KR100344085B1 - 건조혈액시료를이용한다운증후군검색방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 임산부에게서 채혈한 건조된 혈액 시료를 분석하므로써 산전 검사중에 태아 다운 증후군(Trisomy 21), 삼염색체성 13, 삼염색체성 18 및 기타 염색체 이상을 검출하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로서, 본 발명은 임산부에게서 채혈한 건조된 혈액 시료중에 존재하는 유리 베타 인간 융모성성선자극호르몬(HCG) 및 유리 베타(KCG)의 틈이 있는 형태 또는 단편화된 형태 또는 변형 형태(모두 본원을 통해 유리 베타(KCG)로서 표기됨)의 수치를 측정하므로써 상기 염색계 이상을 검색하는데 있어서의 검출 효율을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

Description

건조 혈액 시료를 이용한 다운 증후군 검색 방법
본 출원은 출원번호 07/297,481호(1989. 1. 17 출원, 현재 포기됨)의 일부-계속-출원(CIP)이며, 출원번호 07/311,808호(1989. 2. 17 출원, 현재 포기됨)의 일부-계속-출원이며, 출원번호 07/349,373호(1989 5. 8 출원, 현재 포기됨)의 일부-계속-출원이며, 출원번호 07/360,603호(1989. 6. 1 출원 현재 포기됨)의 일부-계속-출원이며, 출원번호 07/420,775호(1989. 10. 12 출원)의 일부-계속-출원이며, 출원번호 07/868,160호(1992. 4, 14 출원)의 일부-계속-출원이다.
발명의 분야
본 발명은 임신한 여성으로부터 채취한 건조 혈액 시료를 분석함으로써 출산전 검색중에 태아 다운 증후군(삼염색체성 21), 삼염색체성 13, 삼염색체성 18, 터너 증후군 및 기타 염색체 이상을 검출하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 임신한 여성의 건조 혈액 시료 중에서 유리 베타(사람 융모성 성선 자극호르몬, "HCG"), 및 틈이 형성되거나(nicked) 또는 단편화된 또는 변형된 형태의 유리 베타(HCG)(이들 모두를 본 출원에서 유리 베타(HCG)로 표시)의 양을 측정함으로써, 출산전에 다운 증후군을 검색하는 검출 효율을 증대시키는 방법에 관한 것이다.
발명의 배경
삼염색체성 21로도 불리는 다운 증후군은, 심한 정신 지체의 원인중 가장 일반적인 선천성 원인이다. 일반적으로 양막천자 또는 융모막융모 표본, 및 핵형법을 비롯한 진단 방법들에 의해 태아의 다운 증후군을 측정할 수 있다. 그러나, 이러한 진단 방법들은 관혈적(invasive)이고, 산모와 태아에게 위험을 준다. 이러한 이유 및 기타 다른 이유로 인해, 양막천자 또는 융모막융모 표본 및 핵형법은 모든 임신중에 통상적으로 수행되지는 않는다. 대신에, 임신에 대한 위험으로 인해 관혈적 진단 방법을 이용할 수 밖에 없는 경우인지를 측정하기 위해 1종 이상의 검색 방법이 사용될 수 있다.
다운 증후군의 발생율은 산모의 연령이 증가함에 따라 현저하게 증가한다. 사실상, 다운 증후군의 산전 검출은 다운 증후군의 위험률이 태아의 다운 증후군을 검출하기 위해 사용되는 진단 방법의 위험률에 근접하거나 초과하는 연령인 35세 이상의 임산부에게 집중되어 왔다. 그러므로 산전 검색의 표준 방법은 임산부의 연령에 근거하여 진단학적 양막천자를 수행할 수 있는 여성을 선별하는 것을 포함해 왔다. 그러나, 5%의 가장 위험한 임산부, 즉, 35세 이상의 임산부에 대해 양막천자 및 핵형법을 수행함으로써 모든 다운 증후군 임신의 약 20% 미만이 검출될 수 있다는 점에서, 연령은 부적절한 검색 기준이다. 또한, 실제의 임상 실습에서 35세 이상의 임산부의 절반 정도만이 양막천자 및 핵형법을 받으므로, 산전에 검출되는 다운 증후군 임신은 10% 미만이다.
1984년에 임산부의 혈중 알파-페토프로테인(AFP)의 낮은 수치가 태아의 다운 증후군과 상관 관계가 있음이 밝혀졌다. 기타 염색체의 삼염색체성, 구체적으로는삼염색체성 13 및 삼염색체성 18도 임산부의 혈중 AFP의 낮은 수치와 관련이 있었다. 이들 또 다른 염색체의 삼염색체성의 발생율(각각 1/5000, 1/6600)은 삼염색체성 21과 관련된 일반적이고 선천성인 위험(다운 증후군, 1/800)보다 훨씬 낮았다. 그러나, 상기 다른 염색체의 삼염색체성이 낮은 MSAFP 수치, 및 증가되거나 또는 감소된 유리 베타(HCG) 수치와 상관 관계가 있으므로, 임산부의 혈중 AFP 및 유리 베타(HCG) 및 본원에 기재된 가능한 부가적인 표지를 사용한 검색 프로토콜로 이러한 비정상을 검출할 수 있다. 본원에 기재된 삼염색체성 21에 대한 프로토콜을 사용하여, 또한 삼염색체성 13, 삼염색체성 18, 터너 증후군 및 다른 염색체 이상의 검출을 수행할 수 있다는 것이 당업자에게 자명하다.
임산부의 혈중 AFP의 낮은 수치와 태아의 다운 증후군과의 상관 관계는, 약 80%의 다운 증후군 환자가 발생하는, 젊고 외관상 발병하지 않은 가계내 다운증후군 환자의 검출에서, 비-관혈적인 혈중 검색 시험법을 사용할 기회를 제공했다. 임산부의 낮은 혈중 AFP(검색 표지로서)에 근거한 검색 시험법을 사용하여 모든 태아 다운 증후군 환자의 약 20%가 산전에 검출될 수 있다고 추정된다. 또 다른 검색 방법은 임산부 혈중의 비공액 에스트리올(UE)의 수치를 측정하는 것을 포함한다.
보가트에 의한 미국 특허 제4,874,693호에 임신 18 내지 25 주 동안에 임산부 혈중 HCG의 알파 서브유니트(subunit)의 증가된 수치 및 임산부 혈중 증가된 HCG의 수치와, 태아의 다운 증후군간의 상관 관계를 개시하고 있다. 보가트의 특허에 의하면, 검색 프로토콜에서 임산부 혈중 HCG의 알파 서브유니트의 증가된 수치 및 임산부 혈중 HCG의 증가된 수치를 사용하면 AFP 또는 UE 를 단독으로 사용하는경우보다 염색체 비정상 태아를 더 많이 검출할 수 있다. "이수체 태아 임신중의 사람 융모성 성선호르몬 수치"라는 표제하의 논문(보가트외 다수, 출산전 진단방법, 제9권, 379-384(1989))에서 보가트는, HCG의 알파 서브유니트 및 HCG를 사용한 검색 방법은 임신 9 내지 11 주(임신의 첫 삼개월간)에 태아의 이수체성(다운 증후군을 포함) 위험이 있는 임산부를 선별하는 데 유용하지 못하다는 것을 개시하고 있다.
본 출원인의 공계류중인 미합중국 특허 출원 07/868,160호 (1992. 4. 14 출원), 07/709,019호(1991. 5. 31 출원) 및 07/420,775호(1989. 10. 12 출원)에, 유리 베타(HCG)(및 유리 베타(HCG)의 틈이 있거나 또는 분해된 또는 변형된 형태)를 사용한 다운 증후군 검색 방법이 기존의 검색 방법보다 염색체 비정상 태아를 더 많이 검출하는 것으로 기재되어 있다. 상기 출원들은 또한 검색 프로토콜내의 시료를 분석하기 위해 실험실에서 유용하게 사용될 수 있는 장치를 기술한다. 각각의 출원 내용은 본원에서 참고로 인용하였다.
본 출원인의 상기 출원들에 기재된 바대로, 특히 효과적인 다운 증후군 검색방법은 임산부의 유리 베타(HCG)의 혈중 수치를 측정한 후 (1) 정상 태아를 가진 임산부 및 (2) 다운 증후군 태아를 가진 임산부의 유리 베타(HCG)의 수치를 포함한 참조 자료와, 상기 유리 베타(HCG)의 측정된 수치를 비교하는 것이다. 또한 임산부의 혈중 AFP 수치 및 임산부의 임신 기간을 참고 자료와 비교하는 검색 방법을 사용하여 다운 증후군 검색을 더 강화시킬 수 있는 방법도 기재되어 있다. 다변수 판별 분석 기법을 사용하여 상기 비교를 용이하게 수행할 수 있다. 판별 분석법은,확률에 기초하여 모집단을 2개 이상의 군으로 분리하는 다변수 분석법에 대한, 일반적으로 공지된 접근법이다. 판별식 분석법에 대한 일반적인 논의는 마케팅연구(처칠. G. A; 드라이덴, 1976; 제15장, p530-543)에 나타나 있다. 본 출원인의 종래 출원에서 설명한 바와 같이, 임산부의 유리 베타(HCG) 수치 및 AFP 수치, 및 임신 염령을 참고 자료와 비교하는 다변수 판별 분석법을 사용하면, 다운 증후군을 출산전에 검출하는 다른 공지된 검색 방법보다 더 많은 비율의 태아 다운증후군 환자를 검출하고, 허위양성 비율을 감소시킨다.
상기와 같이, 출산전 검색 방법은 일반적으로 임산부의 혈중 분석을 들 수 있다. 일반적으로, 내과 병원에서 또는 이와 유사한 임상 장소내에서 임산부로부터 혈액 시료를 채취한 후, 분석하기 위해 임상 실험실로 이송한다. 혈액 시료는 분석을 위해 저장되거나, 또는 후에 이송될 수 있다.
대부분의 경우에, 임상 장소는 혈액이 분석되는 임상 실험실과 물리적으로 떨어진 위치에 있다. 예를 들면, 임산부로부터 혈액 시료가 채취되는 임상 장소는 도시 또는 인구 밀도 중심지에 위치할 수 있고, 실험실은 교외 또는 전원에, 어떤 경우에는 다른 주에 위치할 수 있다.
일반적으로 사용되는 검색 방법에서, 임산부로부터 채취된 혈액 시료는 바이알 또는 시험관내에 액상 형태로, 후의 분석을 위해 이송 및/또는 저장된다. 부가적으로, 분석적에 시료의 오염을 방지하고 시료의 증발을 방지하기 위해 시험관을 밀봉해야 한다. 액상 형태로 혈액 시료를 이송하고 저장하는 것은 단점이 많다. 충격 흡수성 용기내에 시험관 또는 바이알을 포장하는 것을 비롯해, 시험관 또는 바이알이 깨지는 것을 피하기 위한 특별한 취급 기술을 일반적으로 사용해야 한다. 누수 방지 백에 시험관을 넣는 것이 관례이다. 일반적으로, 유출을 방지하기 위해, 시험관이 똑바로 유지되도록 용기를 고안해야 한다. 그 결과는, 큰 저장 또는 선적면적을 요구하는 거대한 포장 용기일 수 있다.
혈액 시료가 채취, 저장 및/또는 액상 혈을 취급하는데 사용되는 용기내로 이송되었을 때 생길 수 있는 파열, 바늘 막대, 깨진 시험관 때문에 혈액 유래 병원균이 액상 혈액 시료에 의해 옮겨질 수 있다는 것도 공지되어 있다. 부가적으로, 혈액의 어떤 구성 성분은 저온으로 유지되지 않는다면 시험관내에서 품질이 저하된다는 것 또한 일반적으로 공지된 사실이다.
발명의 개요
본 발명의 방법에 의해 상기 단점이 극복되고 다른 장점들이 성취되었다. 본 발명의 방법에 따라, 임산부로부터 검색용 혈액을 채취한 후, 여과지로 옮겨 혈액을 건조시켰다. 그 결과 여과지상에 건조된 혈액의 반점 또는 반점들이 생긴다.
혈액 반점을 함유하는 여과지를 분석하여, 검색 프로토콜에 사용되는 피분석물 또는 피분석물들의 임산부 수치를 결정한다. 혈액 반점을 함유하는 여과지는 분석전에 저장 및/또는 이송되어질 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 혈액 반점을 분석하여 임산부의 유리 베타(HCG) 및/또는 알파 페토프로테인 (AFP) 수치를 측정한다.
비록 본원에서 본 발명의 방법은 혈액을 기준으로 하여 서술하였지만, 이 방법은 뇨를 포함한 다른 체액에도 용이하게 이용될 수 있다. 예를 들어, 환자로부터뇨 또는 다른 체액 방울을 표본 카드상에 떨어뜨리고 건조시킨 뒤, 건조된 혈액 반점의 분석과 관련하여 본원에 기재된 방법과 유사한 방법으로, 당업자에게 공지되어 있는 통상의 면역 기법에 의해 건조된 반점을 분석할 수 있다.
본 발명의 바람직한 방법에서 건조된 혈액 반점을 분석과 관련하는데, 건조된 혈액 반점을 용출시키고 통상적인 면역학적 방법에 의해 유리 베타(HCG) 수치를 측정함으로써, 임산부의 유리 베타(HCG) 수치를 측정한다. 유리 베타(HCG)의 수치를 참조 자료와 비교하여, 환자가 다운 증후군에 걸린 태아를 임신하고 있을 위험률을 측정한다. 검출 효율을 증대시키기 위해, 유리 베타(HCG)의 수치 및 임신 기간을 참조 자료와 비교할 수 있다. 검출 효율을 더 증대시키기 위해, 건조된 혈액 반점을 분석하여 유리 베타(HCG) 및 AFP ("피분석물" 또는 "표지인자"로 언급됨)의 임산부 혈중 수치를 측정한다. 그후, 각각의 표지인자(marker) 수치를 참조 자료와 비교하여, 환자가 다운 증후군 또는 다른 염색체 이상을 가진 태아를 임신하고 있을 위험률을 측정한다.
다변수 판별 분석 기법은 표지인자 수치를 참조 자료와 비교하는데 유용하게 사용되어진다. 더 구체적으로, 다변수 판별 분석법을 사용해 개발된 참조 자료에 대해 환자의 각각 표지인자의 정량적 수치의 로그값을 확률 밀도 함수에 대입시켜 결정되는 상대 빈도(비발병, 및 발병 임신에 대한), 환자의 과거 병력, 및 베이에스(Bayes) 규칙을 이용하여 환자 특이적 위험률을 계산할 수 있다. 환자가 다운 증후군에 걸린 태아를 임신하고 있을 위험률이 주어진 위험 컷-오프 수치보다 높은 경우에, 다운 증후군 및 다른 염색체 이상이 존재하는지 확인하기 위해 진단 시험을 더 받도록 환자에게 권고해야 한다.
이와 유사하게, 본 발명의 방법을 삼염색체성 13, 삼염색체성 18, 터너 증후군 또는 다른 염색체 이상에 대한 검색 프로토콜에 사용하는 경우, 환자가 염색체 이상을 가지는 태아를 임신하고 있을 위험률은 다변수 판별 분석 기법을 사용해 측정할 수 있는데, 상기 방법에서는 유리 베타(HCG) 및 AFP의 수치를 참조 자료와 비교한다.
유리 베타(HCG) 수치 및 AFP 수치와 함께, 임신 기간을 표지인자로서 사용하면 검출 효율을 더 증대시킬 것이다. 다수의 시료를 사용하면 유리 베타(HCG) 및 AFP의 임산부 혈중 수치가 로그-가우스 분포 곡선에 의해 분포되는 경향이 있으므로, 다변수 판별 분석법을 사용하여 전개된 참조 자료에 대해 환자의 각각 표지인자의 정량적 수치 및 임신 연령의 로그값을 확률 밀도 함수에 대입시키므로써 최대의 검출 효율을 얻을 수 있다.
유리 베타 HCG 를 이용한 검색 프로토콜, 및 건조된 혈액 반점 또는 뇨 반점과 함께 사용하기에 유용한 다른 검색 프로토콜의 장점 및 세부사항은 본 출원인의 공계류중인 출원 07/868,160호(1992. 4. 14 출원) 및 본 출원으로서 같은 날에 출원된 "비-관혈적 임산부 혈중 검색에 의한 다운 증후군을 검출하는 방법 및 장치"라는 표제의, 본 출원인의 공계류중인 출원에 설명되어 있고, 본원에 참고 인용 하였다.
여과지 상에 혈액을 "반점찍는" 기법은 일반적으로 공지되어 있다. 예를 들어, 많은 병원에서 신생아 검색 프로그램에 건조된 혈액 표본을 사용한다. 출생 후에 신생아의 발뒤꿈치를 찔러 혈액 방울을 여과지상에 얻는다. 혈액 방울이 건조된 후에, 여과지를 통상의 육상 수송 우편에 의해 분석을 위한 임상 실험실로 송달할 수 있다. 그러나, 본 출원인이 알기로는 과거에는, 건조된 혈액 시료가 유리 베타(HCG)를 이용한 출산전 다운 증후군 검색 프로그램에 사용된 적은 없다. 본 발명 방법의 구체적인 장점은 건조된 혈액 반점이 저장되는 온도에 관계없이 유리 베타(HCG)의 수치가 이량체 HCG 분해의 영향을 받지 않는다는 것이다. 이로 인해 검출 효율이 더 개선될 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 혈액 시료의 이송 및 저장에 대해 많은 장점을 제공한다. 여과지상의 건조된 혈액 반점 시료는 시험관내의 액상 혈액 시료보다 훨씬 적은 공간을 차지한다. 그러므로 시료를 저장하기 위해 필요한 공간도 더 적고, 통상 우편에 의해 또는 작은 포장내의 송달 서비스에 의해 시료를 선적할 수 있다. 시험관 또는 바이알내의 액상 혈액 시료와 비교하여 여과지상의 건조된 혈액 반점을 선적하는 다른 장점들은 당업자에게 자명하다.
건조된 혈액 반점을 사용하는 본 발명의 또 다른 장점은 액상 혈액 시료를 분석하는 환자와 달리, 임산부로부터 보다 적은 양의 혈액을 채혈하면 된다는 것이다. 보다 적은 양의 혈액이 필요하므로, 채혈 기법이 임산부에게 털 관혈적이 되도록 하고 고통을 경감시킬 수 있다.
유리 베타(HCG)를 사용한 바람직한 방법의 장점은, 기존의 공지된 방법보다 더 높은 비율로 태아의 다운 증후군 환자를 정확히 예측하고, 허위양성 비율을 감소시킨다는 것이다.
본 발명의 다른 장점들은 하기의 상세한 설명 및 실시예로부터 명백하게 인지 할 수 있을 것이다.
제1도는 실시예 2에 기술된 바와 같이, 삼염색체성 21에 대한 각각의 표지 인자들의 유의 수준을 나타내는 표이다.
제2도는 실시예 2에 기술된 바와 같이, 각각의 표지인자들의 다운 증후군 검색 효율을 나타내는 표이다.
제3도는 실시예 2에 기술된 바와 같이, 복합 표지인자들의 다운 증후군 검색 효율을 나타내는 표이다.
제4도는 실시예 2에 기술된 바와 같이, 비발병 임신에서 다운 증후군 환자의 비율이 유리 베타(HCG) 분포의 주어진 백분위수 이상임을 나타내는 표이다.
제5도는 실시예 2에 기술된 바와 같이, 각각의 표지인자들의 다운 증후군 효율을 나타내는 표이다.
제6도는 실시예 2에 기술된 바와 같이, 여러 임신 기간 범위에서 복합 표지 인자로서 로그 AFP 및 로그 유리 베타(HCG)의 다운 증후군 검색 효율을 나타내는 표이다.
제7도는 실시예 2에 기술된 바와 같이, 미국 전역에 걸쳐 예측되는 AFP, 유리 베타(HCG) 및 임산부 연령의 다운 증후군 검색 효율을 나타내는 표이다.
제8도는 실시예 2에 기술된 바와 같이, 비발병 임신의 각종 백분위수와 관련하여 삼염색체성 21 환자의 유리 베타(HCG)의 수치를 나타낸다.
제9도는 실시예 2에 기술된 바와 같이, 유리 베타(HCG) 수치의 분포를 나타낸다.
제10도는 실시예 3에 기술된 바와 같이, 각종 표지인자들의 조합에 대한 다운 증후군 검색 효율을 나타내는 표이다.
제11도는 실시예 4에 기술된 바와 같이, 환자 시료중의 유리 베타(HCG) 수치의 분포를 나타낸다.
제12도는 실시예 5에 기술된 바와 같이, 환자 시료중의 유리 베타(HCG) 수치의 분포를 나타낸다.
제13도는 실시예 6에 기술된 바와 같이, 환자 시료중의 유리 베타(HCG) 수치의 분포를 나타낸다.
제14도는 시료 표본 카드의 정면을 도시한 도면이다.
제15도는 시료 표본 카드의 후면을 도시한 도면이다.
제16도는 혈액 시료를 채혈하기 위한 장소를 도시한 도면이다.
제17도는 실시예 7에 기술된 바와 같이, 각종 저장 조건하에 건조된 혈액 시료중의 유리 베타(HCG)의 측정된 수치 변화를 도시하는 도표이다.
제18도는 실시예 7에 기술된 바와 같이 장기간 동안의 각종 저장 조건하에 액상 혈액 시료중의 유리 베타(HCG)의 측정된 수치 변화를 도시하는 도표이다.
본 발명의 방법에 따라, 임산부의 혈액 시료를 임산부로부터 채혈하여 여과지 상에서 건조시켰다. 표본 수집 카드로도 언급되는 여과지는 와트만사 (오레곤주힐스부르그 소재) 및 슐레이처 & 슈엘(뉴 햄프셔, 킨 소재)사를 포함하여 각종 회사에서 시판한다. 시료를 채혈하기 위해서 일반적으로 3×4 인치, 또는 5×7 인치 카드를 사용하는데, 본 발명의 방법에 영향을 미치지 않는 한도내라면 여과지는 어떤 크기이어도 괜찮다. 여과지의 크기는 건조된 혈액 시료를 이동, 저장 및/또는 색인하는 데 편리한 것이 바람직하다. 여과지는 기술자 또는 간호사가 임산부 성명 또는 다른 인식표, 및 시료가 채혈된 일자와 같은 다른 정보를 종이 상에 기록할 수 있도록 충분히 큰 것이 유리할 수 있다. 본 발명의 바람직한 앵태에서 여과지(표본 수집 카드)는, 채혈하는 기술자 또는 간호사가 환자의 식별 번호, 생일, 채혈 일자 및 의사 성명을 기입할 수 있는 공간이 존재하고, 혈 반점이 찍힐 장소를 표시하는 원(도포 부위)이 예비-프린트된 3×4 인치의 슐레이처 & 슈엘 #903TM이다.
상기 표본 카드 형태는 제14도 및 제15도에 제시되어 있다. 제14도에서 나타난 바와 같이, 표본 카드(501)의 정면(500)에는 5개 원(502)의 윤곽이 있다. 이 원들은 채혈하는 기술자 또는 간호사에게 기준점이 된다. 하기에서 설명한 바와 같이, 기술자 또는 간호사가 건조된 혈액 표본을 원(502)내에 위치시키는 것이 바람직하다. 표본 카드(501)의 정면(500)에는 또한 기술자 또는 간호사가 채혈되는 환자에 대한 정보를 기입하는 장소가 미리 인쇄되어 있을 수 있다. 제14도에 나타난 바와 같이, 이 정보는 환자의 성명(504) 및 식별 번호(506)를 포함할 수 있다.
제15도에 표본 카드(501)의 후면(510)이 나타나 있다. 제15도에 나타난 바와 같이, 표본 카드의 후면에도 기술자 또는 간호사가 카드상에 혈액 시료를 위치 시키는 것을 돕기 위해 원(502)의 윤곽이 존재할 수 있다.
임산부로부터 채혈한 혈액의 양은 여과지상에 직경 약 10 mm 정도의 하나 이상의 반점을 찍을 정도로 충분해야 한다. 그러나 임산부로부터 하나 이상의 건조된 혈액 반점을 얻는 것이 일반적으로 유리하다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 임산부로부터 채혈되는 혈액량은 여과지 상에 직경 약 10 mm인 6개의 반점을 찍는데 충분한 양이다. 한 장의 여과지 상에 생성되는 혈액 반점의 수는 여과지의 치수, 및 혈액을 분석하는 의사 및 임상 실험실의 요구에 좌우된다는 것은 당업자에게 자명하다.
여과지 상에 혈액을 "반점 찍는" 각종 기법이 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 혈액 반점을 생산하기 위해 사용되는 구체적인 기법은 시료를 채혈하는 사람이 선택한다. 일반적으로 임산부에게 편한 장소, 구체적으로는 손가락 끝, 발가락 끝 또는 귓불을 살균 소독한 후 무균 란세트로 찌른다. 란세트는 여러 회사에서 시판한다. 특별히 유용한 란세트는 데크니다인 코오포레이션(뉴 저지 소재)에서 제조 및 판매하는 텐더레트(TenderlettTM) 란세트이다.
찔린 부위에서 생기는 혈액 방울을 여과지 상에 떨어뜨려 혈액 반점을 형성 할 수 있다. 또한 여과지와 찔린 부위를 접촉시켜 혈액 반점을 형성할 수도 있다. 혈액은 이동 및/또는 저장 전에 여과지 상에서 건조시켜야 한다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 제14도 및 제15도에 도시된 바와 같은, 직경 약 10 mm의 6개의 원이 미리 인쇄된 슐레이처 & 슈엘 #903TM3×4 인치 카드상에 혈액 반점을 하기 방법으로 수집한다. 먼저, 임산부에 관한 정보 및 기타 세부사항을 적는 카드의 미리 인쇄된 구획(제14도의 504 및 506)을 기입한다. 임산부의 혈액을 채혈하기 위해 찌르는 장소로서 손가락 끝을 선택하는 것이 바람직하다. 시료를 채혈하는 기술자 또는 간호사가 문지름으로써 손가락 끝을 따뜻하게 한다. 그후에 찌르는 부위 주변의 피부를 알콜 면봉으로 세정하고, 피부를 공기 건조시킨다. 텐더레트TM란세트 또는 유사한 기구를 포장에서 꺼내어 절개 부위에 댄다. 란세트를 이용해 충분한 혈액양을 얻을 정도의 깊이로 손가락 끝을 찌른다(벤다). 바람직한 절개 지점이 제16도에 나타나 있다.
혈액의 첫 방울은 무균 거즈로 닦는다. 절개 부위를 위로 하여 손가락을 탁자에 평행하게 고정시킨 후 여과지를 절개부위에 댄다. 과량의 출혈된 혈액이 손가락에 흘러내리기 전에 단일 단계로 종이와 절개 부위를 접촉시키고 혈액이 종이에 스며들도록 한다. 절개 부위가, 6개의 미리 인쇄된 원(제14도 및 제15도의 502) 중 하나의 중앙에 대략 상응하는 종이 부분에 접촉하도록 종이를 위치시킨다. 절개부위와 접촉된 종이를 뗀후, 재위치시키고, 절개 부위에 3 내지 5회 재접촉시켜 카드상에 미리 인쇄된 도포 면적상에 위치한 총 4 내지 6개의 혈액 반점을 생산한다. 총 4 내지 6개의 혈액 반점을 생산하기 위해 필요에 따라 혈류를 증가시키기 위해 절개 부위를 부드럽게 맛사지할 수 있다. 4 내지 6개의 혈액 반점을 만든 후에 무균 거즈를 대고 압박하여 절개부를 밀봉한다. 필요하다면 절개 부위에 붕대를 감을 수 있다.
혈액 반점을 평평한 수평 위치에 놓고 일반적으로 최소 2 시간 동안 상온(65˚F~80˚F)에서 공기 건조한다. 시료의 침출 또는 교차 오염을 방지하기 위해 혈액 반점이 건조될 때까지 여과지를 겹치게 하지 않아야 된다. 건조 후에, 여과지를 봉투에 넣고 혈액 반점을 분석하는 실험실로 이송하거나, 후에 이송하기 위해 저장한다.
상기에서 바람직한 채혈 방법을 상세히 설명했지만, 본 발명의 방법이 상기 방법에 한정되는 것은 아니다. 건조된 혈액 시료를 채취하는 다른 방법들이 의사, 기술자, 간호사 및 다른 의료 요원들에게 공지되어 있고, 본 발명의 방법에 사용되기에 적절하다.
여과지 상에 함유된 건조된 혈액 반점을 분석하여 다운 증후군 및/또는 기타 염색체 이상에 대해 임산부를 검색할 수 있다(즉, 임산부가 다운 증후군 또는 기타 염색체 이상을 가진 태아를 임신하고 있을 위험률이 관혈적 시험법의 위험률보다 큰지를 결정할 수 있음). 문제의 피분석물(들)의 수치를 측정하기 위해 일반적으로 혈액 시료를 용출하는 것을 포함하는 통상의 실험실 기술에 의해 혈액 반점을 분석 할 수 있다. 피분석물이라는 용어는 임산부 혈중의 농도 또는 수치가 측정되는 분자 또는 물질을 의미한다. 본 발명의 바람직한 방법에서, 혈액중 피분석물의 농도를 측정하기 위해 사용되는 면역학적 분석 기술의 일부로서 반점을 용출하므로써 혈액 반점을 분석한다.
더 구체적으로, 상기 바람직한 방법은 하기의 분석 과정을 사용한다.
1. 5개의 PBS(인산염 완충 식염수) 정제를 1,000 ml의 증류수 또는 탈이온수에 용해시켜 세척 용액을 제조한다. 0.5㎖의 트윈 20(미주리, 세인트 루이스에 위치한 시그마 케미컬 컴패니에서 제조 및 판매하는 세제)을 가하여 세척 용액을 완성시킨다.
2. 단일 웰 펀치/용출 판 장치에 대한 직접 이송을 이용하여, 2개의 건조된 혈액 반점으로부터 2개의 4 mm 디스크/용출 판 웰에 구멍을 뚫었다.
3. 15 ml의 분석 완충액을 지정된 시약에 첨가한 후, 135㎕의 분석 완충액을 각각의 용출 판 웰내의 구멍 뚫린 디스크에 첨가했다.
4. 용출 판을 덮고, 티터텍 판 진탕기(버지니아, 맥린의 플로우 실험실에서 제조함)와 같은 판 진탕기상에 놓았다. 용출 판을 30±2 분 동안 고속으로 설정하여 진탕시켰다.
5. 용출 판 웰내에 용출된 물질을 피펫기를 이용해 미소 시험관에 이동시킨다. 표준 8 웰×12 웰 분석 판을 기준으로 하여 차후 과정을 설명한다.
6. 부가적인 15 ml의 분석 완충액을 시약에 첨가하고, 110㎕의 완충액을 모노클로날 "캡처" 항체-피복된 분석 판의 각각의 웰에 이동시킨다.
7. 미소 시험관 각각으로부터 20㎕의 용출된 용액을, 항체-피복된 분석 판내의 지정된 웰로 이동시킨다.
8. 분석 판을 덮은 후 판 진탕기상에서 30±5 초 동안 중간 속도로 진탕한다.
9. 분석 판을 약 60±5 분 동안 200 RPM의 플랫폼 회전기상에 놓는다.
10. 분석 판의 각각의 웰을 세척 용액으로 5회 세척하여 각각의 웰내에 잔류하는 용액을 제거한다.
11. 12 ml의 분석 완충액중 20㎕의 각각의 항체를 혼합함으로써, 피복된 판 상의 모노클로날 항체에 대한 표지화된 항체를 함유하는 첫번째 작용 시약("작용 시약 1")을 제조한다.
12. 100㎕ 작용 시약 1을 모든 분석 판 웰에 이동시킨다. 판을 덮은 후 200RPM의 플랫폼 회전기 상에서 30±2 분 동안 항온 처리한다.
13. 분석판의 각각의 웰을 세척 용액으로 5회 세척하여 각각의 웰내에 잔류하는 용액을 제거한다.
14. 표지화된 항체의 각각에 대한 10㎕의 시그날 화합물과 12 ml의 분석 완충액을 혼합함으로써, 표지화된 항체에 대한 "시그날" 화합물을 함유하는 두번째 작용 시약("작용 시약 2")를 제조한다.
15. 분석 판의 각각의 웰에 100㎕의 작용 시약 2를 첨가한다. 판을 200 RPM의 플렛폼 회전기상에서 약 10±0.5 분 동안 항온 처리한다.
16. 분석 판의 각각의 웰을 세척 용액으로 5회 세척하여 각각의 웰내에 잔류하는 용액을 제거 한다.
17. 작용 시약 2와 반응하여 색이 변화하는 포스파타아제 용액, 또는 유사한 용액을 제조한다. 포스파타아제 용액의 경우에, 15 ml의 포스파타아제 기질용액을 3개의 포스파타아제 기질 정제와 혼합한다. 퍼록시다아제 용액의 경우에, 6 ml의 퍼록시다아제 기질을 6 ml의 퍼록시다아제 용액에 첨가한다.
18. 100㎕의 포스파타아제 또는 퍼록시다아제 용액을 각각의 웰에 첨가한다.이어서 판을 200 RPM의 플랫폼 회전기 상에서 15±1 분 동안 항온 처리한다.
19. 100㎕의 포스파타아제 또는 퍼록시다아제 중단 용액을 각각의 웰에 첨가하여 더 이상의 색 변화를 중단시킨다.
20. 각각의 웰의 흡광도를 분광 광도계를 사용하여 측정하여, 각각의 혈액 시료내의 피분석물의 양을 측정한다. 일반적으로 흡광도는 450nm 또는 450/690 nm에서 측정한다.
21. 분석 판의 각각의 웰을 세척 용액으로 5회 세척하여 각각의 월내에 잔류하는 용액을 제거한다.
22. 이원성(二元性) 피분석물 분석기술이 사용된 경우에 각각의 혈액 시료내의 두번째 피분석물의 양은 제17 내지 20 단계를 반복하여 측정한다. 일반적으로, 제17 단계에서 제조된 첫번째 용액과 다른 퍼록시다아제 또는 유사한 용액이 사용된다.
상기 단계에서, 임산부의 혈액내의 선별된 피분석물 수치를 측정하기 위해 혈액 반점을 분석하는 바람직한 과정을 설명하였으나, 다른 기법도 사용할 수 있다. 혈액 반점의 분석은, 실험실 과학자 및 그 조교를 포함하여 당업자의 능력에 달려있다고 생각된다.
또한 본 발명에 사용되기에 적절한 통상적인 면역학적 기법은 바이오센서의 사용을 포함한다. 바이오센서는 일반적으로, 전기 시그날 또는 다론 관찰가능한 판독 정보를 생산할 수 있는 변환기에 연결된 생체-유래된 감지 요소(예, 항체)를 포함한다. 측정되는 물질(예, 유리 베타(HCG) 또는 그 형태)의 일정양을 감지 요소와접촉시켰을 때 반응이 일어나고, 변환기가 반응을 색, 형광, 온도, 전류 또는 다른 전기-화학적 시그날의 변화로 바꾼다. 건조된 혈액 또는 뇨 반점을 분석하는 바이오 센서도 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 한 양태에서, 혈액 반점을 분석함으로써 유리 베타(HCG)의 임산부 혈중 수치를 측정한다. 유리 베타(HCG)의 임산부 혈중 수치를 참조 자료와 비교하여 환자가 다운 증후군을 가지는 태아를 임신하고 있을 위험성이 큰지를 측정한다. 검출 효율을 증가시키기 위해, 유리 베타(HCG)의 임산부 혈중 수치 및 임신 기간을 참고 자료 세트와 비교하여 환자가 다운 증후군을 가지는 태아를 임신하고 있을 위험성이 큰지를 측정할 수 있다.
당업자에게 자명한 바와 같이, 유리 베타(HCO)의 임산부 혈중 수치를 측정하는 공지된 분석 방법 모두가 본 발명에서 가능하지만, 유리 베타(HCG)에 사용된 분석 방법은, 유리 베타 HCG에 대한 참조 자료를 작성하기 위해 사용된 방법과 동일해야 한다. 새로운 분석 방법을 유리 베타(HCG)에 사용했다면, 그 방법으로 전개된 자료를 기준으로 하여 새로운 참조 자료 세트를 작성해야 한다. 그러므로 핼액 반점을 분석하기 위해 사용되는 기법은 검색되는 시료 및 참고 자료에 대해 동일해야 한다.
일반적으로 유리 베타(HCG) 특이적인 항체를 생성함에 있어, 일부 항체는 단백질에 특이적이고, 일부 항체는 항원 부위와 관련된 탄수화물에 특이적인 것으로 이해된다. 발명의 상세한 설명에 언급되는 유리 베타(HCG) 수치의 측정법은, 단백질 또는 항원 부위에 관련된 탄수화물 또는 유리 베타(HCG)상의 다른 부위에 특이적인 항체를 사용하는 것을 포함한다.
(HCG)의 알파 서브 유니트가 하나의 유전자에 의해 암호화되는 반면에 유리 베타(HCG)는 7개 이상의 매우 유사한 유전자 또는 의사 유전자의 복합 군에 의해 암호화된다는 것을 당업자라면 알 것이다. 예를 들어, 부르스타인, 밤바코풀레스, 및 피데스의 문헌[네이쳐 제300권, 1982. 12. 2]의 제목 "사람 융모성 성선 자극 호르몬 베타-서브유니트는, 일렬로 정렬되고 반전된 쌍으로 존재하는 8개 이상의 유전자에 의해 암호화된다"를 참고할 수 있다. 7개의 유리 베타(HCC) 유전자 중 세개만이 유리 베타(HCG)의 정상 태반 생산 중에 발현된다는 것이 공지되어 있다. 예를 들어, 니시무라, 이데, 웃츄노미야, 키타지마, 유키, 및 모치주키의 문헌[엔도크리놀로지, 제123권 제1호, 1988) "융모막암에 의해 생산된 사람 융모성 성선 자극 호르몬의 베타 서브유니트의 단편화"를 참고할 수 있다. 태아 다운 증후군이 존재하는 것과 같은 질병 상태에서 상기 동일한 3개의 유전자가 발현되는지는 정해지지 않았다. 그러므로, 아미노산 서열내 작은 차이 또는 기타 작은 차이를 가지는 유리 베타(HCG)의 다양한 형태를 합성할 수 있다. 다운 증후군에서는, 유리 베타(HCG) 유전자의 하나 이상이 발현되고, 그에 의해 유리 베타(HCG)의 하나의 독특한 현형 또는 변형들(틈이 있거나 또는 단편화된 또는 변형된 형태로서 전술함)을 생산하는 것도 가능하다. 본 발명에 따라 유리 베타(HCG)를 측정하는 통상의 면역학적 기법에 의해 이 변형들을 측정할 수 있다. 다운 증후군과 관련된, 특이적인 유리 베타(HCG) 변형 또는 변형들을 측정하기 위해 고안된 분석법은 검출 효율을 훨씬 증가시킬 수 있다.
삼염색체성 21로 발병된 임신과 발병되지 않은 임신을 구분하기 위해 유리 베타(HCG)를 측정하는 분석 기법이 효과적으로 사용되어 왔다. 삼염색체성 21의 검출 효율은 83% 정도로 높다. 당업자에게 자명한 바와 같이, 특이적 피분석물을 정량하기 위해 항체를 사용하면 서로 별개지만 유사한 물질과의 교차-반응도를 산출할 수 있다. 따라서, 사용되는 항체에 대한 교차-반응도가 검출되기 때문에, 유리 베타(HCG)의 변형된 형태가 존재하는 것으로 인해, 발병된 환자와 발병되지 않은 환자를 구분할 수 있다. 변형된 유리 베타(HCG)를 새로운 생화학적 물질로서 지정할 수 있다. 실제로, 과학 문헌의 정보는 유리 베타(HCG)의 현형이 인식되어 왔다는 것을 나타낸다(예, 니시무라 외 다수의 문헌).
삼염색체성 21로 발병된 환자는 유리 베타(HCG)의 변형된 형태로 특징지워 질 수도 있는데, 상기 환자에서 당업자는 그러한 변형에 특이적인 항체를 발현시켜 상기 증후군의 검출 효율을 더 증가시킬 수 있다.
또한, 다운 증후군에 걸린 환자는 유리 베타(HCG)를 포함하는 아미노산의 불완전한 부분을 포함하는 유리 베타(HCG)의 단편 형태(또는 단편)에 의해 특징지워질 수 있다. 당업자에게 자명한 바와 같이, 분석법에 사용되는 에피토프(들)가 유리 베타(HCG)의 단편내에 존재한다면, 유리 베타(HCG)를 측정하는데 사용되는 분석법 또한 유리 베타(HCG)의 단편들을 검출할 수 있다.
유리 베타(HCG)의 변형된 또는 단편화된 형태를 "틈이 있는(nicked)" 유리 베타(HCG)로 언급할 수 있다. 틈이 있는 유리 베타(HCG) 내에서는, 유리 베타(HCG)내의 아미노산 사이의 펩타이드 결합이 결여되어 있다. 틈이 있는 유리 베타(HCG)의 공지된 형태에서는 44 및 45 잔기 사이의, 또는 47 및 48 잔기 사이의 펩타이드 결합이 결여되어 있다. 틈이 있는 유리 베타(HCG) 형태를 측정하기 위한 기술들이 개발되어 왔다. 전술한 바와 같이, 이들 기법을 틈이 있는 유리 베타(HCG)의 임산부 혈중 수치 또는 틈이 있는 유리 베타(HCG)와 유리 베타(HCG)의 혼합된 혈중 수치를 측정함으로써 태아의 다운 증후군을 검색하기 위해, 본 발명의 방법에 사용할 수 있다.
실시예 9에서 설명된 바와 같이, 유리 베타(HCG)의 측정에 사용되는 일부 면역 분석법은 "틈이 있는(nicked)" 유리 베타(HCG)를 측정한다. 본 발명의 방법은 이러한 면역 분석법의 사용을 포함한다. 실시예에서 설명된 바와 같이, 임산부 혈중의 유리 베타(HCG) 및 틈이 있는 유리 베타(HCG)의 수치를 측정하는 면역 분석법을 사용하여 다운 증후군을 검색하는 검색 프로토콜은 약 80%의 검출 효율을 가질 수 있다.
또한, 유리 베타(HCG)의 일부 단편은 임산부의 뇨중으로 배설될 수 있다는 것이 일반적으로 공지되어 있다. 이러한 단편은 통상적으로 "베타 코아 단편"으로 언급되며, 완전한 유리 베타(HCG) 분자를 구성하는 55 내지 92번째 아미노산 잔기에 연결된 6 내지 40번째 아미노산 잔기 이황화물을 포함한다. 임산부 뇨중의 유리 베타(HCG)의 베타 코아 단편을 측정하기 위해 고안된 분석법을, 건조된 뇨 반점이 분석되는 본 발명의 방법에 사용할 수 있다.
참조 자료는, 다운 증후군을 지니는 태아를 임신한(발병된 것으로 언급됨) 임산부의 유리 베타(HCG)의 혈중 수치 및/또는 정상 태아를 임신한(발병되지 않은것으로 언급됨) 임산부의 유리 베타(HCG)의 혈중 수치를 반영한다. 당업자에게 자명한 바와 같이, 태아의 다운 증후군을 검색하는 방법은 비교에 의한 결정 방법이다. 모든 결정 방법에 대해서, 질병 또는 문제의 상태를 가지는 환자 및/또는 질병 또는 문제의 상태를 가지지 않는 환자에 기초한 참조 수치가 필요하다. 본 발명에서 참조 수치는, 다운 증후군 태아를 임신한 임산부와 정상 태아를 임신한 임산부내의 측정된 표지인자 또는 표지인자들(예, 유리 베타(HCG))의 혈중 수치이다. 다수의 시료에 대해 참고 수치를 수집함으로써 참조 자료 세트를 설정했다. 당업자에게 자명한 바와 같이, 참조 수치의 수를 증가시킴으로써 참조 자료 세트를 개선할 수 있다.
환자가 다운 증후군을 가지는 태아를 임신하고 있을 위험률이 큰지를 결정하기 위해, 컷-오프를 설정해야 한다. 환자가 삼염색체성 13 또는 삼염색체성 18을 가진 태아를 임신하고 있을 위험성이 큰지를 결정하기 위해 설정된 컷-오프가 삼염색체성 21 환자를 동정하는 데도 효과적일 수 있다는 것이 당업자에게 자명하다. 상기 컷-오프는 실험실, 의사에 의해 또는 환자별로 각각의 환자에 기초해 설정될 수 있다. 관혈적 진단 시험을 받을 여성의 수, 관혈적 진단 시험을 받을 모든 여성에 대해 다운 증후군 태아를 임신하고 있을 평균 위험성, 환자 특이적인 위험성이 어떤 위험 수치 (예, 1/400)보다 큰 여성이 관혈적 진단 시험을 받아야 하는가 하는 결정, 또는 당업자에게 공지된 다른 기준들을 포함한 여러 개의 기준을 기초로 하여 컷-오프 수치를 설정할 수 있다. 백분위수, 평균 ± 표준 편차; 중간값의 배수; 환자 특이적 위험 또는 당업자에게 공지된 다른 방법을 비롯한, 다수의 방법을사용하여 컷-오프 수치를 설정할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 이원성 피분석물 분석법을 사용하여 유리 베타(HCG) 및 AFP에 대해 혈액 반점을 분석하여, 태아의 다운 증후군 환자를 다수 검출한다. 상기 피분석물의 임산부 혈중 수치를 측정하는 공지된 분석 방법 모두가 본 발명에서 가능하지만, 당업자에게 자명한 바와 같이, 각각의 표지인자에 사용한 분석 방법은, 특정한 표지인자에 대한 참조 자료를 만들기 위해 사용된 방법과 동일 해야 한다. 특정한 표지인자에 대해 새로운 분석 방법을 사용한다면, 그 방법에 의해 전개된 자료에 기초하여 새로운 참조 자료를 만들어야 한다.
혈액 반점 중의 유리 베타(HCG) 및 AFP 수치를 참조 자료와 비교하여 임산부가 다운 증후군을 가지는 태아를 임신하고 있을 위험성을 측정한다. 검출 효율을 증가시키기 위해서는, 임신 기간을 상기 비교에 포함한다.
관자의 임신 기간과 함께 환자 각각의 피분석물(유리 베타(HCG) 및 AFP)상의 정량적 수치를, 다변수 판별 분석법을 사용한 참조 자료에 대해 전개된 확률 밀도 함수에 대입시켜 결정되는, 비발병 및 발병된 임신에 대한 상대 빈도, 환자의 과거 위험성 및 베이에스 규칙을 사용하여, 환자가 다운 증후군에 걸린 태아를 임신하고 있을 특이적 위험성을 계산하는 것이 바람직하다. 시판되는 컴퓨터 프로그램 통계 팩키지 "통계 분석 시스템" (SAS 인스티튜트 인코오포레이티드에서 제조 및 판매함)상에서, 또는 다변수 통계 분석의 다른 방법 또는 당업자에게 공지된 다른 통계 소프트웨어 팩키지에 의해 다변수 판별 분석법을 행할 수 있다.
확률 밀도 함수는 환자 각각의 피분석물 수치를 참조 자료 세트와 비교하는방법을 제공한다. 비록 당업자에게는 자명하지만, 확률 밀도 함수의 한 형태를 하기에 설명했다. 다른 확률 밀도 함수도 유사하게 수행되므로, 본 발명을 충분히 수행할 수 있다.
다운 증후군의 위험률에 대한 식
"a" 기호는 발병된 환자를 지칭한다.
"u" 기호는 발병되지 않은 환자를 지칭한다.
(X-M)은 백터로서 각각의 인자는 각각의 변수에서 그 현수의 평균을 뺀 수치이다.
cov-1은 모델에서 모든 변수의 발병 및 비발병된 환자의 합동 공분산 행렬의 역수이다.
(X-M)T는 (X-M) 백터의 전치행렬이다.
EXP는 지수함수이다.
｜COV｜는 참고 자료에 대한 모델내의 모든 변수의 공분산 행렬의 행렬식이다.
당업자에게 자명한 바와 같이, 발병 및 비발명 임산부의 개별적인 공분산 행렬은 합동 공분산 행렬에 의해 대체될 수 있다. 그러므로, 다운 증후군의 위험률에대한 식은 하기와 같다:
판별 분석법을 위해, 일반적이고 선별되지 않은 모집단 중에서 다운 증후군의 선행확률에 대해 가정을 세운다. 일반적으로 선행 확률은 약 1/800 이다. 다변수 판별 분석법을 위해, 양성 시험 결과를 나타내는 위험 컷-오프 수치가 얼마인지에 관해 측정해야 한다. 예를 들면, 다운 증후군 태아를 임신하고 있을 가능성이 1/400 이상인 임산부에 대해 진단 시험을 수행하는 것이 바람직하다면, 임산부가 다운 증후군 태아를 임신하고 있을 가능성이 1/400 보다 크다는 사실을 판별 분석법의 결과가 나타내는 경우에, 임산부는 양성 시험 결과를 갖는 것으로 간주된다. 양성 시험 결과가 나타나는 경우에, 다운 증후군이 존재하는지를 화인하기 위한 진단 시험을 받도록 환자에게 권고해야 한다.
당업자에게 자명한 바와 같이, 선형 판별 분석법 과정과는 달리, 참고 매개 변수를 계산하기 위한 다른 통계학적 및 수학적 기법을 사용할 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 양태에서, 건조된 임산부 혈액 시료를 분석하여 유리 베타(HCG) 및 AFP의 임산부 혈중 수치를 결정한다. 환자의 임신 기간과 함께 환자 각각의 표지인자의 정량적 수치를, 다면수 판별식 분석법을 사용하여 참조 자료에 대해 전개된 확률 밀도 함수에 대입시켜 결정되는, 보유 및 비보유한 임신에 대한 상대빈도, 환자의 과거 위험성, 및 베이에스 규칙을 이용하여,다운 증후군에 걸린 태아를 임신하고 있을 환자 특이적 위험성을 계산한다. 검출 효율을 더 증가시키기 위해, 환자의 임신 기간과 함께 환자의 유리 베타(HCG) 및 AFP의 정량적 수치의 로그값을, 다변수 판별 분석법을 사용하여 참조 자료에 대해 전개된 확률 밀도 함수에 대입한다. 시판되는 컴퓨터 프로그램 통계 팩키지 "통계분석 시스템"(SAS 인스티튜트 인코오포레이티드에서 제조 및 판매함) 상에서, 또는 다변수 통계 분석의 다른 방법 또는 당업자에게 공지된 다른 통계 소프트웨어 팩키지에 의해 다변수 관별 분석법을 행할 수 있다.
판별 분석법을 행할 목적으로, 일반적이고 선별되지 않은 모집단 중에서 다운 증후군의 선행 확률에 관해 가정을 세운다. 일반적으로, 선행 확률은 약 1/800이다. 다변수 판별 분석법을 위해, 양성 시험 결과를 나타내는 위험 컷-오프 수치가 얼마인지에 관해 결정해야 한다. 예를 들면, 다운 증후군 태아를 임신하고 있을 가능성이 1/400 이상인 임산부에 대해 진단 시험을 수행하는 것이 바람직하다면, 임산부가 다운 증후군 태아를 임신하고 있을 가능성이 1/400 보다 크다는 사실을 판별 분석법의 결과가 나타내는 경우에, 임산부는 양성 시험 결과를 갖는 것으로 간주된다. 양성 시험 결과가 나타나는 경우에, 다운 증후군이 존재하는지를 확인하기 위한 추가의 진단 시험을 받도록 환자에게 권고해야 한다.
당업자에게 자명한 바와 같이, 상기 논의된 구체예에서 모집단내의 다른 소그룹에 적용될 수 있는 상이한 과거의 위험성을 사용하는 것, 또는 양성의 위험 컷-오프 수치를 변화시키는 것이 각각의 환자에 대한 판별 분석법의 결과를 변화시킬 수 있다.
본 발명은 전술한 구체예에 한정되는 것이 아니라 하기 실시예에 개시된 표지인자의 조합 및 가능한 구체예를 모두 포함한다.
실시예 1
400명 이상의 환자 시료를 사용하여 임산부 혈청 AFP(MSAFP), UE, 및 원형(intact) HCG와 함께 유리 베타(HCG)의 임산부 혈중 수치에 대한 태아 다운 증후군의 관계를 연구하였다. 이들 시료는 다운 증후군 태아를 임신한 것으로 알려진 임산부에게서 채혈한 25 종의 임산부 혈액 시료 및 발병된 환자에 부합되는 대조군 시료를 포함한다. 이 실시예에서는, 액상의 혈액 시료를 분석했다.
각 혈액 시료에 대해, AFP, 원형 HCG 분자, 유리 베타(HCG), 및 UE(이후부터는 표지인자로 칭함)의 정량적 양을 다음 분석 기법을 통해 측정하였다:
각 표지인자의 양은 시판되는 컴퓨터 소프트웨어 통계 패키지 통계 분석 시스템(SAS 인스티튜트 인코오포레이티드 제품)으로 단계식 판별 절차 및 선형 판별 절차에서 하나의 변수가 되어 참조 데이타 세트를 산출시켰다. 유리 베타(HCG) 대 원형 HCG 분자의 비율 및 환자의 임신 기간도 또한 변수로서 삽입하였다. 단계식 판별 절차는, 모든 변수가 선형 판별 절차내로 삽입될 수 있음을 결정했다. 그 다음 선형 판별 절차를 각 변수에 대해 별도로, 그리고 변수의 여러 조합에 대해 수행하였다. 이들 판별 분석 결과는 하기 도표에 요약되어 있다. 감도는 양성 시험 결과를 나타내는 태아 다운 증후군 환자의 비율이다. 허위 양성은 양성 시험 결과를 나타내는 정상 태아의 비이다.
복합체 = MSAFP + 유리 베타(HCG) + 원형 HCG + UE + 임산 기간 비는 각 변수와 함께 통합된다. 위험 컷 오프수치 = 1/400,
단*는 1/365임
당업자에게는 명백하듯이, 모집단중의 여러 아군에 적용될 수 있는 상이한종전 위험률을 사용하거나 양성군의 위험 컷 오프 수치를 조절하므로써 각 환자에 대한 판별 분석 결과를 조절할 수 있다.
실시예 2
550명 이상의 환자 시료를 사용하여 태아 다운 증후군과 유리 베타 HCG의 임산부 혈중 수치와의 관계를 연구하였다. 먼저 다운 증후군 태아를 임신한 것으로 알려진 임산부에게서 채혈한 29개종의 시료와 임신 기간(동일한 주), 임산부 연령(3년 이내) 및 냉동기 저장 시간(1 달 이내)에 부합되는 520 종의 다운 증후군 비발병 시료를 분석했다. 모든 시료는 당뇨가 없는 백인의 단태아-임신 여성으로부터 얻었다. 이 실시예에서, 분석된 각 시료는 액상 혈액 시료이었다.
검색 효율의 산정시 선입관을 만드는 훈련을 피하기 위해, 유효 세트의 개념을 사용하였다. 유효 세트는 참조 데이타 세트와 무관한 데이타 세트이다. 유효세트의 환자로부터의 결과는 참고 자료를 설정하는데 사용되지 않는다. 오히려, 유효세트중의 환자에게 얻은 결과를 참조 데이타 세트와 비교하여 검색 효율을 결정한다. 이 제2 유효 세트는 26개의 추가의, 확인된 삼염색체성 21 환자 (총 55명)와 무작위적으로 선택된 159명의 대조 시료군으로 구성되었다. 대조 시료도 유사하게 당뇨가 없는 백인의 단태아-임신여성으로부터 얻었다.
전체 연구에서는 하기 제시된 표지인자의 임산부 혈중 수치에 대한 7 가지의다른 분석시 4388개의 측정치로 이루어졌다.
각 표지인자의 양은 시판되는 컴퓨터 소프트웨어 통계 패키지인 통계 분석 시스템(SAS 인스티튜트 인코오포레이티드 제품)에서의 단계식 판별 절차와 선형 판별 절차에서 하나의 변수가 되어 참조 데이타 세트를 산출시켰다. 임신 기간을 또한 변수로서 통합시켰다. 이어서, 선형 판별 절차를 각 변수에 대해 별도로, 및/또는 변수의 여러 조합에 대해 수행하였다. 환자들은 1/365의 다운 증후군 위험 컷 오프 수치를 기준으로 다운 증후군 발병 또는 비발병 군으로 분류하였다. 발병군으로 분류된 비발병 환자를 허위양성으로 간주하였다. 각 환자의 다운 증후군 위험률은 베이에스 규칙, 발병 및 비발병 환자의 다변수 정규 확률 밀도 함수, 및 일반적인 1/800의 종전 위험률을 사용하여 계산하였다. 각 확률 밀도 함수에 대해서 합한 공분산 행렬을 사용하였다.
제1도 내지 제3도에 제시된 표 1 내지 표 3에서 밝혀진 결과는 초기 연구군과 관련이 있다. 제5도 내지 제7도에 제시된 표 5 내지 7 결과는 유효 세트중의 환자 분류를 기초로 한다. 제4도에 제시된 표 4 및 제8도와 제9도는 초기 연구 세트와 모든 발병 환자를 기초로 한 것이다.
분석 절차에서 얻은 결과를 분석하여 비발병 환자와 발병 환자 사이의 각 표지인자의 수치에 유효적 차이가 존재하는지 여부를 결정하였다. 표 1(제1도)에서는, 발병 환자가 U.E 를 제외한 모든 면에서 비발병 환자와 상당히 다름을 나타낸다. 또한, 각 표지인자의 허위 양성을 및 검출 효율도 표 2(제2도)에 제시된 바와 같이 결정하였다. 최고 검출 효율은 원형 분자와 유리 베타(HCG)를 측정하는 HCG 분석법으로 달성하였다. 개별 표지인자를 복합체에 통합시키므로써 검출 효율이 더욱 향상되었다. 원형 HCG 분자와 유리 베타(HCG)를 측정하는 HCG 분석법을 포함하는 복합체는 표 3 (제3도)에 제시된 바와 같은 복합체 중에서 최고 검출 효율을 나타냈다.
HCG의 베타 서브유니트 및 알파 서브유니트를 각각 평가하면, 알파 서브유니트에 있어서 발병 환자와 비발병 환자 사이에 유의적 차이가 없는 반면(p.23) 유리 베타(HCG)는 발병 환자에서 상당한 증가가 관찰되었다 (p=.001). 당업계에 통상적으로 공지된 바와 같이, p는 관찰된 최대 이상의 결과가 우연히 일어날 수 있는 확률을 나타내므로써 과학적 연구에서의 증거 강도를 나타낸다. p 값이 낮을수록, 관찰 결과가 우연한 발생이 아니라는 증거가 강해진다.
제8도는 임신 기간에 따른 유리 베타(HCG)의 10, 50 및 90 백분위수를 나타낸 것이다. 비발병된 임산부에 있어서 임신 기간에 따라 지속적인 하향 추세가 관찰된다. 표 4(제4도)에 제시된 바와 같이, 태아 다운 증후군의 환자에서 유리베타(HCG) 양의 분석은 86%가 비발병된 환자의 중간값 이상에 속함을 나타낸다.
비발병 환자와 발병 환자에 있어서의 유리 베타(HCG)의 양은 로그 가우스 분포(p = 0.78 및 0.86)에 합치된다. 제9도는 이들 분포를 나타낸다. 표 5(제5도)는 유리 베타(HCG)와 유리 알파(HCG)에 대한 검출 효율 데이타를 각각 제공한다. 유리 베타(HCG)의 높은 검출 효율은 표 5에 제시된다.
AFP와 유리 베타(HCG)의 복합체로 상당히 높은 검출 효율을 얻었다. 전술한 바와 같이, 시판되는 컴퓨터 소프트웨어 통계 패키지인 통계 분석 시스템 (SAS 인스티튜트 인코오포레이티드 제품)에서의 선형 판별 절차내로 유리 베타(HCG) 양의 log 값과 MSAF 양의 log 값을 도입시키므로써, 표 6(제6도)에 제시된 바와 같이 우수한 검출 효율을 얻었다. 각 log 값과 반대되는 유리 베타(HCG)의 양 및 AFP의 양을 사용하므로써 또한 높은 검출 효율을 얻었다.
각각 AFP 및 유리 베타(HCG)에 대해 4가지 다른 임산부 연령군(연령 = 30, 31~35, 36~40, 및 40)에 걸쳐 크루스칼-월리스 시험법을 사용하여 데이타를 추가 분석한 바에 따르면, AFP와 유리 베타(HCG)가 임산부 연령과 무관함을 알게 되었다(p = 0.8394 및 0.5214). 또한, 유리 베타(HCG)와 AFP 양의 상관관계(r)는 거의 0이다(비발병 환자와 발병 환자에 대해 각각 r=0.04, p=0.39 및 r=-0.06, p=0.81).
본원의 데이타에서 밝혀진 기초적인 관찰을 통해, 유리 베타(HCG)가 다운증후군에 대한 최고의 검출 효율을 제공한다는 사실이 확인되었다. 사실상, 유리 베타(HCG)만을 측정하는 분석법을 사용하면 검출 효율 및 허위 양성율이 각각 65.4%및 5.2%로 산출되었다. 이 비율을 3가지 분석법의 조합에 의해 다른 문헌에 보고된 것에 필적할 만하다. 따라서, 상기된 바와 같이 분석법 수를 감소시킬 수 있는 것이 본 발명의 잇점이다.
유리 베타(HCG)의 기여에 대한 본원에서의 발견은 다음 (a) 내지 (c)를 기초로 한다:
(a) 다운 증후군의 검출 효율에 대한 단일 최대 기여인자는 유리 베타(HCG)에 대한 분석법이었다;
(b) 원형 HCG 분자에 대한 분석법은 상당히 낮은 검출율을 산출한다;
(c) 원형 HCG 분자와 유리 베타(HCG)의 조합을 측정하는 분석법은 원형 HCG 분자만을 측정하는 분석법보다 검출 효율이 높다.
태아 다운 증후군의 위험은 임산부 연령이 높을수록 증가한다는 사실이 알려져 있다. 따라서 전술한 바와 같이, 본 발명을 임상 용도로 사용하기 위해 환자-특이적 위험률을 산출하려면, 임산부 연령 특이적인 종전 위험률을 다변수 판별 분석법에 통합한다. AFP와 유리 베타(HCG) 양은 모두 임산부 연령과 무관하므로, 각 개인 연령에 있어서의 종전 위험률을 제시한 양성 결과를 나타내는 비발병 및 발명 여성의 수를 알기 위해 본 발명자는 본 발명의 데이타를 분석했다. 미국에서 출산의 임산부 연령 분포를 기준으로 전술한 정보를 사용하여 미국내 전국적인 검색에서의 허위 양성 및 감도율을 계획하였다. 표 7(제7도)에 제시된 바와 같이, 연구 계획을 통해 80%의 검출율, 5%의 허위 양성을 얻을 수 있다는 것을 알 수 있다.
실시예 2에 기술된 시료를 추가로 분석하여 다른 표지인자 조합들의 검출 효율을 측정했다. 더욱 구체적으로, 동일한 위험 컷 오프값과 종전 위험률 수치를 사용하여 임신 기간을 포함시킨 경우와 포함시키지 않은 경우에 대하여 표지인자들의 상이한 조합, 표지인자에 대한 중간값의 배수(MOM) 및 표지인자의 log 값을 가지고 실시예 2의 선형 판별 절차를 실시했다. 선형 판별 절차는 참조 데이타와 유효 데이타를 둘다 사용해서 수행하였다. 그 결과를 하기 표 8과 제10도에 요약하였다.
실시예 3
본 실시예는 1단계 유리 베타(HCG) 분석법 및 2단계 유리 베타(HCG) 분석법의 준비 과정을 예시한 것이다.
1단계 유리 베타(HCG) 분석법의 준비
1. 96웰 미량역가 평판을 유리 베타 인간 융모성 성선 자극 호르몬(HCG) 분자에 특이적인 포착 항체로 피복하였다. 항체는 모노클론 또는 폴리클론 항체일 수 있다. 이 평판을 피복하는데 사용된 항체의 농도는 0.8㎍/웰이지만, 필요에 따라서는 달라질 수 있다. 평판을 4℃에서 16시간 이상 항온처리하였다.
2. 평판을 0.05% Tween 20을 함유하는 pH 7.2의 인산염 완충 식염수 용액으로 세척했다. 기타 적당한 세척 완충액을 사용할 수도 있다. 이어서 평판을 pH 7.2의 인산염 완충 식염수 용액중에 3%의 가수분해된 동물 단백질과 0.05% Tween 20을 함유하는 용액으로 차폐시켰다. 기타 당업자에게 공지된 용액, 예를들면, 1% 소 혈청 알부민 용액을 사용할 수도 있다. 차폐 용액 300㎕를 각각의 웰에 첨가하고 평판을 주위 온도에서 1시간 동안 항온 처리하였다. 유약도포와 같은 기타 차폐 절차도 유효하다.
3. 이어서, 전술한 바와 같이 평판을 세척하고, 유리 베타(HCG)에 특이적인 비오티닐화된 항체를 함유한 분석 완충액 100㎕를 각각의 웰에 첨가했다. 사용된 분석 완충액은 pH 7.2의 인산염 완충 식염수 용액중에 3%의 가수 분해된 동물 단백질과 0.05%의 Tween 20을 함유하는 용액이지만, 당해 기술분야에 공지된 적당한 용액들중 어느 것이라도 사용할 수 있다. 항체는 모노클론 또는 폴리클론 항체일 수 있으며, 취급자의 선택여부에 따라 비오틴 이외의 물질, 예컨대 호스래디쉬(horseradish) 퍼록시다아제 또는 알칼리 포스파타제와 접합시킬 수도 있다. 분석 완충액내의 항체의 농도를 조정하여 최적의 흡광도를 얻을 수 있다.
4. 이어서 20㎕의 시료를 각각의 웰에 첨가했다. 시료는 분석법의 성능을 입증하기 위한 블랭크로서 작용하는 분석 완충액; 미지 시료의 측정치를 표준화 시키는데 사용되는 유리베타(HCG) 용액; 또는 임산부로부터 두번째 3개월간 채혈한 혈청 시료일 수 있다. 평판을 30초동안 와동시킨 후에 200rpm하의 회전기에 놓고, 상온에서 30분동안 항온처리했다.
5. 이어서 평판을 전술한 바와 같이 세척했다. 호스래디쉬 퍼록시다아제에 접합된 스트렙트아비딘을 함유하는 분석 완충액 100㎕를 각각의 웰에 첨가했다. 이 단계는 비오틴 이외의 물질에 접합된 제2의 항체를 사용할 경우에는 불필요하다. 분석 완충액중의 스트렙트아비딘 퍼록시다아제의 농도는 2.0㎍/ml이다. 평판을 상온에서 5분동안 200rpm하의 회전기에 놓는다.
6. 이어서 평판을 전술한 바와 같이 세척했다 o-페닐렌디아민 기질 용액 100㎕를 각각의 웰에 첨가했다. 이 기질 용액은 당업자에게 공지된 다수의 적절한 염료들중 어느 것이라도 선택적으로 사용할 수 있으며, 제2 항체에 접합된 물질이 어떤 것인지에 좌우된다. 평판을 200rpm하의 회전기에 놓고 암실에서 8분동안 상온하에 항온 처리했다.
7. 묽은 황산(1.0N) 100㎕를 각각의 웰에 첨가하여 기질의 반응을 종료시켰다.
8. 각각의 웰의 흡광도를 492nm에서 분광분석기에 의해 측정했다.
2단계 유리 베타(HCG) 분석법의 준비
1. 96웰 미량역가 평판을 유리 베타(HCG) 분자에 특이적인 포착 항체로 피복하였다. 항체는 모노클론 또는 폴리클론 항체일 수 있다. 이 평판을 피복 하는데 사용된 항체의 농도는 0.8㎍/웰이지만, 필요에 따라서는 달라질 수 있다. 평판을 4℃에서 16시간 이상 항온처리하였다.
2. 평판을 0.05% Tween 20을 함유하는 pH 7.2의 인산염 완충 식염수 용액으로 세척했다. 기타 적당한 세척 완충액을 사용할 수도 있다. 이어서 평판을 pH 7.2의 인산염 완충 식염수 용액중에 3%의 가수분해된 동물 단백질과 0.05% Tween 20을 함유하는 용액으로 차폐시켰다. 기타 당업자에게 공지된 용액, 예를들면, 1% 소 혈청 알부민 용액을 사용할 수도 있다. 차폐 용액 30㎕를 각각의 웰에 첨가하고 평판을 상온에서 1시간동안 항온처리하였다. 유약도포와 같은 기타 차폐 절차를 이용할 수도 있다.
3. 이어서, 전술한 바와 같이 평판을 세척하고, 분석 완충액 100㎕를 각각의 웰에 첨가했다. 사용된 분석 완충액은 pH 7.2의 인산염 완충 식염수 용액중에 3%의가수분해된 동물 단백질과 0.05%의 Tween 20을 함유하는 용액이지만, 당업자에 공지된 적당한 용액들중 어느 것이라도 사용할 수 있다.
4. 이어서 20㎕의 시료를 각각의 웰에 첨가했다. 시료는 분석법의 성능을 입증하기 위한 블랭크로서 작용하는 분석 완충액; 미지 시료의 측정치를 표준화시키는데 사용되는 유리 베타(HCG) 용액; 또는 임산부로부터 두번째 3개월간 채혈한 혈청 시료일 수 있다. 평판을 30초동안 와동시킨 후에 200rpm하의 회전기에 놓고, 상온에서 30분동안 항온처리했다.
5. 이어서 평판을 전술한 바와 같이 세척하고, 유리 베타(HCG)에 특이적인 비오틴화된 항체를 함유하는 분석 완충액 10㎕를 각각의 웰에 첨가했다. 항체는 모노클론 또는 폴리클론 항체일 수 있으며, 취급자의 선택 여부에 따라 비오틴 이외의 물질, 예컨대 호스래디쉬 퍼록시다아제 또는 알칼리 포스파타제와 접합시킬 수도 있다. 항체의 농도를 조정하여 최적의 흡광도를 얻을 수 있다. 평판을 30초동안 와동시킨 후에 200rpm하의 회전기 상에 놓고 상온에서 30분동안 항온 처리하였다.
6. 이어서 평판을 전술한 바와 같이 세척했다. 호스래디쉬 퍼록시다아제에 접합된 스트렙트아비딘을 함유하는 분석 완충액 100㎕를 각각의 웰에 첨가했다. 이 단계는 비오틴 이외의 물질에 접합된 제2의 항체를 사용할 경우에는 불필요하다. 분석 완충액중의 스트렙트아비딘-퍼록시다아제의 농도는 2.0㎍/ml이다. 평판을 상온에서 5분동안 200rpm하의 회전기에 놓는다.
7. 이어서 평판을 전술한 바와 같이 세척했다. o-페닐렌디아민 용액 100㎕를 각각의 웰에 첨가했다. 이 기질 용액은 당업자에게 공지된 다수의 적절한 염료들중어느 것이라도 선택적으로 사용할 수 있으며, 이는 제2 항체에 접합된 물질이 어떤 것인지에 좌우된다. 평판을 200rpm하의 회전기상에 놓고 암실에서 8분동안 상온하에 항온 처리했다.
8. 묽은 황산(1.0N) 100㎕를 각각의 웰에 첨가하여 기질의 반응을 종료시켰다.
9. 각각의 웰의 흡광도를 492nm에서 분광분석기에 의해 측정했다.
상기 2가지 분석법을 사용하여 본 발명의 방법을 수행했다. 178명의 환자의 액상 혈액 시료를 이용하여 임산부 혈중 유리 베타 HCG의 양에 대한 태아 다운증후군의 상관관계를 연구하였다. 다운 증후군 태아를 임신한 것으로 알려진 임산부로 부터 얻은 26가지 시료 및 152가지의 다운 증후군을 보유하지 않은 미지의 시료를 분석하였다. 모든 시료는 당뇨가 없는 백인의 단태아-임산부로 부터 얻었다.
이어서 환자의 시료를 가지고 ELISA 분석법으로 MSAFP의 정량적인 수치에 대해서, 그리고 각각 1단계 분석법 및 2단계 분석법에 의해 유리 베타(HCG)의 수치를 분석하였다. 이어서 각각의 분석법에 의한 MSAFP의 수치 및 유리 베타(HCG)의 수치를 시판되는 컴퓨터 소프트웨어 통계 패키지인 통계학적 분석 시스템에 대한 선형 판별 절차중의 변수로 사용하여 참조 데이타 세트를 만들었다. 또한 환자의 임신 기간을 판별 절차에 변수로서 통합시켰다. 임신 전기간과, 14 내지 16주의 임신 기간에 대한 판별 분석의 결과를 이하에 요약하였다.
주 : 모든 분석 결과는 임신 기간을 포함시킨 것임.
*로 표시한 분석에서는 수치 260과 316을 갖는 2명의 국외자를 제외시켰음.
접미사-1은 1단계 절차를, 그리고 -2는 2단계 절차를 의미함.
검출 효율은 양성 시험 결과를 나타내는 태아 다운 증후군 환자의 비율을 언급한 것임.
허위양성은 양성 시험 결과를 나타내는 정상 태아의 비율을 언급한 것임.
대조군은 분석된 다운증후군 발병 시료의 수를 의미함.
다운증후군 발병군은 분석된 다운증후군 발병 시료의 수를 의미함.
유리 베타(HCG) 및 AFP에 대한 1단계 분석법의 조합을 사용하여 임신 전체 기간 및 임신 14-16주 동안 허위양성율을 최저로 하는 최고의 검출 효율을 얻는다.
상기 결과는 산전 혈청 검색 프로토콜 범위내에서 실행가능하고 효과적인 방식으로 다운 증후군을 검색할 수 있는 성능을 뒷받침해주며, 이 검색법은 (a)비관혈적 기법, (b)히위양성율이 낮은 고도의 검출 효율, (c)대부분 상호 독립적인 표지인자의 사용, (d)혈액 채취시 취급곤란한 제한 요건(하루중 채취시간, 음식, 개인습관 등)의 부재, 및 (e)다른 산전 검색 서비스들과의 양립성을 포함한다.
실시예 4
본 실시예는 본 발명의 방법을 사용하여 임신 첫 3개월동안의 다운 증후군을 검색하는 방법을 예시한 것이다. 150명의 환자로 부터 얻은 임산부 혈청 시료를 이용하였다. 각각의 환자는, 시료 채취 당시에 임신 기간이 9~13주인 태아를 임신한 상태였다. 139명의 환자는 다운 증후군이 없는 태아를 임신한 상태로서 이를 '대조군'으로 언급하였으며, 11명의 환자는 다운 증후군에 걸린 태아를 임신한 상태였다. 각각의 환자는 당뇨가 없고 단태아를 임신한 백인 여성이었다.
150가지 임산부 혈청 시료 각각에 존재하는 유리 베타의 수치는 상기 실시예 3에 기술한 2단계 유리 베타(HCG) 분석법을 이용하여 분석했다. 그 분석 결과는 제11도에 도시하였다. 제11도에 도시한 바와 같이, 다운 증후군에 걸린 태아를 임신한 환자들의 임산부 혈청중에 존재하는 유리 베타의 중간치는 대조군의 임산부 혈청중에 존재하는 유리 베타의 중간치보다 더 큰 2.45 MOM(중간치의 배수)이었다. 다운증후군에 걸린 태아를 임신한 환자중의 유리 베타(HCG)의 이러한 수치는 대조군중의 유리 베타(HCG)의 수치보다 상당히 더 컸다. 따라서, 다운 증후군에 걸렸을때 최초 3개월내에 유리 베타 단백질은 크게 증가한다.
실시예 5
또한 본 실시예는 본 발명의 방법을 사용하여 임신 첫 3개월동안의 다운 증후군을 검색하는 방법을 예시한 것이다. 277명의 환자로 부터 얻은 임산부 혈청시료를 이용하였다. 각각의 환자는, 시료 채취 당시에 임신 기간이 7~13주인 태아를 임신한 상태였다. 264명의 환자는 다운 증후군이 없는 태아를 임신한 상태로서 이를 '대조군'으로 언급하였으며, 13명의 환자는 다운 증후군에 걸린 태아를 임신한 상태였다. 각각의 환자는 당뇨가 없고 단태아를 임신한 백인 여성이었다.
277가지 임산부 혈청 시료 각각에 존재하는 유리 베타(HCG)의 수치는 상기 실시예 3에 기술한 2단계 유리 베타(HCG) hCG 분석법을 이용하여 분석했다. 그 분석 결과는 제12도에 도시하였다. 제12도에 도시한 바와 같이, 다운 증후군에 걸린 태아를 임신한 임산부 환자들의 혈청중에 존재하는 유리 베타(HCG)의 중간치는 대조군의 임산부 혈청중에 존재하는 유리 베타의 중간치 보다 더 큰 1.82MOM (중간치의 배수)이었다. 다운증후군에 걸린 태아를 임신한 환자중의 유리 베타(HCG)의 수치는 대조군중의 유리 베타(HCG)의 수치보다 상당히 더 컸다. 따라서, 다운 증후군에 걸렸을때 최초 3개월내에 유리 베타 단백질은 크게 증가한다.
실시예 6
본 실시예도 마찬가지로 본 발명의 방법을 사용하여 임신 첫 3개월동안의 다운 증후군을 검색하는 방법을 예시한 것이다. 융모막 융모 시료(CVS) 절차를 처치받도록 선택된 392명의 환자로 부터 임산부 혈청 시료를 채취했다. CVS 절차는 염색체 분석 핵형법을 위해 융모막 융모의 시료를 입수하는 임상 기법이다. 본 실시예에 사용된 혈청 시료는 환자를 CVS 절차로 처리하기 전에 환자로 부터 채취했다. 통상, 이 기법은 35세 또는 그 이상의 환자들, 즉 다운 증후군에 걸린 태아를 임신할 빈도가 높은 것으로 알려진 그룹을 이용하거나, 또는 가족중 염색체 이상 이력이 있는 환자들을 이용한다.
각각의 환자는 시료 채취 당시에 임신 기간 9~13주의 태아를 임신한 상태였다. 386명의 환자는 다운 증후군이 없는 태아를 임신한 상태로서 이를 '대조군'으로 언급하였으며, 6명의 환자는 다운 증후군에 걸린 태아를 임신한 상태였다. 각각의 환자는 당뇨가 없고 단태아를 임신한 백인 여성이었다.
392가지 임산부 혈청 시료 각각에 존재하는 유리 베타(HCG)의 수치는 상기 실시예 3에 기술한 2단계 유리 베타(HCG) 분석법을 이용하여 분석했다. 그 분석 결과는 제13도에 도시하였다. 제13도에 도시한 바와 같이, 다운 증후군에 걸린 태아를 임신한 환자들의 혈청중에 존재하는 유리 베타(HCG)의 중간치는 대조군의 임산부 혈청중에 존재하는 유리 베타(HCG)의 중간치보다 더 큰 2.94 MOM(중간치의 배수)이었다. 다운증후군에 걸린 태아를 임신한 환자중의 유리 베타(HCG)의 농도는 대조군중의 유리 베타(HCG)의 농도보다 상당히 켰다. 따라서, 다운 증후군에 걸렸을때 최초 3개월내에 유리 베타 단백질은 크게 증가한다.
본 실시예는 또한 전술한 바와 같은 본 발명의 방법을 사용하여 임신 첫 3개월 또는 그 다음 제2의 3개월간의 기간동안 다운 증후군을 비관혈적으로 검색할 수 있음을 예시한다. 본 명세서에서 임신 첫 3개월이라 함은 임신 기간이 14주 이전인 기간을 언급한 것이다. 이와 유사하게 임신 두번째 3개월 이라 함은 14 내지 26주의 임신 기간을 언급한 것이다.
예를들어, 실험실에서 임신 첫 3개월 동안에 얻은 임산부 혈청 시료중의 유리 베타(HCG) 수치를 포함하는 임신 주간 특이적인 참조 데이타를 만들 수 있다. 이러한 참조 데이타는 실시예에 전술한 것과 대등한 방식으로 만들 수 있다.
태아 다운 증후군을 검색하기 위해, 실험실에서는 임신 첫 3개월 동안 환자로 부터 얻은 혈액 시료중의 유리 베타(HCG)의 수치를 측정하고 참조 데이타와 비교하여, 그 환자가 다운증후군인 태아를 임신하고 있을 충분한 위험 상태에 있는지를 측정하여 추가 시험을 보증할 수도 있다. 본 명세서에 개시된 바와 같이, 이와 같은 실험실적 측정은 환자가 다운 증후군에 걸린 태아를 임신할 추후(검색후) 위험도를, 염색체 분석용 태아 세포를 얻기 위한 관혈적인 절차의 환자 및 태아에 대한 위험도를 반영한 소정의 컷 오프 수치와 비교할 필요가 있다.
실험실에서는 양성 검색 결과를 측정하기 위해 중간치 배수값 접근방법을 사용할 수 있다. 예컨대, 참조 데이타 세트로서 실시예 4에 제시한 데이타를 사용하면, 그 참조 데이타는 다운증후군이 아닌 태아를 임신한 여성의 경우보다 다운 증후군 태아를 임신한 여성의 경우 유리 베타(HCG)의 중간치가 2.45배 크다는 것을나타내고 있다. 중간치 배수값 접근 방법을 검색에 사용하고, 환자의 시료중의 유리 베타 (HCG)의 수치가 소정의 컷 오프 수치보다 클 경우, 예를들면 대조군의 유리 베타 (HCG)의 수치보다 중간치의 2.5배수만큼 클 경우, 그 실험실은 임산부에게 자신의 태아가 다운 증후군을 갖고 있는지 진단하기 위한 차후의 관혈적 시험을 받아야만 한다고 권고할 수 있다.
단일의 피분석물에 대한 중간치 배수값 접근방법에 따른 이러한 검색 방법은, 다수의 피분석물을 이용하는 검색 절차 및 다변수 판별 분석 접근방법, 예컨대 실시예 1에 기술된 방법만큼 정확하지 않을 수도 있다는 점을 유의해야 한다.
실시예 7
본 실시예는 액체 혈액 시료와, 실온(대략 20℃) 및 4℃에서 5일간 저장된 건조된 혈액 시료중의 유리 베타(HCG)의 측정된 수치를 비교한다.
액체 혈액 시료를 임산부에게서 얻어, 유리 베타(HCG)의 수치를 본원에서 개시한 분석 기법을 사용하여 측정하였다. 액체 시료 각각의 6개의 분액을 두개의 표본 카드 각각에 찍었다. 남은 액체 혈액 시료를 두 부분으로 분리했다.
각 액체 혈액 시료의 하나의 표본 카드 및 남은 액체 혈액 시료의 두부분중 하나를 4℃에서 냉장 보관하였다. 나머지 다른 표본 카드와 남은 액체 혈액 시료의 나머지 부분을 실온에서 저장하였다.
다음 5일 동안 매일 대략 같은 시간에, 표본 카드 각각의 혈액시료와 남은 액체 시료의 두부분 둘다를 유리베타(HCG) 함량에 대하여 분석하였다. 분석 과정중 생기는 임의의 오차를 감소시키기 위하여, 액체 혈액 시료를 분석하기 직전에 표본카드상에 찍었다. 건조된 혈액 반점의 분석은 본원에서 개시한 방법으로 수행하였다.
상기 결과를 제17도 및 제18도에 그래프로 나타내었다. 이들 도면에서 나타내는 바와같이, 실온에서 저장한 건조된 혈액 시료중에 존재하는 유리 베타의 측정치가 실온에서 저장된 액체 혈액 시료중에 존재하는 유리 베타(HCG)의 측정치보다 더욱 일정하게 유지된다.
실시예 8
본 실시예는 액체 혈액을 이용하는 검색 방법과 건조된 혈액 반점을 이용하는 검색 방법을 비교하는 실험이다. 두 경우 각각에 이용된 검색 방법은 본원에서 개시한 바와 같이, 임산부 혈중의 유리 베타(HGG) 및 AFP 수치와 임신 기간을 참조 자료와 비교하는 것이다.
이 실시예에서는, 건조된 혈액 반점의 실험 프로토콜에 협력한 선별된 의사들로부터 임산부 혈액 시료를 건조된 혈액 반점으로 입수하였다. 이들 건조된 혈액시료를 본원에서 개시한 바대로 평가하여 다운 증후군에 걸린 태아를 임신할 수 있는 임산부의 증가된 위험률을 측정하였다.
건조된 혈액 반점 시료를 사용한 결과를 유사한 모집단의 임산부의 혈액 시료가 액체로 수거된 것과 비교하여 본원의 실시예 3에 설명한대로 평가하였다.
그 결과는 다음과 같다:
상시 결과는, 유사한 모집단의 임산부의 경우, 건조된 혈액 반점의 분석에 근거한 다운 증후군에 걸린 태아를 임신하고 있을 위험이 증가하는 임산부의 수는 액체 혈액 시료의 분석에 비해 현저히 감소하였음을 나타내고 있다.
실시예 9
본 실시예는 유리 베타 (HCG)의 측정에 이용된 특정 면역분석법으로 "틈이 있는" 유리 베타 (HCG)도 또한 측정할 수 있음을 예시한다.
틈이 있는 유리 베타 (HCG)는 다음과 같이 제조했다. 탈이온수에 희석시킨, 캘리포니아, 라호야에 소재하는 스크립스 레보러토리즈에서 제조 및 판매하는 212㎍/ml의 hCG β-서브유니트(스크립스 카타로그 번호 C0904)중 100㎕를 미주리, 세인트 루이스 소재의 시그마 케미칼 컴패니에서 제조 및 판매하며 1ℓ당 0.5M NaCl과 1g Brij를 함유하는 pH 8.5의 0.1M Tris-HCl 중에서 조제한 100㎕의 hLE(0.3단위)(hLE=인체 백혈구 엘라스타제)에 첨가했다. 혼합물을 37℃에서 항온 처리했다. 그 혼합물로부터 0, 60, 120 및 180분째에 시료를 채취했다. 각각의 시료에 10mg/ml의 콩 트립신 억제제 10㎕를 첨가하여 β HCG와 hLE간의 반응을 중지시킴으로써 틈이 있는 유리 베타 (HCG)의 더 이상의 형성을 중단시켰다. 4종의 시료 즉, 유리 베타 (HCG)(0분 채취 시료) 1종 및 틈이 있는 유리 베타 (HCG) (60, 120 및 180분 채취 시료)를 함유하는 3종의 시료를 다음과 같이 분석했다.
안정제와 방부제를 함유하는 pH 7.2의 PBS(인산염 완충 식염수 용액)를 사용하여, 초기 시료를 절반 농도로 단계적으로 희석시킴으로써 각 시료에 대해 7가지의 추가의 농도를 갖는 시료를 제조했다. 따라서, 각각의 시료에 대해 8가지 농도, 즉 100%, 50%, 25%, 12.5%, 6.25%, 3.125%, 1.5625%, 0.78125%(% = 초기 시료를 기준으로 한 %)의 시료를 조제했다. 8가지 농도로된 각각의 시료(0, 60, 120 및 180분째 채취한 시료)를 상기 실시예 3에 기술된 2단계 유리 베타(HCG) 분석법을 이용하고, 2가지 상이한 방으로 된 포착/검출 항체를 사용하여 2회 분석하였다. 그 결과는 다음과 같다.
각각의 분석에 있어서, 0분 동안 항온처리한 시료중의 유리 베타(HCG)의 측정 농도에 비해 hLE와 함께 60, 120 및 180분 동안 항온처리한 시료중의 유리 베타 (HCG)의 측정 농도가 약간 상승했다. 각 분석에 대한 평균 변화율(%)은 시험한 8가지 농도에 대하여 180분 시료 대 0분 시료를 비교해 볼때 각각 102.1%(96.2%~107.6% 범위) 및 112.4%(106.3%~121.7% 범위)였다.
제1 항체 쌍에 있어서, 시료중의 틈이 있는 유리 베타 (HCG) 증가율의 인식은 유리 베타 (HCG)에 대한 면역반응성의 정도를 크게 변화시키지 않았다. 제 2 항체 쌍은 제1 항체 쌍보다 틈이 있는 유리 베타(HCG)에 대해서 더욱 큰 친화도를 가졌다. 제2 항체 쌍의 경우에, 변화도는 0에서 60분 까지의 범위(110.5% 변화); 및0분 내지 120분 까지의 범위(115.1% 변화)에 걸쳐 증가하였다. 180분에서 변화율(%)은 120분에서의 변화율(%)에 비해 증가하지 않았다. 제2 항체 쌍에 대한 평균 변화율(%)은 112.7%였다 따라서, 제1 항체 쌍은 유리 베타(HCG) 및 틈이 있는 유리 베타 (HCG)에 대해서 반응성이 동등하며, 제2 항체 쌍은 제1 항체 방에 비해 틈이 있는 유리 메타 (HCG)에 대해 반응성이 더 크다(+12%).
이러한 결과는 틈이 있는 유리 베타(HCG) 및 유리 베타 (HCG)를 모두 측정하는 분석법을 다운 증후군에 대한 검색법에 사용할 수 있다는 것을 뒷받침해 준다. 그와 같은 분석법을 본 발명의 방법에 사용할 경우 약 80%의 검출 효율이 제공될 것으로 예상된다.
상기 결과는 다른 방법에 의해 제안된 것보다 작은 횟수의 생화학적 분석을 수행하면서 동시에 다운 증후군 검색에 있어서 더 높은 검출율을 얻을 수 있음을 시사한다. 다운 증후군 검색에 고도로 유효한 표지인자를 사용하는 방법은 심각한정신 지체의 가장 흔한 원인인 다운 증후군에 걸린 대부분의 가족에게 산전 초기에 비관혈적 검색 정보를 제공할 수 있다.
당업자에게는 양성의 위험 첫 오프 수치를 변화시키거나, 모집단중의 여러아군들에 적용할 수 있는 상이한 종전 위험률을 사용하면 환자의 판별 절차의 결과를 변화시킬 수 있다는 것은 자명한 것이다.
따라서, 본 발명은 첨부된 특허청구범위내에 포함되는 모든 변형예들까지도 포함하는 것으로 파악되어야 함은 물론이다.

Claims (12)

  1. 유리 베타(인간 융모성 성선 자극 호르몬(HCG))의 혈중 수치를 측정하는 방법에 있어서,
    혈액 시료를 여과지 상에 채취하는 단계;
    상기 혈액 시료를 건조시켜 건조된 혈액 반점을 형성시키는 단계;
    상기 건조된 혈액 반점으로부터 유리베타(HCG)의 혈중 수치를 측정하는 단계를 포함하며,
    상기 방법은 임산부가 다운증후군에 걸린 태아를 임신하고 있을 수 있는 위험도를 검색하는데 사용될 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 건조된 혈액 반점으로부터 알파-페토프로데인(AFP) 의 혈중 수치를 측정하는 단계를 더 포함하며,
    유리 베타(인간 융모성 성선 자극 호르몬(HCG)) 및 AFP의 혈중 수치는 임산부가 다운증후군에 걸린 태아를 임신하고 있을 수 있는 위험도를 검색하는데 사용될 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 유리 베타(HCG)는 유리 베타(HCG)의 단백질 부분, 유리 베타(HCG)의 탄수화물 부분, 또는 탄수화물 부분과 단백질 부분의 접합 부위에 위치한 유리 베타(HCG)인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 유리 베타(HCG)는 유리 베타(HCG)의 변형된 형태인 것을 특징으로 하는 방법,
  5. 제1항에 있어서, 상기 유리 베타(HCG)는 유리 베타(HCG)의 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 유리 베타(HCG)의 변형된 형태는 틈이 있는 (nicked) 유리 베타(HCG)것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 유리 베타(HCG)는 유리 베타(HCG)의 베타 코아 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항, 제2항, 제3항, 제4항, 제5항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈액 시료는 임신 첫 번째 삼개월간, 두 번째 삼개월간 및 세 번째 삼개월간으로 이루어진 군에서 선택된 기간 중에 임산부로부터 채취한 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항, 제2항, 제3항, 제4항, 제5항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 측정 단계 이전에 여과지 상의 건조된 혈액 반짐을 용출하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항, 제2항, 제3항, 제4항, 제5항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 측정단계는 유리 베타(HCG)에 대한 항체를 이용하는 분석법을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항, 제2항, 제3항, 제4항, 제5항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 임산부가 삼염색체성 18에 걸린 태아를 임신하고 있을 수 있는 위험도를 검색하는데 사용될 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항, 제2항, 제3항, 제4항, 제5항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 혈액 시료 대신에 뇨 시료를 사용하고, 건조된 혈액 반점 대신에 건조된 뇨 반점이 형성되고, 혈중 수치 대신에 뇨 수치를 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
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