KR100317952B1 - 세팔로스포린c생산 신규한 미생물 및 이를 이용한 세팔로스포린c의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 미생물 세포의 미토콘드리아에서 일어나는 산화적 인산화반응의 차단제인 소디움아지드(NaN3)에 내성을 나타내며 세팔로스포린 C를 고농도로 생산하는 미생물 세팔로스포리움 아크레모니움(Cephalosporium acremonium; KFCC 10782)의변이주 및 이 미생물 변이주를 이용한 고농도 세팔로스포린 C의 제조방법에 관한 것으로 소디움아지드의 농도가 32.5mg/L이상인 조건에서도 생육가능한 미생물 세팔로스포리움 아크레모니움(KFCC 10782)의 변이주를 선별한 후 이를 세팔로스포리움 아크레모니움 SA755(KFCC 11058)로 명명하고 이성화액당, 혼합오일, 땅콩분, 콘스팁리커, 암모늄 설페이트 등이 함유된 배지 중에서 상기 선별한 미생물 변이주 세팔로스포리움 아크레모니움 SA755를 배양하므로써 저산소 상태인 일반적인 발효조의 조건에서도 세팔로스포린 C를 대량으로 생산하는 뛰어난 효과가 있다.
Description
본 발명은 세팔로스포린 C를 생산하는 신규한 미생물 및 이를 이용한 세팔로스포린 C의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 미생물 세포의 미토콘드리아에서 일어나는 산화적 인산화반응의 차단제인 소디움아지드(NaN3)에 내성을 나타내며 세팔로스포린 C를 고농도로 생산하는 미생물 세팔로스포리움 아크레모니움(Cephalosporium acremonium; KFCC 10782)의 변이주 및 이 미생물 변이주를 이용하여 세팔로스포린 C를 고수율로 제조하는 방법에 관한 것이다.
종래의 세팔로스포린 C 생산균주는 산소요구성이 매우 높아 발효가 진행됨에 따라 용존산소량이 30% 수준 이하가 되면 세팔로스포린 C의 생산성이 급격하게 떨어진다. 따라서 발효중 산소요구성을 충족시키기 위해 발효조의 통기, 교반 및 내압을 상승시키거나 순수 산소를 공급하였다. 그러나 일반적으로 2차 대사 발효인 세팔로스포린 C 발효의 경우 균증식, 균체량 및 발효조의 한계성으로 인하여 용존산소의 부족현상이 나타나게 되고 결과적으로 균체의 성장이 저해되거나 세팔로스포린 C의 생합성 경로중 산화반응이 저해되어 세팔로스포린 C의 생산성이 낮아지는 단점이 있었다.
본 발명은 상기 문제점을 해결하고자 안출한 것으로 이화효소(Catalase)나 철매개성효소(Fe enzyme) 및 미생물 세포의 미토콘드리아에서 일어나는 산화적 인산화반응의 차단제인 소디움아지드(NaN3)의 존재하에서도 정상적인 성장을 하는 변이주를 선별 제공하므로써 완성하였다.
본 발명의 목적은 미생물 세포의 미토콘드리아에서 일어나는 산화적 인산화 반응의 차단제인 소디움아지드(NaN3)에 내성을 나타내며 세팔로스포린 C를 고농도로 생산하는 미생물 변이주를 제공함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 미생물 변이주를 저산소 상태에서 발효배양하는 고농도 세팔로스포린 C의 제조방법을 제공함에 있다.
본 발명의 상기 목적은 소디움아지드의 농도가 32.5mg/L 이상인 조건에서도 생육가능한 미생물 세팔로스포리움 아크레모니움(KFCC 10782)변이주를 선별한 후 이성화액당, 혼합오일, 땅콩분, 콘스팁리커, 암모늄 설페이트 등이 함유된 배지 중에서 상기 선별한 미생물 변이주를 배양하여 세팔로스포린 C를 고농도로 생산하므로써 달성하였다.
이하, 본 발명의 구체적인 구성 및 작용을 상세히 설명한다.
본 발명은 세팔로스포리움 아크레모니움(KFCC 10782) 친주에 변이 유발제를 처리하고 배양한 후 소디움아지드 최소저해농도를 함유하는 배지에서 자라는 변이주를 분리한 후 저산소 조건에서 세팔로스포린 C를 고농도로 생산하는 변이주를 선별하는 단계; 친주인 세팔로스포리움 아크레모니움과 상기 선별한 변이주의 소디움아지드에 대한 내성을 비교 조사하는 단계; 친주인 세팔로스포리움 아크레모니움과 상기 선별한 변이주의 산소 소비량을 측정하여 비교하는 단계; 친주인 세팔로스포리움 아크레모니움과 상기 선별한 변이주의 산소 소모속도 및 이산화탄소 배출속도를 측정하는 단계; 친주인 세팔로스포리움 아크레모니움과 상기 선별한 변이주를 배양하면서 일정 수준의 용존산소를 유지시키기 위한 내압 및 RPM을 측정하는 단계 및; 친주인 세팔로스포리움 아크레모니움과 상기 선별한 변이주를 각각 발효배양하여 생성된 세팔로스포린 C의 생성량을 비교하는 단계로 구성된다.
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예와 실험예를 들어 구체적으로 설명하지만 본 발명의 권리범위가 이들 실시예와실험예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 세팔로스포린 C를 고농도로 생산하는 변이주 선별
본 실시예에서는 세팔로스포리움 아크레모니움(KFCC 10782)을 친주로 하여 자외선 조사, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 등의 변이 유발제로 변이 처리한 후 이 변이주를 소디움아지드가 6.5 ∼ 65mg/L의 농도로 함유되어 있는 액체또는 한천배지(포도당 10g/L, 아스파라긴 1g/L, 황산마그네슘 0.5g/L, 인산 제 1 칼륨, 0.5g/L, 인산 제2 칼륨 1g/L, pH7.0)에서 7 ~ 10일간 배양하였다. 이때, 고농도의 소디움아지드에 대해 내성을 갖는 균주는 생육이 가능하므로 소디움아지드가 최소저해 농도(Minimum Inhibitory Concentration:MIC)로 함유된 배지에서 자라는 변이주를 분리하였으며 이들 변이주들 중에서 용존산소가 30% 이하인 저산소 조건에서도 세팔로스포린 C를 고농도로 생산하는 변이주만을 별도로 선별하였으며 선별한 미생물 변이주의 균학적 성질은 소디움 아지드 내성, 상대적으로 낮은 산소요구성 및 세팔로스포린 C 생산성을 제외하고는 친주의 그것과 동일하였다.
본 발명자들은 상기 방법에 따라 선별된 변이 균주를 세팔로스포리움 아크레모니움 SA755(Cephalosporium acremoniumSA755)라 명명하고, 이를 1998년 11월 23일자로 사단법인 한국종균협회에 기탁하여 KFCC 11058의 기탁번호를 부여받았다.
실험예 1: 소디움아지드에 대한 내성
친주인 세팔로스포리움 아크레모니움(KFCC 10782)과 본 발명의 변이주 세팔로스포리움 아크레모니움 SA755(KFCC 11058)를소디움아지드의 함량을 변화시킨 조건에서 배양하였으며 생육여부에 따라 소디움아지드에 대한 내성을 하기 표 1에서 나타낸 바와 같이 비교하였다. 실험결과, 본 발명의 변이주 세팔로스포리움 아크레모니움 SA755는 친주 세팔로스포리움 아크레모니움에 비하여 소디움아지드의 내성이 우수하였다.
실험예 2: 산소 소비량의 측정
본 실험예에서는 친주인 세팔로스포리움 아크레모니움과 본 발명의 변이주 세팔로스포리움 아크레모니움 SA755의 균체당산소소비량을 비교하기 위하여 삼각플라스크에서 배양한 균체 동량의 산소 소비량을 Warburg 장치로 측정하여 그 상대값을 표 2에 나타냈다. 실험결과, 본 발명의 변이주는 친주에 비하여 균체당 산소 소비량이 현저히 낮았다.
실험예 3: 산소 소모속도 및 이산화탄소 배출속도 측정
본 실험예에서는 친주인 세팔로스포리움 아크레모니움과 본 발명의 변이주세팔로스포리움 아크레모니움 SA755의 산소 요구성을 비교하기 위하여 산소 소모속도(Oxygen Uptake Rate)와 이산화탄소 배출속도(Carbon dioxide Evolution Rate)를 30L 발효조에서 측정하여 표 3에 나타냈다. 실험결과, 초기에는 변이주 세팔로스포리움 아크레모니움 SA755의 산소 소모속도와 이산화탄소 배출속도가 친주보다 빨랐으나 시간이 지남에 따라 친주 세팔로스포리움 아크레모니움의 산소소모속도및 이산화탄소 배출속도가 급속히 증가하여 변이주 세팔로스포리움 아크레모니움 SA755보다 휠씬 빨랐다.
실험예 4 : 내압 및 RPM 측정
본 실시예에서는 친주인 세팔로스포리움 아크레모니움과 본 발명의 변이주 세팔로스포리움 아크레모니움 SA755을 30L 발효조에서 배양하여 용존산소를 최소 30% 수준으로 유지시키기 위해 필요한 내압 및 RPM을 측정하였다. 실험결과, 표 4에나타낸 바와 같이 변이주 세팔로스포리움 아크레모니움 SA755가 친주 세팔로스포리움 아크레모니움보다 산소요구도가 낮았다.
실시예 2 : 세팔로스포린 C 제조
본 실시예에서는 상기 상기 실험예 2, 실험예 3 및 실험예 4에서 산소 요구도가 매우 낮은 특성을 나타낸 변이주 세팔로스포리움 아크레모니움 SA755 (KFCC 11058)를 이성화액당, 혼합오일, 땅콩분, 콘스팁리커 및 암모늄설페이트 등이 함유된배지에서 배양하여 세팔로스포린 C를 제조하였다.
대두분 1.0%, 콘스팁리커 0.75%, 설탕 2.5%, 포도당 1.0%, 탄산칼슘 0.5% 및 소포제 0.14%가 함유된 1차 종배지(pH 7.0으로 조절)를 50mL 용량의 진탕용 삼각플라스크에 넣고 살균시킨 후 친주인 세팔로스포리움 아크레모니움과 본 발명의 변이주 세팔로스포리움 아크레모니움 SA755를 각각 식균하여 30℃에서 220rpm으로 4일간 1차 종배양하였다. 대두분 3.0%, 땅콩분 3.0%, 콘스팁리커 1.5%, 설탕 2.5%, 포도당 1.0%, 탄산칼슘 0.5%, 소포제 0.14%가 함유된 2차 종배지(pH 7.0으로 조절)를 7L 용량의 시험용 발효조에 각 5L씩 분주하고 121℃에서 30분간 살균, 냉각시킨 후 상기 1차 종배양에서 얻은 배양원료액(액체종균)을 17mL씩 접종한 다음 매 분당 0.5~1.0L의 공기를 공급하면서 30℃에서 600 ~ 900rpm으로 4일간 종배양하였다. 마지막으로 이성화당 4.5%, 혼합오일 1.5%, 땅콩분 2.5%, 콘스팁리커 3.5%, 콘밀 1.5%, 글루텐밀 3.0%, D,L-메치오닌 0.75%, 황산칼슘 1.0%, 탄산칼슘 2.5%, 암모늄설페이트 0.8%, 소포제 0.1%가 함유된 발효배지(pH 6.9로 조절)를 30L용량의 시험용 발효조에 19.4L 씩 분주하고 121℃에서 30분간 살균, 냉각시킨 후 2차 종배양액을 1.6L씩 접종한 다음, 매분당 0.5 ~ 1.0L의 공기를 공급하면서 300 ~ 600rpm, 25 ~ 30℃로 배양하였다. 배양중 잔존 혼합오일 농도가 4 ~ 5%가 되면 살균된 혼합오일을 수시로 공급하였다. 배양중 pH는 암모니아수를 사용하여 5.0 ~ 6.0으로 조절하면서 6일간 배양하였다. 발효 완료 후 배지중의 세팔로스포린 C의 농도는 하기 표 5에 나타낸 바와 같다.
이상의 실험예와 실시예를 통하여 명백한 바와 같이, 본 발명 미생물 변이주 세팔로스포리움 아크레모니움 SA755(KFCC11058)는 소디움아지드에 대하여 뛰어난 내성을 나타내 생장시 소량의 산소만을 요구하므로써 일반적인 발효조의 조건에서도 세팔로스포린 C를 대량으로 생산하는 뛰어난 효과가 있으므로 발효산업 및 생물의약 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.
Claims (3)
- 고농도의 소디움아지드에 내성을 나타내며 저산소 조건에서도 균체 증식에 저해를 받지 않고 세팔로스포린C를 고농도로 생산할 수 있는 미생물 변이주 세팔로스포리움 아크레모니움(Cephalosporium acremonium) SA755(KFCC 11058).
- 제 1 항에 있어서, 상기 소디움아지드의 농도가 26.0mg/L 이상인 조건에서도 생육할 수 있는 미생물 변이주 세팔로스포리움 아크레모니움(Cephalosprium acremonium) SA755(KFCC 11058).
- 제 1 항 내지 2항의 어느 한 항에 따른 미생물 변이주 세팔로스포리움 아크레모니움(Cephalosporium acremonium) SA755(KFCC 11058)를 이성화액당, 혼합오일, 땅콩분, 콘스팁리커 및 암모늄설페이트 등을 함유한 배지중에서 발효배양함을 특징으로 하는 세팔로스포린 C의 제조방법.
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