JPH08500181A

JPH08500181A - 乾燥血液試料を用いるダウン症候群のスクリーニング法

Info

Publication number: JPH08500181A
Application number: JP6505620A
Authority: JP
Inventors: ジェイムズエヌマクリ
Original assignee: ジェイムズエヌマクリ
Priority date: 1992-08-07
Filing date: 1993-08-06
Publication date: 1996-01-09
Anticipated expiration: 2019-05-24
Also published as: EP0667958A1; AU5003593A; DE69332610T2; DE69332610D1; US5252489A; WO1994003805A1; AU688279B2; ES2189799T3; EP0667958B1; EP0667958A4; KR100344085B1; CA2141870A1; CA2141870C; JP3529777B2; ATE230488T1

Abstract

(57)【要約】本発明は、妊婦の乾燥血液試料を分析することによる出生前スクリーニングで胎児ダウン症候群（２１−トリソミー）、１３−トリソミー、１８−トリソミー及び他の染色体異常を検出する方法に関する。更に詳細には、本発明は、妊婦の乾燥血液試料中の、本出願を通してすべて遊離β（ＨＣＧ）と呼はれる、遊離βヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）及び遊離β（ＨＣＧ）のニック又はフラグメント型又は異常型の量を測定することにより異常をスクリーンする検出効率の改善方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】乾燥血液試料を用いるダウン症候群のスクリーニング法本出願は、1992年４月14日出願の出願番号第07/868,160号一部継続出願であり、その出願は1989年10月12日出願の出願番号第07/420,775号の一部継続出願であり、その出願は1989年６月１日出願の出願番号第07/360,603号の一部継続出願であり、その出願は現在放棄されている1989年５月８日出願の出願番号第07/349,3 73号の一部継続出願であり、その出願は現在放棄されている1989年２月17日出願の出願番号第07/311,808号の一部継続出願であり、その出願は現在放棄されている1989年１月17日出願の出願番号第07/297,489号の一部継続出願である。発明の分野本発明は、妊婦の乾燥血液試料を分析することによる出生前スクリーニングで胎児ダウン症候群（２１−トリソミー）、１３−トリソミー、１８−トリソミー、ターナー症候群及び他の染色体異常を検出する方法に関する。更に詳細には、本発明は、本明細書を通してすべて妊婦の乾燥血液試料中の遊離β（ＨＣＧ）を意味する、遊離β（ヒト絨毛性ゴナドトロピン“ＨＣＧ”）及び遊離β（ＨＣＧ）のニック又はフラグメント型又は異常型の量を測定することによるダウン症候群の出生前スクリーニングにおける検出効率の改善方法に関する。発明の背景２１−トリソミーとも言われるダウン症候群は、重度知能障害の最も一般的な原因である。一般的には、胎児ダウン症候群は、羊水穿刺又は絨毛穿刺及ひ核型のような診断法によって決定される。しかしながら、これらの診断法は侵入するものであり、妊婦及び胎児に対して危険を伴う。この及び他の理由のために、妊娠中に羊水穿刺又は絨毛穿刺及び核型は通常行われない。代わりとして、妊娠に対する危険が侵入診断法を受ける危険を正当とする場合に１種以上のスクリーニング法が用いられる。ダウン症候群の発生頻度は、母の年齢が高くなるにつれて著しく増大する。歴史的に、ダウン症候群の出生前検出は３５歳以上の妊婦に集中しており、その年齢のダウン症候群の危険率は胎児ダウン症候群を検出するために用いられた診断法の危険に近づくかあるいはこれを超える。従って、出生前スクリーニングの標準法は母親の年齢に基づいて診断羊水穿剌の妊婦を選ぶことを伴ったものである。しかしながら、年齢は、最も危険な状態の妊婦、即ち、３５歳以上の妊婦の５％について羊水穿刺及び核型を行うことにより全ダウン症候群妊娠の約２０％しか検出することができないという点で不十分なスクリーニング基準である。更に、実際の臨床診療では３５歳以上の妊婦の半数位しか羊水穿刺及び核型を受けないので、ダウン症候群妊娠が出生前に検出されるのは１０％より少ない。 1984年には、母体血液のα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）レベルの低下と胎児ダウン症候群との関連が発見された。他の染色体トリソミー、特に１３−トリソミー及び１８−トリソミーも母体血液のＡＦＰレベルの低下と関連があることが特に言及された。これらの他の染色体トリソミーの発生頻度（各々妊娠５０００に１回及び６６００に１回）は、一般のもの２１−トリソミー（ダウン症候群、妊娠８００に１回）に関連した事前危険率より著しく低い。しかしながら、ＭＳＡＦＰレベルの低下及び遊離β（ＨＣＧ）レベルの上昇又は降下のあるこれらの他の染色体トリソミーの関連のために、母体血液ＡＦＰ及び遊離β（ＨＣＧ）、あるいは本明細書に記載される追加のマーカーを用いスクリーニングプロトコールの中にも検出されてしまう。２１−トリソミーの本明細書に記載されるプロトコールを用いるという点で、１３−トリソミー、１８−トリソミー、ターナー症候群及び他の染色体異常の検出も行われることは当業者に明らかである。母体血液のＡＦＰレベルの低下と胎児ダウン症候群との間の関連により、ダウン症候群の症例の約８０％が出現する若い見掛け上罹患していない家族のダウン症候群の症例の検出において非侵入血液スクリーニングを使用する機会が生じた。母体血液の低ＡＦＰ（スクリーニングマーカーとして）に基づくスクリーニングテストを使用すると、胎児ダウン症候群の全症例の約２０％の出生前検出をもたらすと推定される。別のスクリーニング方法は、母体血液中の非抱合型エストリオール（ＵＥ）レベルを測定することを含むものである。 Bogartの米国特許第 4,874,693号には、妊娠１８−２５週の母体血液のＨＣＧレベルの上昇及び母体血液のＨＣＧのαサブユニットレベルの上昇と胎児ダウン症候群との間の関連が開示されている。Bogart特許では、母体血液のＨＣＧレベルの上昇と母体血液のＨＣＧのαサブユニットレベルの上昇をスクリーニングプロトコールに使用すると、ＡＦＰ又はＵＥ単独を使用するより染色体異常の胎児の割合を多く検出すると推定されている。“Human Chorionic GonadotropinLeve ls in Pregnancies with Aneuploid Fetuses”(Bogartら，PrenatalDiagnosis, Vol．9,379-384(1989))と題する論文で、BogartはＨＣＧ及びＨＣＧのαサブユニットを用いるスクリーニング法が胎児異数性（ダウン症候群を含む）に危険な状態の妊娠を選択するのに妊娠９−１１週（妊娠初期の３ヵ月間）に有効でないことを開示している。本発明者の1992年４月14日出願の同時係属米国特許出願第07/868,160号、1991 年３月31日出願の同第07/709,019号及び1989年10月12日出願の同第07/420,775号には、これまで用いられたスクリーニング法より染色体異常の胎児の割合を多く検出する遊離β（ＨＣＧ）（及び遊離β（ＨＣＧ）のニック又はフラグメント型又は異常型）を用いるダウン症候群スクリーニング法が記載されている。これらの出願には、スクリーニングプロトコールで試料を分析する検査室で有利に使用される装置も記載されている。各出願の開示を参考として本明細書に引用する。これらの出願に記載されているように、特に有効なダウン症候群スクリーニング法は、妊婦の母体血液の遊離β（ＨＣＧ）レベルを測定し、測定した遊離β（ＨＣＧ）レベルを（１）正常な胎児を妊娠している妊婦及び（２）ダウン症候群胎児を妊娠している妊婦の遊離β（ＨＣＧ）レベルを含む基準データと比較することが含まれる。妊婦の母体血液のＡＦＰレベル及び妊婦の妊娠年齢を基準データと比較することを含むスクリーニング法を用いることにより、ダウン症候群スクリーニングが更に高められる方法も記載されている。この比較は、多変数判別式分析法を用いて有利に行われる。判別式分析は、母集団を確率に基づいて２つ以上のグループに分けることを含む一般に知られる多変数分析方法である。判別式分析の一般論理は、Marketing Research; Churchill, G.A.; Dryden, 1976;Ch ap. 15, p．530-543に見出される。本発明者の先願に示されているように、妊婦の遊離β（ＨＣＧ）及びＡＦＰレベル及び妊娠年齢を基準データと比較するために多変数判別式分析を使用すると、ダウン症候群の出生前検出の他の既知のスクリーニング法より胎児ダウン症候群の症例の大きい割合が低い偽陽性率で検出される。前項に記載されたように、出生前スクリーニング法は一般に妊婦の血液の分析が含まれる。通常、この血液試料は医師の診療室か又は同様の臨床環境内で妊婦から採取され、次いで分析用臨床検査室に運搬される。血液試料は、分析又はもっと後での運搬のために保存されてもよい。多くの場合、臨床環境は血液が分析されるべき臨床検査室とは物理的に別の位置にある。例えば、血液が妊婦から採集される臨床環境は都市や人口の中心に位置し、検査室は郊外又は田舎の環境、ある場合には別の状態に位置する。通常用いられるスクリーニング法では、妊婦から採取された血液試料はバイアル又は試験管内に液体の形で運搬及び／又はもっと後の分析のために保存される。更に、試験管は、分析前に試料の汚染を防止し更に試料の蒸発を防止するために密封されなければならない。液体の形の運搬及び保存血液試料は欠点が多い。試験管又はバイアルを衝撃吸収包装に包装することを含む試験管又はバイアルの破損を避けるために、一般的には特殊な取扱い方法を用いなければならない。漏れ試験済の袋に試験管を入れるのが通例である。一般的には、こぼれを避けるために、試験管がまっすぐに保たれるように袋も設計しなければならない。最終結果として、大きな貯蔵あるいは輸送面積を要するかさばった袋ができることがある。更に、病原体を有する血液は、血液試料が液体血液を取扱うために用いられた容器で採取、保存及び／又は運搬される場合に生じる飛散、穿剌、試験管の破損等のために液体血液試料により伝染させることも既知である。更に、血液のある成分が低温で維持されないと試験管内で分解することも一般に既知である。発明の要約本発明の方法によって上記欠点が克服されかつ他の利点が達成される。本発明によれば、スクリーンされるべき妊婦から採血され、血液が乾燥するろ紙に移される。結果は、乾燥血液のろ紙上の１つ又は複数のスポットである。次いで、血液スポットを含むろ紙を分析してスクリーニングプロトコールに用いられた妊婦の被検体レベルを求める。血液スポットを含むろ紙は、分析の前に保存及び／又は運搬される。本発明の好ましい実施態様においては、血液スポットを分析して妊婦の遊離β（ＨＣＧ）及び／又はαフェトプロテイン（ＡＦＰ）レベルを求める。本発明の方法は血液について本明細書で記載されているが、本方法は尿のような他の体液でも有利に利用される。例えは、患者の尿又は他の体液の小滴を標本カード上に置き、乾燥させる。次いで、乾燥スポットを当業者に既知の慣用の免疫学的手法により乾燥血液スポットの分析について本明細書に記載された方法と同様の方法で分析することができる。本発明の好ましい方法においては、乾燥血液スポットを溶離し遊離β（ＨＣＧ）レベルを慣用の免疫学的方法で求めることにより妊婦の遊離β（ＨＣＧ）レベルを決定するために乾燥血液スポットが分析される。次いで、遊離β（ＨＣＧ）レベルを基準データセットと比較してダウン症候群をもつ胎児を妊娠している患者の危険率を求める。検出効率を改善するために、遊離β（ＨＣＧ）レベルと妊娠年齢を基準データセットと比較することができる。更に検出効率を改善するために、乾燥血液スポットを分析して妊婦の母体血液の遊離β（ＨＣＧ）とＡＦＰのレベル（“被検体”又は“マーカー”と呼ぶ）を求める。次いで、各マーカーのレベルを基準データセットと比較してダウン症候群又は他の染色体異常をもつ胎児を妊娠している患者の危険率を求める。多変数判別式分析法は、マーカーのレベルを基準データセットに比較するために有利に用いられる。更に詳細には、Bayesの法則、患者の事前危険率及び患者の各マーカーの量的レベルの対数を多変数判別式分析を用いて展開した基準データの確率密度関数に組込むことにより求められる非罹患及び罹患妊娠の相対頻度を用いて患者特定危険率か算出される。ダウン症候群をもつ胎児を妊娠している患者の危険率が一定の危険カットオフレベルより大きい場合には、更にダウン症候群及び他の染色体異常の存在を確認する診断テストを患者に勧めなければならない。同様に、本発明の方法が１３−トリソミー、１８−トリソミー、ターナー症候群又は他の染色体異常のスクリーニングプロトコールに用いられる場合には、遊離β（ＨＣＧ）レベルとＡＦＰレベルを基準データセットと比較する多変数判別式分析法を用いて異常のある胎児を妊娠している患者の危険率が求められる。遊離β（ＨＣＧ）レベルとＡＦＰレベルと共にマーカーとして妊娠年齢を組合わせると検出効率を更に改善する。多くの試料の場合母体血液の遊離β（ＨＣＧ）レベルと母体血液のＡＦＰレベルが対数−ガウス分布曲線に従って分布する傾向があるので、患者の各マーカーの量的レベルの対数と妊娠年齢を多変数判別式分析を用いて展開した基準データの確率密度関数に組込むことにより最大検出効率を得ることができる。更に、遊離βＨＣＧを用いるスクリーニングプロトコール及び乾燥血液又は尿スポットについて有用な他のスクリーニングプロトコールの詳細及び利点が1992 年４月14日出願の本発明者の同時係属出願第07/868,160号及び親出願と同日に出願され発明の名称が“Method and Apparatus for Detdcting Down Syndrome byN on-Invasive Maternal Blood Screening”である本発明者の同時係属出願に示されており、この開示を参考として本明細書に引用する。血液をろ紙上に“スポットする”手法は一般に既知である。例えば、多くの病院が新生児スクリーニング計画において乾燥血液試料を利用している。出産直後新生児のかかとを刺し、血液を一滴ろ紙に置く。血液の小滴を乾燥した後、ろ紙は分析用臨床検査室に通常普通郵便で送られる。しかしながら、知っている限りでは、以前に遊離β（ＨＣＧ）を用いる出生前ダウン症候群スクリーニング計画に乾燥血液試料が用いられたことがなかった。本発明の方法の具体的な利点は、遊離β（ＨＣＧ）レベルが乾燥血液スポットを保存する温度に無関係に二量体ＨＣＧ分解作用に抵抗することである。これにより、検出効率がより良くなる。更に、本発明の方法は、血液試料の輸送及び保存に多くの利点を提供する。ろ紙上の乾燥血液試料は、試験管内の液体血液試料より場所をほとんど取らない。即ち、試料を貯蔵する必要な場所が少なく、試料は小さな袋で通常郵便又は配達サービスによって送られる。試験管又はバイアル内の液体血液試料に比べてろ紙の乾燥血液スポットを送る点での他の利点は、当業者に容易に明らかである。乾燥血液スポットを用いる利点は、更に、本発明の方法においては液体血液試料が分析される場合より少量の血液が妊婦から採取されることである。必要とされる血液が少ないので、妊婦への侵入が少ない、痛みの少ない可能性のある採取方法を可能にする。遊離β（ＨＣＧ）を用いる好ましい方法の利点は、高割合の胎児ダウン症候群の症例を正しく、既知の他の方法及び段階より偽陽性率を少なく予想することである。本発明の他の利点は、下記の詳細な説明及び下記の実施例から明らかになるであろう。図面の簡単な説明図１は、実施例２に言及される、２１−トリソミーの個々のマーカーの有意レベルを示す表である。図２は、実施例２に言及される、個々のマーカーのダウン症候群スクリーニング効率を示す表である。図３は、実施例２に言及される、複合マーカーのダウン症候群スクリーニング効率を示す表である。図４は、実施例２に言及される、非罹患妊娠における遊離β（ＨＣＧ）分布の一定のパーセンチル以上のダウン症候群の症例の割合を示す表である。図５は、実施例２に言及される、個々のマーカーのダウン症候群効率を示す表である。図６は、実施例２に言及される、種々の妊娠年齢範囲における複合マーカーとしての対数ＡＦＰと対数遊離β（ＨＣＧ）のダウン症候群スクリーニング効率を示す表である。図７は、実施例２に言及される、米国全土のＡＦＰ、遊離β（ＨＣＧ）及び妊娠年齢の予想ダウン症候群スクリ−ニング効率を示す表である。図８は、実施例２に言及される、非罹患妊娠の種々のパーセンチルに関して２１−トリソミーの症例における遊離β（ＨＣＧ）レベルを示すものである。図９は、実施例２に言及される、遊離β（ＨＣＧ）レベルの分布を示すものである。図１０は、実施例３に宵及される、マーカーの種々の組合わせのダウン症候群スクリーニング効率を示す表である。図１１は、実施例４に言及される、患者の試料中の遊離β（ＨＣＧ）レベルの分布を示すものである。図１２は、実施例５に言及される、患者の試料中の遊離β（ＨＣＧ）レベルの分布を示すものである。図１３は、実施例６に言及される、患者の試料中の遊離β（ＨＣＧ）レベルの分布を示すものである。図１４は、試料標本カードの前面図を示すものである。図１５は、試料標本カードの裏面図を示すものである。図１６は、血液試料を得る部位を示すものである。図１７は、実施例７に言及される、種々の保存条件における乾燥血液試料中の測定遊離β（ＨＣＧ）レベルの経時変化を示す図表である。図１８は、実施例７に言及される、種々の保存条件における液体血液試料中の測定遊離β（ＨＣＧ）レベルの経時変化を示す図表である。発明の詳細な説明本発明の方法によれば、妊婦から出生前血液試料を採取し、ろ紙上で乾燥する。標本採取カードとも呼ばれるろ紙は、ヒルスボラフ、オレゴンにある Whatman 社及びキーネ、ニューハンプシャーにあるSchleicher & Schuellを含む種々の所から市販されている。通常、３インチ×４インチ又は５インチ×７インチカードを用いて試料を採取するが、ろ紙は本発明の方法に影響せずに任意のサイズとすることかできる。ろ紙のサイズは、乾燥血液試料を運搬し、保存し及び／又は索引を付けるのに便利であることが好ましい。ろ紙は、技術者又は看護婦か妊婦の名前又は他の確認者及び試料をろ紙に採取した日付のような他の情報を書くことを可能にするのに十分なサイズを有することが有利である。本発明の好ましい実施態様においては、ろ紙（標本採取カード）は血液スポットの場所を示す円及び血液試料を採取する技術者又は看護婦が患者の確認番号、出産日、試料の採取日及び医師名を入れる場所が予め印刷されたSchleicher & Schuell #903 ^TM３インチ×４インチカードである。この種類の標本カードは図１４及び１５に示されている。図１４に示されているように、標本カード５０１の前面５００は５個の円５０２の輪郭を有する。この円は、技術者又は看護婦が血液試料を採取する基準点を示すものである。下記に示されるように、技術者又は看護婦は乾燥血液試料を円５０２内に置くことを試みることが好ましい。標本カード５０１の前面５００は、また、技術者又は看護婦が血液を採取する患者についての情報を入れる予め印刷された場所を含んでもよい。図１４に示されるように、この情報は患者名５０４及び確認５０６を含めてもよい。図１５は、標本カード５０１の裏面５１０を示すものである。図１５に示されるように、標本カードの裏は、また、血液試料をカードに置くに当たり技術者又は看護婦を助ける円５０２の輪郭を含めてもよい。妊婦から採取した血液の量は、直径約１０ミリメートルのろ紙に少なくとも１スポット作成するのに十分でなければならない。しかしながら、通常は妊婦からの乾燥血液を１スポット以上作成することが有利である。本発明の好ましい実施態様においては、妊婦から採取した血液の量はろ紙上に約１０mmの６スポットを作成するのに十分である。当業者には、１枚のろ紙上に作成した血液試料数かろ紙の寸法並びに血液を分析する医師及び臨床検査室の要求に左右されることが理解されるであろう。血液をろ紙に“スポットする”ための種々の手法は、当該技術に既知である。血液スポットを作成するために用いられる具体的な手法の選択は、試料を採取する人の選択の問題である。一般に、妊婦について便利な部位、好ましくは指先、足指又は耳たぶを滅菌し、次いで無菌披針で刺す。披針は種々の所から市販されている。特に有用な披針は、ニュージャージーのTechnidyne社で製造販売されているTenderlett^TM披針である刺した部位にできる血液の小滴は、血液スポットを形成するためにろ紙に滴下される。また、刺した部位は血液スポットを作成するためにろ紙と接触した状態に置かれる。血液は、輸送及び／又は貯蔵の前にろ紙上で乾燥しなければならない。本発明の好ましい実施態様においては、血液スポットを次の方法で図１４及び１５に示されるような直径約１０mmの６個の円を予め印刷したSchleicher &Schu ell #903^TM３×４インチカードに採取する。まず、妊婦に関する情報及び他の詳細を探すカードの図１４の予め印刷された部分５０４及び５０６を書き入れる。好ましくは、妊婦の血液を採集するために刺される部位として指先が選ばれる。試料を採取する技術者又は看護婦によって領域を摩擦することにより指先が温められる。次に、刺されるべき部位の回りの皮膚をアルコール綿を用いて清浄し、皮膚を風乾する。Tenderlett^TM披針又は類似の器具をその袋から取り出し、切開部位にしっかりと置く。披針を用いて十分な血流を確保する深さまで指先を刺す（切開する）。切開の好ましい点は図１６に示されている。血液の最初の小滴は、滅菌カーゼで拭き取る。テーブルに対して平らな指を切開部位を上にして保持しながらろ紙を切開部位まで持ってくる。過剰のプール血液が指の下に流れ落ちる前に、１段階でろ紙を部位と接触状態にし、血液をろ紙に浸漬する。切開部位が図１４及び１５の６個の予め印刷された円５０２の１つの中心にほぼ対応するろ紙部分を接触させるようにろ紙を置く。次いで、切開部位との接触からろ紙を取り除き、再び置き、次いで切開部位に３〜５回接触させてカードの予め印刷された塗布面に大体位置した６個の血液スポットの全部を作成する。４〜６個の血液スポットの全部を作成するために必要な場合には血流を高めるために、切開部位の回りに弱いマッサージが用いられる。４〜６個のスポットが作成された後、滅菌カーゼと圧迫を適用して切開が閉じられる。次いで、必要な場合には切開部位に包帯が巻かれる。血液スポットは、平らな水平位置で周囲温度（６５−８０゜Ｆ）で通常最低２時間風乾される。試料の交差汚染又は浸出を避けるために、血液スポットが乾燥するまでろ紙を積み重ねてはならない。乾燥後、ろ紙を封筒に入れ、血液スポットが分析される検査室に運搬されるか又はもっと後での輸送のために貯蔵される。前項は試料を採取する好ましい方法の詳細な説明を含むが、本発明の方法がこの方法に限定されると解釈されてはならない。乾燥血液試料を採取する他の方法も医師、技師、看護婦及び他の医療職員に既知であり、本発明の方法に使用するのに適している。ろ紙に含まれる乾燥血液スポットは、妊婦のダウン症候群及び／又は他の染色体異常をスクリーンするために、即ち、ダウン症候群あるいは別の染色体異常をもつ胎児を妊娠している妊婦の危険率がそれ以後の侵入試験を正当とするかを決定するために分析される。血液スポットは、問題の被検体のレベルを求めるために通常血液を溶離することを含む一般の実験法によって分析される。被検体という語は、妊婦の血液中の濃度又はレベルが求められる分子又は物質を意味する。本発明の好ましい方法においては、乾燥血液スポットは被検体の血中濃度を求めるために用いられる免疫学的分析法の一部としてスポットを溶離することにより分析される。更に詳細には、好ましい本方法は次の分析手順を用いる。１．ＰＢＳ（リン酸塩緩衝食塩水）５錠剤を１０００mlの蒸留水又は脱イオン水に溶解することにより洗浄液を調製する。0.5mlのトゥイーン２０、セントルイス、ミズーリにあるシグマケミカル社で製造販売されている清浄剤を加えて洗浄液を完了する。２．単一ウェルパンチ／溶離プレートへの直接移動器具を用いて、乾燥血液スポット２つからの２つの４mmディスク／溶離プレートウェルにパンチする。３．１５mlの分析バッファーを表示試薬に加え、次いで１３５μｌの分析バッファーを各溶離プレートウェル内のパンチディスクに加える。４．溶離プレートをかぶせ、マクレーン、バージニアのFlow Laboratoriesで製造されたTitertekプレートシェーカーのようなプレートシェーカー上に置く。溶離プレートを高速設定で３０±２分間振盪する。５．次いで溶離プレートウェル内の溶離物質をミクロ試験管にピペットを用いて移す。残りの手順は、８ウェル×１２ウェル標準分析プレートについて示される。６．追加の１５mlの分析バッファーを試薬に加え、１１０μｌのバッファーをモノクローナル“標識”抗体被覆分析プレートの各ウェルに移す。７．ミクロ試験管の各々からの２０μｌの溶離溶液を抗体被覆分析プレート内の表示ウェルに移す。８．分析プレートをかぶせ、次いでプレートシェーカー上中位の速度で３０±５秒間振盪する。９．次いで分析プレートを台回転器上２００ＲＰＭで約６０±５分間置く。１０．次いで分析プレートの各ウェルを洗浄液で５回洗浄して各ウェルに残っている溶液を除去する。１１．被覆プレート上のモノクローナル抗体に対する標識化抗体を含有する第１使用試薬(“使用試薬１”)は、２０μlの各抗体を１２mlの分析バッファーに混合することにより調製する。１２．１００mlの使用試薬１を全分析プレートウェルに移す。プレートをかぶせ、２００ＲＰＭの台回転器で３０±２分間インキュベートする。１３．次いで分析プレートの各ウェルを洗浄液で５回洗浄して各ウェルに残っている溶液を除去する。１４．標識化抗体に対する“シグナル”化合物を含有する第２使用試薬（“使用試薬２”)は、１２mlの分析バッファーと１０μlの標識化抗体の各々に対するシグナル化合物を混合することにより調製する。１５．１００μlの使用試薬２を分析プレートのウェルの各々に加える。次いでプレートを２００ＲＰＭの台回転器で約１０±０．５分間インキュベートする。１６．次いで分析プレートの各ウェルを洗浄液で５回洗浄して各ウェルに残っている溶液を除去する。１７．使用試薬２と反応して呈色変化を生じるホスファターゼ溶液又は類似の溶液を調製する。ホスファターゼ溶液の場合には、１５mlのホスファターゼ基質溶液をホスファターゼ基質３錠剤と混合する。ペルオキシダーゼ溶液の場合には、６mlのペルオキシダーゼ基質を６mlのペルオキシダーゼ溶液に加える。１８．１００μlのホスファターゼ又はペルオキシダーゼ溶液を各ウェルに加える。次いでプレートを２００ＲＰＭの台回転器で約１０±１分間インキュベートする。１９．次いで１００μlのホスファターゼ又はペルオキシダーゼ停止溶液を各ウェルに加えて呈色変化を停止させる。２０．各ウェルの吸光度を分光光度計を使用して読取り各血液試料中の被検体量を求める。通常吸光度は４５０nm又は４５０／６９０nmで読取る。２１．次いで分析プレートの各ウェルを洗浄液で５回洗浄して各ウェルに残っている溶液を除去する。２２．二重被検体分析法を用いた場合には、段階１７−２０を繰り返して各血液試料中の第２被検体量を求める。通常段階１７で調製した第１溶液と異なるペルオキシダーゼ又は類似の溶液を用いる。前記段階は妊婦の血液中の使用被検体レベルを求めるために血液スポットを分析する好ましい手順を示すものであるが、他の方法を用いてもよい。血液スポットの分析は、実験科学者及びその助手を含むこれらに限定されない当業者の能力の範囲内にあると考えられる。本発明で使用するのに適した慣用の免疫学的手法は、バイオセンサーの使用も含まれる。バイオセンサーは、一般に、電気信号又は他の識別できるリードアウトを発生することができる変換器に連結した抗体のような生物学的検出要素を含む。測定されるべき物質、例えは遊離β（ＨＣＧ）又はその形態の特定量が検出要素と接触すると、反応が起こり変換器がその反応を呈色、蛍光、温度、電流又は他の電気化学信号の変化に変える。乾燥血液又は尿スポットを分析するバイオセンサーは、本発明の範囲内である。本発明の１実施態様においては、次に血液スポットを分析することにより母体血液の遊離β（ＨＣＧ）レベルを測定する。次いで母体血液の遊離β（ＨＣＧ）レベルを基準データセットと比べて患者がダウン症候群をもつ胎児を妊娠している危険率が高いかを求める。検出効率を高めるために、妊娠年齢と母体血液の遊離β（ＨＣＧ）レベルを基準データセットと比べて患者がダウン症候群をもつ胎児を妊娠している危険率が高いかを求める。母体血液の遊離β（ＨＣＧ）レベルを測定する既知の分析法は当業者に明らかなように本発明において機能するが、遊離β（ＨＣＧ）に用いられる分析法は遊離βＨＣＧの基準データを作成するために用いた方法と同一でなければならない。新規な分析法を遊離β（ＨＣＧ）に用いる場合には、この方法で生じたデータに基づいて新規な基準データセットを作成しなければならない。即ち、血液スポットを分析するために用いられる手法は基準データとスクリーンされるべき試料に対して同一でなければならない。一般的には、遊離β（ＨＣＧ）に特異的な抗体を生成するに当たり、ある抗体はタンパク質に特異的でありかつある抗体は炭水化物会合抗原部位に特異的であることも理解される。本発明の説明を通して言及される遊離β（ＨＣＧ）レベルの測定は、タンパク質あるいは炭水化物会合抗原部位又は遊離β（ＨＣＧ）の他の部位に特異的な抗体を用いることが含まれる。更に、（ＨＣＧ）のαサブユニットは単一遺伝子でコードされるが、遊離β （ＨＣＧ）は少なくとも７つの極めて類似した遺伝子又は偽遺伝子の複合系統群でコードされることが当業者によって理解される。例えば、“ヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットは縦列及び逆方向対で配置された少なくとも８つの遺伝子でコードされる”,Boorstein,Vamvakopoules, & Fiddes; Nature Vol 300,2 Dec．1982参照；この教示を参考として本明細書に引用する。７つの遊離β（ＨＣＧ）遺伝子の３つだけが遊離β（ＨＣＧ）の正常な胎盤生産で発現されることが既知である。例えば、“絨毛癌によって産生されたヒト絨毛性ゴナドトロピン βサブユニットの断片化”；Nishimura,lde,Utsunomiya,Kitajima,Yuki，&Mochi zuki;Endocrinology,Vol.123,No.1,1988参照；この教示を参考として本明細書に引用する。これらの３つの同一遺伝子が疾患状態で例えば胎児ダウン症候群の存在で発現されるかは求められなかった。従って、アミノ酸配列に小さな差異又は他の小さな差異のある遊離β（ＨＣＧ）の多重形か合成されることは可能である。更に、ダウン症候群において１つ以上の遊離β（ＨＣＧ）遺伝子が発現され、それにより遊離β（ＨＣＧ）のユニークな変異体（以前にはニックあるいはフラグメント型又は異常型と呼ばれた）が産生される。本発明によれば、これらの変異体は遊離β（ＨＣＧ）を測定する慣用の免疫学的手法で測定される。ダウン症候群と関連する特定の遊離β（ＨＣＧ）変異体を測定するために作られた分析により、更に高い検出効率が得られる。２１−トリソミー罹患及び非罹患妊娠を区別する遊離β（ＨＣＧ）を測定する分析法を効果的に用いた。８３％の高い２１−トリソミー検出効率が達成された。当業者に周知であるように、特定の被検体を定量するために抗体を使用すると、異なるが類似の物質と交差反応性の程度が得られる。従って、罹患及び非罹患症例の区別は、用いられる抗体との交差反応性の程度のために検出される遊離β （ＨＣＧ）の異常型の存在によって影響される。遊離β（ＨＣＧ）の異常型は、新規な生化学物質として示される。実際に、科学文献からの情報に、遊離β（ＨＣＧ）の異常型が認識されたことが示されている（例えば下記Nishimuraら参照）。２１−トリソミー罹患の症例は、また、遊離β（ＨＣＧ）の異常型を特徴とするものであり、その場合当業者はこの症候群に対して更に高い検出効率が得られる異常型に特異的な抗体を開発することができる。また、ダウン症候群罹患の症例も遊離β（ＨＣＧ）を含むアミノ酸の不完全部分を含む遊離β（ＨＣＧ）のフラグメント型（又はフラグメント）を特徴とするものである。当業者に理解されるように、遊離β（ＨＣＧ）を測定するために用いられる分析は、その分析に用いられたエピトープが遊離β（ＨＣＧ）のフラグメントに存在する場合には遊離β（ＨＣＧ）のフラグメントも検出する。遊離β（ＨＣＧ）の１つの異常又はフラグメント型は“ニック”遊離β（ＨＣＧ）と呼ばれる。ニック遊離β（ＨＣＧ）においては、ペプチド結合は遊離β（ＨＣＧ）のアミノ酸間で消失している。ニック遊離β（ＨＣＧ）の既知型においては、ペプチド結合は残基４４と４５の間又は残基４７と４８の間で消失することがある。ニック遊離β（ＨＣＧ）型を測定する手法が開発された。上記で説明したように、これらの手法は、本発明の方法においては母体血液のニック遊離β （ＨＣＧ）レベル又はニック遊離β（ＨＣＧ）と遊離β（ＨＣＧ）の合計血液レベルを測定することにより胎児ダウン症候群をスクリーンするために用いられる。実施例９に示されるように、遊離β（ＨＣＧ）の測定に用いられるある種の免疫分析が“ニック”遊離β（ＨＣＧ）を測定する。本発明の方法は、そのような免疫分析の使用が含まれる。実施例に示されるように、妊婦の血液中遊離β（ＨＣＧ）とニック遊離β（ＨＣＧ）のレベルを測定する免疫分析を使用するダウン症候群のスクリーニングプロトコールは、約８０％の検出効率を有するものである。更に、遊離β（ＨＣＧ）の特定のフラグメントが妊婦の尿に排泄されることが一般に既知である。そのようなフラグメントは一般に“βコアフラグメンド”と呼はれ、完全な遊離β（ＨＣＧ）分子をつくる５５−９２番目のアミノ酸残基にジスルフィド結合した６−４０番目のアミノ酸残基を含む。妊婦の尿中の遊離β （ＨＣＧ）のβコアフラグメントを測定するために設計された分析は、乾燥尿スポットが分析される本発明の方法を使用することができる。基準データは、ダウン症候群をもつ胎児を妊娠している（罹患とも呼はれる）妊婦の母体血液の遊離β（ＨＣＧ）レベル及び／又は正常な胎児を妊娠している（非罹患とも呼はれる）妊婦の母体血液の遊離β（ＨＣＧ）レベルを反映する。当業者に一般に理解されるように、胎児ダウン症候群のスクリーニング方法は比較による決定方法である。決定方法の場合、問題の疾患又は症状を有する患者及び／又は問題の疾患又は症状を有しない患者に基づく基準値を必要とする。本発明においては、基準値はダウン症候群胎児を妊娠している妊婦及び正常な胎児を妊娠している妊婦の双方の母体血液の測定マ-カー、例えは遊離β（ＨＣＧ）レベルである。基準データセットは、多数の試料の基準値を集めることにより設定される。当業者に明らかなように、基準データセットは基準値の数を増やすことにより改善する。患者がダウン症候群をもつ胎児を妊娠している危険率が高いかを決定するために、カットオフを設定しなければならない。患者が１３−トリソミー又は１８− トリソミーをもつ胎児を妊娠している危険率が高いかを決定するために設定されたカットオフが２１−トリソミーの確認症例にも有効であることは当業者に明らかである。このカットオフは、検査室の医師によって又は各患者による場合に基づいて設定される。カットオフレベルは、侵入診断試験に更に進む妊婦数、侵入診断試験に更に進む全妊婦に対するダウン症候群胎児を妊娠している平均危険率、患者の特定の危険率が４００人に１人ようなある危険レベルより大きい妊婦が侵入診断試験に更に進まなければならない決定を含む数種の基準又は当業者に既知の他の基準に基づくことができる。カットオフレベルは、パーセンチル、平均プラス又はマイナス標準偏差；中央値の倍数；患者特定危険率を含む多数の方法又は当業者に既知の他の方法を用いて設定される。胎児ダウン症候群の多数の症例を検出することになる本発明のもう１つの実施態様においては、二重被検体分析を用いて血液スポットの遊離β（ＨＣＧ）とＡＦＰの両方を分析する。これらの被検体の母体血液レベルを測定する既知の分析方法が本発明において機能するが、当業者に明らかなように、各マーカーに用いられた分析方法は個々のマーカーの基準データを作成するために用いられた方法と同一でなければならない。個々のマーカーに新規な分析方法を用いる場合には、その方法で生じたデータに基づく新規な基準データを作成しなければならない。次いで、血液スポット中の遊離β（ＨＣＧ）及びＡＦＰレベルを基準データと比較してダウン症候群をもつ胎児を妊娠している妊婦の危険率を求める。検出効率を更に改善するために、妊娠年齢をこの比較に含める。ダウン症候群をもつ胎児を妊娠している患者特定危険率は、Bayes法則、患者の事前危険率並びに各被検体についての患者の量的レベル（遊離β（ＨＣＧ）及びＡＦＰ）を患者の妊娠年齢と共に多変数判別式分析を用いて基準データに展開した確率密度関数に組込むことにより決定される非罹患及び罹患妊娠の相対頻度を用いて算出されることが好ましい。多変数判別式分析は、市販のコンピュータープログラム統計パッケージ統計分析系(SAS Institute社で製造販売されている )又は多変数統計分析の他の方法又は当業者に既知の他の統計ソフトウェアパッケージで行うことができる。確率密度関数は、各被検体の患者レベルを基準データセットと比較する方法を与える。確率密度関数の１形式を下記に示すが、当業者に明らかなように、他の確率密度関数も同様に行うので本発明においても十分に行うものである。ダウン症候群の危険率の式下つきの文字“ａ”は罹患症例を意味する。下つきの文字“ｕ”は非罹患症例を意味する。（Ｘ−Ｍ）は各因子が各変数レベルマイナス変数平均であるベクトルである。ｃｏｖ^-1はモデルにおける罹患及び非罹患の全変数のプールされた共分散行列の逆数である。（Ｘ−Ｍ）^Tは（Ｘ−Ｍ）ベクトルの移項である。ＥＸＰは指数関数を意味する。｜ＣＯＶ｜は基準データ用モデルにおける全変数の共分散行列の行列式を意味する。当業者に明らかなように、非罹患及び罹患妊娠の個々の共分散行列をプールされた共分散行列に置き換えることができる。そのときのダウン症候群の危険率は下記式になる。判別式分析のために、一般非選択母集団におけるダウン症候群の事前確率に関して推定される。通常、事前確率は８００人にほぼ１人である。多変数判別式分析の場合、危険率カットオフレベルが陽性試験結果を構成するものに関して決定される。例えは、４００人に１人以上ダウン症候群胎児を妊娠している可能性を有する妊婦について更に診断試験を行うことが好ましい場合、判別式分析の結果が４００人に１人以上ダウン症候群胎児を妊娠している可能性を有することを示すとその妊婦は陽性試験結果を有するとみなされる。陽性試験結果を示す場合には、患者は更に診断試験について勧められてダウン症候群の存在を確認しなければならない。当業者に明らかなように、直線的判別式分析法以外の基準パラメーターを計算する他の統計的及び数学的手法も用いることができる。上記で示したように、本発明の好ましい実施態様においては、乾燥母体血液試料を分析して遊離β（ＨＣＧ）及びＡＦＰの母体血液レベルを決定する。次いでダウン症候群をもつ胎児を妊娠している患者特定危険率をBayes法則、患者の事前危険率並びに各マーカーの患者の量的レベルを患者の妊娠年齢と共に多変数判別式分析を用いて基準データに展開した確率密度関数に組込むことにより決定される非罹患及び罹患妊娠の相対頻度を用いて算出する。検出効率を更に高めるために、遊離β（ＨＣＧ）及びＡＦＰの患者の量的レベルの対数が患者の妊娠年齢と共に、多変数判別式分析を用いて基準データに展開した確率密度関数に組込まれる。多変数判別式分析は、市販のコンピュータープログラム統計パッケージ統計分析系(SAS Institute社で製造販売されている)又は当業者に既知の多変数統計分析の他の方法又は他の統計ソフトウェアパッケージで行うことができる。判別式分析のために、一般非選択母集団におけるダウン症候群の事前確率に関して推定される。通常、事前確率は８００人にほぼ１人である。多変数判別式分析の場合、危険カットオフレベルが陽性試験結果を構成するものに関して決定される。例えは、４００人に１人以上ダウン症候群胎児を妊娠している可能性を有する妊婦について更に診断試験を行うことが好ましい場合、判別式分析の結果が４００人に１人以上ダウン症候群胎児を妊娠している可能性を有することを示すとその妊婦は陽性試験結果を有するとみなされる。陽性試験結果を示す場合には、患者は更に診断試験について勧められてダウン症候群の存在を確認しなければならない。当業者に明らかなように、上記で論じた実施態様のいずれにおいても陽性の危険カットオフレベルを変化させるか又は母集団における種々のサブグループにあてはめる事前危険率を異なって用いると、各患者の判別式分析の結果を変えることができる。本発明は、上記で論じた実施態様に限定されずむしろ下記実施例に開示されたマーカーの可能な実施態様及び組合わせのすべてを包含する。実施例１４００以上の患者の試料を用いて母体の血清ＡＦＰ（ＭＳＡＦＰ）、ＵＥ及び無傷ＨＣＧと共に母体血液の遊離β（ＨＣＧ）レベルに対する胎児ダウン症候群の関係を調査した。これらの試料は、ダウン症候群をもつ胎児を妊娠していることが知られる妊婦からの２５母体血液試料及び罹患症例に適合した対照試料が含まれた。本実施例においては、液体血液試料を分析した。各血液試料に対して、ＡＦＰ、無傷ＨＣＧ分子、遊離β（ＨＣＧ）及びＵＥ（以後各々をマーカーと呼ぶ）の量的レベルを次の分析法によって求めた。各マーカーレベルが市販のコンピューターソフトウェア統計パッケージ統計分析系(SAS Institute社)による段階的判別式方法及び直線的判別式方法の変数になって基準データセットを作成した。無傷ＨＣＧ分子及び患者の妊娠年齢に対する遊離β（ＨＣＧ）の比率も変数に組込まれた。段階的判別式方法が、全変数を直線的判別式方法に組込むことができることを決定した。次いで直線的判別式方法を各変数について別個に及び変数の種々の組合わせについて行った。これらの判別式被検体の結果を下記チャートに纏める。感受性は、陽性テスト結果を示す胎児ダウン症候群症例の割合である。偽陽性は、陽性テスト結果を示す正常な胎児の割合である。当業者に明らかなように、陽性の危険カットオフレベルを変化させるか又は母集団における種々のサブグループにあてはめる事前危険率を異なって用いると、各患者の判別式分析の結果が変わる。実施例２５５０以上の患者の試料を用いて母体血液の遊離βＨＣＧレベルに対する胎児ダウン症候群の関係を調査した。最初にダウン症候群をもつ胎児を妊娠していることが知られる妊婦からの２９試料及び妊娠年齢（同週）、母体年齢（３年以内）及び凍結保存期間（１ヵ月以内）に適合した５２０非罹患試料を分析した。すべて単一児の非糖尿病の白人妊婦の試料とした。本実施例においては、分析した試料の各々は液体血液試料とした。スクリーニング効率の評価においてトレーニングセットの偏りを避けるために、確認セットの概念を用いた。確認セットは、基準データセットとは無関係なセットである。確認セットにおける患者の結果は、基準データを決定するのに用いられない。むしろ確認セットにおける患者の結果は、スクリーニング効率を求めるために基準データセットと比較される。この第２の確認セットは、２１−トリソミーの２６追加確認症例（合計５５症例）及び１５９対照試料の無作為に選択されたグループからなるものとした。対照試料は、同様に単一児の非糖尿病の白人妊婦から得られた。全調査は、下記に示される母体血液のマーカーレベルの７種類の分析により４３８８決定からなるものであった。各マーカーレベルが市販のコンピューターソフトウェア統計パッケージ統計分析系(SAS Instltute社)による段階的判別式方法及び直線的判別式方法の変数になって基準データセットを作成した。妊娠年齢も変数として組込まれた。次いで直線的判別式方法を各変数について別個に及び変数の種々の組合わせについて行った。３６５人に１人のダウン症候群危険カットオフに基づいて罹患又は非罹患として患者を分類した。罹患として分類した非罹患症例は偽陽性とみなした。ダウン症候群の各患者の危険率をBayes法則、罹患及び非罹患症例の多変数正常確率密度関数及び８００人に１人の一般事前危険率を用いて計算した。プールされた共分散行列を各確率密度関数に用いた。図１−３に示されているように、表１〜３に見出される結果は、初期の調査セットに関するものである。図５−７、表５−７における結果は、確認セットにおける患者の分類に基づくものである。図４及び図８及び９に示されている表４は、初期調査セット及び罹患全症例に基づくものである。分析手順からの結果を分析して罹患及び非罹患症例との間の各マーカーレベルに有意差があるかを求めた。表１（図１）は、罹患がU.E.を除くすべてに非罹患と著しく異なることを示している。更に、各マーカーの偽陽性率及び検出効率を表２（図２）に示されているように求めた。最高検出効率は、無傷分子及び遊離 β（ＨＣＧ）双方を測定するＨＣＧ分析を用いて得られた。個々のマーカーを複合マーカーに組合わせることにより、検出効率を更に高めることが認められた。無傷ＨＣＧ分子及び遊離β（ＨＣＧ）の双方を測定するＨＣＧ分析を含む複合マーカーは、表３（図３）に示されるように複合マーカーの中で最も高い検出効率を生じた。ＨＣＧのβ及びαサブユニットの評価は、αサブユニットの場合罹患と非罹患症例との間に有意差はなく(ｐ０．２３)、罹患において遊離β（ＨＣＧ）の顕著な増加が認められた(ｐ＝０．００１)ことを個々に示した。当該技術において一般に知られるように、ｐは少なくとも認められるほど極端な結果が偶然に生じる確率を示すことにより科学調査の証拠力を測定する。ｐ値が低いほど観察が偶然に生じない証拠が強い。図８は、妊娠年齢による１０番目、５０番目及び９０番目の遊離β（ＨＣＧ）のパーセンチルを示すものである。非罹患妊娠において妊娠年齢による連続下向傾向が認められる。表４（図４）に示されているように、胎児ダウン症候群の症例において遊離β（ＨＣＧ）レベルの分析により、非罹患の中央値以上ては８６％に下がることがわかる。罹患及び非罹患症例における遊離β（ＨＣＧ）レベルは、対数ガウス分布に一致する（ｐ＝0.78及び0.86）。図９は、これらの分布を示すものである。表５（図５）は、遊離β（ＨＣＧ）及び遊離α（ＨＣＧ）について個々に検出効率を示すものである。遊離β（ＨＣＧ）の高検出効率は表５に示されている。更に高い検出効率は、ＡＦＰと遊離β（ＨＣＧ）の複合で得られた。遊離β（ＨＣＧ）レベルの対数とＭＳＡＦレベルの対数を上記に記載されるように市販のコンピューターソフトウェア統計パッケージによる直線的判別式方法に組込むことにより、表６（図６）に示されるように優れた検出効率が得られた。各対数とは反対に、遊離β（ＨＣＧ）レベルとＡＦＰレベルを用いても高検出効率が得られた。更にデータの分析により、ＡＦＰ及び遊離β（ＨＣＧ）の双方がＡＦＰと遊離 β（ＨＣＧ）の各々について４種類の母体年齢グループ（年齢＝３０、３１−３５、３６−４０及び４０）前後のKruskal-Wallisテストを用いて母体年齢（ｐ＝０.８３９４及び０.５２１４)と無関係であることが認められた。更に、遊離β （ＨＣＧ）とＡＦＰのレベルの相関（ｒ）が０と著しく異なった（非罹患及び罹患症例についてｒ＝０.０４、ｐ＝０.３９及びｒ＝−０.０６、ｐ＝０.８１）。我々のデータに見出される基本的な観察により、遊離β（ＨＣＧ）かダウン症候群に対して最高検出効率を与えるという事実が確認される。事実、遊離β（ＨＣＧ）単独で測定する分析を用いると、検出効率及び偽陽性率各々65.4％及び5. 2％を生じた。これらの割合は、３種類の分析の組合わせを用いる他のものによって報告されたものに匹敵する。即ち、前述のように、分析数を減少させることが本発明の利点である。遊離β（ＨＣＧ）の寄与による我々の知見は次のことに基づいている：（ａ）ダウン症候群の検出効率に対して最良の単一寄与は遊離β（ＨＣＧ）に対する分析であった、（ｂ）無傷ＨＣＧ分子の分析は実質的に低検出率を生じる、（ｃ）無傷ＨＣＧ分子と遊離β（ＨＣＧ）の組合わせを測定する分析は、無傷のＨＣＧ分子単独で測定する分析より高い検出効率を生じる。胎児ダウン症候群が母体年齢とともに増加することが確かめられる。従って、上記のように、本発明の臨床用患者特定危険率を与えるために、母体年齢事前危険率が多変数判別式分析方法に組込まれる。ＡＦＰと遊離β（ＨＣＧ）両レベルが母体年齢と無関係であるので、非罹患及び罹患妊婦が各個々の年齢の事前危険率を示す陽性結果を有する方法を知るために我々のデータを分析した。上記情報を用いて、米国の生存出産の母体年齢分布に基づいて米国内の広範な全国的スクリーニングの偽陽性及び感受性率を計画した。表７（図７）に示されるように、その計画により偽陽性５％を含む検出率８０％を得ることが可能であることが示される。実施例２に記載される試料を更に分析してマーカーの他の組合わせの検出効率を発見した。更に詳細には、同一危険カットオフ及び事前危険率レベルによる実施例２の直線的判別式方法を、マーカーの種々の組合わせ、マーカーの中央値（ＭＯＭ）の倍数及びマーカーの対数により妊娠年齢を組込んで又は組込まずに行った。直線的判別式方法は、基準データと確認データの双方を用いて行った。結果を図１０の表８に纏める。実施例３下記実施例は、１段階遊離β（ＨＣＧ）分析及び２段階遊離β（ＨＣＧ）分析の調製を示すものである。１段階遊離β（ＨＣＧ）分析の調製１．９６ウェルマイクロタイタープレートを遊離βヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）分子に特異的なキャッチング抗体で被覆する。この抗体はモノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。プレートを被覆するために用いられる抗体濃度は、１ウェルにつき０.８μgであるが場合によっては異なってよい。プレートは４℃で少なくとも１６時間インキュベートする。２．プレー卜を0.05％トゥイーン２０を含有するｐＨ7.2のリン酸塩緩衝食塩溶液で洗浄する。他の適切な洗浄バッファーを用いてもよい。次いでｐＨ7.2のリン酸塩緩衝食塩溶液中３％加水分解動物タンパク質及び０.０５％トゥイーン２０を含有する溶液でプレートを阻止する。当業者に良く知られるような他の溶液、例えば１％ウシ血清アルブミン溶液を用いてもよい。３００μlの阻止溶液を各ウェルに加え、プレートを室温で１時間インキュベートする。他の阻止手順は生存可能な、例えばグレージングである。３．次いでプレートを前述のように洗浄し、遊離β（ＨＣＧ）に特異的なビオチニル化抗体を含有する１００μlの分析バッファーを各ウェルに加える。使用分析バッファーはｐＨ7.2のリン酸塩緩衝食塩溶液中３％加水分解動物タンパク質及び0.05％トゥイーン２０であるが、当業者に既知の多数の適切な溶液のいずれであっもよい。抗体はモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であっもよく、技術者の好みによって、ホースラディッシュペルオキシダーゼ又はアルカリ性ホスファターゼのようなビオチン以外の物質に結合させてもよい。抗体の分析バッファー中の濃度は、最適吸光度値を得るように調整される。４．次いで２０μlの試料を各ウェルに加える。試料は、分析の性能を実証するためにブランクとして行われる分析バッファー；未知試料値を標定するために用いられる遊離β（ＨＣＧ）溶液；又は中期の３ヵ月間の妊婦からの血清試料とする。プレートを３０秒間回転させ、次いで２００ｒｐｍの回転器に置き、室温で３０分間インキュベートする。５．次いでプレートを前述のように洗浄する。次いでホースラディッシュペルオキシダーゼに結合したストレプトアビジンを含有する１００μlの分析バッファーを各ウェルに加える。使用第２抗体がビオチン以外の物質に結合される場合にはこの工程は必要としない。ストレプトアビジンーペルオキシダーゼの分析バッファー中の濃度は、１ml当たり２.０μgである。プレートを室温で５分間２００ｒｐｍの回転器に置く。６．次いでプレートを前述のように洗浄する。１００μlのｏ−フェニレンジアミン基質を各ウェルに加える。この基質溶液もまた当業者に既知の多くの適切な色素のいずれかであってもよく、第２抗体に結合される物質に左右される。プレートを２００ｒｐｍの回転器に置き、室温で８分間暗所でインキュベートする。７．次いで１００μlの希釈(l.ON)硫酸を各ウェルに加えて基質の反応を停止させる。８．各ウェルの４９２nmの吸光度を分光光度法で求める。２段階β（ＨＣＧ）分析の調製１．９６ウェルマイクロタイタープレートを遊離β（ＨＣＧ）分子に特異的なキャッチング抗体で被覆する。抗体はモノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。プレートを被覆するために用いられる抗体濃度は、１ウェルにつき０.８μgであるが場合によっては異なってよい。プレートは４℃で少なくとも１６時間インキュベートする。２．プレートを０.０５％トゥイーン２０を含有するｐＨ7.2のリン酸塩緩衝食塩溶液で洗浄する。他の適切な洗浄バッファーを用いてもよい。次いでｐＨ7.2のリン酸塩緩衝食塩溶液中３％加水分解動物タンパク質及び０．０５％トゥイーン２０を含有する溶液でプレー卜を阻止する。当業者に良く知られるような他の溶液、例えば１％ウシ血清アルブミン溶液を用いてもよい。３００μlの阻止溶液を各ウェルに加え、プレートを室温で１時間インキュベートする。他の阻止手順、例えばグレージングも用いられる。３．次いでプレートを前述のように洗浄し、１００μlの分析バッファーを各ウェルに加える。使用分析バッファーはｐＨ7.2のリン酸塩緩衝食塩溶液中３％加水分解動物タンパク質及び０.０５％トゥイーン２０であるが、当業者に既知の多数の適切な溶液のいずれであっもよい。４．次いで２０μlの試料を各ウェルに加える。試料は、分析の性能を実証するためにブランクとして行われる分析バッファー；未知試料値を標定するために用いられる遊離β（ＨＣＧ）溶液；又は中期の３ヵ月間の妊婦からの血清試料とする。プレートを３０秒間回転させ、次いで２００ｒｐｍの回転器に置き、室温で３０分間インキュベートする。５．次いでプレートを前述のように洗浄し、遊離β（ＨＣＧ）に特異的な１０μ lの分析バッファーを各ウェルに加える。抗体はモノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよく、技術者の好みによってビオチン以外の物質、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ又はアルカリ性ホスファターゼに結合される。抗体の濃度は、最適吸光度値を得るように調整される。プレートを３０秒間回転させ、次いで２００ｒｐｍの回転器に置き、室温で３０分間インキュベートする。６．次いでプレートを前述のように洗浄する。次いでホースラディッシュペルオキシダーゼに結合したストレプトアビジンを含有する１００μlの分析バッファーを各ウェルに加える。使用第２抗体がビオチン以外の物質に結合される場合にはこの工程は必要としない。ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼの分析バッファー中の濃度は、１ml当たり２.０μgである。プレートを室温で５分間２００ｒｐｍの回転器に置く。７．次いでプレートを前述のように洗浄する。１００μlのｏ−フェニレンジアミン溶液を各ウェルに加える。この基質溶液もまた当業者に既知の多くの適切な色素のいずれかであってもよく、第２抗体に結合される物質に左右される。プレートを２００ｒｐｍの回転器に置き、室温で８分間暗所でインキュベートする。８．次いで１００μlの希釈（1.ON）硫酸を各ウェルに加えて基質の反応を停止させる。９．各ウェルの４９２nmの吸光度を分光光度法で求める。本発明の方法を行うに当たりこれらの２種の分析を用いた。１７８の患者の液体血液試料を用いて遊離βＨＣＧの母体血液レベルに対する胎児ダウン症候群の関係を調査した。ダウン症候群をもつ胎児を妊娠していることが知られる妊婦からの２６試料及び１５２の未知の非罹患試料を分析した。全試料は単一児の非糖尿病の白人妊婦からのものとした。次いで患者の試料を、ＥＬＩＳＡ検定法によりＭＳＡＦＰの量的レベル及び１段階分析及び２段階分析単独による遊離β（ＨＣＧ）レベルについて分析した。次いで各分析によるＭＳＡＦＰレベル及び遊離β（ＨＣＧ）レベルが市販のコンピューターソフトウェア統計パッケージ分析系による直線的判別式方法における変数になって基準データセットを作成した。患者の妊娠年齢も判別式方法の変数として組込んだ。全妊娠年齢及び１４〜１６週の妊娠年齢の場合のこれらの判別式分析の結果を下記に纏める。添字−１は１段階手順を意味し、−２は２段階手順を意味する。検出効率は、陽性テスト結果を示す胎児ダウン症候群の症例の％を意味する。偽陽性は、陽性テスト結果を示す正常な胎児の％を意味する。対照は、分析された非罹患試料数を意味する。罹患は、分析された罹患試料数を意味する。遊離β（ＨＣＧ）及びＡＦＰの１段階分析の組合わせを用いると、最高検出効率を生じ、妊娠の全週及び妊娠の１４−１６週の場合偽陽性が最も低い。我々の知見は、（ａ）非侵人手法、（ｂ）偽陽性率の低い高検出効率、（ｃ）相互にほとんど無関係なマーカーの使用、（ｄ）血液試料採取において扱いにくい制限の無いこと（時刻、食事、性格、習慣等）及び（ｅ）他の出生前スクリーニングサービスとの適合性を含む出生前血清スクリーニングプロトコールの範囲内の実行可能でかつ効果的な方法におけるダウン症候群スクリーニングの性能を支持する。実施例４本実施例は、妊娠初期の３ヵ月でダウン症候群をスクリーンするに当たり本発明の方法を使用することを示すものである。１５０人の患者からの母体血清試料を用いた。各患者は、試料を採取するときに妊娠年齢９〜１３週の胎児を妊娠していた。１３９人の患者は“対照”と呼ばれるダウン症候群をもたない胎児を妊娠しており、１１人の患者はダウン症候群をもつ胎児を妊娠していた。患者の各々は、単一児妊娠の非糖尿病の白人妊婦とした。１５０の母体血清試料の各々における遊離βレベルを、実施例３に記載される２段階遊離β（ＨＣＧ）分析を用いて分析した。この分析結果を図１１に図示する。図１５に示されるように、ダウン症候群をもつ胎児を妊娠している患者の母体血清中遊離βの中央値レベルは、対照の母体血清における遊離βの中央値レベルより大きい２.４５ＭＯＭ（中央値の倍数）であった。ダウン症候群をもつ胎児を妊娠している患者のこの遊離β（ＨＣＧ）レベルは、対照における遊離β（ＨＣＧ）レベルより著しく大きい。即ち、遊離βタンパク質は、ダウン症候群が存在すると初期の３ヵ月で著しく上昇する。実施例５本実施例は、更に、妊娠初期の３ヵ月でダウン症候群をスクリーンするに当たり本発明の方法を使用することを示すものである。２７７人の患者からの母体血清試料を用いた。各患者は、試料を採取するときに妊娠年齢７〜１３週の胎児を妊娠していた。２６４人の患者は“対照”と呼ばれるダウン症候群をもたない胎児を妊娠しており、１３人の患者はダウン症候群をもつ胎児を妊娠していた。患者の各々は、単一児妊娠の非糖尿病の白人妊婦とした。２７７人の母体血清試料の各々における遊離βレベルを、実施例３に記載される２段階遊離β（ＨＣＧ）分析を用いて分析した。この分析結果を図１２に図示する。図１６に示されるように、ダウン症候群をもつ胎児を妊娠している患者の母体血清中遊離βの中央値レベルは、対照の母体血清における遊離βの中央値レベルより大きい１.８２ＭＯＭ（中央値の倍数）であった。ダウン症候群をもつ胎児を妊娠している患者のこの遊離β（ＨＣＧ）レベルは、対照における遊離β （ＨＣＧ）レベルより著しく大きい。即ち、遊離βタンパク質は、ダウン症候群が存在すると最初の３ヵ月で著しく上昇する。実施例６本実施例は、更に、妊娠初期の３ヵ月でダウン症候群をスクリーンするに当たり本発明の方法を使用することを示すものである。絨毛穿刺（ＣＶＳ）法を行うために選択された３９２人の患者から母体血清試料を採取した。ＣＶＳ法は、絨毛試料が染色体分析核型に得られる臨床手法である。本実施例に用いられる血清試料は、ＣＶＳ法を行う患者に先立って患者から採取された。通常、この手法はダウン症候群をもつ胎児を妊娠している発生頻度の高いことが知られるグループである３５才以上の患者に用いられるか又は染色体異常の家族歴を有する患者に用いられる。各患者は、試料を採取するときに妊娠年齢９〜１３週の胎児を妊娠していた。３８６人の患者は“対照”と呼ばれるダウン症候群をもたない胎児を妊娠しており、６人の患者はダウン症候群をもつ胎児を妊娠していた。患者の各々は、単一児妊娠の非糖尿病の白人妊婦とした。３９２の母体血清試料の各々における遊離βレベルを、実施例３に記載される２段階遊離β（ＨＣＧ）分析を用いて分析した。この分析結果を図１３に図示する。図１７に示されるように、ダウン症候群をもつ胎児を妊娠している患者の母体血清中遊離βの中央値レベルは、対照の母体血清における遊離βの中央値レベルより大きい２.９４ＭＯＭ（中央値の倍数）であった。ダウン症候群をもつ胎児を妊娠している患者のこの遊離β（ＨＣＧ）レベルは、対照における遊離β（ＨＣＧ）レベルより著しく大きい。即ち、遊離βタンパク質は、ダウン症候群が存在すると最初の３ヵ月で著しく上昇する。これらの実施例は、更に、本明細書で記載されるように本発明の方法が妊娠初期又は中期の３ヵ月でダウン症候群を非侵入的に用いられることを示すものである。本明細書で用いられる妊娠初期の３ヵ月は、妊娠年齢１４週前の期間を意味する。同様に、妊娠中期の３ヵ月は妊娠年齢１４から２６週の期間を意味する。例えば、検査室は、妊娠初期の３ヵ月で得られた母体血清試料中の遊離β（ＨＣＧ）レベルを含有する妊娠週特定基準データセットを作成することができる。この基準データは、実施例で述べた方法に匹敵する方法で作成することができる。胎児ダウン症候群をスクリーンするために、検査室は妊娠初期の３ヵ月で患者から得られた血液試料中の遊離β（ＨＣＧ）レベルを測定し基準データと比較して患者がそれ以後のテストを正しいとするダウン症候群をもつ胎児を妊娠している十分危険な状態にあるかを決定する。本明細書で述べたように、検査室によるこの決定には、ダウン症候群をもつ胎児を妊娠している患者の事後（スクリーニング後）危険率を染色体分析用胎児細胞を得る侵入法の患者と胎児に対して危険率を反映する設定カットオフレベルと比較することが必要である。検査室は、陽性スクリーニング結果を求めるために中央値に近い倍数を用いることを決定することができる。例えば、基準データセットとして実施例４に示されるデータを用いると、基準データは遊離β（ＨＣＧ）の中央値レベルが非罹患胎児を妊娠している妊婦よりダウン症候群胎児を妊娠している妊婦が２.４５倍大きいことを示す。スクリーニングに中央値倍数法を用いると、患者の試料中の遊離β（ＨＣＧ）レベルが対照における遊離β（ＨＣＧ）レベルより中央値が２ .５倍大きいなど選択されたカットオフレベルより大きい場合には、検査室は胎児がダウン症候群をもつかを診断する侵入テストを妊婦が更に受けることを勧める。単一被検体用中央値倍数法によるこのスクリーニング法が実施例１に記載されるような複数の被検体を用いるスクリーニング法及び多変数判別式分析法ほど正確でないことは留意されなければならない。実施例７本実施例は、４℃及び室温（約２０℃）で５日間保存した液体及び乾燥血液試料中の測定遊離β（ＨＣＧ）レベルを比較する。液体血液試料を妊婦から得、本明細書に記載される分析法によって遊離β（ＨＣＧ）レベルを測定した。各液体試料からの６部分を２枚の標本カードの各々にスポットした。残りの液体血液試料を２部分に分けた。各液体血液試料からの１枚の標本カードと残りの液体血液試料の２部分の１つを冷蔵庫に４℃で保存した。もう１枚の標本カードと残りの液体血液試料の他の部分を室温で保存した。翌５日間毎日ほぼ同じ時間に、各標本カードと残りの液体試料の両方の部分からの血液試料の遊離β（ＨＣＧ）含量を分析した。分析法に帰せられる誤差を少なくするために、分析前に液体試料を標本カードにスポットした。乾燥血液スポットの分析を本明細書に記載される方法で行った。結果は図１７及び１８に図示されている。これらの図に示されているように、室温で保存した乾燥血液試料中の測定遊離β（ＨＣＧ）レベルは、室温で保存した液体試料中の測定遊離β（ＨＣＧ）レベルより一定に保たれた。実施例８本実施例は、乾燥血液スポットを用いるスクリーニング法と液体血液を用いるスクリーニング法を比較するものである。各場合に用いられるスクリーニング法は、本明細書に記載される方法、即ち母体血液の遊離β（ＨＣＧ）とＡＦＰレベルと妊娠年齢を基準データと比較する方法とした。本実施例においては、乾燥血液スポット実験プロトコールで協力する選ばれた医師の診療室が乾燥血液スポットとして本発明者の検査室に母体血液試料を送った。これらの乾燥血液試料を本明細書に記載されるように評価して、ダウン症候群をもつ胎児を妊娠している危険率の高い妊婦を決定した。乾燥血液スポット試料を用いる結果を血液試料を液体として採取する妊婦の同様の母集団と比較し、本明細書の実施例３に記載されるように評価した。結果は次の通りであった。これは、妊婦の同様の母集団の場合、乾燥血液スポットの分析に基づいてダウン症候群をもつ胎児を妊娠している危険率が高いと示された妊婦の数が液体血液試料の分析と比較して顕著に減少したことを示すものである。実施例９本実施例は、遊離β（ＨＣＧ）の測定に用いられた特定の免疫分析が“ニック ”遊離β（ＨＣＧ）も測定することを示すものである。ニック遊離β（ＨＣＧ）を次のように調製した。脱イオン水で希釈したScripp s Laboratories, LaHoyaカリフォルニアで製造販売されている１００μlの２１２μg／mlｈＣＧβサブユニット（ScrippsカタログNo C0904）をSigmaChemical 社，セントルイス，ミズーリで製造販売されている１リットル当たり0.5M ＮａＣｌ及び１gＢｒｉｊを含有する0.1Mトリス−ＨＣｌ，ｐＨ8.5に調製された１００μl のｈＬＥ（0.3単位）(ｈＬＥ＝白血球エラスターゼ）に加えた。この混合液を３７℃でインキュベートした。この混合液から０、６０、１２０及び１８０分で試料を採取した。各試料に１０μlの１０mg／mlダイズトリプシンインヒビターを加えてβＨＣＧとｈＬＥとの間の反応を停止し、そのことにより更にニック遊離β（ＨＣＧ）の形成を停止した。４試料、遊離β（ＨＣＧ）の１試料（０分試料）及びニック遊離β（ＨＣＧ）を含む３試料（６０、１２０及び１８０分試料）を次のように分析した。安定剤と防腐剤を含有するＰＢＳ（リン酸塩バッファー食塩溶液）ｐＨ7.2を用いて段階方式で最初の試料を半分だけ希釈することにより、更に７濃度の各試料を調製した。即ち、８濃度の各試料、１００％、５０％、２５％、１２.５％、６.２５％、３.１２５％、１.５６２５％、０.７８１２５％(％＝最初の試料％)を調製した。８濃度の各試料（０、６０、１２０及び１８０分）を、２種類のキャッチング／検出抗体対による実施例３に記載された２段階遊離β（ＨＣＧ）分析を用いて２回分析した。各分析において、ｈＬＥと６０、１２０及び１８０分間インキュベートした試料中の測定遊離β（ＨＣＧ）レベルに０分間インキュベート試料中の測定遊離β （ＨＣＧ）レベルと比べてわずかな上昇が生じた。試験した８濃度の０分試料に対して１８０分試料の場合、各分析の平均％変化は各々１０２.１％（９６.２〜１０７.６％の範囲）及び１１２.４％(１０６.３〜１２１.７％の範囲)であった。第１抗体対においては、試料中のニック遊離β（ＨＣＧ）増加％の認識は遊離 β（ＨＣＧ）に対する免疫反応性の程度を顕著に変えなかった。第２抗体対は、第１抗体対よりニック遊離β（ＨＣＧ）に親和性であった。第２抗体対の場合には、変化の程度は０分から６０分まで（１１０.５％）及び０分から１２０分まで(１１５.１％)の期間にわたって増大した。１８０分の変化％は、１２０分の変化％に対して増大しなかった。第２抗体対の平均％変化は１１２.７％であった。即ち、第１抗体対は遊離β（ＨＣＧ）及びニック遊離β（ＨＣＧ）と同様に反応し、第２抗体対は第１抗体対よりニック遊離β（ＨＣＧ）と反応する(＋１２％)。これらの結果は、ダウン症候群のスクリーニングプロトコールにおいてニック遊離β（ＨＣＧ）及び遊離β（ＨＣＧ）の双方を測定する分析の使用を支持するものである。本発明の方法においてそのような分析の使用は、約８０％の検出効率を与えることを予想しなければならない。我々の結果は、ダウン症候群スクリーニングの高い検出率を達成するが他のものによって提案されたより生化学的分析をほどんど行わないことが可能であることを示すものである。ダウン症候群スクリーニングにおいて非常に有効なマーカーの使用は、重度知能障害の最も一般的な原因によって罹患した家族の最も高い割合に対して出産前の早期に非侵入スクリーニング情報を与えるために役立つことができる。当業者に明らかなように、陽性の危険カットオフレベルを変えるか又は母集団の種々のサブグループにあてはめる事前危険率を異なって用いると、患者の判別式方法の結果が変わる。従って、本発明が次の請求の範囲内に入る変更をすべて包含することは明らかに理解されなければならない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．ダウン症候群をもつ胎児を妊娠している妊婦の危険率を求めるスクリーニング法であって、妊娠初期の３ヵ月、妊娠中期の３ヵ月及び妊娠後期の３ヵ月からなる群より選ばれた期間に妊婦の血液試料をろ紙上に取り、その血液試料を乾燥して乾燥血液スポットを形成し；乾燥血液スポットから該妊婦の母体血液の遊離β（ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ））レベルを決定し、該遊離β（ＨＣＧ）レベルを（１）ダウン症候群をもつ胎児を妊娠している妊婦及び（２）正常な胎児を妊娠している妊婦におけるその期間の遊離β（ＨＣＧ）レベルの基準値と比較し、該比較が該妊婦のダウン症候群をもつ胎児を妊娠している危険率を示す、ここで高い遊離β（ＨＣＧ）レベルはダウン症候群をもつ胎児を妊娠している確率の高いことを示す；ことを特徴とする方法。２．更に乾燥血液スポットから妊婦の母体血液のα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）レベルを決定し、妊婦の血液のＡＦＰレベルと（１）ダウン症候群をもつ胎児を妊娠している妊婦及び（２）正常な胎児を妊娠している妊婦におけるその期間のＡＦＰレベルの基準値を、低いＡＦＰレベルが危険率の高い確率を示す該比較に組込むことを特徴とする請求項１記載の方法。３．妊婦がダウン症候群をもつ胎児を妊娠している妊婦の危険率を求める方法であって、妊娠初期の３ヵ月、妊娠中期の３ヵ月及び妊娠後期の３ヵ月からなる群より選ばれた期間に妊婦の血液試料をろ紙上に取り、その血液試料を乾燥して乾燥血液スポットを形成し；乾燥血液スポットから該妊婦の母体血液の遊離β（ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ））のタンパク質部分；遊離β（ＨＣＧ）の炭水化物部分；及び炭水化物とタンパク質部分の結合近くに位置する遊離β（ＨＣＧ）部分からなる群より選ばれた被検体レベルを決定し、被検体レベルを（１）ダウン症候群をもつ胎児を妊娠している妊婦及び（２）正常な胎児を妊娠している妊婦におけるその期間の被検体レベルの基準値を含む基準データと比較し、該比較が該妊婦の危険率を示す、ここで高い被検体レベルはダウン症候群をもつ胎児を妊娠している確率の高いことを示す；ことを特徴とする方法。４．更に乾燥血液スポットから妊婦の母体血液のα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）レベルを決定し、妊婦の血液のＡＦＰレベルと（１）ダウン症候群をもつ胎児を妊娠している妊婦及び（２）正常な胎児を妊娠している妊婦におけるその期間のＡＦＰレベルの基準値を、低いＡＦＰレベルが危険率の高い確率を示す該比較に組込むことを特徴とする請求項３記載の方法。５．ダウン症候群をもつ胎児を妊娠している妊婦の危険率がそれ以後のテストを正しいとするかを決定する方法であって、妊娠初期の３ヵ月、妊娠中期の３ヵ月及び妊娠後期の３ヵ月からなる群より選ばれた期間に妊婦の血液試料をろ紙上に取り、その血液試料を乾燥して乾燥血液スポットを形成し；乾燥血液スポットから遊離β（ＨＣＧ）に対して生じた抗体を使用する分析を用いて該妊婦の母体血液の被検体レベルを決定し、被検体レベルを（１）ダウン症候群をもつ胎児を妊娠している妊婦及び（２）正常な胎児を妊娠している妊婦におけるその期間の被検体レベルの基準値を含む基準データセットと比較し、該比較が染色体トリソミーをもつ胎児を妊娠している危険率を示す、ここで高い被検体レベルはダウン症候群をもつ胎児を妊娠している確率の高いことを示す；ことを特徴とする方法。６．ダウン症候群をもつ胎児を妊娠している妊婦の危険率がそれ以後のテストを正しいとするかを決定する方法であって、妊娠初期の３ヵ月、妊娠中期の３ヵ月及び妊娠後期の３ヵ月からなる群より選ばれた期間に妊婦の血液試料をろ紙上に取り、その血液試料を乾燥して乾燥血液スポットを形成し；乾燥血液スポットから遊離β（ＨＣＧ）の分析を用いて該妊婦の母体血液の被検体レベルを決定し、該被検体レベルを（１）ダウン症候群をもつ胎児を妊娠している妊婦及び（２）正常な胎児を妊娠している妊婦におけるその期間の被検体レベルの基準値セットと比較し、該比較が染色体トリソミーをもつ胎児を妊娠している危険率を示す、ここで高い被検体レベルはダウン症候群をもつ胎児を妊娠している確率の高いことを示す；ことを特徴とする方法。７．遊離β（ＨＣＧ）が遊離β（ＨＣＧ）の異常型である請求項１記載の方法。８．遊離β（ＨＣＧ）が遊離β（ＨＣＧ）の異常型である請求項２記載の方法。９．妊婦がダウン症候群をもつ胎児を妊娠している危険率を求める方法であって、妊娠初期の３ヵ月、妊娠中期の３ヵ月及び妊娠後期の３ヵ月からなる群より選はれた期間に妊婦の血液試料をろ紙上に取り、その血液試料を乾燥して乾燥血液スポットを形成し；乾燥血液スポットから該妊婦の母体血液の遊離β（ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ））のフラグメントレベルを決定し、該遊離β（ＨＣＧ）のフラグメントレベルの測定値を（１）ダウン症候群をもつ胎児を妊娠している妊婦及び（２）正常な胎児を妊娠している妊婦におけるその期間の遊離β（ＨＣＧ）のフラグメントレベルの基準値を含む基準データと比較し、該比較が妊婦の危険率を示す、ここで高い遊離β（ＨＣＧ）のフラグメントレベルはダウン症候群をもつ胎児を妊娠している確率の高いことを示す；ことを特徴とする方法。 10．１８−トリソミーをもつ胎児を妊娠している妊婦の危険率を求めるスクリーニング法であって、妊娠初期の３ヵ月、妊娠中期の３ヵ月及び妊娠後期の３ヵ月からなる群より選ばれた期間に妊婦の血液試料をろ紙上に取り、その血液試料を乾燥して乾燥血液スポットを形成し；乾燥血液スポットから該妊婦の母体血液の遊離β（ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ））レベルを決定し、該遊離β（ＨＣＧ）レベルを（１）１８−トリソミーをもつ胎児を妊娠している妊婦及び（２）正常な胎児を妊娠している妊婦におけるその期間の遊離β（ＨＣＧ）レベルの基準値と比較し、該比較が妊婦の１８ −トリソミーをもつ胎児を妊娠している危険率を示す、ここで低い遊離β（ＨＣＧ）レベルはダウン症候群をもつ胎児を妊娠している確率の高いことを示す；ことを特徴とする方法。 11．染色体異常をもつ胎児を妊娠している妊婦の危険率を求めるスクリーニング法であって、妊娠初期の３ヵ月、妊娠中期の３ヵ月及び妊娠後期の３ヵ月からなる群より選ばれた期間に妊婦の血液試料をろ紙上に取り、その血液試料を乾燥して乾燥血液スポットを形成し；乾燥血液スポットから該妊婦の母体血液の遊離β（ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ））レベルを決定し、該遊離β（ＨＣＧ）レベルを（１）染色体異常をもつ胎児を妊娠している妊婦及び（２）正常な胎児を妊娠している妊婦におけるその期間の遊離β（ＨＣＧ）レベルの基準値と比較し、該比較が妊婦の染色体異常をもつ胎児を妊娠している危険率を示す；ことを特徴とする方法。 12．遊離β（ＨＣＧ）が遊離β（ＨＣＧ）の異常型である請求項２記載の方法。 13．遊離β（ＨＣＧ）の異常型がニック遊離β（ＨＣＧ）である請求項14記載の方法。 14．ダウン症候群をもつ胎児を妊娠している妊婦の危険率を求めるスクリーニング法であって、妊娠初期の３ヵ月、妊娠中期の３ヵ月及び妊娠後期の３ヵ月からなる群より選ばれた期間に妊婦の尿試料をろ紙上に取り、その尿試料を乾燥して乾燥尿スポットを形成し；乾燥尿スポットから該妊婦の尿の遊離β（ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ））のβコアフラグメントレベルを決定し、該遊離β（ＨＣＧ）レベルを（１）染色体異常をもつ胎児を妊娠している妊婦及び（２）正常な胎児を妊娠している妊婦におけるその期間の遊離β（ＨＣＧ）のβコアフラグメントレベルの基準値と比較し、該比較が該妊婦のダウン症候群をもつ胎児を妊娠している危険率を示す；ことを特徴とする方法。