 크기의 변동은 불안정한 물질, 특히 미생물 또는 불용성 구조물을 이미 형성된 리포좀에 이들을 사멸시키거나 불활성시키거나 리포좀 완전성을 파괴하지 않으면서 혼입시키는 방법이 제공되는 한 잠재적으로 무한하다.

특히 콜레스테롤, PG 또는 등가물로 안정화된 바람직한 리포좀이 사실상 이의 미립형 내용물을 자발적으로 방출하지 않는다는 사실로 보아 본 발명의 리포좀을 사용하면 특이적으로 신체의 대식세포, 식세포 및/또는 항체 생성 세포를 표적할 수 있다. 따라서, 미립형 물질은 대식세포 또는 식세포에 의해 처리되어, 예를 들면 사이토킨의 면역 반응 및 관련 효과를 향상시키는 경향이 있다. 또한, 대식세포 또는 식세포와 직면할 때까지 미립형 물질이 지질에 의해 순환되는 항체로부터 보호된다는 사실은 면역 시스템 및 항체 생성 세포에 최대 태위(presentation)를 보장한다.

본 발명의 리포좀 및 방법은 이하, 하기 도면, 비제한적 실시예 및 비교 실시예를 참조하여 예시한다. 이러한 관점에서, 본 발명의 범위에 속하는 다른 많은 적합한 리포좀과 이의 제조방법은 당해 기술 분야의 숙련가에게 용이하게 명백해질 것이다.

거대 단일층 리포좀의 형성

이들 실시예에서는 거대 리포좀을 예비형성시키는데, 이의 평균 직경은 5.5 ± 0.2㎛이고, 미립형 또는 가용성 물질과 혼합된 후 조절된 재수화에 적용된다.

생성된 리포좀은 이의 원래 평균 직경과 직경 범위를 유지하며 첨가된 물질을 26.7%(평균치) 이하로 함유하는 것으로 밝혀졌다. 미립자-함유 리포좀은 트레할로스의 존재하에 동결 건조시킬 수 있는데, 염수로 복원시 형성된 소포 내에서 포획된 물질의 대부분(87% 이하)을 회수할 수 있다.

난(egg) 포스파티딜콜린(PC), 디스테아로일 포스파티딜콜린(DSPC), 콜레스테롤, 면역정제된 파상풍 톡소이드 및 트레할로스의 공급원 및 등급은 문헌에 기술되어 있다[참조: Davis and Gregoriadis, 1987, Immunology, 61, 229-234]. 포스파티딜 글리세롤(PG) 및 트리올레인(TO)은 각각 리피드 프로덕츠(Nuthill, Surrey) 및 시그마 케미칼 캄파니(London)로부터 구입한다. 사멸된 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 바실레 칼메테-구에린(BCG)은 각각 닥터 브루스존스(Public Health Laboratories Service, Porton Down, Salisbury, Wilts) 및 닥터 제이. 엘. 스탠포드(Dept of Medical Microbiology, UCL Medical School, London)로부터 증여되었다. 파상풍 톡소이드, 비. 서브틸리스(B. subtilis) 및 BCG를¹²⁵I으로 방사선 표지하는 것은 이미 문헌(참조: Kirby and Gregoriadis, 1984)에 기술되어 있는 바와 같이 수행한다. 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)(Sigma)로 비. 서브틸리스를 표지하는 것은 상기 박테리아를 4℃에서 24시간 동안 FITC 1mg을 함유하는 0.1M 탄산나트륨 완충액 1ml(pH 9.0) 중에서 배양함으로써 수행한다(참조: Mann and Fish, (1972) Meth. Enzymology, 26, 28-42). 다른 모든 시약은 분석 등급의 것이다.

도면

제1도는¹²⁵I 표지된 비. 서브틸리스를 함유하는 거대 리포좀을 슈크로즈 구배 원심분리한 구배 분획 대 부가된 방사능 또는 지질의 비율(%)을 나타낸다. 비 포획된 비. 서브틸리스로부터 포획된 리포좀의 분리(A) 및 첨가된 유리 비. 서브틸리스로부터 빈(empty) 리포좀의 분리(B)는 하기되는 바와 같은 슈크로즈 구배 분리에 의해 수행한다. 제시된¹²⁵I 방사능(○) 및 지질(●)은 하기 비교 실시예 및 실시예 1에 기술된 방법에 의해 제조된 PC 또는 DSCP 리포좀에 대한 전형적인 형태이다. 값은 분획화용으로 사용된 방사능 또는 지질의 %이다.

제2도는 혈장 속에서의 배양 시간 대 본 발명의 리포좀 중의 비. 서브틸리스의 보유율(%)을 나타낸다.¹²⁵I 표지된 비. 서브틸리스를 함유하는 PC 또는 DSPC 리포좀을 37℃에서 마우스 혈장(○) 또는 PBS(●)로 배양시킨다. 샘플을 슈크로즈 구배 상에서 일정한 간격으로 분획화하여 포획된 비. 서브틸리스를 함유하지 않는 리포좀을 분리하고, 3중 실험으로부터의 값은 리포좀으로 회수된 방사능의 % + SD이다.

제3도는 혈장의 존재하에서의 본 발명의 리포좀에 의한 파상풍 톡소이드의 보유율을 나타낸다.¹²⁵I 표지된 파상풍 톡소이드를 함유하는 PC 또는 DSPC 리포좀을 37℃에서 혈장(○) 또는 PBS(●)의 존재하에 배양시킨다. 샘플을 일정한 간격으로 600xg에서 원심분리시켜 포획된 톡소이드를 함유하지 않는 리포좀을 분리한다. 3중 실험으로부터의 값은 리포좀으로 회수된 방사능의 % + SD이다.

제4도는 파상풍 톡소이드와 비. 서브틸리스를 마우스에 근육내 주사한 후 이들의 제거율을 나타낸다.¹²⁵I 표지된 파상풍 톡소이드(A) 또는 비. 서브틸리스(B)가 포획된 리포좀(●) 또는 함유하지 않은 리포좀(○)을 마우스의 뒷다리에 주사한다. 동물을 일정한 시간 경과후 사망시켜 다리를 절단하여 방사능을 측정한다. 각각의 값은 3마리 동물에서 측정하고 주사 직후 다리에서 회수된 방사능의 % + SD로서 나타낸다.

비교 실시예

유기 용매의 존재하에서 백신-함유 거대 리포좀의 제조

포획된 물질을 함유하는 거대 리포좀은 용매 소구 증발법(Kim and Martin,1981)을 변형시켜 제조한다. 간단하게는, 캡슐화할¹²⁵I 표지된 물질(2 x 10³내지 2 x 10⁴cpm; 포자로서 10⁵개의 비. 서브틸리스 박테리아 및 1 내지 2mg의 파상풍 톡소이드)을 함유하는 0.15M 슈크로즈 용액 1ml를 PC 또는 DSPC, Chol, PG 및 TO(4:4:2:1의 몰 비; 총 지질 9μmol)를 함유하는 클로로포름 용액 1ml와 45초 동안 와동 혼합한다. 생성된 클로로포름-중-수 에멀젼을 디에틸 에테르 중의 전술한 지질 용액 0.5ml 및 0.2M 슈크로즈 용액 2.5ml로부터 제조된 수-중-디에틸 에테르 에멀젼과 함께 15초 동안 와동 혼합한다. 이렇게 형성된 수-중-유-중-수 에멀젼을 250ml의 원뿔형 플라스크에 넣고, 샘플을 진탕 항온기에서 온화하게 교반하면서 유기 용매를 37℃에서 질소를 플러싱하여 증발시킨다. 생성된 리포좀을 5분 동안 600xg에서 5% 글루코즈 용액에서 2회 원심분리하고, 펠릿을 0.9% NaCl이 보충된 pH 7.4의 0.1M 인산나트륨 완충액(PBS)에 재현탁시킨다. 이 마지막 단계는 포획되지 않은 톡소이드로부터 포획된 톡소이드를 분리시킨다. (리포좀과 함께 침전된) 포획되지 않은 비. 서브틸리스의 분리를 위해, 슈크로즈 구배 분획화가 사용된다(하기 참조). 몇몇 실험에서, FITC 표지된 폴리스티렌 입자(직경 0.5 및 1㎛; Polysciences 참조) 또는 FITC 표지된 비.서브틸리스는 리포좀내에 상기한 바와 같이 포획되고, 이를 형광 현미경 조사에 사용하였다.

실시예 1

본 발명의 방법에 의한 예비형성된 거대 리포좀 내로의 생 백신의 포획

유기 용매의 부재하에 거대 리포좀 내에 잠재적으로 불안정한 미립형 물질을포획하기 위해, 슈크로즈만을 함유하는 "빈" 거대 리포좀을 상기 비교 실시예에서 기술된 바와 같이(지질 총량이 36μmol인 두 제제를 사용하여) 예비형성하고, 5분 동안 600xg 에서 벤치 원심분리기에서 5% 글루코즈 용액에서 원심분리한다. 리포좀 펠릿을 0.9% NaCl이 보충된 pH 7.4의 0.1M 인산나트륨 완충액(PBS) 1ml에 재현탁시키고, 캡슐화될 물질(포자로서 비. 서브틸리스, 파상풍 톡소이드 및 포자로서 BCG)의 용액 또는 현탁액 1ml와 혼합하고, 진공하에 처리하여 전술한 바와 같이 동결 건조시킨다(참조: Gregoriadis et al, 1987: Kirby and Gregoriadis, 1984). 통상적으로 증류수 중의 리포좀 현탁액 2ml를 50ml들이 환저 플라스크 또는 21mm 직경의 유리 튜브에서 포획될 물질의 현탁액 또는 용액 2ml와 혼합하고, 혼합물을 카디스 및 이소프로판올의 동결 혼합물에서 와동시킴으로써 얇은 쉘로 플래시 동결시킨다. 동결시킨 후에 제제를 예를 들면, 헤토식 동결 건조기에서, 0.1torr의 진공에서 4 내지 5시간 동안 또는 13Pa에서 밤새도록 냉동 건조시킨다.

동결 건조된 물질을 20℃에서 증류수 0.1ml를 첨가시켜 초기에 재수화시킨다(50 내지 60℃에서의 "고 용융" DSPC를 함유 하는 리포좀의 재수화는 물질의 포획률(%)에 중대한 영향을 미치지 않는다). 현탁액을 격렬하게 와동시키고, 30분 동안 정치시킨다. 30분 후에 PBS 0.1ml와 0.8ml를 연속 첨가한 후에 이 방법을 반복한다. 흡수 정도를 평가하기 위해서 포획용 물질 모두를¹²⁵I로 표지한다. 하나의 실험에서, 위에서 제조된 비. 서브틸리스 함유 리포좀을 0.25M(최종 농도)의 트레할로스의 존재하에 동결 건조시킨 후, PBS에 재구성한다.

실시예 2

비포획 물질로부터 포획 물질을 함유하는 리포좀의 분리

비포획 물질로부터 포획 물질의 분리는 슈크로즈 구배 원심분리(비. 서브틸리스 및 BCG; 하기 참조)에 의해 또는 10분 동안 600xg에서 원심분리한 후 두번 PBS-세척된 펠릿을 PBS(파상풍 톡소이드) 1ml 중에 현탁시킴으로써 수행된다. 재형성된 소포에 의한 비. 서브틸리스 보유율은 슈크로즈 구배 분획화에 의해 평가된다. 불연속 슈크로즈 구배는 스윙 아웃 버킷 원심분리 튜브에 4M 슈크로즈 용액의 10개 희석물(슈크로즈 함량: 0.4M 내지 4M)을 적층시켜 제조한다(Gregoriadis, (1970) J. Biol Chem 245, 5833-5837). 실시예 1로부터의 포획된 및 비포획된 비. 서브틸리스 또는 BCG의 제제(1ml)를 구배의 상부에 둔 후, 스웡-아웃 버킷을 사용하여 듀퐁 콤비 플러스 초원심분리기에서 25,000rpm으로 1.5시간 동안 원심분리한다. 원심분리한 후, 1ml 분획을 구배의 상부로부터 피펫으로 취해 월락 미니감마 계수기로¹²⁵I 방사능 및 인지질 함량을 분석한다(참조: Stewart. (1979) Anal. Biochem. 104, 10-14). 슈크로즈 분획으로부터의 리포좀의 분리는 이들을 예를 들면, 원심분리 버킷의 용적을 구성하기에 충분한 희석제를 사용하여, 물 또는 PBS로 희석시킨 다음, 포획되지 않은 파상풍 톡소이드를 제거하기 위해 10분 동안 600xg에서 원심분리함으로써 수행한다.

소포 크기의 측정

거대 리포좀의 용적 분포 면에서 평균 직경은 말베른 마스터사이져(MalvernMastersizer)로 측정한다.

광 현미경 검사

FITC 표지된 비. 서브틸리스 또는 폴리스티렌 입자를 함유하는 리포좀에 대한 광 현미경 검사는 모두 형광원이 장착된 니콘 현미경 및 레이카 공촛점 현미경을 사용하여 수행한다. 리포좀의 가시화를 향상시키기 위해, 리포좀 제조 도중 지질의 클로로포름 용액 중에 오일-레드-0를 가하여 이들을 염색시킨다.

혈장에서의 거대 리포좀의 안정성

방사능 표지된 톡소이드(10³cpm: 0.1 내지 0.2mg) 또는 비. 서브틸리스(3 내지 5 x 10³cpm: 10³박테리아)를 함유하며 실시예 1 및 실시예 2에서와 같이 본 발명의 방법으로 제조된 PC 또는 DSPC 거대 리포좀(총 지질 3 내지 5mg)을 마우스(수컷, CDI 혈통) 혈장 또는 PBS 5용적을 사용하여 3중 혼합한 다음, 37℃에서 배양시킨다. 시간 간격으로, 샘플을 제거하고 리포좀에 의해 포획된 물질의 보유율을 슈크로즈 구배 분획화(비. 서브틸리스) 또는 600xg에서 원심분리시켜(톡소이드) 확인한다. 소포 안정성은 소포에 의해 보유되는 원래 포획된 물질의 %로서 나타냈다.

마우스에 근육내 주사 후의 리포좀-포획된 톡소이드 및 비. 서브틸리스의 제거

48마리의 수컷 CDI 마우스(체중 20 내지 25g)를 각각 12마리의 동물로 이루어진 4개의 그룹으로 랜덤하게 나누고, 0.1ml의 (a) 방사선 표지된 유리 톡소이드(6 x 10³cpm; 0.01mg); (b) 방사선 표지된 유리 비. 서브틸리스(3 x10³cpm; 포자로서 10³박테리아); (c) 실시예 1의 방법으로 DSPC 리포좀(총 지질 1mg) 속에 포획된(a)에서와 같은 톡소이드; (d) (c)에서와 같이 DSPC 리포좀 속에 포획된 (b)에서와 같은 비. 서브틸리스를 사용하여 근육내(뒷다리) 주사한다. 3그룹의 동물을 사멸시키고 주사한 직후(제로(0) 시간 값을 설정하기 위하여) 및 이후의 시간 간격으로 뒷다리를 제거한다.¹²⁵I를 절단된 다리에서 측정하고, 결과를 제로 시간에서의 조직에서 회수된 방사능(%)으로서 예측한다.

결과:

거대 리포좀으로의 비. 서브틸리스 포획에 대한 포획 연구 평가는 둘다 저속에서 침전되므로 원심분리에 의해 성취할 수 없다. 그러나, 완전한 분리는 이미 기술한 바와 같은 슈크로즈 구배 분획화에 의해 수득된다. 원심분리 후 분획에서 측정한¹²⁵I 방사능 활성(비.서브틸리스) 및 인지질(리포좀) 값은, 박테리아-함유 PC 또는 DSPC 리포좀이 하부 분획에 침전되는 유리 비. 서브틸리스와 함께, 구배의 상부 10개의 0.5ml 분획에서 회수되었음을 나타낸다.

실시예의 프로토콜에 따라 제조된 8개의 상이한 PC 및 DSPC 제제에서 이들 소포의 평균(+SD) 직경은 하부 및 상부 직경 범위(모든 제제)가 1 내지 14㎛로 상당히 다양한 것(5.5 ± 2.2㎛)으로 밝혀졌다. PC와 DSPC 리포좀 사이의 평균 직경에 있어서 통계학적으로 중요한 차이는 존재하지 않는다. 박테리아가 빈 소포의 표면에 흡착되었을 가능성은, 구배 분획화 전에 22시간 동안 비. 서브틸리스를 갖는 이러한 리포좀의 배양이 하부 분획에서 후자를 정량적으로 회복시키기 때문에 무시한다. (동일 분획에서 리포좀성 인지질의 존재에 부합하는) 슈크로즈 구배의 상부 10개의 분획 중의 비. 서브틸리스의 존재를 근거로 하여, 김 및 마틴(Kim and Martin)의 방법에 의한 12개의 별도 실험에서의 비. 서브틸리스 포획률은 사용된 박테리아의 평균 값으로 31.6%와 함께 다양했다. 그러나, (유기 용매의 존재하의)동일한 방법에 의한 파상풍 톡소이드를 포획하기 위한 시도는, 아마도 물-클로로포름 계면에서 단백질의 변성 및 이로인해 수상 속에 변경된 단백질이 잔류할 수 없음으로 인해, 실패하였다.

상기 발견 및 포획용으로 충당된 기타 단백질 항원 및 약화되거나 살아있는 미생물의 유사한 손상 또는 다른 불활성화에 대한 전망은 본 발명의 방법과 생성 리포좀의 진보를 입증한다. 비. 서브틸리스, BCG 및 파상풍 톡소이드를 갖는 예비 형성된 리포좀을 동결 건조시킴으로써 수득된 분말의 조절된 재수화는, 다양하지만 상당한 비율의 비. 서브틸리스, BCG 및 톡소이드(사용된 물질의 8.4 내지 27.8%)를 함유하는, 모체 소포(상기 참조)의 것과 유사한 평균 직경(4.6 ± 1.3㎛ 및 1 내지 18㎛의 하부 및 상부 범위; 모든 제제)을 갖는 소포를 형성했다. 본 발명의 방법으로 수득한 비. 서브틸리스 포획치와 김 및 마틴의 방법으로 수득한 비. 서브틸리스 포획치에는 중요한 차이점은 없었지만, 김 및 마틴의 방법과 달리, 리포좀 내용물을 배양판상에서 접종할 경우 박테리아를 성장시키는 능력이 보유되었다.

형태학 연구:

광 현미경 검사는 오일 레드-0로 염색된 거의 모든 거대 소포가 많은 예에서 소포 내벽(또는 내벽쪽의 침전물)에 흡착하는 것처럼 나타나는 다수의 FITC-표지된비. 서브틸리스 세균을 함유함을 나타냈다. 직경이 18㎛인 리포좀내에 포획시키기 위한 미립형 물질로서 폴리스티렌 입자 및 라텍스 입자(직경: 0.5㎛ 및 1㎛)를 사용하는 실험에서 유사한 결과가 생성된다. 리포좀 내에 입자가 배치되었다는 것을 소포 내의 공간의 상이한 "섹션"에서 이들의 가시화를 가능하게 하는 공촛점 현미경 검사에 의해서 추가로 증명되었다.

혈장 중에서 거대 리포좀의 안정성

예비 면역된 동물, 백신에 대한 모체 항체 또는 백신 불순물에 대한 항체를 갖는 동물에게 살아있거나 약화된 미생물 백신의 담체로서 리포좀의 성공적인 사용(단독으로 또는 가용성 항원과 배합하여)을 위한 중요한 필요 조건은 항원 제시 세포로의 이들의 운반 이전에 항체와 백신의 상호작용을 피하는 것이다. 이전의 연구(Gregoriadis & Allison, 1974)는, 이러한 상호작용은 다중층 리포좀을 함유하는 단백질을 당해 단백질로 예비-면역된 마우스 내에 정맥 주사할 때 회피되는 반면; 아마도 이층(bilayer) 내에 항원의 감금으로 인해, 유리 단백질을 주사한 모든 동물은 아나필락시성 쇽으로 죽고, 포획된 단백질로 처리된 동물들은 살아남는다는 것을 입증했다. 유사하게, 리포좀성 항원을 피하 주사한(발) 마우스에서 아르수스 반응(Arthus reaction)이 전혀 없었다(참조: Gregoriadis & Allison, 1974). 따라서, 탈수-재수화로 제조된 거대 리포좀이 37℃에서 마우스 혈장의 존재하에 포획된 박테리아 또는 파상풍 톡소이드 함량을 여전히 보유하는지의 여부를 살피는 것은 흥미롭다.

결과로서, 비. 서브틸리스-함유 PC 거대 리포좀은 이들의 박테리아 함량을혈장의 존재하에 24시간 이상 동안 80 내지 90%로 유지한다. 약 10%의 박테리아가 혈장과 혼합시키자마자 유리될 때, 이들은 박테리아가 포획되는 동안 리포좀 표면에 흡착된 후, 혈장 성분에 의해 제거됨을 나타낼 수 있다. 이는 PBS에 노출된 리포좀이 이들의 비. 서브틸리스 함량 모두를 보유한다는 사실에 의해 지지된다. 혈장의 존재하에서 DSPC 리포좀에 의한 비. 서브틸리스의 보유율은 7시간 이상 동안 보다 훨씬 더 커졌다(> 95%). 또한, 보유율 값은 PBS의 존재하에서 제시된 것과 상당히 상이한 것은 아닌데, 이는 아마도 이의 구조내에 DSPC를 함유하는 리포좀성 이층이 더 견고하며, 따라서 입자 흡착에 대한 내성이 더 강하기 때문이다. 비. 서브틸리스(직경 0.8㎛)의 거의 정량적인 보유에 대조적으로, 거대 리포좀은 혈장의 존재하에 점차적으로 상당한 양 또는 톡소이드 함량을 손실하는 것으로 나타났는데, 이 손실은 DSPC 리포좀(38%: 24시간 값)에 대해서보다 PC(48%)에 대해서 더 현저했다.

근육내 주사 후의 거대 리포좀의 생체내 안정성

마우스에 근육내 주사 후에 거대 리포좀에 의한 파상풍 톡소이드 및 비. 서브틸리스 보유 정도는, 예를 들어 근육조직 내에 방출된 물질 및 리포좀 포획된 물질을 측정함에 의해 직접 추산될 수 없다. 그러나, 조직으로부터 유리 및 리포좀 포획된 파상풍 톡소이드 및 비. 서브틸리스의 제거율을 비교하면 리포좀이 동일 반응계에서 보유하는 정도의 증거를 제공할 수 있는 것으로 추론된다. 리포좀을 통해 투여된 파상풍 톡소이드가 주사 후 10시간 경과후에 조직내에서 톡소이드만 투여된 것(27%)보다 훨씬 많이(주사직후 조직에서 측정된 함량의 67%) 회수되었다.(포획된및 유리) 2가지 톡소이드 제형 사이의 제거 속도의 현저한 차이는 다량의 리포좀성 톡소이드가 동일 반응계에서 소포내에 보유되어 있음을 시사한다.

리포좀성 톡소이드의 느린 제거 속도로부터 리포좀이 점차로 불안정화되어 톡소이드를 방출한 후, 이것이 조직으로부터 유리형으로 제거됨을 알 수 있다. 그러나 소포들중 일부, 특히 크기가 작은 소포는 또한 림프관으로 이동할 수 있다. 한편, 유리 및 리포좀성 비. 서브틸리스의 제거 속도는 초기에는 유사하며, 비. 서브틸리스 또는 톡소이드를 함유하는 리포좀이 국부 환경에서 동일한 정도로 불안정해진다( 및 이들의 내용물을 방출시킴)고 가정하면, 최초 5시간 동안 리포좀성 비. 서브틸리스의 제거 속도가 (리포좀성 톡소이드의 제거 속도에 비해) 더 느려지는 것은 아마도 유리 박테리아의 유사하게 느린 제거 속도에 기인하는 것이다. 그럼에도 불구하고, 주사후 24시간 경과 후에 2개의 비. 서브틸리스 제형 사이의 조직농도의 현저한 차이는 리포좀이 주사된 조직 내에서 안정한 상태를 유지하는 상당한 정도를 나타낸다.

따라서, 살아있거나 약화된 미생물에 치명적인 용매의 사용 및 생체내 사용에 대해 유독하게 작용하는 제형에서 세제의 존재는 본 발명을 이용함으로써 회피될 수 있음이 입증되었다. 본 방법에 의해 제조된 리포좀은 혈장의 존재하에 박테리아 또는 가용성 항원 함량의 대부분을 (외부 환경으로부터 분리된 채로), 그리고 이를 생체내에 상당한 비율로 보유한다. 따라서, 리포좀은, 경우에 따라, 함께 포획된 가용성 항원 또는 사이토킨과 함께, 미생물 백신용 면역보강제로서 작용할 뿐만 아니라, 백신 불순물에 대한 모체 항체 또는 예비형성 항체와 살아있거나 또는약화된 미생물 백신의 상호 작용을 예방할 필요가 있는 경우에 살아있거나 또는 약화된 미생물 백신의 담체로서도 또한 작용할 수 있다.

더욱이, 본 발명은 포획 단계를 최적화할 필요없이, 미생물 또는 세포를 리포좀내에 포획시킨 후, 이를 포획된 상태로 배양하여 활성 물질의 '용량'을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 단지 소수의 세포만이 재수화 단계에서 포획될 필요가 있고, 이어서 이들은 리포좀 벽을 통해 영양분, 바람직하게는 지질 대사의 억제제를 공급받아 증식하여 리포좀 소포로 하여금 목적하는 물질을 좀더 많이 적재할 수 있도록 할 수 있다. 일단 적당하게 적재되면, 리포좀은 보관을 위해서 동결 건조시키고, 사용하기 바로 전에 재수화시켜 사용한다.

본 발명의 다중층 리포좀의 형성:

실시예 3

다중층 DRV 리포좀 속에서 생 포자 및 기타 물질의 포획

PC 또는 DSPC 및 등몰의 콜레스테롤(인지질 18μmol)로 이루어진 작은 단일층 소포를, 문헌(참조: Kirby 및 Gregoriadis, 1984)에 기술되어 있는 바와 같이 인지질과 콜레스테롤을 클로로포름에 용해시킨 다음, 회전 증발시켜 플라스크 벽에 지질 박막을 잔류시켜 제조한다. 박막을 증류수 2ml로 4℃(PC) 또는 60℃(DSPC)에서 분쇄시킨 다음, 약 2분 동안 탐침-초음파 분해시켜 현탁액 중의 SUV를 생성시킨다. 현탁액을¹²⁵I- 표지된 생 포자(10⁷) 2ml,¹²⁵I-표지된 톡소이드 100 내지 150㎍ 또는 방사성 표지된 포자와 표지되지 않은 톡소이드와의 혼합물과 혼합하고, 밤새동결 건조시킨다. 동결 건조된 물질을 적합한 온도(실시예 2 참조)에서 물 0.1ml와 함께 격렬히 혼합하고, 30분 동안 정치시킨다. 당해 단계를 PBS 0.1ml를 사용하여 반복하고, 30분 후 현탁액에 PBS 0.8ml를 보충한다. 최종 현탁액을 슈크로즈 구배 분획화시켜 포획되지 않은 포자로부터 포획된 포자를 분리하거나, 90,000xg에서 20분 동안 2회 원심분리시켜 포획된 톡소이드로부터 유리 톡소이드를 분리한다. 표지되지 않은 톡소이드를 플루오레스카민법(fluorescamine method; Anderson and Desnick (1979) J. Biol. Chem., 254, 6924)으로 측정한다.

결과:

이러한 유형의 소포의 소포 크기가 비교적 작다는 이전의 발견에도 불구하고, 포자 포획률은 예기치 않게 높았다(63.6 내지 78%). PC-DRV의 평균 크기는 직경이 3.6㎛이고, DSPC-DRV의 평균 크기는 직경이 3.2㎛이다.

포자 생존능력

비. 서브틸리스 포자를 함유하는 거대 또는 DRV 리포좀을, 트리톤 X-100으로 처리하여 영양 육즙에 연속 희석된 포자를 유리시킨 다음, 영양 한천 플레이트상에 도포하여 총 콜로니수, 생존체 수 및 각각의 소포당 생존한 포자의 평균수를 추산하여 포자 생존 능력에 대해 시험한다. 결과는 콜로니 수가 기재되어 있는 하기 표 1에 제시된다.

시험된 각각 처리된 제제에 대해 생성된 콜로니수는 무손상 리포좀으로 관찰한 것보다 훨씬 많고, 무손상 리포좀 속의 포자는 단일 콜로니만을 생성하기 쉽다. 표는 20개 이하의 포자가 각각의 소포에서 발견될 수 있으며, 포자수와 사용된 인지질과의 관계는 명백하지 않음을 나타낸다. 포획된 포자수와 소포 크기 사이에는 포지티브 관계가 있다.

사용된 6개의 상이한 거대 리포좀 제제 중에서 최저 포자수는 최소 직경의 소포로 수득되었고, 최고 포자수는 최대 직경의 소포로 수득되었다. 그러나, DRV 리포좀에 있어서는, 이들의 보다 작은 크기가 보다 적은 포자수를 반영하는 것은 아니었다.

표 1. 소포당 생존가능한 비. 서브틸리스 포자의 추산된 평균수

비. 서브틸리스 포자를 비교 실시예(A) 및 실시예 1(B)의 방법에 의한 거대 리포좀 또는 DRV 리포좀 내에 포획시키고, 각각의 유형을 제조하기 위해 PC와 DSPC 지질을 모두 사용한다. 트리톤 처리 후의 콜로니 수를 대조군 수로 나누어 소포당 포자의 추산을 수행하는데, 이때 트리톤 수는 소포로부터 유리된 생존가능한 포자수와 동일하다. 대조군 수는 포획된 포자가 한개의 콜로니만을 생성할 때의 소포수와 동일하다. 포자에 대한 용매(방법 A)의 독성 효과가 입증되며, 이러한 효과는증식형 박테리아에 대해 증대된다.

Claims

(a) 리포좀을 형성시키는 단계,

(b) 이렇게 형성된 리포좀을 동결 건조시키는 단계 및

(c) 동결 건조된 리포좀을 그 속에 함유될 물질과의 친밀한 혼합물 중에서 재수화시키는 단계를 포함하는, 용해되지 않거나 수불용성인 미립형 생물학적, 화학적 또는 물리학적 활성 물질을 함유하는 직경 0.1㎛ 이상의 리포좀의 제조방법.
제1항에 있어서,

(a) 그 속에 함유될 미립형 물질을 수용하기에 충분한 크기의 단일층 리포좀(unilamella liposome)을 형성시키는 단계,

(b) 이렇게 형성된 리포좀을 동결 건조시키는 단계 및

(c) 동결 건조된 리포좀을 미립형 물질과의 친밀한 혼합물 중에서 재수화시키는 단계를 포함하는, 용해되지 않거나 수불용성인 미립형 물질을 함유하는 단일층 리포좀의 제조방법.
제1항에 있어서,

(a) 직경이 생성될 다중층 리포좀(multilamella liposome)의 직경 미만인 단일층 리포좀을 형성시키는 단계,

(b) 이렇게 형성된 리포좀을 그 속에 함유될 물질의 존재하에 동결 건조시키는 단계 및

(c) 동결 건조된 리포좀 및 물질을 재수화시키는 단계를 포함하는, 용해되지 않거나 수불용성인 미립형 물질을 함유하는 다중층 리포좀의 제조방법.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 실질적으로 수불용성이거나 용해되지 않은 미립형 물질이 미생물, 식물 또는 동물 세포, 또는 유기 용매에 불안정한 생화학적 또는 면역학적 활성을 갖는 수불용성 구조물을 포함하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 리포좀의 형성 단계(a)가 직경이 0.1㎛ 내지 50㎛인 리포좀의 형성을 포함하는 방법.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계(b)가 리포좀과 이미 친밀하게 혼합된 캡슐화될 물질을 사용하여 수행되는 방법.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 수분 손실 효과에 대한 보호제가 재수화 단계 후에 리포좀 생성물에 첨가되는 방법.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 리포좀 내에 함유될 물질이 살아있는 미생물 또는 식물 또는 동물 세포를 포함하고, 재수화 단계(c)이후에 미생물 또는 세포가 배양 및 증식되도록 리포좀 벽을 통해 영양분이 제공됨을 특징으로하는 방법.
제8항에 있어서, 영양분이, 미생물 또는 세포의 리포좀의 지질을 대사할 수 있는 활성에 대한 억제제와 함께 공급되는 방법.
제8항에 있어서, 세포가 포자 형태인 방법.
제1항에 따르는 방법에 의해 수득되는 리포좀.
하나 이상의 살아있는 또는 약화된 미생물, 식물 또는 동물 세포, 또는 유기 용매에 불안정한 생화학적 또는 면역학적 활성을 갖는 수불용성 구조물을 함유함을 특징으로 하는 리포좀.
살아있는 또는 약화된 바이러스, 박테리아 및/또는 원생동물을 함유함을 특징으로 하는 리포좀.
제12항에 있어서, 수불용성 사멸 구조물이 사이토킨, 효소, 항원 또는 항체를 함유하는 지지 물질을 포함하는 리포좀.
제11항 내지 제13항 및 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, 수용성의 생화학적 또는 면역학적 활성 물질을 추가로 함유함을 특징으로 하는 리포좀.
직경이 0.1 내지 50㎛이고, 구의 평균 직경이 6.2㎛인 리포좀의 소포당 포자수가 4를 초과하도록 생존가능한 박테리아 포자를 함유하는 제11항 내지 제13항중의 어느 한 항에 청구된 리포좀을 포함하는 리포좀 제제.
제16항에 있어서, 리포좀이 다중층이고, 생존가능한 박테리아 포자의 수가 평균 직경 3.2㎛의 리포좀 구당 6 포자 이상인 리포좀 제제.