CN102240531B - 一种植物细胞微球及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种微球，特别公开了一种植物细胞微球及其应用。该植物细胞微球，其特征在于：是由植物原生质体、植物细胞、植物孢粉或花粉为基础加工制造的微球，原生质体来源的植物细胞微球含有基质、基质通道、中腔、内球和外挂件；细胞来源的植物细胞微球含有外壁、基质、基质通道、中腔、内球和外挂件；孢粉来源的植物细胞微球含有外壁、内壁、基质、基质通道、中腔、内球和外挂件。本发明的植物细胞微球在功能方面，可以实现缓释、控释及其他物化功能，在使用后可以自然降解。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种微球，特别涉及一种植物细胞微球及其应用。
(二)背景技术
微球是在新材料领域发展起来的直径在1至1000微米之间的球形和近球形实心、空心或孔、层、间隙等符合心的实体，具有承载、卸载、填充、机械强度强化或软化、胶粘、固化、热导或隔热、导电、电阻或绝缘、透光、反光、滤光、吸附、过滤、灭菌、酸碱缓冲、氧化还原、置换、物质的缓释和控释等功能。
传统的微球由物理、化工等方法制成，存在诸多不足：(1)缺乏智能性，使用性能单一；(2)不能满足绿色食品的标准；(3)不能满足绿色和天然化妆美容品、绿色和天然生物医药辅剂的标准；(4)材料生产和微球制造工艺复杂；(5)智能微球生产难度大；(6)微球功能修饰直接涉及生产线的改变，使生产线升级换代的代价大；(7)微球材料生产和微球制造工艺高耗能、高污染；(8)部分微球不易降解，造成环境污染；(9)微球生产环节本身没有环境增益。
(三)发明内容
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种可定向修饰、自然降解的植物细胞微球。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种植物细胞微球，其特征在于：是由植物原生质体、植物细胞、植物孢粉或花粉为基础加工制造的微球，原生质体来源的植物细胞微球含有基质、基质通道、中腔、内球和外挂件；细胞来源的植物细胞微球含有外壁、基质、基质通道、中腔、内球和外挂件；孢粉来源的植物细胞微球含有外壁、内壁、基质、基质通道、中腔、内球和外挂件。
细胞来源的植物细胞微球的外壁以及孢粉来源的植物细胞微球的内壁是由植物细胞壁组成，为包被在细胞膜外侧的可分层的异质体膜壳结构，含有胼胝质、果胶质、纤维素质、半纤维素或木质素。
孢粉来源的植物细胞微球的外壁是指孢粉壁，为包被在细胞壁外侧的小孢子壁或雄配子壁，呈异质体膜壳结构，含有孢粉素。
所述植物细胞微球内球，是指细胞原生质体结构内的修饰实体。
所述植物细胞微球外挂件为原生质体、细胞壁或孢粉壁的表面或其间所镶嵌的结构。
淀粉质植物细胞微球作为高吸水性微球的应用。
纤维素质植物细胞微球作为高吸水性微球的应用。
植物细胞微球作为保水剂、缓释剂在农业、化妆品、药物方面的应用。
植物细胞微球在安全保卫方面的应用。
植物细胞微球的加工包括前处理、培养期处理和后期加工处理。
(1)前处理
按照成品植物微球的尺寸、形态、结构、物质构成、功能和色泽等指标要求进行物种、品种和发育时期的选择。
按照成品植物微球的尺寸、形态、结构、物质构成、功能和色泽等指标要求进行立地条件、气候类型和种植季节的选择。
通过或结合杂交、自交、诱变、单倍体育种等遗传育种方法创制和筛选适宜品种(系)，形成所涉及植物的生长特性或植物细胞微球的特定性状和功能。具体育种方法是：①在授粉亲和的植物品种中进行杂交授粉。产生的F1代进行自交授粉，选择花粉或离体培养的体细胞系；②根据花粉或离体细胞形态结构的改良性状进行株系筛选，并回交授粉或侧交授粉，进一步选择和稳定后代的性状及纯化基因型；③在难稳定性状的株系中进行小孢子离体培养，以NLN改良培养基诱导产生双单二倍体植株或细胞系，筛选确定稳定性状的纯化基因型。
引起过敏反应的孢粉外壁蛋白可以通过上述方法修饰去除。
选择水源洁静、无化学污染和辐射污染、无相关有害物种和转基因生物的地区进行所筛选出的植物株系的材料的收集和生产。
利用PCR或ELISA等检测技术，检测区分转基因材料及有害物种。
建立种质资源库，保持所选植物株系和相应亲本。
(2)培养期处理
按照成品植物微球的尺寸、形态、结构、物质构成、功能和色泽等指标要求和所用植物细胞系或品种的特性进行培养条件的调控，特别是培养基成分的选择。其中，引起过敏反应的孢粉外壁蛋白可以灭活或得到修饰及去除；内球及其他结构中的内容物可以得到改变；外挂件可以得到组装。
(3)后期加工处理
进行相应的物理、化学、生物学修饰、分离、聚合，以及筛选和纯化。由此，相应的植物细胞微球的化学组成、组份、结构、功能等可以得到筛选和改变。其中，引起过敏反应的孢粉外壁蛋白可以灭活或得到修饰及去除；内球及其他结构中的内容物可以得到改变；外挂件可以得到组装。
进行相关植物细胞和孢粉的固化、干燥、收集。以临界点干燥、冰冻干燥、常温、高温、变温等干燥方式减除植物细胞微球所含部分或全部游离水。
建立湿法储藏和干燥储藏、常温储藏、低温储藏及超低温储藏库。
建立相应的标记、包装、物流、销售技术和方式。
建立细胞系资源库。
植物细胞微球的功能修饰，可以按照成品植物微球的尺寸、形态、结构、物质构成、功能和色泽等指标要求和所用植物细胞系或品种的特性进行植物细胞的遗传修饰，主要通过细胞融合、化学诱变、分子标记辅助筛选等遗传操作，对植物细胞特定基因(群)的DNA进行修饰，从而定向修饰植物细胞的特定分子、物质组分、形态和结构。例如细胞壁或孢粉壁的修饰，免疫集团的修饰，物质组份的改变等。
所述植物细胞微球的功能修饰，也可以通过培养条件的调控进行。例如重金属的减除、糖组份和含量的改变、维生素组份和含量的改变、物质组份的改变等。
所述植物细胞微球的功能修饰，也可以通过培养细胞的物理、化学、特别是酶化学的实施进行。例如细胞壁或孢粉壁的修饰，纳米附件的内装和外挂，免疫集团的修饰，生物活性物质的修饰，电性、亲水性及通透性的改变等。
所述植物细胞微球具有承载、卸载、填充、机械强度强化或软化、流动、胶粘、粘滞、固化、胶合或愈合、升温、降温、恒温、热导或隔热、激应反应、导电、电阻或绝缘、磁性、透光、反光、滤光、吸附、置换、过滤、灭菌、杀灭其他细胞或生物体、酸性、碱性、酸碱缓冲、氧化、还原、示踪、跟踪、导向、催化反应、降解、光和作用、信号发生和传导、物质的传导或转移、物质代谢、物质的缓释和控释等一种或数种功能。
以植物细胞微球的种类、功能和所使用和涉及的客体和环境，按使用技术标准进行运输、储藏、保存、调配、使用等操作。
所述植物细胞微球可应用在物理、化学、化工、生物学、生物技术、医学、医疗、卫生、药学、农业、化妆美容、食品、环境科学、生态保护、机械、工业制造、加工业、建筑业、运输业、航空航天、仪器分析、计算机、信息工程、通讯、军工、安全等领域。
植物细胞微球，其植物细胞的细胞壁或完整、或增厚、或部分去除、或完全去除；其植物细胞的形态、结构和成分或保留完整、或增加、或减少、或变化。植物细胞可以从自然界收集或以种植方式及离体培养或发酵的方式生产、收集，并加工成型。植物细胞和植物细胞微球的形态、结构、物质组份、生理、生态、性状和功能可以通过遗传育种、物理、化学等方式改变。
该植物细胞微球，用于完成直径在1-1000微米之间的球形和近球形实心、空心或孔、层、间隙等符合心的实体，可具有填充、机械强度强化或软化、胶粘、固化、热导或隔热、导电、电阻或绝缘、透光、反光、滤光、吸附、过滤、灭菌、酸碱缓冲、氧化还原、置换、物质的缓释和控释等功能。该微球，包括不同植物类群的原生质体来源、细胞来源和小孢子及花粉来源，其颗粒尺度在1-1000微米之间，具有遗传修饰、培养条件修饰、物理及化学加工修饰潜能，以到达生物量产率、生长性状、微球组份、微球结构等的改变，适应不同微球使用环境和目的的要求。
本发明的植物细胞微球在功能方面，可以实现缓释、控释及其他物化功能；同时也可以实现天然、绿色、有机标准的要求；也可以实现智能化的要求；在制造方面工艺精准、扩展升级容易；所述植物细胞微球在植物细胞微球材料和微球生产方面可以定向修饰以完成其结构、外形、组份、功能和可操纵性智能的产生、改变和扩展；在生产加工阶段可以最大限度地减少排放、保护环境，特别是由于利用了光合作用而实现环境增益；在使用后可以自然降解。
(四)附图说明
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
图1为原生质体来源的植物细胞微球解剖示意图；
图2为细胞来源的植物细胞微球解剖示意图；
图3为孢粉来源的植物细胞微球解剖示意图。
图中，1基质，2内球，3基质通道，4中腔，5外挂件，6官能团，7外壁通道，8外壁，9内壁，10内壁通道。
(五)具体实施方式
实施例1：
该植物细胞微球，是由植物原生质体、植物细胞、植物孢粉或花粉为基础加工制造的微球，原生质体来源的植物细胞微球含有基质、基质通道、中腔、内球和外挂件；细胞来源的植物细胞微球含有外壁、基质、基质通道、中腔、内球和外挂件；孢粉来源的植物细胞微球含有外壁、内壁、基质、基质通道、中腔、内球和外挂件。
植物细胞微球是由原核或真核植物细胞或孢粉作为原料产生，以植物细胞为微球结构主体，可包括原生质体、细胞壁(带壁微球)、孢粉壁(孢粉微球或花粉微球)、内外挂件的全部或其中一部或几部的组合。
植物细胞微球内球，是指细胞原生质体结构内的修饰实体，可被膜或无。例如囊泡、无机盐颗粒、有机物颗粒等。
植物细胞微球外挂件为原生质体、细胞壁或孢粉壁的表面或其间所镶嵌的结构，例如多肽或蛋白质(例如酶、抗原或抗体)、多糖、脂(酯)类、DNA序列、RNA序列、生物大分子、单体、金属颗粒、纳米颗粒等特定修饰物。
实施例2：原生质体来源的植物细胞微球：
植物细胞微球原生质体是指植物细胞除去细胞壁后所剩的细胞部分，其结构上包括细胞膜、细胞核(或原核细胞的核区)、细胞器(或原核细胞所对应的非膜包被功能区)，以及细胞质。其结构和组份可以经过所述植物细胞微球生产过程所涉及的遗传改良、修饰、诱变、发育时期选择、处理和加工等而改变其存在和性质。
原核或真核植物的细胞，特别是体细胞，进行发酵用固体或液体培养基，例如：B5、MS、NLN等培养基。培养温度：0-80℃。摇动速度：1-500rpm。培养基含N、P、K、Fe、Ca等大量元素、Mn等微量元素、维生素等有机元素和糖等，pH 5-8，以上各项以及光照时间、光的强度和波长等培养条件依物种和微球成品的形态、结构、物质构成、功能、色泽和产率等指标要求而定。
培养产生的植物个体、植物器官、组织或细胞可以经离心(100-5000rpm)、过滤(50-400目滤网)、吸附(有机或无机材料吸附、亲和材料吸附等)或电泳分离方式(相应培养液或其简化配方，1-100v)等，或这些方法的组合，进行植物细胞和细胞团的收集，待用；或不经上述收集方式而直接采集，待用。
以等渗溶液，例如：原生质体培养基、高钙溶液、PEG溶液、蔗糖溶液、葡萄糖或其他单糖溶液、或生理盐水等溶液，冲洗1-3次，加入用相应适宜等渗溶液配制的纤维素酶、果胶酶、半果胶酶、蜗牛酶、裂解酶，0.1％-20％(w/v)，或其组合，保温(4-50℃)静止或缓慢摇动(0.5-24h)，待镜鉴细胞壁消解至所要求标准，即细胞壁新增穿孔密度0-99％，或细胞壁完全消失，然后以等渗溶液冲洗3次，收集待用。
植物萌发的种子、种苗、植物的器官或组织如根、茎、叶、花、果实、种子、菌根、子实体等植物体，经过酒精或氧化剂(次氯酸、双氧水等)消毒，冲洗，或使用无菌的试管苗、细胞培养所产生的愈伤组织、芽丛、体细胞胚、悬浮细胞系等，以等渗溶液(例如：原生质体培养基、高钙溶液、PEG溶液、蔗糖溶液、葡萄糖或其他单糖溶液、或生理盐水等溶液)冲洗1-3次，加入用相应适宜等渗溶液配制的纤维素酶、果胶酶、半果胶酶、蜗牛酶、裂解酶，0.1％-20％(w/v)，或其组合，保温(4-50℃)静止或缓慢摇动(0.5-24h)。待镜鉴细胞壁消解至所要求标准(细胞壁新增穿孔密度0-99％，或细胞壁完全消失)，然后以等渗溶液冲洗3次，固化、干燥，收集待用；或经离心(100-5000rpm)、过滤(50-400目滤网)、吸附(抗原、抗体吸附、有机或无机材料吸附、亲和材料吸附等)或电泳分离方式(相应培养液或其简化配方，1-100v)等，或这些方法的组合，进行植物原生质体的收集，待用。
实施例3：细胞来源的植物细胞微球：
原核或真核植物的细胞，特别是体细胞，进行发酵用固体或液体培养基(例如：B5、MS、NLN等培养基)培养。培养温度：0-80℃。摇动速度：1-500rpm。培养基含N、P、K、Fe、Ca等大量元素、Mn等微量元素、维生素等有机元素和糖等，pH 5-8。以上各项以及光照时间、光的强度和波长等培养条件依物种和微球成品的形态、结构、物质构成、功能、色泽和产率等指标要求而定。
培养产生的悬浮细胞可以经离心(100-5000rpm)、过滤(50-400目滤网)、吸附(有机或无机材料吸附、亲和材料吸附等)或电泳分离方式(相应培养液或其简化配方，1-100v)等，或这些方法的组合，进行植物细胞的收集，待用。
培养产生的植物个体、植物器官、组织或细胞团可以经过上述(1)步骤所述方式产生原生质体。然后用原生质体培养液洗去酶液，以原生质体培养基进行细胞壁再生培养。在所需要的细胞壁再生1-100％范围内按所需细胞壁再生指标(例如10％、50％、80％、100％等)停止培养，收集，待用。
实施例4：孢粉来源的植物细胞微球：
细胞来源的植物细胞微球的外壁以及孢粉来源的植物细胞微球的内壁，由植物细胞壁组成，为包被在细胞膜外侧的异质体膜壳结构，可分层，常含有胼胝质、果胶质、纤维素质、半纤维素、木质素质等组份。细胞来源的植物细胞微球的外壁和孢粉来源的植物细胞微球的内壁主要由细胞壁产生，其中有纳米级通道，其结构和组份可以经过所述植物细胞微球生产过程所涉及的遗传改良、修饰、诱变、发育时期选择、处理和加工等而改变其存在和性质。
孢粉来源的植物细胞微球中所含的孢粉壁，为包被在细胞壁外侧的小孢子壁或雄配子壁，呈异质体膜壳结构，常具各式纹饰和萌发孔或萌发沟，常含有孢粉素等组份。孢粉来源的植物细胞微球外壁主要由孢粉壁或花粉壁产生，其中有纳米级通道，其结构和组份可以经过所述植物细胞微球生产过程所涉及的遗传改良、修饰、诱变、发育时期选择、处理和加工等而改变其存在和性质。
植物孢粉，特别是裸子植物的孢粉和被子植物的花粉，包括小孢子、2-细胞孢粉或花粉和多细胞孢粉或花粉，按照微球产品的尺寸、形态、结构、物质构成、功能和色泽等指标要求，将特定品种在适宜的地块、气候类型和发育时期进行定向种植和收集、筛选(过滤50目-400目，或风筛)、净化(显微镜或PCR检验去杂)，以干燥、低温(-196℃-10℃)储存，待用。
植物细胞系由离体种质保存方法保存于培养基内，0℃-10℃；或含DMSO保存液内0℃～-196℃，物种也可以以种子的形式在种质资源库保存。
实施例5：淀粉质植物细胞微球作为高吸水性微球的应用
以淀粉质植物细胞微球进行淀粉接枝丙烯酸、丙烯酸酯、丙烯腈、丙烯酰胺等，制备高吸水性微球，用于制作床垫、衣物及超薄卫生巾、尿布、失禁垫、绷带等。
具体步骤是：
选择淀粉质植物细胞，例如马铃薯薯块细胞，在5～10倍(w/v)水中85～95℃下糊化0.5～2h，冷却至室温后加入10～50％(w/w)丙烯腈接枝共聚反应单体、2％～25％(w/w)硝酸铈铵、25～60℃反应2～4h，在80～90℃下用10～20倍(w/v)的质量分数为6％的NaOH溶液和质量分数为45％甲醇溶液皂化4～8h，冷却至室温，以6mol/L盐酸中和至pH 6～8，过滤或离心，中性水洗涤，干燥后使用，使用时，将该微球材料固定于布垫或卫生纸的夹层中，吸水率30000～100000％(w/w)。
实施例6：纤维素质植物细胞微球作为高吸水性微球的应用
以纤维素质植物细胞微球进行纤维素丙烯腈接枝，制备高吸水微球，用于制作床垫、衣物及超薄卫生巾、尿布、失禁垫、绷带等。
具体步骤是：
选择纤维素质植物细胞，例如棉纤维细胞，在5～10倍(w/v)质量分数为1％NaOH溶液中20～60℃下处理0.5～3h，加入0.5～2倍(w/w)丙烯腈接枝共聚反应单体和CS2(混合后浓度为1～4x0.03mol/L)，20～60℃条件下反应2～6h，冷却清洗后，在80～90℃下用10～20倍(w/v)的质量分数为6％的NaOH溶液和质量分数为45％的甲醇溶液皂化4～8h，甲醇水溶液清洗、干燥后使用，使用时，将该微球材料固定于布垫或卫生纸的夹层中，吸水率12000～45000％(w/w)。
实施例7：植物细胞微球作为保水剂、缓释剂在农业、化妆品、药物方面的应用
植物细胞微球可以用作营养元素、生长调节剂或药物的缓释或控释载体用于农业施肥、施药和无土栽培上。也可以用于治沙和盐碱地治理。
植物细胞微球作为保水剂、缓释剂可以作为营养元素及活性成分的缓释或控释载体用于化妆品制造。具有特种色彩、组份和构造的植物细胞微球可以制作具有防紫外线照射、防腐蚀、驱虫等功能的护肤品。
植物细胞微球可以用作营养元素、生长调节因子、激素、药物等的缓释或控释载体用于药物的制造，达到长效及定向释放等效果。植物细胞微球可以依其高吸附能力和特定分解能力作为体内毒素吸附、毒素分解、异质物清除等进行血液透析、体内排毒等医用智能材料。
用于农业和环境的微球的具体制备方法同实施例1、2。所不同的是，微球在无菌环境下干燥，然后在4～30℃下浸入含有相应营养元素、生长调节剂或药物的无菌溶液中，抽真空(-1Pa)并离心(1000rpm)后，干燥备用(如有敏感药物或活性物质需要冰冻干燥和冷藏)。
用于化妆品、医药的微球制备方法，除了基因改良方法外，在微球加工方面的具体步骤是：
①含有内源药物或活性物质的植物细胞
植物细胞或孢粉在无菌条件下收获，然后在无菌条件下不经化学处理，直接冰冻干燥和冷藏。需要载入外源活性物质或药物的，则在4～30℃下浸入含有相应营养元素、活性物质、生长调节剂或药物的无菌溶液中，抽真空(-1Pa)并离心(1000rpm)后，冰冻干燥，-20～-80℃冷藏。所有过程一直保持无菌。
②含有与外源待装载药物或活性物质有不良反应的植物细胞
植物细胞或孢粉在无菌条件下收获，然后在无菌条件下经100℃水抽提或120℃高压灭活。干燥后待用。需要载入外源活性物质或药物的，则在4～30℃下浸入含有相应营养元素、活性物质、生长调节剂或药物的无菌溶液中，抽真空(-1Pa)并离心(1000rpm)后，冰冻干燥，-20～-80℃冷藏。所有过程一直保持无菌。
测试各内含物含量，使用时按相应医药服用剂量和医嘱剂量使用。
实施例8：植物细胞微球在安全保卫方面的应用
植物细胞微球可以依其特种DNA序列，布控在特定环境和物体上，接触该环境或物体的人或物，可以通过PCR(聚合酶链式反应)检测出该DNA序列。由于该DNA序列在微球内得以保护，因此其特定DNA序列的保存时间可以很长，而且可以通过其内球的组份以控制保存时间和引入其他DNA序列和探测参数。
Claims (4)
1.一种植物细胞微球，其特征在于：是由植物原生质体、植物细胞、植物孢粉或花粉为基础加工制造的微球，原生质体来源的植物细胞微球含有基质、基质通道、中腔、内球和外挂件；细胞来源的植物细胞微球含有外壁、基质、基质通道、中腔、内球和外挂件；孢粉来源的植物细胞微球含有外壁、内壁、基质、基质通道、中腔、内球和外挂件；内球，是指细胞原生质体结构内的修饰实体；外挂件为原生质体、细胞壁或孢粉壁的表面或其间所镶嵌的结构；植物细胞微球的加工包括前处理、培养期处理和后期加工处理。
2.根据权利要求1所述的植物细胞微球，其特征在于：细胞来源的植物细胞微球的外壁以及孢粉来源的植物细胞微球的内壁是由植物细胞壁组成，为包被在细胞膜外侧的可分层的异质体膜壳结构，含有胼胝质、果胶质、纤维素质、半纤维素或木质素。
3.根据权利要求1所述的植物细胞微球，其特征在于：孢粉来源的植物细胞微球的外壁是指孢粉壁，为包被在细胞壁外侧的小孢子壁或雄配子壁，呈异质体膜壳结构，含有孢粉素。
4.根据权利要求1所述的植物细胞微球，其特征在于：植物细胞微球作为保水剂、缓释剂在农业、化妆品、药物方面的应用。
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