KR0171451B1 - 비관혈적인 임산부 혈액 검색에 의해 다운 증후군을 검출하는 방법 및 장치 - Google Patents

비관혈적인 임산부 혈액 검색에 의해 다운 증후군을 검출하는 방법 및 장치

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KR0171451B1
KR0171451B1 KR1019950700505A KR19950700505A KR0171451B1 KR 0171451 B1 KR0171451 B1 KR 0171451B1 KR 1019950700505 A KR1019950700505 A KR 1019950700505A KR 19950700505 A KR19950700505 A KR 19950700505A KR 0171451 B1 KR0171451 B1 KR 0171451B1
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제임스 엔. 맥크리
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맥크리 제임스 엔
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Abstract

본 발명은 임산부에게서 채혈한 혈액 샘플을 분석하므로써 산전 검색중에 태아 다운 증후군(Trisomy 21), 삼염색체성 13, 삼염색체성 18 및 다른 염색체 이상을 검출하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 임산부에게서 채혈한 혈액 샘플중에 존재하는 유리 베타 인융모성 성선자극 호르몬(HCG) 및 유리 베타(HCG)의 틈이 있는 형태 또는 단편화된 형태 또는 변이 형태(모두 본원을 통해 유리 베타(HCG)로서 표기됨)의 양을 측정하므로써 상기 염색체 이상을 검색하는데 있어서의 검출 효율을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

Description

[발명의 명칭]
비관혈적인 임산부 혈액 검색에 의해 다운 증후군을 검출하는 방법 및 장치
[발명의 상세한 설명]
본 출원은 1992년 4월 14일자 출원된 출원 일련 번호 07/868,160호의 CIP이며, 07/868,160호는 1989년 10월 12일자로 출원된 출원 일련번호 07/420,775호의 CIP 출원이며, 07/420,775호는 1989년 6월 1일 출원되었으나 현재 포기된 출원 07/360,603호의 CIP이며, 07/360,603호는 1989년 5월 8일 출원되었으나, 현재 포기된 출원 일련 번호 07/349,373호의 CIP이며, 07/349/373호는 1989년 2월 17일 출원되었으나, 현재 포기된 출원 일련 번호 07/311,808호의 CIP이며, 07/311,808호는 1989년 1월 17일 출원되었으나, 현재 포기된 출원 일련 번호 07/297,481호의 CIP 출원이다.
[발명의 분야]
본 발명은 태아 다운 증후군(삼염색체성 21), 삼염색체성 13, 삼염색체성 18, 터너 증후군 및 산전 검색증의 기타 염색체 이상을 검출하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 유리 베타(인융모성 성선자극 호르몬 HCG) 및 틈(nick)이 있거나 또는 단편화된 또는 변이 형태의 유리 베타(HCG)(이하 유리 베타의 모든 형태는 본 출원을 통해 유리 베타(HCG)로서 표기된다)의 양을 측정하므로써 다운 증후군에 대한 산전 검색에 있어서의 검출 효율을 증진시키는 방법에 관한 것이다.
[발명의 배경]
삼염색체성(Trisomy) 21로 명명되는 다운 증후군은 심각한 정신 박약의 가장 흔한 선천적 원인이다. 일반적으로, 태아의 다운 증후군은 양막천자 또는 융모막 융모 표본 및 핵형별을 비롯한 진단 절차에 의해 측정될 수 있다. 그러나, 이런 진단 절차는 관혈적이며 산모와 태아에게 위험을 준다. 이런 이유와 기타 다른 이유로 인해, 양막천자 또는 융모막 융모 표본 및 핵형별은 모든 임신 기간중에 통상적으로 수행되지 않는다. 대신, 하나 이상의 검색 방법을 이용하여 임신에 대한 위험도가 관혈적 진단 절차 수행의 위험도를 정당화하는 경우를 결정할 수 있다.
다운 증후군의 빈도는 임산부 연령의 증가에 따라 현저하게 증가한다. 사실상, 다운 증후군의 산전 검출은 다운 증후군의 위험도가 태아의 다운 증후군을 검출하는데 사용되는 진단 절차의 위험도에 근접하거나 초과하는 연령인 35세 및 35세 이상의 임신 여성에 대해서만 초점을 두어왔다. 따라서, 산전 검색의 표준 방법은 임산부 연령에 근거하여 진단적인 양막천자를 수행할 수 있는 여성을 선별하는 것을 포함했다. 그러나, 다운 증후군을 보유한 모든 임신중의 단지 약 20%만이 가장 위험성이 큰 35이상의 임신 여성들의 5%에 대해 양막천자 및 핵형별을 수행하므로써 검출될 수 있다는 점에서 연령은 부적절한 검색기준이다. 실제 임상 실습에서 35세 이상인 여성들의 약 절반만이 양막천자와 핵형별을 검사받기 때문에 다운 증후군을 보유한 임신의 10% 미만만이 산전에 검출된다.
1984년에 임산부 혈액의 알파 페토프로테인(AFP) 양의 저하와 태아의 다운 증후군과의 관계가 발견되었다. 예컨대, 문헌[임산부의 혈청 알파 페토프로테인의 저하와 태아 염색체 이상간의 관계, Merkatz, Macri, et al.; Am. J. Obstet, Gynecol. 148 : 996, 1984 ; 이 명세서는 본원에 참고 문헌으로 포함된다]을 참조하라. 이 문헌에서 주지할만한 것은 다른 염색체의 삼염색체성, 특히 삼염색체성 13 및 삼염색체성 18도 또한 임산부의 혈액내 AFP 양의 저하와 관련이 있다는 것이다. 이런 부가적인 염색체의 삼염색체성의 빈도(각각, 임산부 5000명중의 1명 및 임산부 6600명중의 1명)는 일반적인 삼염색체성 21(다운 증후군, 임산부 800명중의 1명)과 관련된 선천적 위험도보다 훨씬 낮다. 그러나, 저하된 MSAFP 양, 및 상승되거나 억제된 유리 베타(HCG) 양과 상기 다른 염색체의 삼염색체성과의 관련성으로 인해, 임산부의 혈액 AFP와 유리 베타(HCG) 및 가능하다면 본원에 기술된 부가의 표지인자를 이용하는 검색법으로 상기 이상 증후군들을 검출할 수 있을 것이다. 당업자라면 본원에 기술된 삼염색체성 21에 대한 검사법을 사용하므로써 삼염색체성 13, 삼염색체성 18, 터너 증후군 및 기타 염색체 이상도 검출될 수 있음을 명백히 인지할 것이다.
임산부 혈액내 저하된 AFP 양과 태아의 다운 증후군간의 관련성은 다운 증후군의 발병율이 약 80%인 가족중에 뚜렷하게 다운 증후군을 나타내지 않은 어린이들 중에서 다운 증후군 환자를 검출하는데 비관혈적인 혈액 검색 시험법을 사용할 기회를 제공했다. 임산부 혈액내 낮은 AFP 양(검색 표시인자로서 사용)을 근거로 한 검색 시험법의 사용이 모든 태아 다운 증후군 환자들의 약 20%를 산전 검출할 수 있도록 유도할 것으로 추정되고 있다.
또다른 검색 방법은 임산부 혈액내의 비결합된 에스트라이올(UE)의 양을 측정하는 것을 포함한다. 예컨대, 문헌[임신 초기에 다운 증후군을 검출하기 위한 임산부 혈액 검색법; Wald, et al. British Journal of Obstetrics and Gynocology (BMJ) Volume 95, April 1988, 이 명세서는 본원에 참고 문헌으로 포함됨]을 참조하라.
보다 최근 임산부의 혈액내 상승된 원형 HCG 분자 및 HCG의 알파 서브유니트(HCG는 2개의 서브유니트로 구성됨)의 양과 태아 다운 증후군간의 관련성이 밝혀졌다. 예컨대, 문헌[태아의 염색체 이상을 보유한 임신중의 비정상적인 임산부 혈청 융모성 성선호르몬 양 ; Bogart, Pandian and Jones ; Prenatal Diagnosis, Vol. 7, 623-630(1987), 이 명세서는 본원에 참고문헌으로 포함됨]을 참조하라. 이 보가트 문헌에서 추정되는 것은 임산부 혈액내 상승된 원형 HCG 양과 임산부 혈액내 상승된 HCG의 알파 서브유니트의 양을 이용하므로써 약 68%의 염색체성 비정상 태아를 검출할 수 있다는 것이다. 그러나, 이런 결과는 임신 18 내지 25주된 임산부에 대한 연구로부터 얻어졌고 다운증후군을 보유한 환자는 다운 증후군의 위험성이 있는 것으로 이전에 판명된 여성인 것으로 밝혀졌다.
미합중국 특허 제 4,874,693호(Bogart)는 임신 18 내지 25주된 임산부의 혈액내 상승된 HCG 양 및 임산부의 혈액내 상승된 HCG의 알파 서브유니트의 양과 태아 다운 증후군간의 관련성을 제시하고 있다. 보가트에 의한 상기 특허에서 추정되는 것은 검색법에 임산부의 혈액내 상승된 HCG 양과 상승된 HCG의 알파 서브유니트의 양을 이용하므로써 AFP 또는 UE를 단독 사용할 때보다 염색체 이상인 태아를 보다 높은 비율로 검출할 수 있다는 것이다. 이수체 태아를 임신한 임산부내의 인융모성 성선호르몬 양이라는 명칭의 논문(Bogart et al., Prenatal Diagnosi, Vol. 9, 379-384(1989))에서 보가트는 HCG 및 HCG의 알파 서브유니트를 이용하는 검색법이 임신 9 내지 11주에 태아 이수성(다운 증후군 포함)의 위험이 있는 임산부를 선별하는데 유용하지 않음을 개시하고 있다.
일반적으로, 상술한 바와 같이 임산부의 혈액내 HCG 양의 평가에 의한 검색법은 단지 원형 HCG 분자의 측정법 및 부가적으로 HCG의 알파 서브유니트의 측정법만을 포함하고 있다. 이런 검색법이 태아 다운 증후군을 검출할 지라도, 태아 다운 증후군 환자를 보다 높은 비율로 검출하는 방법이 필요로 되고 요구되었다.
본 발명자는 임산부의 혈액내 상승된 유리 베타(HCG) 양과 태아 다운증후군간의 이전에 공지되지 않은 관련성을 발견했다. 본 발명자는 또한 임산부 혈액내 유리 베타(HCG) 양 및 AFP 양과 태아 다운 증후군간의 종래 공지되지 않은 관련성을 발견했다. 본 발명자는 또한 임산부 혈액내 원형 HCG 분자 양에 대한 임산부 혈액내 유리 베타(HCG) 양의 비율과 태아 다운 증후군간의 종래 공지되지 않은 관련성을 발견했다. 본 발명자는 또한 다변량 판별 분석기법을 사용하므로써, 특히 임신 기간이 또한 판별 분석기법의 변수로서 포함될 때, 소정의 위험 컷-오프 양에 대한 임산부 혈액내 유리 베타(HCG) 양, 또는 임산부 혈액내 유리 베타(HCG) 양 및 임산부 혈액내 AFP 양, 또는 이 두값중 어느 하나의 log 값을 사용하여 검색법의 검출 효율을 증진시킨다. 임신 기간이 임산부의 태아 연령을 의미한다. 검출 효율은 소정의 위험 컷 오프 양에 대해 정확하게 검출되는 태아 다운 증후군을 지닌 환자의 비율을 의미한다. 위험 컷 오프 양은 다음 부분에서 보다 충분히 설명될 것이다. 판별 분석은 하나의 집단을 확률을 기초로하여 2개 이상의 군으로 분리하는 것을 포함하는 다변량 분석의 일반적으로 공지된 접근법이다. 판별 분석은 또한 때로 독립적인 변수들의 일차 결합을 작제하는 방식으로서 묘사되며, 따라서, 측정 군간의 차이의 문제를 일변수 문제로 환산시킨다. 판별 분석의 일반적인 검토는 문헌[Marketing Research; Churchill, G.A. ; Dryden, 1976; Chapter 15, pages 530-543, 이것의 명세서는 본원에 참고 문헌으로 포함됨]에서 찾아볼 수 있다. 본 발명자는 임산부 혈액내 유리 베타(HCG) 양, 임산부 혈액내 원형 HCG 양, 임산부 혈액내 원형 HCG 분자의 양에 대한 임산부 혈액내 유리 베타(HCG) 의 양의 비율, 임산부 혈액내 AFP 의 양, 임산부 혈액내 UE의 양, 및 다변량 판별 분석에 대한 임신기간을 측정하는 것이 다운 증후군을 산전 검출하기 위해 공지된 임의의 다른 검색법 보다도 태아 다운 증후군 환자를 보다 낮은 위양성율을 지닌 보다 높은 비율로 검출한다는 것을 발견했다. 본 발명자는 임산부 혈액내 유리 베타(HCG) 양 및 임산부 혈액내 AFP 양의 측정값만을 사용하고 각 측정값의 log 값과 다변량 판별 분석법에 대한 임신 기간을 취하므로써 태아 다운 증후군을 지닌 보다 많은 수의 환자를 검출할 수 있음을 발견했다. 이 발견들과 기타 발견들을 본 발명의 개요 부분 및 본 발명의 상세한 설명 부분에서 보다 충분히 설명할 것이다.
본 발명의 제1목적은 다른 공지된 산전 검색법보다도 소정의 위양성율을 지닌 태아 다운 증후군 환자를 보다 높은 비율로 검출하는 태아 다운 증후군을 검색하는 방법 및 공정을 제공하는 것이다.
본 발명의 제2목적은 다른 공지된 방법보다도 소정의 검출 비율에 대해 보다 적은 위양성율을 지닌 태아 다운 증후군을 검색하는 방법 및 공정을 제공하는 것이다.
본 발명의 제3목적은 보다 적은 위양성율을 지닌 태아 다운 증후군 환자를 보다 높은 비율로 검출하기 위해 다변량 판별 분석법을 다운 증후군의 검색 방법에 적용하는 것이다.
본 발명의 제4목적은 임산부 혈액내 유리 베타(HCG)의 양을 측정하므로써 태아 다운 증후군을 검색하는 방법 및 공정을 제공하는 것이다.
본 발명의 제5목적은 임산부 혈액내 AFP 양 및 임산부 혈액내 유리 베타(HCG) 양을 측정하므로써 태아 다운 증후군을 검색하는 방법 및 공정을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 장점은 다음 본 발명의 설명 부분으로부터 명백히 제시될 것이다.
[본 발명의 개요]
이 목적들과 다른 목적들을 달성하기 위해 본 발명에 있어서 임산부(이사에는 때로 환자로 명명되기도 함)의 임산부 혈액내 유리 베타(HCG)의 양은 전술한 문헌들에 기술되어 있는 바와 같은 면역 분석법을 포함하는 통상적인 면역학적 기법 및 당업계에 공지된 다른 기법에 의해 측정한다. 그 다음 유리 베타(HCG)의 양을 일군의 참조 데이타와 비교하여 다운 증후군 태아를 임신한 환자의 위험도를 측정한다. 검출 효율을 증진시키기 위해 유리 베타(HCG)의 양 및 임신 기간을 일군의 참조데이타와 비교할 수 있다. 검출 효율을 더욱 증진시키기 위해, 환자의 임산부 혈액내 유리 베타(HCG) 및 AFP(이하, 표지인자로서 명명됨)의 양을 통상적인 면역학적 방법, 및 전술한 문헌들에 기술된 당업계에 공지된 분석기법으로 측정한다. 그 다음 각 표지인자의 양을 일군의 참조 데이타와 비교하여 다운 증후군 태아를 임신한 환자의 위험도를 측정한다. 다변량 판별 분석기법은 표지인자들의 양과 일군의 참조 데이타를 비교하는데 유리하게 사용된다. 보다 구체적으로, 환자 특이적인 위험도는 그 다음 베이스 규칙, 환자의 선천적 위험도, 및 다변량 판별 분석법을 사용하여 전개되는 참조 데이타에 대한 확률밀도 함수내로 환자내의 각 표지인자의 정량적인 양이 log 값을 통합시키므로써 측정되는 다운 증후군을 보유하지 않은 임신과 다운 증후군을 보유한 임신의 상대적인 빈도를 사용하여 계산한다. 다운 증후군 태아를 임신한 환자의 위험도가 소정의 위험 컷 오프 양보다 크다면, 다운 증후군의 존재를 확인하기 위한 추가 진단 시험에 대하여 그 환자에게 권고해야 한다.
이와 유사하게는 본 발명의 방법이 삼염색체성 13, 삼염색체성 18, 터너 증후군 또는 다른 염색체 이상에 대한 검색법에 이용된다면, 이상이 있는 태아를 임신한 환자의 위험도는 다변량 판별 분석법을 사용하여 측정할 수 있고 이에 의해 유리 베타(HCG) 및 AFP의 양이 일군의 참조 데이타와 비교된다.
유리 베타(HCG)의 양과 AFP의 양과 함께 표지인자로서 임신 기간을 통합시키면 검출 효율은 더욱 증진될 것이다. 다수의 샘플에 대한 임산부 혈액내 유리 베타(HCG)의 양 및 임산부 혈액내 AFP 양은 log-가우스 분포 곡선에 따라 분포되는 경향이 있으므로, 다변량 판별 분석법을 사용하여 전개되는 참조 데이타에 대한 확률 밀도 함수에 환자내 각 표지인자의 정량적인 양 및 임신 기간을 통합시키므로써 최대의 검출 효율을 수득할 수 있다.
본원 및 본 발명자의 종래 출원들에 기술된 바와 같이, 유리 베타(HCG)는 원형 유리 베타(HCG) 및 소위 유리 베타(HCG)의 변이 형태를 비롯한 많은 형태를 존재할 수 있다. 유리 베타(HCG)의 변이 형태는 완전한 유리 베타(HCG) 분자의 단편 및 틈이 있는 유리 베타(HCG)를 포함할 수 있다. 이 형태들 및 유리 베타(HCG)의 다른 형태들에 관한 추가의 구체적인 설명은 하기 부분에 포함되어 있다. 유리 베타(HCG)의 임의의 형태 또는 모든 형태들을 측정하는 면역학적 방법은 본 발명의 영역에 속한다.
본 발명에 사용하기에 적합한 통상적인 면역학적 기법은 또한 생체 감응 장치의 사용 방법을 포함한다. 생체 감응 장치는 일반적으로 전기 신호나 다른 관측가능한 기록을 산출시킬 수 있는 변환기에 연결된 항체등의 생물학적 유래의 감응 인자를 포함한다. 유리 베타(HCG) 또는 이것의 한 형태와 같은 측정하고자 하는 물질의 임의량의 감응 인자에 접촉하면, 반응이 일어나고 변환기는 그 반응을 색, 형광성, 온도, 전류 또는 다른 전기 화학적 신호의 변화로 번역한다. 유리 베타(HCG)의 양 및/또는 유리 베타(HCG)의 한 형태의 양을 측정하는 생체 감응 장치도 본 발명의 방법의 영역에 속한다.
본 발명의 방법 및 공정의 잇점은 다른 공지된 방법 및 공정보다도 더 낮은 위양성율을 나타내면서 태아 다운 증후군 환자를 보다 높은 비율로 정확하게 예상한다는 점이다.
본 발명의 다른 잇점은 하기 보다 상세한 설명 및 실시예로부터 명백히 인지할 수 있을 것이다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 실시예 2에 기술된 바와 같은 삼염색체성 21에 대한 각각의 표지인자들의 유의 수준을 나타내는 표이다.
제2도는 실시예 2에 기술된 바와 같은 각각의 표지인자들의 다운 증후군 검색 효율을 나타내는 표이다.
제3도는 실시예 2에 기술된 바와 같은 복합 표지인자들의 다운 증후군 검색 효율을 나타내는 표이다.
제4도는 실시예 2에 기술된 바와 같은 다운 증후군을 보유하지 않은 임신중에 존재하는 유리 베타(HCG) 분포가 소정의 백분위수 이상인 다운 증후군 환자의 비율을 나타내는 표이다.
제5도는 실시예 2에 기술된 바와 같은 각각의 표지인자들의 다운 증후군 효율을 나타내는 표이다.
제6도는 실시예 2에 기술된 바와 같은 여러 임신 기간 범위에서 복합 표지인자로서 log AFP 와 log 유리 베타(HCG)의 다운 증후군 검색 효율을 나타내는 표이다.
제7도는 실시예 2에 기술된 바와 같은 미국 전역에 걸쳐 예측되는 AFP, 유리 베타(HCG) 및 임산부 연령의 다운 증후군 검색 효율을 나타내는 표이다.
제8도는 실시예 2에 기술된 바와 같은 다운 증후군을 보유하지 않은 임신의 각종 백분위수와 관련하여 삼염색체성 21의 환자중의 유리 베타(HCG)의 양을 나타낸다.
제9도는 실시예 2에 기술된 바와 같은 유리 베타(HCG) 양의 분포를 나타낸다.
제10도는 실시예 2에 기술된 바와 같은 다양한 표지인자들의 조합에 대한 다운 증후군 검색 효율을 나타내는 표이다.
제11도는 다운 증후군을 검출하는 방법을 수행하는데 이용되는 본 발명의 장치를 도시한 것이다.
제12도 및 제13도는 다운 증후군에 걸린 태아를 임신한 환자의 특이 위험도의 측정과 함께 사용하기 위한 참조 매개 변수를 이용하는 컴퓨터 프로그램의 순서도를 도시한 것이다.
제14도는 다운 증후군에 걸린 태아를 임신한 환자의 특히 위험도를 측정하기 위해 제12도 및 제13도에 도시된 프로그램에서 계산된 참조 매개 변수를 이용하는 컴퓨터 프로그램의 순서도를 나타낸 것이다.
제15도는 실시예 4에 기술된 바와 같은 환자의 샘플중에 존재하는 유리 베타(HCG) 양의 분포를 나타낸 것이다.
베16도는 실시예 5에 기술된 바와 같은 환자의 샘플중에 존재하는 유리 베타(HCG) 양의 분포를 나타낸 것이다.
제17도는 실시예 6에 기술된 바와 같은 환자의 샘플중에 존재하는 유리 베타(HCG) 양의 분포를 나타낸 것이다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명의 제1양태로서, 한 환자로부터 임산부 혈액 샘플을 채취한다. 그 다음 임산부 혈액내 유리 베타(HCG)의 양을 당업계에 공지된 면역학적 방법등의 통상적인 분석 방법으로 측정한다. 임산부 혈액내 유리 베타(HCG)의 양을 일군의 참조 데이타와 비교하여 그 환자가 다운 증후군의 태아를 임신하고 있는 증가된 위험 상태에 있는지를 측정한다. 검출 효율을 증가시키기 위해, 임신 기간과 임산부 혈액내 유리 베타(HCG) 양을 일군의 참조 데이타와 비교하여 그 환자가 다운 증후군이 태아를 임신하고 있는 증가된 위험 상태에 있는지를 측정할 수도 있다.
본 출원과 동일자로 출원되고 건조된 혈액 시료를 이용한 다운 증후군 검색 방법이라는 명칭하에 공계류중인 출원에 기술되어 있는 바와 같이, 임산부에게서 채혈한 혈액 샘플은 수송과 이후의 분석을 위해 건조될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 액상 및 건조된 상태의 혈액 샘플의 분석을 포함한다.
부가적으로, 유리 베타(HCG)의 임의의 단편들이 임산부의 소변중에 분비될 수 있다는 것은 일반적으로 공지되어 있다. 이런 단편중 하나는 흔히 베타코어 단편이라고 명명되며, 완전한 유리 베타(HCG) 분자를 구성하는 55내지 92번째 아미노산 잔기에 이황화 결합된 6 내지 40번째 아미노산 잔기를 포함한다. 임산부의 소변중에 존재하는 유리 베타(HCG)의 베타 코어 단편을 측정하기 위해 고안된 분석법은 본 발명의 방법에 의한 다운 증후군의 검색법에 이용될 수 있다.
임산부의 혈액내 존재하는 유리 베타(HCG)의 양을 측정하기 위한 공지된 분석 방법중 임의의 방법이 본 발명에 사용될 수 있을지라도, 당업자에게 명백한 바와 같이 유리 베타(HCG)의 참조 데이타를 수득하는데 사용된 것과 동일한 방법이어야만 한다. 새로운 분석 방법이 유리 베타(HCG)에 이용된다면, 이 방법으로 산출된 데이타를 기초로 한 새로운 군의 참조 데이타도 수득되어야만 한다. 따라서, 혈액 반점을 분석하는데 이용된 기법은 참조 데이타와 검색될 샘플을 분석하는데 이용된 기법과 동일해야만 한다.
일반적으로, 유리 베타(HCG)의 특이적인 항체를 생성하는데 있어서, 약간의 항체는 단백질에 특이적이며 다른 일부 항체는 탄수화물이 결합된 항원 부위에 특이적이라는 것은 말할 나위도 없다. 본원을 통해 언급된 유리 베타(HCG)의 양의 측정은 단백질이나 탄수화물 결합된 항원부위 또는 유리 베타(HCG) 상의 임의의 다른 부위에 특이적인 항체를 사용하는 것을 포함한다.
또한, (HCG)의 알파 서브유니트가 단일 유전자에 의해 암호되는 반면, 유리 베타(HCG)는 7개 이상의 매우 유사한 유전자 또는 가유전자의 복합군에 의해 암호된다는 것은 당업자에게는 자명한 사실이다. 예컨대, 문헌[일렬 쌍 및 역위 쌍으로 배열된 8개 이상의 유전자에 의해 암호되는 인융모성 성선자극 호르몬 베타-서브 유니트, Boorstein, Vamvakopoules, Fiddes; Nature Vol 300, 2 December 1982; 이 문헌의 교시는 본원에 참고 인용]을 참조하라. 7개의 유리 베타(HCG) 유전자중의 단지 3개가 유리 베타(HCG)의 정상적인 태반 생성시에 형질발현 된다는 것은 공지되어 있다. 예컨대, 문헌[융모암에 의해 생성된 인융모성 성선자극 호르몬의 베타 서브 유니트의 단편화; Nishimura, Ide, Utsunomiya, Kitajima, Yuki and Mochizuki; Endocrinology, Vol. 123, No. 1, 1988; 이 문헌의 교시는 본원에 참고 인용됨]을 참고하라. 이런 동일한 3개의 유전자가 태아 다운 증후군의 존재동안 등의 질병 상태에서도 형질 발현되는지는 측정되지 않았다. 따라서, 아미노산 서열의 약간의 차이를 지니거나, 또는 다른 작은 차이를 지닌 유리 베타(HCG)의 다중 형태가 합성될 수 있다는 것이 가능하다. 또한, 다운 증후군에서도 하나 이상의 유리 베타(HCG) 유전자가 형질 발현되고 이에 의해 유리 베타(HCG)의 고유 변이체 또는 변이체들(전술된 틈이 있는 형태, 단편화된 형태 또는 변이 형태)을 생성하는 것이 가능하다. 본 발명에 따라, 이 변이체들은 유리 베타(HCG)를 측정하는 통상적인 면역학적 기법에 의해 측정될 수 있다. 다운 증후군과 관련된 특이적인 유리 베타(HCG) 변이체, 또는 변이체들을 측정하기 위해 산출된 분석법은 더욱 더 검출 효율을 증가시킬 수 있을 것이다.
삼염색체성 21을 보유한 임산부와 이를 보유하지 않은 임산부를 구별하기 위해 유리 베타(HCG)를 측정하는 분석기법을 효과적으로 사용했다. 삼염색체성 21에 대한 검출 효율은 83%로 높았다. 당업자에게 잘 공지된 바와 같이, 특정 피분석물을 정량하기 위해 항체를 사용하면 별개이나 유사한 물질과 교차반응성을 지니게 된다. 따라서, 삼염색체성 21을 보유한 환자와 보유하지 않은 환자의 차이가 사용된 항체와의 어느 정도의 교차 반응성으로 인해 검출되는 변이 형태의 유리 베타(HCG)의 존재 여부에 의해 영향을 받을 수 있다. 유리 베타(HCG)의 변이 형태는 신규 생화학 물질로서 지칭될 수 있다. 과학 문헌에 의한 정보를 통해, 유리 베타(HCG)의 변이 형태가 인식된 바 있음을 알 수 있다(예를 들어, 니시무라외 다수의 상기 문헌 참조).
삼염색체성 21을 보유한 환자는 또는 변이 형태의 유리 베타(HCG)를 특징으로 나타낼 수 있는데, 당업자라면 이런 환자중에서 이 증후군에 대한 검출 효율을 더욱 향상시킬 수 있는 상기 변이 형태에 대한 특이 항체를 개발시킬 수 있을 것이다.
대안적으로, 다운 증후군을 보유한 환자는 또한 유리 베타(HCG)를 포함하는 아미노산의 불완전부를 포함하는 유리 베타(HCG)의 단편화된 형태(또는 단편)를 특징적으로 나타낼 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 유리 베타(HCG)를 측정하는데 사용된 분석법은 또한 이 분석법에 사용된 에피토프, 또는 에피토프들이 유리 베타(HCG)의 단편에 존재한다면, 유리 베타(HCG)의 단편도 측정할 것이다.
하나의 그러한 변이 또는 단편화된 형태의 유리 베타(HCG)는 틈이 있는 유리 베타(HCG)로서 칭할 수 있다. 틈이 있는 유리 베타(HCG)에 있어서 유리 베타(HCG)의 아미노산 사이에는 펩티드 결합이 누락되어 있다. 공지된 형태의 틈이 있는 유리 베타(HCG)에 있어서, 잔기 44와 45 사이 또는 잔기 47과 48 사이에 펩티드 결합이 누락되어 있다. 틈이 있는 유리 베타(HCG)의 형태를 측정하기 위한 기법이 개발되어 있다. 상기 설명된 바와 같이, 이들 기법은 본 발명의 방법에서 임산부 혈액내 틈이 있는 유리 베타(HCG)의 양 또는 총 혈액내 틈이 있는 유리 베타(HCG)와 유리 베타(HCG)의 양을 측정하므로써 태아 다운 증후군을 검색하는데 사용할 수 있다.
실시예 7에 설명된 바와 같이, 유리 베타(HCG)의 측정시 사용된 특정 면역 분석법은 틈이 있는 유리 베타(HCG)를 측정한다. 본 발명의 방법은 그러한 면역 분석법의 사용 방법을 포함한다. 실시예에 설명된 바와 같이, 임산부의 혈액중 유리 베타(HCG)의 양과 틈이 있는 유리 베타(HCG)의 양을 측정하는 면역 분석법을 사용하는 다운 증후군에 대한 검색법은 검색 효율이 약 80%일 수 있다.
참조 데이타는 다운 증후군인(다운 증후군을 보유한 태아로도 칭함) 태아를 임신한 임산부의 임산부 혈액내 유리 베타(HCG)의 양과 정상 태아를 임신한 임산부의 임산부 혈액내 유리 베타(HCG) 양을 나타낸다. 당업자에게는 통상적으로 인식되는 바와 같이, 태아의 다운 증후군에 대한 검색 방법은 비교에 의해 이루어지는 결정방법이다. 임의의 결정 형성 방법에 있어서, 해당 증상 또는 질환을 가진 환자 및/또는 해당 질환 또는 증상을 가지지 않은 환자를 기초로 한 참조값이 필요하다. 본 발명에서, 참조값은 다운 증후군 태아를 임신한 임산부와 정상 태아를 임신한 임산부에 있어서 임산부 혈액내 측정된 표지인자(들)의 양이다. 참조 데이타 군은 많은 샘플의 참조값을 수집하여 이루어진 것이다. 당업자에게는 명백하듯이, 참조 데이타 군은 참조값의 수를 증가시키므로써 개선될 것이다.
환자가 다운 증후군 태아를 임신한 증가된 위험 상태에 있는지를 진단하기 위해, 컷오프 값을 설정해야 한다. 환자가 삼염색체성 13 또는 삼염색체성 18인 태아를 임신한 증가된 위험 상태에 있는지를 진단하기 위해 설정된 컷오프값은 또한 삼염색체성 21의 환자를 확인하는데에도 효과적일 수 있다. 이 컷오프값은 실험, 내과의사에 의해 또는 각 환자들의 질병에 따라 설정될 수 있다. 컷오프값은 부가의 관혈적 진단 시험이 필요한 여성의 수, 부가의 관혈적 진단 시험에 필요한 모든 여성에게 있어서의 다운 증후군 태아를 임신한 평균 위험도, 400명중 1명과 같은 특정 위험율보다 더큰 환자 특이 위험도를 지닌 어떤 여성이 부가의 관혈적 진단 시험을 받아야 하는 지에 대한 결정과 같은 몇몇 기준 또는 당업자에게 공지된 다른 기준에 근거할 수 있다. 컷오프값은 많은 방법을 사용하여 설정할 수 있다: 예를 들면, 백분위수, 평균값 ± 표준편차(들); 중간값의 배수; 환자 특이 위험도 또는 당업자에게 공지된 다른 방법을 들 수 있다.
많은수의 태아 다운 증후군의 환자를 검출할 수 있는 본 발명의 또다른 방법에서는, 이중 피분석을 분석법을 사용하여 유리 베타(HCG) 및 AFP에 대해 혈액 반점을 분석했다. 이들 피분석물의 임산부 혈액내 양을 측정하는 임의의 공지된 분석 방법이 본 발명에서 사용될 수 있을지라도 각 표지인자에 대해 사용된 분석 방법은 특정 표지인자에 대한 참조 데이타를 만드는데 사용된 것과 동일한 방법이어야 한다. 신규 분석 방법이 특정 표지인자에 대해 사용되는 경우에는, 그 방법에 의해 산출된 자료를 기초로 한 새로운 참조 데이타 세트가 형성되어야 한다.
다운 증후군 태아를 임신한 환자의 특이 위험도는 베이스 규칙, 환자의 선천적 위험도, 및 다운 증후군 보유 및 보유하지 않은 임산부의 상대적 빈도수를 사용하여 계산하는 것이 바람직하며, 이 상대적 빈도수는 다변량 판별 분석을 사용하여 참조 데이타로서 산출되는 확률 밀도 함수내로 환자 임신 기간과 함께 환자내의 각 피분석물(유리 베타(HCG) 및 AFP)의 정량적인 양을 통합시키므로써 결정된다. 다변량 판별 분석은 시판되는 컴퓨터 프로그램 통계 패키지 통계 분석 시스템(SAS 인스티튜트 인코오포레이티드에서 제조 및 시판)으로 수행되거나 또는 당업자에게 공지된 다른 통계 소프트웨어 패키지 또는 다른 다변량 통계 분석 방법을 통해 수행할 수 있다.
확률 밀도 함수는 일군의 참조 데이타와 각 피분석물의 환자내 수준을 비교하는 방법을 제공한다. 확률 밀도 함수의 한 종류를 하기 제시하나, 당업자에게 명백한 바와 같이 다른 확률 밀도 함수가 이와 유사하게 수행될 수 있으며, 따라서 본 발명에 적당하게 수행될 것이다.
[다운 증후군의 위험도 공식]
첨자 a는 다운 증후군 보유한 환자를 칭하는 것이고, 첨자 u는 다운 증후군 보유하지 않은 환자를 칭하는 것이며, (X-M)은 각 인자가 각 변수의 양-변수의 평균값인 벡터이다.
COV-1는 그 모델에서 사용된 모든 변수들의 다운 증후군 보유군과 보유하지 않은 군에 있어서의 합한 공분산 매트릭스의 역수이다.
(X-M)T는 (X-M)벡터의 이항값이다.
EXP는 지수함수이다.
｜COV｜는 참조 데이타를 만들기 위한 모델에 있어서의 모든 변수들의 공분산, 매트릭스의 행렬식을 칭하는 것이다.
당업자에게는 명백하듯이, 다운 증후군 보유하지 않은 임산부와 보유한 임산부의 개별 공분산 매트릭스는 푸울형 공분산 매트릭스 대신 사용될 수 있다. 이런 경우 다운 증후군의 위험도 공식은 다음과 같다:
판별 분석을 위해, 일반적인 비선택 집단중에서 다운 증후군의 선천적 확률에 대해 하나의 가정을 세운다. 통상적으로, 선천적 확률은 800 명중 약 1명이다. 다변량 판별 분석을 위해 어떤 컷오프 양이 양성 시험 결과를 구성하는 지에 대해서도 결정한다. 예를 들어, 다운 증후군 태아를 임신한 확률이 400중 1또는 그 이상인 임산부에 대해 추가의 진단 시험을 수행하는 것이 바람직하다면, 그 다음 판별분석의 결과가 임산부가 다운 증후군 태아를 임신한 확률이 400중 1 또는 그 이상인 임산부로 나타날 때, 그 임산부는 양성 시험 결과를 가지는 것으로 간주된다. 양성 시험 결과가 나타나면, 환자에게 추가의 진단 시험에 대해 권고하여 다운 증후군의 존재여부를 확인해야 한다.
제11도 내지 제14도에는 참조 매개변수 및 특이 위험도를 계산하는 컴퓨터 프로그램의 장치 및 순서도가 제시된다.
제11도에 제시된 바와 같이, 임신 기간(GA), AFP 양과 유리 베타(HCG)의 양은 다운 증후군 보유 및 보유하지 않은 임산부로부터 통상적인 기법을 통해 측정하여 참조 데이타를 만든다. 다수의 샘플을 선택하여 신뢰도를 증가시킨다. 참조 매개변수의 설정을 위한 측정치는 도면에서 10으로 표시된다.
일단 참조 매개변수(22)가 적당한 입력 장치(15)를 통해 입력된 후 공정유니트(20)에 의해 계산되면, 각 환자의 특이 위험도(25)가 환자 개인이 측정된 특이 표지인자값(30으로 표시됨)을 기초로 하여 계산될 수 있다.
참조 매개변수를 결정하기 위한 프로그램은 제12도 및 제13도에 도시되며 특이 위험도를 계산하는 프로그램은 제14도에 도시한다.
제12도 및 제13도를 참고로 하여, 제1루프(100)에서, 프로그램은 확인 데이타(ID), 임신 기간(GA), AFP 및 유리 베타(HCG)의 양 및 참조 데이타를 마련하기 위한 참조군으로부터 임산부가 삼염색체성 21에 걸린 여부를 나타내는 코드를 판독한다. 이는 단계(102)에 도시된다. 순서도에서, 임신 기간(GA)은 변수 X1로 표시되며, log AFP는 변수 X2로, 유리 베타(HCG)의 log 값은 X3로 표시되는데, 이는 단계(104)에 제시된다. 이어서 합계 및 합계 결과의 매트릭스를 X1, X2, X3및 X3값을 기초로 하여 단계(106)에 제시된 바와 같이 결정 또는 계산한다. 참조 군중에서 다운증후군 보유 및 보유하지 않은 환자의 수를 계측하는 변수 Ncode가 이어서 증가된다. 흐름 라인(110)으로 제시된 바와 같이 일단 로프가 종료되면, 참고 번호(112)로 표시된 바와 같은 양 I, J 및 K로 정의된 일련의 루프를 통해 평균값이 계산된다. 이들 루프에서, 공분산 매트릭스는 루프(100)에서 정의된 합계 매트릭스 및 루프(100)에서 계산된 합계 결과 매트릭스를 사용하여 계산한다. 이들 루프 이후에는, 다운 증후군 보유군 및 보유하지 않은 군에 대한 공분산 매트릭스를 합할 것인지의 선택이 이루어진다. 이 선택은 합해지는 단계(114, 116 및 118)에 입력되고, 공분산을 합하여 단계(120)로 제시된 바와 같이 합한 공분산 매트릭스를 형성하고, 합한 공분산 매트릭스를 역으로 하여(122)에 제시된 바와 같이 합한 공분산 매트릭스의 역값이 산출되며, 평균값 및 합한 공분산 매트릭스의 역값을 화일에 저장하여 단계(124, 126)에서 인쇄한다. 공분한 매트릭스를 합하지 않도록 선택하는 경우에는, 2개의 공분산 매트릭스를 각각 단계(123) 및 (125)에서 역으로 하고 평균값과 공분산 매트릭스의 역값을 한 화일에 저장한 뒤 단계(125) 및 (127)에서 인쇄한다. 이들 양은 다운 증후군 보유 태아를 임신한 환자 개개의 특이 위험을 계산하기 위한 참조 매개변수를 포함한다.
제14도를 참조로 하여, 제12도 및 제13도에 제시된 프로그램의 실행 동안에 측정된 참조 매개변수인 평균값 및 합한 공분산 매트릭스의 역값을 포함하는 참조 매개변수를 (130)에서 제시된 바와 같이 판독된다. 환자 확인, 임신 기간(GA), AFP 및 유리 베타(HCG)를 비롯한 특정 환자 기록이 이어서 (132)에서 제시된 바와 같이 판독된다. 이어서 임신 기간을 (134)에서 보다 구체적으로 계산하고, 임산부 연령의 계산은 (136)에서 이루어진다. (138)에서 임산부 연령과 빈도 데이타를 기초로 하여 선천적 위험도를 결정한다. 하기 거론된 실시예에서, 이 계산 결과는 통상적인 수인 1/800 계수이다.
(140)에서는, 선천적 위험도 다운 증후군 보유 태아(ABT)를 임신한 상대적 빈도수가 결정되며, 이는 상기 거론된 식(1) 또는 (2)의 분자이다. (142)에서는, (1-선천적 위험도)를 곱한 다운 증후군 보유하지 않은 태아를 임신한 상대적 빈도수인 (NT)가 결정되며, 이는 상기에서 밝힌 식(1) 또는 (2)의 분모로 제2계수이다. (144)에서는, 베이스 규칙을 사용하여 특이 위험도가 결정되며, 즉, ABN=ABT/(ABT+NT)이다. (식(1)과 (2)). 146에서는 결과가 인쇄되는데, 즉 환자의 특이 위험도 ABN 및 환자의 확인 번호가 인쇄된다.
당업자에게 명백하듯이, 선형 판별 분석 방법 이외에도 참조 매개변수를 계산하는 다른 통계적, 수학적 기법도 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시 태양에 따르면, 임산부의 혈액 샘플을 환자로부터 취한다. 유리 베타(HCG) 및 AFP (이후에서는 표지인자로 칭함)의 임산부 혈액중의 양을 이어서 당해 기술분야에서 공지된 통상적인 면역학적 방법을 통해 측정한다. 이들 표지인자의 임산부 혈액중의 양을 측정하기 위한 임의의 공지된 분석 방법은 본 발명에서 기능을 수행할 것이다, 당업자에게 명백하듯이 각 표지인자에 사용된 분석 방법은 특정 표지인자에 대한 참조 데이타를 마련하는데 사용된 것과 동일한 방법이어야 한다. 신규 분석 방법을 특정 표지인자에 사용할 경우에는, 그 방법으로 마련된 데이타를 기초로 한 새로운 참조 데이타 군이 마련되어야 한다.
다운 증후군 태아를 임신한 환자의 특이 위험은 이어서 베이스 규칙, 환자의 선천적 위험율, 각 환자의 임신 기간에 따라 환자내 각 표지인자의 정량적 수준을 다변량 판별 분석법을 사용하여 참조 데이타를 위해 전개되는 확률 및 밀도 함수에 통합시키므로써 결정된 비보유 및 보유한 임산부의 상대적 빈도수를 사용하여 계산한다. 검출 효율을 더욱 증가시키기 위해, 환자의 임신 기간에 따른 환자내 유리 베타(HCG) 및 AFP의 정량적 양의 log 값을 다변량 판별 분석법을 사용하여 참조 데이타를 위해 전개되는 확률 밀도 함수에 통합한다. 다변량 판별 분석은 시판되는 컴퓨터 프로그램 통계 패키지 통계 분석 시스템(SAS 인스티튜트 인코오포레이티드에서 제조 및 시판)으로, 또는 다른 다변량 통계 분석 방법 또는 당업자에게 공지된 다른 통계적 소프트웨어 패키지를 통해 수행할 수 있다.
판별 분석을 위해 일반적인 비선택 집단중에서 다운 증후군의 종전 확률에 대한 가정을 세운다. 통상적으로, 종전 확률은 약 1/800이다. 다변량 판별 분석을 위해 어떤 컷오프 양이 양성 시험 결과를 구성하는 것에 대해서도 결정한다. 예를 들어, 다운 증후군 태아를 임신한 확률이 1/400이상인 임산부에 대해 추가의 진단 시험을 수행하는 것이 바람직하다면, 판별 분석 결과가 다운 증후군 태아를 임신한 확률이 1/400 이상인 임산부로 나타날 때, 그 임산부는 양성 시험 결과를 가지는 것으로 간주한다. 양성 시험 결과가 나타나면, 환자에게 추가의 진단 시험에 대해 권고하여 다운 증후군의 존재 여부를 확인하여야 한다.
당업자에게는 명백하듯이, 상기 거론된 임의의 실시 태양에 있어서 집단중의 여러 아군에 적용될 수 있는 상이한 선천적 위험도를 사용하거나 양성군의 위험 컷오프 양을 조절하므로써 각 환자에 대한 판별 분석 결과를 조절할 수 있다.
본 발명은 상기 거론된 실시태양에 국한되기 보다는 모든 가능한 실시태양 및 하기 실시예에 개시된 표지인자의 조합을 포함한다.
[실시예 1]
400명 이상의 환자 샘플을 사용하여 임산부 혈청 AFP(MSAFP), UE, 및 원형 HCG와 함께 유리 베타(HCG)의 임산부 혈액중의 양에 대한 태아 다운 증후군의 관계를 연구하였다. 이들 샘플은 다운 증후군 태아를 임신한 것으로 공지된 임산부에게서 채혈한 25종의 임산부 혈액 샘플 및 보유한 환자에 부합되는 대조군 샘플을 포함한다. 이 실시예에서는, 액상의 혈액 샘플을 분석했다.
각 혈액 샘플에 대해, AFP, 원형 HCG 분자, 유리 베타(HCG), 및 UE(이후부터는 표지인자로 칭함)의 정량적 양을 다음 분석 기법을 통해 결정하였다.
각 표지인자의 양은 시판되는 컴퓨터 소프트웨어 통계 패키지 통계 분석 시스템(SAS 인스티튜트 인코오포레이티드 제품)으로 단계식 판별 절차 및 선형 판별 절차에서 하나의 변수가 되어 참조 데이타 군을 산출시킨다. 유리 베타(HCG) 대 원형 HCG 분자의 비율 및 환자의 임신 기간도 또한 변수로서 삽입하였다. 단계식 판별 절차는, 모든 변수가 선현 판별 절차내로 삽입될 수 있음을 결정했다. 그 다음 선형 판별 절차를 각 변수에 대해 별도로, 그리고 변수의 여러 조합에 대해 수행하였다. 이들 판별 분석 결과는 하기 도표에 요약한다. 감도는 양성 시험 결과를 보이는 태아 다운 증후군의 비율이다. 위(僞) 양성은 양성 시험 결과를 보이는 정상 태아의 비이다.
조합체 = MSAFP + 유리 베타(HCG) + 원형 HCG + UE
임신 기간 비는 각 변수화 함께 통합된다. 위험 컷오프양 = 1/400, 단 *는 1/365임
당업자에게는 명백하듯이, 집단중의 여러 아군에 적용될 수 있는 상이한 선천적 위험도를 사용하거나 양성군의 위험 컷오프 양을 조절하므로써 각 환자에 대한 판별 분석 결과를 조절할 수 있다.
[실시예 2]
550명 이상의 환자 샘플을 사용하여 태아 다운 증후군과 유리 베타 HCG의 임산부 혈액중의 양과의 관계를 연구하였다. 먼저 다운 증후군 태아를 임신한 것으로 알려진 임산부에게 채혈한 29개종의 샘플과 임신 기간(동일한 주), 임산부 연령(3년 이내) 및 냉동기 저장 시간(1달 이내)에 부합되는 520종의 다운 증후군 보유하지 않은 샘플을 분석했다. 모든 샘플은 당뇨가 없는 백인의 단태아-임신 여성으로부터 얻었다. 이 실시예에서, 분석된 각 샘플은 액상 혈액 샘플이었다.
검색 효율의 산정시 선입관을 만드는 훈련을 피하기 위해, 유효군의 개념을 사용하였다. 유효군이란 참조 데이타 군과 무관한 데이타 군이다. 유효 군중의 환자로부터의 결과는 참고 자료를 설정하는데 사용되지 않는다. 대신, 유효 군중의 환자로부터의 결과는 참조 데이타 군을 설정하는 데에는 사용되지 않는다. 오히려, 유효군중의 환자에게 얻은 결과를 참조 데이타 군과 비교하여 검색 효율을 결정한다. 이 제2 유효 군은 26개의 추가의, 확인된 삼염색체성 21환자(총 55명)와 무작위적으로 선택된 159명의 대조 샘플군으로 구성되었다. 대조 샘플도 유사하게 당뇨가 없는 백인의 단태아-임신여성으로부터 얻었다.
전체 연구에서는 하기 제시된 표지인자의 임산부 혈액중의 양에 대한 7개의 다른 분석시 4388개의 측정치로 이루어졌다.
각 표지인자의 양은 컴퓨터 소프트웨어 통계 패키지인 통계 분석 시스템(SAS 인스티튜트 인코오포레이티드 제품)에서의 단계식 판별 절차와 선형 판별 절차에서 하나의 변수가 되어 참조 데이타 군을 산출시킨다. 임신 기간을 또한 변수로서 통합시켰다. 선형 판별 절차를 이어서 각 변수에 대해 별도로, 및/또는 변수의 여러 조합에 대해 수행하였다. 환자들은 1/365의 다운 증후군 위험 컷오프 양을 기준으로 다운 증후군 보유 또는 비보유한 군으로 분류하였다. 보유군으로 분류된 비보유 환자를 위양성으로 간주하였다. 각 환자의 다운 증후군 위험도는 베이스 규칙, 보유 및 비보유한 환자의 다변량 정상 확률 밀도 함수, 및 일반적인 1/800의 선천적 위험율을 사용하여 계산하였다. 각 확률 밀도 함수에 대해서 합한 공분산 매트릭스를 사용하였다.
제1도 내지 제3도에 제시된 표 1 내지 표 3에서 밝혀진 결과는 초기 연구 군과 관련이 있다. 제5도 내지 제7도에 제시된 표 5-7 결과는 유효 군중의 환자 분류를 기초로 한다. 제4도에 제시된 표 4 및 제8도와 제9도는 초기 연구 군과 모든 보유 환자를 기초로 한 것이다.
분석 방법을 통한 결과를 분석하여 비보유 환자와 보유 환자 사이의 각 표지인자의 수준에 있어서의 유효적 차이가 존재하는지의 여부를 결정하였다. 표 1(제1도)에서는, 보유 환자가 UE를 제외한 모든 면에서 비보유 환자와 상당히 다름을 나타낸다. 또한, 각 표지인자의 위 양성율 및 검출 효율도 표 2(제2도)에 제시된 바와 같이 결정되었다. 최고 검출 효율은 원형 분자와 유리 베타(HCG)를 측정하는 HCG 분석법으로 달성하였다. 개별표지인자를 조합체에 통합시킴으로써 검출 효율이 더욱 향상되었다. 원형 HCG 분자와 유리 베타(HCG)를 측정하는 HCG 분석법을 포함하는 조합체는 표 3(제3도)에 제시된 바와 같은 조합체 중에서 최고 검출 효율을 나타냈다.
HCG의 베타 및 알파 서브 유니트를 각각 평가함에 따라, 알파 서브 유니트에 있어서의 보유 환자와 비보유 환자 사이에 유효적 차이가 없는 반면(p.23) 유리 베타(HCG)는 보유 환자에서 상당한 증가가 관찰되었다(p.=001). 당해 기술 분야에 통상적으로 공지된 바와 같이, p는 관찰된 최대 이상의 결과가 우연히 일어날 수 있는 확률을 나타내므로써 과학적 연구에서의 증거 강도를 나타낸다. p 값이 낮을수록, 관찰이 우연한 발생이 아니라는 증거가 강해진다.
제8도는 임신 기간에 따른 유리 베타(HCG) 10, 50 및 90 백분위수를 나타낸 것이다. 비보유된 임산부에 있어서 임신 기간에 따라 지속적인 하향 추세가 관찰된다. 표 4(제4도)에 제시된 바와 같이, 태아 다운 증후군의 환자에 있어서의 유리 베타(HCG) 양의 분석은 86%에서 비보유된 환자의 중간값 이상으로 저하됨을 나타낸다.
비보유 환자와 보유 환자에 있어서의 유리 베타(HCG)의 양은 log 가우스 분포(p=0.78 및 0.86)에 적합하다. 제9도는 이들 분포를 나타낸다. 표 5(제5도)는 유리 베타(HCG)와 유리 알파(HCG)에 대한 검출 효율 데이타를 각각 제공한다. 유리 베타(HCG)의 높은 검출 효율은 표 5에 제시된다.
AFP와 유리 베타(HCG)를 조합하여 사용할 경우 상당한 높은 검출 효율이 얻어졌다. 상기된 바와 같이, 시판되는 컴퓨터 소프트웨어 통계 패키지인 통계 분서 시스템(SAS 인스티튜트 인코오포레이티드 제품)에서의 선형 판별 절차내로 유리 베타(HCG) 양의 log 값과 MSAF 양의 log 값을 병입시키므로써, 표 6(제6도)에 제시된 바와 같이 우수한 검출 효율이 수득되었다. 각 log 값과 대비하여 유리 베타(HCG)의 양 및 AFP의 양을 사용하므로써 또한 높은 검출 효율을 수득했다.
각각 AFP 및 유리 베타(HCG)에 대해 4가지 다른 임산부 연령군(연령 = 30, 31-35, 36-40 및 40)에 걸쳐 크루스칼-월리스 시험을 사용하여 데이타를 추가 분석한 바에 따르면 AFP와 유리 베타(HCG)가 임산부 연령과 무관함을 알게 되었다(p = o.8(394 및 0.5214). 또한, 유리 베타(HCG)와 AFP 양의 상관관계(r)는 거의 0 수준이다(비보유 환자와 보유 환자에 대해 각각 r=0.04, p=0.39 및 r=-0.06, p=0.81).
본원의 데이타에서 밝혀진 기초적인 관찰을 통해, 유리 베타(HCG)가 다운 증후군에 대한 최고의 검출 효율을 제공한다는 사실이 확인되었다. 사실상, 유리 베타(HCG)만을 측정하는 분석법을 사용하면 검출 효율 및 위 양성율이 각각 65.4% 및 5.2%로 산출되었다. 이 비율은 3가지 분석법의 조합에 의해 다른 문헌에 보고된 것이 필적할 만하다. 따라서, 상기된 바와 같이 분석법의 수의 감소가 본 발명의 잇점이다.
유리 베타(HCG)의 기여에 대한 본원에서의 발견은 다음 (a) 내지 (c)를 기초로 한다:
(a) 다운 증후군의 검출 효율에 대한 단일 최대 공헌인자는 유리 베타(HCG)에 대한 분석법이었다 ; (b) 원형 HCG 분자에 대한 분석법은 상당히 낮은 검출율을 산출한다 ; (c) 원형 HCG 분자와 유리 베타(HCG)의 조합을 측정하는 분석법은 원형 HCG 분자만을 측정하는 분석법보다 검출 효율이 높다.
태아 다운 증후군의 위험은 임산부 연령이 높을수록 증가한다. 따라서 상기된 바와 같이, 본 발명을 임상 용도로 사용하기 위해 환자-특이적 위험도를 산출하려면, 임산부 연령 특이적인 선천적 위험도를 다변량 판별 분석법에 통합한다. AFP와 유리 베타(HCG) 양은 모두 임산부 연령과 무관하므로, 각 개인 연령에 있어서의 선천적 위험도를 제시한 양성 결과를 보이는 비보유 및 보유 여성의 수를 알기 위해 본 발명자는 본 발명의 데이타를 분석했다. 전술한 정보를 미합중국에서 출산의 임산부 연령 분포, 미합중국내에서의 포괄적인 전극에 걸친 검색에서의 위 양성 및 감도율을 기초로 한 계획에 사용했다. 표 7(제7도)에 제시된 바와 같이, 연구 계획을 통해 검출율은 80%이고, 위양성은 5%일 수 있음을 알 수 있다.
실시예 2에 기술된 샘플을 추가로 분석하여 다른 표지인자 조합들의 검출 효율을 측정했다. 더욱 구체적으로, 동일한 위험도 컷오프값과 선천적인 위험도 준위를 사용하여 임신 기간을 포함시킨 경우와 포함시키지 않은 경우에 대하여 상이한 표지인자 조합, 표지인자에 대한 중간값의 배수(MOM) 및 표지인자의 log 값을 가지고 실시예 2의 선형 판별 절차를 실시했다. 선형 판별 절차는 참조 데이타와 유효 데이타를 둘다 사용해서 수행하였다. 그 결과를 하기 표 8과 제10도에 요약하였다.
[실시예 3]
본 실시예는 1단계 유리 베타(HCG)분석법 및 2단계 유리 베타(HCG)분석법의 제법을 예시한 것이다.
[1단계 유리 베타(HCG)분석법의 준비]
1. 96웰 미소역가 평판을 유리 베타 인융임산부 성선자극호르몬(HCG) 분자에 특이적인 포착 항체로 피복하였다. 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있다. 이 평판을 피복하는데 사용된 항체의 농도는 0.8㎍/웰이지만, 필요에 따라서는 달라질 수 있다. 평판을 4℃에서 적어도 16시간 동안 항온처리하였다.
2. 평판을 0.05% Tween 20을 함유하는 pH 7.2의 인산염 완충 식염수 용액으로 세척했다. 기타 적당한 세척 완충액을 사용할 수도 있다. 이어서 평판을 pH 7.2의 인산염 완충 식염수 용액중에 3%의 가수분해된 동물 단백질과 0.05% Tween 20을 함유하는 용액으로 차폐시켰다. 기타 당업자에게 공지된 용액, 예를들면, 1% 소 혈청 알부민 용액을 사용할 수도 있다. 차폐 용액 300μl를 각각의 웰에 첨가하고 평판을 주위온도에서 1시간 동안 항온 처리하였다.
유약도포와 같은 기타 차폐 절차도 유효하다.
3. 이어서, 전술한 바와 같이 평판을 세척하고, 유리 베타(HCG)에 특이적인 비오틴화된 항체를 함유한 분석 완충액 100μl를 각각의 웰에 첨가했다. 사용된 분석 완충액은 pH 7.2의 인산염 완충 식염수 용액중에 3%의 가수분해된 동물 단백질과 0.05%의 Tween 20을 함유하는 용액이지만, 당해 기술분야에 공지된 적당한 용액들중 어느 것이라도 사용할 수 있다. 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있으며, 취급자의 선택여부에 따라 비오틴 이외의 물질, 예컨대 양고추냉이 퍼옥시다제 또는 알칼리 포스파타제와 결합시킬 수도 있다. 분석 완충액내의 항체의 농도를 조정하여 최적의 흡광도를 얻을 수 있다.
4. 이어서 20μl의 샘플을 각각의 웰에 첨가했다. 샘플은 분석법의 성능을 입증하기 위한 블랭크로서 진행시키는 분석 완충액; 미지 샘플의 측정치를 표준화시키는데 사용되는 유리 베타(HCG)가 없는 용액; 또는 임산부로부터 제2의 3개월간 체혈한 혈청 샘플일 수 있다. 평판을 30초동안 와동시킨 후에 200rpm 이하의 회전자 Q 상에 놓고, 주위 온도에서 30분 동안 항온처리했다.
5. 이어서 평판을 전술한 바와 같이 세척했다. 양고추냉이 퍼옥시다아제에 결합된 스트렙트아비딘을 함유하는 분석 완충액 100μl를 각각의 웰에 첨가했다. 이 단계는 비오틴 이외의 물질에 결합된 제2의 항체를 사용할 경우에는 불필요하다. 분석 완충액중의 스트렙트아비딘 퍼옥시다제의 농도는 2.0㎍/ml이다. 평판을 주위 온도에서 5분동안 200rpm하의 회전자Q상에 놓는다.
6. 이어서 평판을 전술한 바와 같이 세척했다. o-페닐렌디아민 기질 용액 100μl를 각각의 웰에 첨가했다. 이 기질 용액은 당해 기술 분야에 공지된 다수의 적절한 염료들중 어느 것이라도 선택적으로 사용할 수 있으며, 제2항체에 결합된 물질이 어떤 것인지에 좌우된다. 평판을 200rpm하의 회전자Q상에 놓고 암실에서 8분동안 주위 온도하에 항온 처리했다.
7. 묽은 황산(1.0N) 100μl를 각각의 웰에 첨가하여 기질의 반응을 종료시켰다.
8. 각각의 웰의 흡광도를 492mm에서 분광분석기에 의해 측정했다.
[2단계 유리 베타(HCG)분석법의 준비]
1. 96웰 미소역가 평판을 유리 베타(HCG) 분자에 특이적인 포착 항체로 피복하였다. 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있다. 이 평판을 피복하는데 사용된 항체의 농도는 0.8㎍/웰이지만, 필요에 따라서는 달라질 수 있다. 평판을 4℃에서 적어도 16시간 동안 항온처리하였다.
2. 평판을 0.05% Tween 20을 함유하는 pH 7.2의 인산염 완충 식염수 용액으로 세척했다. 기타 적당한 세척 완충액을 사용할 수도 있다. 이어서 평판을 pH 7.2의 인산염 완충 식염수 용액중에 3%의 가수분해된 동물 단백질과 0.05% Tween 20을 함유하는 용액으로 차폐시켰다. 기타 당업자에게 공지된 용액, 예를들면, 1% 소 혈청 알부민 용액을 사용할 수도 있다. 차폐 용액 300μl를 각각의 웰에 첨가하고 평판을 주위온도에서 1시간 동안 항온 처리하였다. 유약도포와 같은 기타 차폐 절차도 유효하다.
3. 이어서, 전술한 바와 같이 평판을 세척하고, 분석 완충액 100μl를 각각의 웰에 첨가했다. 사용된 분석 완충액은 pH 7.2의 인산염 완충 식염수 용액중에 3%의 가수분해된 동물 단백질과 0.05%의 Tween 20을 함유하는 용액이지만, 당해 기술분야에 공지된 적당한 용액들중 어느 것이라도 사용할 수 있다.
4. 이어서 20μl의 샘플을 각각의 웰에 첨가했다. 샘플은 분석법의 성능을 입증하기 위한 블랭크로서 진행시키는 분석 완충액; 미지 샘플의 측정치를 표준화시키는데 사용되는 유리 베타(HCG)가 없는 용액; 또는 임산부로부터 제2의 3개월간 체혈한 혈청 샘플일 수 있다. 평판을 30초동안 와동시킨 후에 200rpm 이하의 회전자상에 놓고, 주위 온도에서 30분 동안 항온처리했다.
5. 이어서 평판을 전술한 바와 같이 세척하고, 유리 베타(HCG)에 특이적인 비오틴화된 항체를 함유하는 분석 완충액 10μl를 각각의 웰에 첨가했다. 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있으며, 취급자의 선택여부에 따라 비오틴 이외의 물질, 예컨대 양고추냉이 퍼옥시다제 또는 알칼리 포스파타제와 결합시킬 수도 있다. 항체의 농도를 조정하여 최적의 흡광도를 얻을 수 있다. 평판을 30초동안 와동시킨 후에 200rpm하의 회전자 상에 놓고 주위 온도에서 30분동안 항온 처리하였다.
6. 이어서 평판을 전술한 바와 같이 세척했다. 양고추냉이 퍼옥시다제에 결합된 스트렙트아비딘을 함유하는 분석 완충액 100μl를 각각의 웰에 첨가했다. 이 단계는 비오틴 이외의 물질에 결합된 제2의 항체를 사용할 경우에는 불필요하다. 분석 완충액중의 스트렙트아비딘 퍼옥시다제의 농도는 2.0㎍/ml이다. 평판을 주위 온도에서 5분 동안 200rpm하의 회전자상에 놓는다.
7. 이어서 평판을 전술한 바와 같이 세척했다. o-페닐렌디아민 기질 용액 100μl를 각각의 웰에 첨가했다. 이 기질 용액은 당해 기술 분야에 공지된 다수의 적절한 염료들중 어느 것이라도 선택적으로 사용할 수 있으며, 제2항체에 결합된 물질이 어떤 것인지에 좌우된다. 평판을 200rpm하의 회전자상에 놓고 암실에서 8분동안 주위 온도하에 항온 처리했다.
8. 묽은 황산(1.0N) 100μl를 각각의 웰에 첨가하여 기질의 반응을 종료시켰다.
9. 각각의 웰의 흡광도를 492mm에서 분광분석기에 의해 측정했다.
상기 2가지 분석법을 사용하여 본 발명의 방법을 수행했다 178명의 환자의 액상 혈액 샘플을 이용하여 임산부 혈액중의 유리베타 HCG의 양에 대한 태아 다운 증후군의 상관관계를 연구하였다. 다운 증후군 태아를 임신한 것으로 알려진 임산부로부터 얻은 26가지 샘플 및 152가지의 병에 걸리지 않은 미지의 샘플을 분석하였다. 모든 샘플은 당뇨가 없는 백인의 단태아-임산부로부터 얻었다.
이어서 환자의 샘플을 가지고 ELISA 분석법으로 MSAFP의 정량적인 수준에 대해서, 그리고 각각 1단계 분석법 및 2단계 분석법에 의해 유리 베타(HCG)의 농도를 분석하였다. 이어서 각각의 분석법에 의한 MSAFP의 농도 및 유리 베타(HCG)의 농도를 시판되는 컴퓨터 소프트웨어 통계 패키지인 통계학적 분석 시스템에 대한 선형 판별 절차중의 변수로 사용하여 일군의 참조 데이타를 만들었다. 또한 환자의 임신 기간을 판별 절차에 변수로서 통합시켰다. 임신 전기간 14 내지 16주 임신 기간에 대한 판별 분석의 결과를 이하에 요약하였다.
주 : 모든 분석 결과는 임신 기간을 산입시킨 것임
*로 표시한 분석에서는 수치 260과 316을 갖는 2명의 국외자를 제외시켰음.
접미사-1은 1단계 절차를, 그리고 -2는 2단계 절차를 의미함.
검출 효율은 양성 시험 결과를 나타내는 태아 다운 증후군 환자의 비율을 언급함 것임.
위양성은 양성 시험 결과를 나타내는 정상 태아의 비율을 언급한 것임.
대조군은 분석된 다운증후군을 보유하지 않은 샘플의 수를 의미함.
다운증후군 보유군은 분석된 다운증후군을 보유한 샘플의 수를 의미함.
유리 베타(HCG) 및 AFP에 대한 1단계 분석법의 조합을 사용하여 임신 전기간 및 임신 14-16주 동안 위양성율을 최저로 함과 동시에 최고의 검출 효율을 산출시킨다.
상기 결과는 산전 혈청 검색법 범위내에서 실행가능하고 효과적인 방식으로 다운 증후군을 검색할 수 있는 성능을 지지해주며, 이 검색법은 (a) 비관혈적 기법, (b)위양성율이 낮은 고도의 검출 효율, (c)대부분 상호 독립적인 표지인자의 사용, (d)혈액 채취시 취급 곤란한 제한요건(분만기, 음식, 개인습관등)의 부재, 및 (e)다른 산전 검색 서비스들과의 양립성을 포함한다.
[실시예 4]
본 실시예는 본 발명의 방법을 임신 첫 3개월 동안의 다운 증후군에 대한 검색에 사용하는 방법을 예시한 것이다. 150명의 환자로부터 얻은 임산부 혈청 샘플을 이용하였다. 각각의 환자는, 샘플 채취 당시에 임신 기간이 9-13주인 태아를 임신한 상태였다. 139인의 환자는 다운 증후군이 없는 태아를 임신한 상태로서 이를 '대조군'으로 언급하였으며, 11명의 환자는 다운 증후군에 걸린 태아를 임신한 상태였다. 각각의 환자는 당뇨가 없고 단태아를 임신한 백인 여성이었다.
150가지 임산부 혈청 샘플 각각에 존재하는 유리 베타의 농도는 상기 실시예 3에 기술한 2단계 유리 베타(HCG)분석법을 이용하여 분석했다. 그 분석 결과는 제15도에 도시하였다. 제15도에 도시한 바와 같이, 다운 증후군에 걸린 태아를 임신한 환자들의 임산부 혈청중에 존재하는 유리 베타의 중간치 농도는 대조군의 임산부 혈청중에 존재하는 유리 베타의 중간치 농도보다 더 큰 2.45MOM(중간치의 배수)이었다. 이러한 다운증후군에 걸린 태아를 임신한 환자중의 유리 베타(HCG)의 농도는 대조군중의 유리 베타(HCG)의 농도보다 상당히 컸다. 따라서, 다운 증후군에 걸렸을 때 최초 3개월내에 유리 베타 단백질은 크게 증가한다.
[실시예 5]
본 실시예도 본 발명의 방법을 임신 첫 3개월 동안의 다운 증후군에 대한 검색에 사용하는 방법을 예시한 것이다. 277명의 환자로부터 얻은 임산부 혈청 샘플을 이용하였다. 각각의 환자는, 샘플 채취 당시에 임신 기간이 7~13주인 태아를 임신한 상태였다. 264명의 환자는 다운 증후군이 없는 태아를 임신한 상태로서 이를 '대조군'으로 언급하였으며, 13명의 환자는 다운 증후군에 걸린 태아를 임신한 상태였다. 각각의 환자는 당뇨가 없고 단태아를 임신한 백인 여성이었다.
277가지 임산부 혈청 샘플 각각에 존재하는 유리 베타(HCG)의 농도는 상기 실시예 3에 기술한 2단계 유리 베타(HCG) 분석법을 이용하여 분석했다. 그 분석 결과는 제16도에 도시하였다. 제16도에 도시한 바와 같이, 다운 증후군에 걸린 태아를 임신한 임산부 환자들의 임산부 혈청중에 존재하는 유리 베타(HCG)의 중간치 농도는 대조군의 임산부 혈청중에 존재하는 유리 베타의 중간 농도보다 더 큰 1.82MOM(중간치의 배수)이었다. 이러한 다운증후군에 걸린 태아를 임신한 환자중의 유리 베타(HCG)의 농도는 대조군중의 유리 베타(HCG)의 농도보다 상당히 컸다. 따라서, 다운 증후군에 걸렸을 때 최초의 3개월내에 유리 베타 단백질은 크게 증가한다.
[실시예 6]
본 실시예도 마찬가지로 본 발명의 방법을 임신 첫 3개월 동안의 다운 증후군에 대한 검색에 사용하는 방법을 예시한 것이다. 융모막 융모 샘플(CVS) 절차를 처치받도록 선택된 392명의 환자로부터 임산부 혈청 샘플을 채취했다. CVS 절차는 염색체 분석 핵형별을 위해 융모막 융모의 샘플을 입수하는 임상 기법이다. 본 실시예에 사용된 혈청 샘플은 환자를 CVS 절차로 처리하기 전에 환자로부터 채취했다. 통상, 이 기법은 35세 또는 그 이상의 환자들, 즉 다운 증후군에 걸린 태아를 임신할 빈도가 높은 것으로 알려진 그룹을 이용하거나, 또는 가족중 염색체 이상 이력이 있는 환자들을 이용한다.
각각의 환자는 샘플 채취 당시에 임신 기간 9~13주의 태아를 임신한 상태였다. 386명의 환자는 다운 증후군이 없는 태아를 임신한 상태로서 이를 '대조군'으로 언급하였으며, 6명의 환자는 다운 증후군에 걸린 태아를 임신한 상태였다. 각각의 환자는 당뇨가 없고 단태아를 임신한 백인 여성이었다.
392가지 임산부 혈청 샘플 각각에 존재하는 유리 베타(HCG)의 농도는 상기 실시예 3에 기술한 2단계 유리 베타(HCG) 분석법을 이용하여 분석했다. 그 분석 결과는 제17도에 도시하였다. 제17도에 도시한 바와 같이, 다운 증후군에 걸린 태아를 임신한 환자들의 임산부 혈청중에 존재하는 유리 베타(HCG)의 중간치 농도는 대조군의 임산부 혈청중에 존재하는 유리 베타(HCG)의 중간치 농도보다 더 큰 2.94 MOM(중간치의 배수)이었다. 농다운증후군에 걸린 태아를 임신한 환자중의 유리 베타(HCG)의 농도는 대조군중의 유리 베타(HCG)의 농도보다 상당히 컸다. 따라서, 다운 증후군에 걸렸을 때 최초 3개월내에 유리 베타 단백질은 크게 증가하였다.
본 실시예는 또한 전술한 바와 같은 본 발명의 방법을 임신 첫 3개월 또는 그 다음 제2의 3개월간의 기간동안 다운 증후군에 대한 비관혈적 검색에 이용할 수 있음을 예시한다. 본 명세서에서 임신 첫 3개월이라 함은 임신 기간이 14주 이전인 기간을 언급한 것이다. 이와 유사하게 임신 제2의 3개월이라 함은 임신 기간이 14주 내지 26주인 기간을 언급한 것이다.
예를 들면, 실험실에서 임신 첫3개월 동안에 얻은 임산부 혈청 샘플중의 유리 베타(HCG) 농도를 포함하는 일군의 임신 주간 특이적인 참조 데이타를 만들 수 있다. 이러한 참조 데이타는 실시예에 전술한 것과 대등한 방식으로 만들 수 있다.
태아 다운 증후군을 검색하기 위해, 실험실에서는 임신 첫3개월 동안 환자로부터 얻은 혈액 샘플중의 유리 베타(HCG)의 농도를 측정학 참조 데이타와 비교하여, 그 환자가 다운증후군인 태아를 임신하고 있을 충분한 위험 상태에 있어서 추가 시험을 정당화 하는지를 결정할 수도 있다. 본 명세서에 게시된 바와 같이, 이와 같은 실험실적 측정은 환자가 다운 증후군에 걸린 태아를 임신할 후천적인(검색후) 위험도를, 염색체 분석용 태아 세포를 얻기 위한 관혈적인 절차의 환자 및 태아에 대한 위험도를 반영한 소정의 컷오프 준위와 비교할 필요가 있다.
실험실에서는 양성 검색 결과를 측정하기 위해 중간치 배수값 접근 방법을 사용할 수 있다. 예컨대, 실시예 4에 일군의 참조 데이타로서 전술한 바와 같은 데이타를 사용하면, 그 참조 데이타는 다운 증후군이 아닌 태아를 임신한 여성의 경우보다 다운 증후군 태아를 임신한 여성의 경우 유리 베타(HCG)의 중간치 농도가 2.45배 크다는 것을 나타내고 있다. 중간치 배수값 접근 방법을 검색에 사용하고, 환자의 샘플중의 유리 베타(HCG)의 농도가 소정의 컷오프 준위보다 클 경우, 예를들면 대조군의 유리 베타(HCG)의 농도보다 중간치의 2.5배수만큼 클 경우, 그 실험실은 그 임산부에게 자신의 태아가 다운 증후군을 갖고 있는지 진단하기 위한 차후의 관혈적 시험을 받아야만 한다고 권고할 수 있다.
이러한 검색 방법은, 단일의 피분석물에 대한 중간치 배수값 접근 방법에 따라, 다수의 피분석물을 이용하는 검색 절차 및 다변량 판별 분석 접근방법, 예컨대 실시예 1에 기술된 것과 같은 정도로 정확하지 않을 수도 있다는 점을 유의해야 한다.
[실시예 7]
본 실시예는 유리 베타(HCG)의 측정에 이용된 특정의 면역분석법이 틈이 있는 유리 베타(HCG)도 또한 측정할 수 있음을 예시한다.
틈이 있는 유리 베타(HCG)는 다음과 같이 제조했다. 캘리포니아, 라호야에 소재하는 스크립스 레보러토리즈에서 제조 및 판매하는 hCG-β-서브유니트(스크립스 카타로그 번호 C0904)를 탈이온수에 212㎍/ml로 희석시킨 용액을 미주리, 세인트 루이스 소재의 시그마 케미칼 컴패니에서 제조 및 판매하며 0.5M NaCL 과 1g Brij/리터를 함유하는 pH 8.5의 0.1M Tris-HCl 중에서 조제한 100μl의 hLE(0.3단위)(hLE=인체 백혈구 엘라스타제)에 첨가했다. 혼합물을 37℃에서 항온 처리했다. 그 혼합물로부터 0, 60, 120 및 180분째에 샘플을 채취했다. 각각의 샘플에 10mg/ml의 콩 트립신 억제제를 10μl를 첨가하여 β HCG와 hLE 간의 반응을 중지시키므로써 틈이 있는 유리 베타(HCG)의 더 이상의 형성을 중단시켰다. 4종의 샘플 즉, 유리 베타(HCG)(0분 채취 샘플) 1종 틈이 있는 유리 베타(HCG)(60, 120 및 180분 채취 샘플)를 함유하는 3종의 샘플을 다음과 같이 분석했다.
안정제와 방부제를 함유하는 pH 7.2의 PBS(인산염 완충 식염수 용액)을 사용하여, 단계식으로, 초기 샘플을 절반 농도로 희석시키므로써 각 샘플에 대해 7가지의 추가의 농도를 갖는 샘플을 제조했다. 즉, 각각의 샘플에 대해 8가지 농도, 100%, 50%, 25%, 12.5%, 6.25%, 3.125%, 1.5625%, 0.78125%(%=초기 샘플을 기준으로 한 %)의 샘플을 조제했다. 8가지 농도로 된 각각의 샘플(0, 60, 120 및 180분째 채취한 샘플)을 상기 실시예 3에 기술된 2단계 유리 베타(HCG) 분석법을 이용하고, 2가지 상이한 쌍으로 된 포착/검출 항체를 사용하여 2회 분석하였다. 그 결과는 다음과 같다.
각각의 분석에 있어서, 0분 동안 항온처리한 샘플중의 유리 베타(HCG)의 측정농도에 비해 hLE와 함께 60, 120 및 180분 동안 항온처리한 샘플중의 유리 베타(HCG)의 측정 농도가 약간 상승했다. 각 분석에 대한 평균 변화율(%)은 시험한 8가지 농도에 대하여 180분 샘플대 0분 샘플을 비교해 볼 때 각각 102.1%(96.2%-107.6% 범위) 및 112.4%(106.3%-121.7%범위)였다.
제1항체 쌍에 있어서, 샘플중의 틈이 있는 유리 베타(HCG) 증가율의 인식은 유리 베타(HCG)에 대한 면역반응성의 정도를 크게 변화시키지 않았다. 제2항체 쌍은 제1항체 쌍보다 틈이 있는 유리 베타(HCG)에 대해서 더욱 큰 친화도를 가졌다. 제2항체 쌍의 경우에, 변화도는 0에서 60분 까지의 범위(110.5% 변화); 및 0분 내지 120분 까지의 범위(115.1% 변화)에 걸쳐 증가하였다. 180분에서 변화율(%)은 120분에서의 변화율(%)에 비해 증가하지 않았다. 제2항체 쌍에 대한 평균 변화율(%)은 112.7%였다. 따라서, 제1항체 쌍은 유리 베타(HCG) 및 틈이 있는 유리 베타(HCG)에 대해서 반응성이 동등하며, 제2항체 쌍은 제1항체 쌍에 비해 틈이 있는 유리 베타(HCG)에 비해 반응성이 더 크다(+12%).
이러한 결과는 틈이 있는 유리 베타(HCG) 및 유리 베타(HCG)를 모두 측정하는 분석법을 다운 증후군에 대한 검색법에 사용할 수 있다는 것을 뒷받침해준다. 그와 같은 분석법을 본 발명의 방법에 사용할 경우 약 80%의 검출 효율이 제공될 것으로 예기된다.
상기 결과는 다른 방법에 의해 제안된 것보다 작은 횟수의 생화학적 분석을 수행하면서 동시에 다운 증후군 검색에 있어서 더 높은 검출율을 얻을 수 있음을 시사한다. 다운 증후군 검색에 고도로 유효한 표지인자를 사용하는 방법은 심각한 정신 박약의 가장 흔한 원인인 다운 증후군에 걸린 대부분의 가족에게 산전 초기에 비관혈적 검색 정보를 제공할 수 있다.
당업자에게는 양성의 위험 컷오프 준위를 변화시키거나, 실험군중의 여러 아군들에 적용할 수 있는 상이한 선천적 위험도를 사용하는 것이 환자의 판별 절차의 결과를 변경시킬 수 있다는 것은 자명한 것이다.
따라서, 본 발명은 첨부된 특허청구범위내에 포함되는 모든 변경예들까지도 포함하는 것으로 파악되어야 함은 물론이다.

Claims (11)

  1. 임산부의 혈액내 존재하는 유리 베타(인융모성 성선자극 호르몬(HCG))의 양을 임신 첫 3개월 동안 측정하는 단계; 및 이 유리 베타(HCG)의 양을, (1) 다운 증후군인 태아를 임신한 임산부 및 (2) 정상 태아를 임신한 임산부중에 존재하는 유리 베타(HCG)의 양에 대해 상기 임신 첫 3개월동안 측정한 참조값과 비교하는 단계로 구성되는 다운 증후군인 태아를 임신하고 있는 임산부의 위험도를 진단하는 검색 방법으로서, 상기 비교 단계는 보다 높은 유리 베타(HCG) 양이 다운 증후군인 태아를 임신하고 있을 보다 높은 확률을 나타내는 다운 증후군인 태아를 임신하고 있는 임산부 위험의 지표인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 임산부의 혈액내 존재하는 알파-페토프로테인(AFP)의 양을 상기 임신 첫 3개월 동안 측정하는 단계, 및 (1) 다운 증후군인 태아를 임신한 임산부와 (2) 정상 태아를 임신한 임산부중에 존재하는 AFP 양에 대해 상기 임신 첫 3개월동안 측정한 참조값을 상기 비교 단계에 통합시키는 단계를 추가로 포함하며, 낮은 AFP 양이 다운 증후군인 태아를 임신하고 있을 보다 높은 확률의 위험도를 나타내는 방법.
  3. 임산부의 혈액내 존재하는 유리 베타(인융모성 성선자극 호르몬(HCG))의 단백질부; 유리 베타(HCG)의 탄수화물부; 및 유리 베타(HCG)의 탄수화물부와 단백질부의 접합부에 대략 위치한 유리 베타(HCG)의 부로 구성된 군중에서 선택된 피분석물의 양을 임신 첫 3개월동안 측정하는 단계; 이 피분석물의 양의 측정값을 (1) 다운 증후군인 태아를 임신한 임산부 및 (2) 정상 태아를 임신한 임산부중에 존재하는 상기 피분석물의 양에 대해 상기 임신 첫 3개월동안 측정한 참조값을 포함하는 참조 데이타와 비교하는 단계로 구성되는, 임산부가 다운 증후군인 태아를 임신하고 있는 위험도를 진단하는 방법으로서, 상기 비교 단계는 보다 높은 피분석물 양이 다운 증후군인 태아를 임신하고 있을 보다 높은 확률을 나타내는 임산부 위험의 지표인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 임산부의 혈액내 존재하는 알파-페토프로테인(AFP)의 양을 상기 임신 첫 3개월 동안 측정하는 단계, 및 (1) 다운 증후군인 태아를 임신한 임산부와 (2) 정상 태아를 임신한 임산부중에 존재하는 AFP 양에 대해 상기 임신 첫 3개월동안 측정한 참조값을 상기 비교 단계에 통합시키는 단계를 추가로 포함하며, 상기 비교 단계는 낮은 AFP 양이 다운 증후군인 태아를 임신하고 있을 보다 높은 확률의 위험도를 나타내는 방법.
  5. 다운 증후군인 태아를 임신하고 있는 임산부의 위험도가, 임산부의 혈액내 존재하는 피분석물의 양을 임신 첫 3개월동안 측정하는 단계; 유리 베타(HCG)에 대하여 유발된 항체를 이용하는 분석법을 사용하여 상기 피분석물의 양을 (1) 다운 증후군인 태아를 임신한 임산부 및 (2) 정상 태아를 임신한 임산부중에 존재하는 상기 피분석물의 양에 대해 상기 임신 첫 3개월동안 측정한 참조값을 포함하는 일군의 참조 데이타와 비교하는 단계로 구성되는 추가의 시험법을 정당화 하는지를 진단하는 방법으로서, 상기 비교 단계는 보다 높은 피분석물 양이 다운 증후군의 태아를 임신하고 있을 보다 높은 확률을 나타내는 다운 증후군인 태아를 임신하고 있는 임산부 위험의 지표인 방법.
  6. 다운 증후군인 태아를 임신하고 있는 임산부의 위험도가, 임산부의 혈액내 존재하는 피분석물의 양을 임신 첫 3개월동안 측정하는 단계; 및 유리 베타(HCG)에 대한 분석법을 사용하여 상기 피분석물의 양을 다운 증후군인 태아를 임신한 임산부 및 정상 태아를 임신한 임산부중에 존재하는 상기 피분석물의 양에 대해 상기 임신 첫 3개월동안 측정된 참조값을 포함하는 일군의 참조 데이타와 비교하는 단계로 구성되는 추가의 시험법을 정당화 하는지를 진단하는 방법으로서, 상기 비교 단계는 보다 높은 피분석물 양이 다운 증후군인 태아를 임신하고 있을 보다 높은 확률을 나타내는 다운 증후군인 태아를 임신하고 있는 임산부 위험의 지표인 방법.
  7. 제1항, 제2항, 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 유리 베타(HCG)가 유리 베타(HCG)의 변이 형태인 방법.
  8. 임산부의 혈액내 존재하는 틈이 있는(nicked) 유리 베타(인융모성 성선자극 호르몬(HCG))의 양을 임신 첫3개월간, 임신 제2의 3개월간, 및 임신 제3의 3개월간으로 구성된 군중에서 선택된 기간동안 측정하는 단계; 및 이 유리 베타(HCG)의 양을 (1) 다운 증후군인 태아를 임신한 임산부 및 (2) 정상 태아를 임신한 임산부중에 존재하는 유리 베타(HCG)의 양에 대해 상기 기간동안 측정한 참조값을 포함하는 참조 데이타와 비교하는 단계로 구성되는, 임산부가 다운 증후군인 태아를 임신하고 있는 위험도를 진단하는 방법으로서, 상기 비교 단계는 틈이 있는 보다 높은 유리 베타(HCG)의 양이 다운 증후군인 태아를 임신하고 있을 보다 높은 확률을 나타내는 임산부 위험의 지표인 방법.
  9. 임산부의 혈액내 존재하는 유리 베타(인융모성 성선자극 호르몬(HCG))의 단편의 양을 임신 첫 3개월동안 측정하는 단계; 및 이 유리 베타(HCG)의 단편의 양을 (1) 다운 증후군인 태아를 임신한 임산부 및 (2) 정상 태아를 임신한 임산부중에 존재하는 유리 베타(HCG)의 단편의 양에 대해 상기 임신 첫 3개월동안 측정한 참조값을 포함하는 참조 데이타와 비교하는 단계로 구성되는, 임산부가 다운 증후군인 태아를 임신하고 있는 위험도를 진단하는 방법으로서, 상기 비교 단계는 보다 높은 유리 베타(HCG)의 단편의 양이 다운 증후군인 태아를 임신하고 있을 보다 높은 확률을 나타내는 임산부 위험의 지표인 방법.
  10. 임산부의 소변중에 존재하는 유리 베타(인융모성 성선*자극 호르몬(HCG))의 양을 임신 첫3개월간, 임신 제2의 3개월간, 및 임신 제3의 3개월간으로 구성된 군중에서 선택된 기간동안 측정하는 단계; 및 이 유리 베타(HCG)의 양을 (1) 다운 증후군인 태아를 임신한 임산부 및 (2) 정상 태아를 임신한 임산부중에 존재하는 유리 베타(HCG) 양의 참조값과 비교하는 단계로 구성되는 다운 증후군인 태아를 임신하고 있는 임산부의 위험도를 진단하는 검색 방법으로서, 상기 비교 단계는 다운 증후군인 태아를 임신하고 있는 임산부 위험의 지표인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 측정 단계가 생체 감응 장치를 이용하므로써 수행되는 방법.
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