KR100268654B1 - 아미노산 결합된 질소 머스타드 유도체 및 이를 종양 치료에 약물 전구체로서 사용하는 방법 - Google Patents

아미노산 결합된 질소 머스타드 유도체 및 이를 종양 치료에 약물 전구체로서 사용하는 방법

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로버트 이안 다웰
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캐롤린 조이 스프링거
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돈 리사 로얄
제네카 리미티드
폰든 수잔 이.
캔써 리서치 캠페인 테크놀로지 리미티드
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Abstract

본 발명은 하기 일반식(Ⅰ) 화합물의 약물 전구체를 항체 직접 효소 약물 전구체 치료 요법(ADEPT)에 사용하는 방법에 관한 것이다. 상기 약물 전구체는 카르복시펩티다제 G2(CPG2)에 대한 기질이고, 공지의 CPG2 촉매화 반응 생성물보다 더욱 활성이 큰 세포독성 약물을 산출한다. 이때, R1및 R2각각은 염소, 브롬, 요오드, OSO2Me 또는 OSO2페닐을 나타내고, X는 O, NH 또는 -CH2-를 나타내고, Y는 O를 나타낸다 :

Description

아미노산 결합된 질소 머스타드 유도체 및 이를 종양 치료에 약물 전구체로서 사용하는 방법
본 발명은 항체에 의해 지시되는 효소 약물 전구체 요법(Antibody Directed Enzyme Prodrug Therapy; ADEPT)에 사용하기 위한 화합물, 이들의 제조 방법, 이들을 함유한 약학 조성물, 이들을 사용하는 방법, 그리고 1) 효소와 항체 또는 항체 분절과의 접합체 및 2) 본 발명의 화합물을 함유한 이성분계(二成分系)에 관한 것이다. 특히, 상기 화합물은 카르복시펩티다아제 G 효소, 특히 카르복시펩티다아제 G2(CPG2)와 함께 사용하기 위한 약물 전구체로서 중요하다.
대부분의 세포 독성 화합물이 암의 화학 요법에 사용될 수 있다는 것은 밝혀져 있다. 이러한 세포 독성 화합물의 중요한 한 가지 종류가 질소 머스타드(nitrogen mustard)이다. 일반적으로, 세포 독성 화합물, 특히 질소 머스타드의 임상학적 용도는 이들이 종양 세포와 정상 세포간 세포 독성 효과에서의 낮은 선택성으로 인해 제한 되어 있었다.
상기 문제점을 해결하기 위한 한 가지 접근 방식은 소위 약물 전구체의 개발과 관련되어 있는데, 상기 약물 전구체는 세포 독성 약물의 유도체, 주로 비교적 단순한 유도체이고, 이들의 세포독 특성은 원래 약물의 세포 독성에 비해 현저히 감소된다. 상기 약물 전구체가 소정의 작용 부위 근처에서만 세포 독성 약물로 전환되는 양생법하에서 약물 전구체를 환자에게 투여하는 방법이 제안되었다.
상기 접근 방식은 세포 독성인 원래의 질소 머스타드와 아미노산을 결합시켜 약물 전구체를 형성하는 것에 관한 것으로, 상기 약물 전구체는 효소의 영향하에 소정의 작용 부위에서 원래의 질소 머스타드로 전환될 수 있다. 상기 방법은 약물 전구체와 함께 항체/효소 접합체의 사용에 의해 수행될 수 있다. 항체/효소 접합체는 종양에 대해 선택적인 항체와 효소로 구성되고, 상기 항체/효소 접합체는 약물 전구체에서 세포 독성 약물로 전환될 것이다. 임상 실험에서는, 항체/효소 접합체를 먼저 환자에게 투여하여 종양에 결합되도록 한다. 적당한 시간이 경과한 후, 신체의 잔부에서 항체/효소 접합체를 제거하고, 약물 전구체를 환자에게 투여한다. 배치된 효소의 영향하에 주로 종양 부위에서 약물 전구체가 세포 독성 약물로 전환된다. 상기 시스템은 국제 공개 번호 WO88/07378으로 공개된 국제 출원 PCT/GB88/00181 및 미국 특허 제 4,975,278호에 개시되어 있다.
CPG에 의해 분해되는 공지의 ADEPT용 약물 전구체는 그들의 활성 약물로서 벤조산 머스타드를 생성한다. 그러나, 종양 세포에 대한 치료 효능을 향상시키기 위해서는 CPG 분열에 의해 생성되는, 보다 활성이 큰 약물이 요구된다. 또한, CPG를 사용하는 ADEPT 치료의 선택성을 향상시킬 필요가 있는데, 이 때 선택성이란 건강한 세포에 비해 암세포에 대한 독성 비율을 말한다.
본 발명은 CPG에 의해 분해되는 ADEPT 치료에 사용하기 위한 신규의 약물 전구체의 발견에 기초한 것이며, 상기 약물 전구체는 CPG 촉매화 반응의 공지된 생성물보다 현저히 큰 활성을 가진 세포 독성 약물을 생성한다. 본래 CPG는 효소를 열화(劣化)시키는 엽산염으로서 작용하며, 특히 엽산염 유도체에서 글루탐산 및 아스파르트산을 가수 분해시킨다(Sherwood, R.F. et al., Eur. J. Biochem. (1985), 148, 447-453). 카르복시펩티다아제 G 효소는 비(非)분류성 엽산염 유사체를 인지하지 않기 때문에(Kalghatgi, K.K. et al., Cancer Research (1979), 39, 3441-3445), 기질 특이성을 보존시키는 것으로 생각된다. 놀랍게도, 본 발명의 약물 전구체는 CPGI, 특히 CPG2 효소 같은 CPG 효소에 대한 기질이다. CPG2는 L-글루타메이트에 대하여 특이성이 있는 엑소펩티다제(exopeptidase)이다. 엽산 및 이의 유사체로부터 글루탐산 부분 및 글루타밀-p-아미노벤조산을 부분 구조식인 -방향족 고리-CO-NH-Glu의 -CO-NH-에서의 분열에 의해 가수 분해시키는 것은 공지되어 있다. 본 발명에 있어서, 비교용의 부분 구조식은 -방향족-고리-X-CO-NH(여기서, X는 -NH, -O- 또는 CH2-임)이므로; 특히, X가 HN 또는 O일 때, -CO-NH-결합을 가로질러 전자 분포가 바뀔 뿐만 아니라 분해 지점과 방향족 고리 사이의 거리도 바뀌게 된다. CPG2는 이들 공간적 및 전자적 차이를 수용하는 것으로 예견되지 않았다.
X가 -CH2-인 화합물이 문헌[Chemical Abstracts 75(5), 1971년 8월 2일자, 요약서 제36603m호] 및 카르파비시우스 등의 문헌[Izv. Acad. Nauk. SSSR, Ser, Khim. 제9권, 1970, 2150-2153(표 1의 화합물, Ⅵ, Ⅷ, Ⅸ 및 XI)]에 기재된 바 있다.
본 발명의 한 가지 특징에 의하면 CPG 효소용 약물 전구체 기질인 하기 일반식(Ⅰ)의 화합물 및 이의 염이 제공된다.
상기 식에서, R1및 R2는 각각 독립적으로 염소, 브롬, 요오드, OSO2Me, 또는 OSO2페닐(여기서, 페닐은 C1-4알킬, 할로겐, -CN 또는 -NO2에서 각각 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환체로 선택적으로 치환됨)을 나타내고;
R1a및 R2a는 각각 독립적으로 수소, C1-4알킬 또는 C1-4할로알킬을 나타내며;
R3및 R4은 각각 독립적으로 수소, C1-4알킬 또는 C1-4할로알킬을 나타내고;
R5a, R5b, R5c및 R5d는 각각 독립적으로 수소, 이중 결합 1개 또는 삼중 결합 1개를 선택적으로 함유한 C1-4알킬, C1-4알콕시, 할로겐, 시아노, -NH2, -CONR7R8(여기서, R7및 R8은 다음에 정의하는 바와 같음), -NH(C1-4-알킬), -N(C1-4알킬)2및 C2-5알카노일을 나타내거나; 또는
R5a및 R5b는 함께
a) 선택적으로 이중 결합인 1개인 C4알킬렌;
b) C3알킬렌; 또는
c) C1-4알킬, C1-4알콕시, 할로겐, 시아노, 니트로, C2-5알카노일 및 -CONR7R8(여기서, R7및 R8은 아래에서 정의하는 바와 같음)로 이루어진 군 중에서 각각 선택된 1, 2, 3, 또는 4개의 치환체로 선택적으로 치환된 -CH=CH-CH=CH-, -CH=CH-CH2- 또는 -CH2-CH=CH-를 나타내고;
X는 O, NH 또는 -CH2-를 나타내며;
Y는 O를 나타내고;
Z는 -V-W를 나타내는데, 여기서 V는 -CH2-T-이고, T는 -CH2-, -O-, -S-, -(SO)- 또는 -(SO2)- (단, V가 제2 원자로서 황 또는 산소를 가지는 경우에, W는 -COOH 이외의 것임)로서, 상기 V는 탄소 원자가 선택적으로 1 또는 2개의 Q1및/또는 Q2에 의해 더 치환되는데 이 때 Q1및 Q2는 각각 C1-4알킬 또는 할로겐을 나타내거나, 또는 Q1및 Q2가 인접한 탄소 원자에 결합된 경우에는, Q1및 Q2는 함께 C1-4알킬 및 할로겐으로 이루어진 군 중에서 독립적으로 선택된 1, 2, 3 또는 4 개의 치환체로 선택적으로 치환된 C3-C4알킬렌 라디칼을 추가로 나타낼 수 있으며; W는
(1) COOH이고;
(2) -(C=O)-O-R6(여기서, R6은 C1-6알킬, C3-6시클로알킬 또는 아릴기 (하기 (3)에 정의되어 있음)를 나타냄)이며;
(3) -(C=O)-NR7R8(여기서, R7및 R8은 각각 수소, 또는 탄소를 통해 N에 결합된 헤테로아릴, 아릴, C3-6시클로알킬, C1-6알킬 또는 C7-9아르알킬기인데, 이 때 아릴은 페닐이고, 헤테로아릴은 질소 및 황으로 이루어진 군 중에서 선택된 1 내지 3 개의 헤테로 원자를 함유한 5 또는 6 원 고리이고, 아릴 부분 그 자체, 헤테로아릴 부분 및 아르알킬기의 아릴 부분은 탄소 원자가 -COOH, -OH, -NH2, -CH2-NH2, -(CH2)1-4-COOH, 테트라졸-5-일 및 -SO3H로 이루어진 군 중에서 선택된 1 내지 4개의 치환체에 의하여 치환되고, 알킬 부분은 선택적으로 메틸기를 지님)이고;
(4) -SO2NHR9(여기서, R9는 R7에서 정의한 바와 같고, 추가로 -CF3, -CH2CF3또는 앞에서 정의한 바와 같은 아릴을 나타냄)이며;
(5) SO3R10(여기서, R10은 H, C1-6알킬 또는 C3-6시클로알킬을 나타냄)이고;
(6) PO3R10R10(여기서, R10라디칼들은 동일 또는 상이하며, 앞에서 정의하는 바와 같음)이며;
(7) 테트라졸-5-일기이고;
(8) -CONH-SO2R11(여기서, R11은
(a) C3-7시클로알킬 ;
(b) 아래에서 정의하는 바와 같은 아릴, C1-4-알킬, CF3또는 할로겐으로 이루어진 군중에서 선택된 치환체에 의해 선택적으로 치환된 C1-6-알킬;
(c) 퍼플루오로-C1-6알킬을 나타내는데, 여기서 아릴은 페닐 또는 치환체 수가 1-5개인 페닐로서, 이들 치환체는 할로겐, -NO2, -CF3, C1-4알킬, C1-4알콕시, -NH2, -NHCOCH3, -CONH2, -OCH2COOH, -NH(C1-4-알킬), -N(C1-4-알킬)2, -NHCOOC1-4알킬, -OH, -COOH, -CN 및 -COOC1-4알킬로 이루어진 군 중에서 선택됨)이며;
(9) -M-Het(여기서, M은 S, SO 또는 SO2를 나타내고, Het는 방향족 고리의 탄소 원자를 통해 M에 결합된 5원 또는 6원 헤테로사이클릭 방향족 고리를 나타내는데 방향족 고리는 0, N 및 S로 이루어진 군 중에서 선택된 헤테로 원자를 1, 2, 3 또는 4개 함유하고, 상기 방향족 고리는 -OH, -SH, -CN, -CF3, NH2및 할로겐으로 이루어진 군 중에서 선택된 치환체 1, 2, 3 또는 4개가 고리의 탄소 원자에 선택적으로 치환됨)이다.
상기 일반식(Ⅰ)의 화합물은 1개 이상의 비대칭 탄소 원자를 포함하고, 이 탄소 원자는 일반식(Ⅰ)에서 치환체 -COOH를 가진다. 더욱이, R1, R2, R3, R4, Q1및 Q2의 의미에 따라, 일반식(Ⅰ)의 화합물은 추가의 비대칭 탄소 원자를 가질 수 있다. 본 명세서에서 정의된 본 발명 조성물의 유용한 생리학적 특성을 가진 라세미형 및 이들 각각의 광학 이성질체를 비롯한 모든 형태의 일반식(Ⅰ)의 화합물이 본 발명에 속하고, 당분야의 숙련자에게는 상기 이성질체들의 분리 방법 및 이들의 생리학적 특성의 측정 방법이 잘 알려져 있다. 본 발명의 화합물은 일반식(Ⅰ)에서 치환체 -COOH를 가지는 탄소 원자에서 L 배치를 가지는 것이 바람직하다.
일반식(Ⅰ) 화합물의 염 또한 본 발명에 속한다. 그러나, 약학적 용도에 사용하기 위하여 상기 염은 약학적으로 허용 가능한 것이야 하지만, 기타 염들은, 예컨대 일반식(Ⅰ)의 화합물 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 제조에 사용할 수 있다. 다결정성 형태의 본 발명 화합물이 제조될 수 있고, 이들 역시 본 발명에 속한다.
본 명세서에서 언급한 임의의 치환체가 알킬기를 나타내거나 또는 함유하는 경우에, 상기 알킬기는 직쇄 또는 분지쇄일 수 있다. 본 명세서에서 언급한 임의의 치환체가 C1-6알킬기를 나타내거나 또는 이를 함유하는 경우에, 상기 기는 탄소 수가 1 내지 4개인 것, 예컨대, 메틸, 에틸, n-프로필 또는 이소프로필, 바람직하게는 메틸 및 에틸, 특히 메틸인 것이 유리하다. 본 명세서에서 언급한 임의의 치환체가 C1-4알킬기를 나타내거나 또는 이를 함유하는 경우에, 상기 기는 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필 또는 이소프로로필이고, 메틸 및 에틸이 좋고, 메틸인 것이 특히 좋다.
바람직한 R1및 R2는 I, Br, Cl, OSO2Me 및 OSO2페닐인데, 여기서 페닐은 2 및/또는 4 위치에서 치환체(본 명세서에서 정의한 바와 같음) 1 또는 2개(특히, 1개)로 치환된다. 특히 바람직한 R1및 R2는 I, Br, Cl 및 -OSO2Me이다. 바람직한 R1a및 R2a는 -CH3또는 수소이고, 특히 바람직한 것은 수소이다.
바람직한 R3및 R4는 수소, 메틸 및 CF3이고, 특히 수소가 바람직하다.
바람직한 R5a-d는 수소, 불소, 염소, 메틸, -CONH2및 CN이다. R5a, R5b, R5c및 R5d중 1개 이상이 페닐 고리에서 수소 이외의 것으로 치환되는 경우에, R5a, R5b, R5c및 R5d중 1 또는 2개 만이 수소가 아닌 것이 좋다. 상기 조건에서, R5b및 R5d가 수소이고, R5a및/또는 R5c가 수소 이외의 것이라면 더욱 바람직하다. 그러나, R5a-b가 수소인 것이 특히 좋다.
바람직한 X는 O 또는 N인데, 특히 O가 바람직하다. 본 발명의 다른 실시예에 있어서는 X가 N인 것이 특히 바람직하다.
V는 -CH2-CH2-인 것이 바람직하다. 본 발명의 다른 실시예에 있어서, W가 테트라졸-5-일인 경우에 V는 -CH2-S-인 것이 바람직하다.
W가 상기 정의 (3)의 기를 나타내는 경우에, 아릴은 치환된 페닐이 바람직하고, 헤테로아릴은 1 또는 2개의 헤테로 원자를 함유한 5원 또는 6원 고리인 것이 유리하고, 상기 헤테로 원자는 피리딜 또는 피리미디닐 같은 질소가 되는 것이 바람직하다. 아릴 부분 그 자체, 헤테로아릴 부분 또는 아르알킬기의 아릴 부분에 있는 양호한 치환체는 -COOH, -CH2-COOH 또는 테트라졸-5-일이다.
W가 정의 (8)의 (b)의 기를 나타내는 경우에, W는 아릴로 임의 치환된 C1-6알킬기를 나타내고, 선택적으로 치환된 아릴기는 -CONH2, -OCH2-COOH 및/또는 -COOH로 치환된 페닐이 바람직하지만, 미치환된 페닐이 특히 바람직하다.
W가 정의 (9)의 기를 나타내는 경우에, Het는 질소원자 1, 2, 3 또는 4개를 함유한 5원 또는 6원 헤테로사이클릭 방향족 고리를 나타내는 것이 유리하다. 질소가 고리에 존재하는 유일한 헤테로 원자인 것이 바람직하다. 따라서, 이들 특정의 기들은 피리딜, 피롤릴, 1,2,3-트리아지닐 및 1,2,4-트리아지닐을 들 수 있다.
W에 대한 특정의 정의는 (1), (2), (3), (5), (6), (7) 및 (9)인데, 바람직한 정의는 전술한 바와 같은 (1), (2), (3), (7) 및 (9)이다.
W에 대한 정의는,
-COOH,
-CONH2,
-CONHR8(여기서, R8은 앞에서 정의되어 있는데, 특히 R8은 페닐임), 테트라졸-5-일;
-CONH-SO2R11(여기서, R11은 상기에서 정의한 정의(b) 및 (c)를 나타냄), 그리고
-M-Het기 (여기서, M은 S이고, Het는 헤테로사이클릭 고리가 3-헤테로 원자를 가진 경우에 탄소 원자가 할로겐 원자 또는 시아노기로 선택적으로 치환된 3 또는 4개의 헤테로 원자를 지닌 5원 헤테로사이클릭 방향족 고리를 나타냄)이다.
W가 -CONH-SO2R11을 나타내는 경우에, R11은 퍼플루오로-C1-6알킬기를 나타내고, 퍼플루오로알킬기는 탄소 원자가 1 내지 4개, 특히 탄소 원자가 1 또는 2개인 것이 좋다.
특히, W는 -COOH, 테트라졸-5-일 또는 -CONH(아릴) (여기서, 아릴은 상기의 정의 (3)에 정의된 바와 같음)이다. 이와 관련하여 아릴은 치환된 페닐인 것이 바람직하고, 바람직한 치환체는 -COOH, -CH2-COOH 또는 테트라졸-5-일이다.
ADEPT에 본 명세서의 화합물을 활용하는데 있어 특히 바람직한 화합물로는 하기에 제시한 화합물을 들 수 있다.
(S)-2-(4-[비스(2-클로로에틸)아미노]페녹시카르보닐아미노)-4-(1H-1,2,3,4-테트라졸-5-일)부티르산 및 이의 염;
N-(4-[비스(2-클로로에틸)아미노]-3-플루오로페닐카르바모일)-L-글루탐산 및 이의 염;
N-(4-(비스(2-클로로에틸)아미노)페닐카르바모일)-L-글루탐산 및 이의 염.
그러나, 특히 바람직한 본 발명의 화합물은 N-(4-[비스-(2-클로로에틸)아미노]페녹시카르보닐)-L-글루탐산 및 이의 염이다.
시험시 우수한 활성을 나타내는 다른 바람직한 화합물로는 N-(4-[비스-(2-요오도에틸)아미노]페녹시카르보닐)-L-글루탐산 및 이의 염이 있다.
본 발명의 중요한 화합물의 특정한 자세한 기들은 R1-R4, R5a-d, X, Y, W, Q1또는 Q2에 대해 전술한 특정의 정의 또는 일반적 정의 중 임의의 하나를 단독으로 취함으로써 얻어지거나, 또는 R1-R4, R5a-d, X, Y, W, Q1또는 Q2에 대한 임의의 다른 특정의 정의 또는 일반적 정의와 함께 얻어질 수 있다.
더욱이, 효과적인 ADEPT를 위한 본 발명의 시험 화합물을 CPG로 분해시켜 제조한 약물은 생리학적 조건하에서 CPG2 촉매화 반응에 의해 생성된 공지의 약물보다 더 불안정하다. 이러한 낮은 안정성으로 인해 약물이 공지의 ADEPT용 CPG 촉매화 반응 생성물과 유사한 안정성을 지니는 경우 및 종양 부위에서 생성된 활성 약물 부분이 전체 순환계로 누출되는 경우보다 건강한 세포에 대한 독성이 감소된다. 따라서, 수행된 시험들은 약물(약물 전구체가 아닌 활성 약물)을 정맥내 투여 후, 심지어 15 분 후 약물이 혈장 중에서 검출되지 않았음을 나타내고 있다.
본 발명의 화합물은 각종 유기산, 유기 염기, 무기산, 무기 염기를 지닌 염을 형성하고, 상기 염은 본 발명에 속한다. 상기 염들의 예로는 암모늄염, 알칼리 금속염(예: 나트륨염 및 칼륨염), 알칼리 토금속염(예: 칼슘염 및 마그네슘염), 유기 염기를 지닌 염류(예: 디시클로헥실아민염, N-메틸-D-글루카민), 아미노산(예: 아르기난, 리신등)을 지닌 염류를 들 수 있다. 유기산 및 무기산을 지닌 염류도 역시 제조될 수 있다. 예를 들면, HCl, HBr, H2SO4, H3PO4, 메탄설폰, 톨루엔설폰, 캄포설폰, 산은 pKa 값이 2 이하, 특히 1 이하로 강산인 것이 바람직하다. 생리학적 허용 가능한 염이 바람직하지만, 기타 염들도 생성물을 분리 또는 정제하는 데 유용할 수 있다.
상기 염은 통상의 방법, 예컨대 염이 불용성인 용매 또는 매질에서 유리산 또는 유기 염기 형태의 생성물을 1 당량 이상의 적당한 염기 또는 산과 반응시키거나, 또는 물과 같은 용매에서 반응시켜 제조할 수 있으며, 물을 진공하에서 제거하거나 또는 동결 건조 또는 적절한 이온 교환 수지상의 다른 양이온으로 존재하는 염의 양이온을 교환시킴으로써 물을 제거하여 제조한다.
본 발명의 또 하나의 특징은 일반식(Ⅰ)의 화합물 및 이의 염의 제조 방법을 제공하는 것이다. 이 방법은 하기 일반식(Ia)의 화합물을 탈보호하고, 필요에 따라 생성된 일반식(Ⅰ)의 화합물을 이의 염으로 전환시키는 단계를 포함한다.
상기 식에서, R1, R2, R1a, R2a, R3, R4, R5a, R5b, R5c, R5d, X, Y, Q1및 Q2는 상기에서 정의한 바와 같고, Z1은 W가 보호된 형태로 존재하는 카르복실기(Pr2로 나타냄)인 조건하에서 앞에서 정의한 바와 같은 Z를 나타내고, Pr1도 역시 보호된 형태의 카르복실기를 나타낸다(Pr2와 동일 또는 상이함).
따라서, Pr1및 Pr2는 예를 들어 벤질옥시카르보닐기, t-부틸옥시카르보닐기, 2-(트리메틸실릴)에틸 에스테르, 디메틸-t-부틸실릴 에스테르, 디페닐메틸 에스테르, 테트라히드로피란 에스테르, 테트라히드로푸란 에스테르, 메톡시 에톡시메틸 에스테르 또는 벤질옥시케틸 에스테르로 나타낼 수 있거나, 또는 일반적으로 공지된 카르복시 보호기, 예를 들면 가수소 분해 또는 산촉매 반응에 의한 탈보호 반응용 에스테르 형성 보호기(Greene, T.W. ＆ Wuts, P.G.M., in Protective Groups in Organic Synthesis, 2nd Edition, Wiley-Interscience, 1990)를 들 수 있다.
Pr1및/또는 Pr2가 벤질옥시카르보닐기를 나타내는 경우에, 탈보호 반응은 수소화 반응에 의해 수행되는 것이 바람직하다. 상기 수소화 반응은 백금 또는 라니 니켈의 존재하와 같은 임의의 통상적인 방법, 특히 탄소의 존재하에서 팔라듐을 사용함으로써 수행되는 것이 바람직하다. 수소화 반응은 불활성 용매의 존재하에서 수행하는 것이 유리하고, 비양성자성 용매, 특히 에틸 아세테이트, 테트라히드로푸란 또는 디메틸포름아미드 같은 극성 비양성자성 용매가 바람직하고, 온도는 0 내지 100℃가 바람직한데, 더 바람직한 온도는 15 내지 50℃, 특히 상온(常溫)이며, 시간은 1 내지 24 시간이 좋다.
Pr1및/또는 Pr2가 t-부틸옥시카르보닐기를 나타내는 경우에, 탈보호 반응은 산, 특히 트리플루오로아세트산, HCl, HBr, HI 또는 포름산과 같은 강산의 존재하에서 수행되는 것이 유리하다. 용매의 사용이 필요한 경우에, CH2Cl2또는 디에틸에테르와 같은 불활성 비양성자성 용매가 바람직하다. 상기 반응은 0 내지 100℃, 바람직하게는 0 내지 30℃, 특히 상온에서 용이하게 수행된다.
일반식(Ia)의 화합물 및 이의 염은 신규하고, 따라서 본 발명의 또 다른 특징을 구성한다.
본 발명의 또 하나의 특징에 따르면, 전술한 일반식(Ia)의 화합물(이 때, X는 0이고, Y는 0 임) 및 이의 염을 제조하는 방법이 제공된다. 이 방법은 하기 일반식(Ⅱ)의 화합물과 하기 일반식(Ⅲ)의 화합물을 반응시켜 상기 일반식(Ia)의 화합물을 형성하고, 필용에 따라 일반식(Ia)의 화합물을 이의 염으로 전환시키는 단계를 포함한다.
상기 식에서, R1, R2, R1a, R2a, R3, R4, R5a, R5b, R5c및 R5d는 앞에서 정의 한 바와 같고, X는 0이고, Y는 0이며, L은 이탈 원자 또는 이탈기를 나타내고, Pr1및 Z1은 앞에서 정의한 바와 같다. L은 Cl, Br, I, 4-니트로페녹시 또는 펜타플루오로페녹시인 것이 유리하다. 상기 반응은 -10℃ 내지 100℃, 바람직하게는 20 내지 50℃에서 용매의 존재하에서 용이하게 수행된다.
바람직한 반응 조건은 유기 용매(특히, 클로로포름, 에틸 아세테이트, 톨루엔, 디메틸포름아미드 및 CH2Cl2)의 존재하에서 5 내지 50℃, 1 내지 24 시간 동안 반응을 수행하는 것을 포함한다. 본 발명의 또 다른 특징을 이루는 일반식(Ⅱ)의 화합물은 아닐리노 머스타드기를 함유한 상응하는 페놀과 아릴 클로로포르메이트[예: 니트로페닐 클로로포르메이트 (특히, 4-니트로페닐 클로로포르메이트)] 또는 포스겐을 반응시켜 일반식(Ⅱ)의 화합물을 제조할 수 있다.
바람직한 반응 조건은 유기 용매(특히, 에틸 아세테이트 또는 클로로포름)의 존재하, 15 내지 50℃ (특히, 상온)에서 1 내지 10 시간 수행하는 것이다.
W가 본 명세서에서 정의한 바와 같은 정의(3)의 기를 나타내는 일반식(Ⅲ)의 화합물은 표준 조건하에서 W가 본 명세서에서 정의한 바와 같은 정의(2)의 기를 나타내는 일반식(Ⅲ)의 화합물로부터 제조할 수 있다. 바람직한 표준 조건은 질소 친핵제 (특히, 암모니아, 1차 아민 또는 2차 아민)를 사용한 반응을 포함하는데, 바람직한 온도는 25 내지 50℃이고, 바람직한 시간은 약 24 시간이다.
W가 테트라졸-5-일기인 일반식(Ⅲ)의 화합물을 공지의 방법, 예컨대 피네간(Finnegan, W.G.) 등에 의한 문헌 [JACS, 80, 1978, 3909]에 개시된 방법으로 상응하는 니트릴로부터 제조한 다음, 아민(Pr3)을 탈보호시켜 W가 테트라졸-5-일인 일반식(Ⅲ)의 화합물을 제조한다.
W가 본 명세서에서 정의한 바와 같은 정의(9)의 기를 나타내는 일반식(Ⅲ)의 화합물은 본 명세서에 정의된 일반식(XV)의 화합물을 상응하는 1차 알콜로 표준 조건 (특히, 디보란을 사용하거나, 또는 무수물과 혼합 반응한 다음 나트륨 보로히드리드로 환원시킴)에서 환원시켜 제조할 수 있다. 상응하는 1차 알콜은 표준 방법, 예컨대 메탄 설포닐 클로라이드 및 트리메틸아민을 CH2Cl2의 존재하에서 0℃에서 사용하여 Br, I 또는 메실레이트와 같은 이탈기로 전환시킨다. 상기 이탈기는 하기 일반식(XVI)의 기로 치환될 수 있고, 산화 조건하에서 처리하여 하기 일반식(XVII)의 화합물을 얻는다.
HS - Het (XVI)
상기 식에서, Het는 W = (9)에서 정의한 바와 같고, Z111은 W가 -S-Het, -(S=O)-Het 또는 -SO2-Het인 조건하에서, 본 명세서에서 정의한 바와 같은 Z를 나타내고, Pr1및 Pr3은 각각 본 명세서에서 정의한 바와 같은 카르복실기 및 -NH2기이다. 적절한 산화 조건은 산화제(특히, 3-클로로퍼벤조산)로 처리하는 단계를 포함한다. 본 명세서에서 정의한 표준 조건하에서 일반식(XVII)의 화합물의 -NH2기를 탈보호시켜 W가 본 명세서 중의 정의 (9)의 기를 나타내는 일반식(Ⅲ)의 화합물을 제조한다.
본 발명의 또 하나의 특징에 따르면, 일반식(Ia)의 화합물(이 때, X는 N이고, Y는 0 임) 및 이의 염을 제조하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 하기 일반식 (IV)의 화합물 또는 이의 염과 본 명세서에서 정의한 바와 같은 일반식(Ⅲ)의 화합물을 반응시켜 일반식(Ia)를 형성하고, 필요에 따라, 일반식(Ia)의 화합물을 이의 염으로 전환시키는 단계를 포함한다.
상기 식에서, R1, R2, R1a, R2a, R3, R4, 및 R5a-d는 앞에서 정의한 바와 같다.
상기 반응은 유기 용매(극성 비양성자성 용매, 특히 CH2Cl2또는 에틸 아세테이트가 좋다)의 존재하서 실온에서 약 1 내지 5 시간 수행한다.
본 발명의 또 다른 특징에 의하면, 일반식(Ⅳ)의 화합물 및 이의 염을 제조하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 하기 일반식(Ⅴ)의 화합물(이 때, R1, R2, R1a, R2a, R3, R4및R5a-d는 상기에서 정의한 바와 같음)과 일반식 L1-(C=O)-L2의 화합물(이 때, L1및 L2는 이탈기임)을 반응시켜 일반식(Ⅳ)의 화합물을 형성하는 단계를 포함한다.
상기 L1및 L2로서는 Cl, CCl3, 이미다졸릴 및 아릴옥시(특히, 페녹시)를 들수 있다. 바람직한 반응 조건은 유기 용매(극성 비양성자성 용매, 특히 에틸 아세테이트가 좋다) 중에서, 5-25℃로 약 15 분간 수행하는 것을 포함한다.
본 발명의 또 하나의 특징에 따르면, 상기에서 정의한 일반식(Ia)의 화합물(이 때, X는 -CH2-이고, Y는 0 임) 및 이의 염을 제조하는 방법이 되는데, 이 방법은 앞에서 정의한 일반식(Ⅱ)의 화합물 또는 이의 염[단, X는 -CH2-이고, Y는 0이고, L은 펜타플루오로페녹시, Cl, -O-(CO)-C1-6알킬 (바람직하게는 분지 알킬, 특히 C1-4알킬) 및 카르보디이미드(특히, 디시클로 헥실카르보디이미드)와 반응시킨 아닐리노 머스타드를 함유한 상응하는 페닐 아세트산의 생성물임]과 앞에서 정의한 일반식(Ⅲ)의 화합물을 표준 반응 조건(예를 들어, 20-50℃에서 1 내지 24 시간 동안 디메틸포름아미드, 에틸 아세테이트 또는 테트라히드로푸란 같은 극성의 비양성자성 용매의 존재하에서 반응을 수행함)을 이용하여 반응시켜 일반식(Ia)의 화합물을 형성하고, 필요에 따라, 일반식(Ia)의 화합물을 이의 염으로 전환시키는 단계를 포함한다. 일반식(Ⅱ)의 화합물은 아닐리노 머스타드기를 함유하는 상응하는 페닐 아세트산으로부터 표준 방법을 이용하여 제조할 수 있다.
본 발명의 또 한 가지 특징에 따르면, 앞에서 정의한 일반식(Ia)의 화합물(이 때, W는 앞에서 정의한 바와 같은 정의 (8)의 기, 즉 -CONH-SO2R11을 나타냄) 또는 이의 염을 제조하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 W가 단지 정의 (8)의 기를 의미한다는 조건하에서 본 명세서에서 정의한 일반식(Ⅱ)의 화합물과 본 명세서에서 정의한 일반식(Ⅲ)의 화합물을 공지의 반응 조건하에서 반응시켜 W가 정의 (8)의 기를 나타내는 일반식(Ia)의 화합물을 형성하고, 필용에 따라 상기 일반식(Ia)의 화합물을 이의 염으로 전환시키는 단계를 포함한다. 바람직한 반응 조건은 유기 용매(극성의 비양성자성 용매, 특히 에틸 아세테이트 또는 디클로로메탄이 좋다)의 존재하에 바람직하게는 5 내지 50℃(특히, 주위 온도)로 1 내지 5 시간 동안 반응을 수행하는 것을 포함한다.
본 발명의 또 다른 특징을 이루는 일반식(Ⅲ)의 화합물은 하기 일반식(XI) 화합물의 아민기를 공지의 반응 조건하에서 탈보호시킴으로써 W가 정의 (8)의 기를 나타내는 일반식(Ⅲ)의 화합물을 형성하고, 필요에 따라 일반식(Ⅲ)의 화합물을 이의 염으로 전환시킨다.
상기 식에서, Pr1은 앞에서 정의한 바와 같이 보호된 형태인 카르복시기를 나타내고, Pr3은 보호된 형태인 -NH2기, 특히 벤질옥시카르보닐 유도체 또는 프탈이미도 유도체를 나타내고, Z1은 W가 정의(8)의 기를 나타낸다는 조건하에서 앞에서 정의한 바와 같은 Z를 나타낸다. 바람직한 반응 조건은 유기 용매 (극성의 비양성자성 용매, 특히, 에틸아세테이트 또는 테트라히드로푸란이 좋다) 중의 탄소에 함침시킨 팔라듐의 존재하에, 바람직하게는 상온에서 1 내지 24 시간 동안 수소화 반응을 수행하는 것을 포함한다. 다른 바람직한 반응 조건으로는 아세트산 중 HBr의 존재하에 바람직하게는 상온에서 1 내지 24 시간 동안 탈보호 반응을 수행하는 것을 포함한다.
일반식(XI)의 화합물은 하기 일반식(XV)의 화합물과 일반식 R11SO2NH2의 화합물(이 때, R11은 W = (8)에서 정의한 바와 같음)을 표준 반응 조건하에서 반응시켜 제조할 수 있다.
상기 식에서, Pr1및 Pr3은 앞에서 정의한 바와 같고, Z11은 W가 단지 COOH인 조건하에서 앞에서 정의한 바와 같은 Z를 나타낸다. 표준 반응 조건은 카르보디이미드(특히, 디시클로헥실카르보디이미드) 및 염기[특히, 4-(N,N-디메틸아미노)피페리딘]의 존재하에서 불활성 용매(특히, 디클로로메탄) 중에서 반응을 수행하는 것을 포함한다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 일반식(Ⅰ) 화합물[이 때, W는 앞에서 정의한 바와 같이 정의 (4) (즉, -SO2NHR9), 정의 (5) (즉, -SO2R10) 및 정의 (6) (즉, -PO3R10R10을 나타냄)]을 제조하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 하기 일반식(WVⅢ)의 화합물을 앞에서 정의한 일반식(Ⅱ)의 화합물 또는 앞에서 정의한 일반식(Ⅴ)의 화합물과 표준 조건하에서 반응시켜 W가 상기 (4), (5) 및 (6)의 기를 나타내는 일반식(Ⅰ)의 화합물을 제조하고, 필용에 따라 일반식(Ⅰ)의 화합물을 이의 염으로 전환시키는 방법을 포함한다.
상기 식에서, Z1111은 W가 정의(4)의 기(즉, -SO2NHR9), 정의 (5)의 기(즉, -SO2R10) 및 정의 (6)의 기(즉, -PO3R10R10)를 나타낸다는 조건하에서 앞에서 정의한 바와 같은 Z를 나타낸다. 표준 조건은 유기 용매(극성의 비양성자성 용매, 특히, 디클로로메탄이 좋다)의 존재하에서 염기(특히, 트리에틸아민)를 사용하여 바람직하게는 상온에서 수행하는 것을 포함한다. 일반식(XVⅡ)의 화합물은 공지되어 있으며(시그마 케미칼 컴패니에서 시판함), 표준 방법에 따라 공지의 화합물로부터 제조될 수도 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 앞에서 정의한 일반식(Ia)의 화합물[이 때, X는 N 또는 0이고, Y는 0이고, R1및 R2는 Cl, Br, I 또는 OSO2Me(특히, Cl)이고, R1a는 H이며, R2a는 H 이며, R3은 H이고, R4는 H임] 및 이의 염을 제조하는 방법이 제공되는데. 이 방법은 하기 일반식(XIX)의 화합물을 유기 용매(비극성의 비양자성 용매, 특히 CH2Cl2가 바람직함), 바람직하게는 1 내지 2 시간(특히, 90분 동안) 환류 가열시킨 유기 용매 존재하에 할로겐화제(특히, 오염화인) 또는 티오닐 클로라이드과 반응시키거나 또는 유기 용매(극성의 비양성자성 용매, 특히 피리딘이 바람직함) 존재하에 메틸 설포닐 클로라이드와 반응시켜 일반식(Ia)의 화합물(이 때, X는 0 또는 NH이며, Y는 0이고, R1및 R2는 Br, I, OSO2Me 또는 Cl이며, R1a는 H이고, R2a는 H이며, R3은 H이고, R4는 H임)을 형성시키고, 필요에 따라 일반식(Ia)의 화합물을 이의 염으로 전환시키는 단계를 포함한다.
상기 식에서, 5a-d, Pr1및 Z1은 앞에서 정의한 바와 같고, X는 0 또는 NH이다. 메틸 설포닐 클로라이드가 사용되는 경우에, 일반식(XIX)의 화합물 중 히드록시기들을 반응에 사용된 온도에 다라 C1 및/또는 OSO2Me로 전환시킬 수 있다. 반응을 70℃에서 15 분간 수행함으로써 디클로로 화합물(즉, R1= R2= Cl)을 용이하게 얻을 수 있고, 반응을 50℃에서 10 분간 수행함으로써 R1= Cl이고, R2= OSO2Me인 상응하는 화합물을 용이하게 얻을 수 있다.
R1및 R2가 Br이고, R1및 R2가 I인 경우에, 메탄 설포닐 무수물 대신에 메탄 설포닐 클로라이드를 사용하는 것이 바람직하다. 왜냐 하면, 이것이 반응 중 경합하는 할로겐의 문제점을 제거하기 때문이다. 일반식(XIX)의 화합물(0.002M)을 CHCl3(30ml) 중에 용해시켰다. 트리에틸아민(1.12ml)과 메틸설포닐 무수물(0.008M)을 상온에서 첨가하고, 상기 혼합물을 2 시간 동안 교반한 다음 수세하였다. 이 때 얻은 생성물을 MgSO4로 건조시켜, 여과하고 증발시켜 오일을 얻었다. 이 오일을 무수 DMF 중에 용해시키고, 요오드화리튬 (또는 브롬화리튬; 0.005 M)을 첨가한 다음, 80℃에서 2 시간 교반한 후, 냉각시키고 물에 주입하여 에테르로 추출하였다. 여기서 얻은 생성물을 MgSO4로 건조시키고, 여과 및 증발시켜 건조시킨 다음 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다.
일반식(XIX)의 화합물은 하기 일반식(XX)의 화합물을 앞에서 정의한 하기 일반식(Ⅲ)의 화합물과 반응시켜 하기 일반식(XXI)의 화합물을 생성시킴으로써 제조할 수 있다.
상기 식에서, R5a-d, Pr1, Z1은 앞에서 정의한 바와 같고, R*는 -N=C=O 또는 -O-CO-L (이 때, L은 상기에서 정의한 바와 같은 이탈기임)이고, X는 0 또는 NH이다. 생성된 화합물을 수소화 반응(탄소에 침지시킨 팔라듐의 존재하에서 수행하는 것이 좋다)시켜 일반식(XXI)에 상응하고, -NO2대신 -NH2를 지닌 화합물을 얻는다. 수득된 화합물을 산 수용액 조건(아세트산/물이 1:1인 것이 좋다)하에 에틸렌옥사이드와 바람직하게는 상온에서 바람직하게는 1 내지 2일 동안 반응시켜 일반식(XIX)의 화합물을 제조한다. 상기 공정을 반응 도식 5에 예시한다.
일반식(Ⅰ)의 화합물(이 때, W는 테트라졸-5-일기를 나타냄)을 제조하는 방법은 하기 일반식(XVⅢ)의 화합물과 앞에서 정의한 바와 같은 일반식(Ⅱ)의 화합물을 표준 조건하에서 반응시켜 W가 테트라졸-5-일기인 일반식(Ⅰ)의 화합물을 형성하고, 필요에 따라 일반식(Ⅰ)의 화합물을 이의 염으로 전환시키는 단계를 포함한다.
상기 식에서, Z1111은 W가 테트라졸-5-일기를 나타낸다는 조건하에서 상기에서 정의한 바와 같은 Z를 나타낸다. 표준 조건은 염기(디메틸아미노 피리딘, 특히 트리에틸아민이 바람직함)의 존재하에 극성 비양성자성 용매(특히, DMF) 중에서 20 내지 50℃(특히, 25℃)로 2 시간 이상(바람직하게는 20시간) 반응을 수행하는 것을 포함한다.
[약물 전구체 및 약물의 생체외 세포 독성 효능]
약물 전구체, 약물 전구체 + 효소 및 약물의 생체외 세포 독성 효능은 스케한(Skehan) 등의 문헌(J. Natl. Cancer Inst 82, 1107-1112, 1990]에 기재된 것과 유사한 세포 독성 분석법에 따라 측정되었다. 로보(LOVO) 세포(ECACC 번호: 87060101)를 DMEM 배지[FCS 10%, 글루타민 1%, 및 겐타마이신 0.2%를 함유함) 중에 희석시키고 2,500 세포/웰의 밀도로 96웰 미량 역가 평판에 플레이트하여 37℃의 5% CO2중에서 밤새 배양하였다. 각종 농도의 약물 전구체, 대조군으로서 상응하는 약물 또는 약물 전구체 + 효소(1U CPG2 활성/웰-효소 1 유니트는 37℃에서 1μmol의 메토트렉세이트/분/ml로 가수분해시키는 데 필요한 양을 말함)를 상기 세포에 첨가한 후, 1 시간 또는 24 시간 배양시킨 다음, 세포를 수세하여, 새로운 배지를 첨가하고, 세포를 37℃의 5% CO2중에서 배양시켰다. 화합물을 첨가한 3일 후, TCA를 상기 웰(최종 농도 16%)에 첨가하고, 상기 평판에 부착하는 세포간 단백질의 양을 SRB 염료(스케한 등)를 첨가하여 평가하였다. 540 nm에서 광학 밀도를 측정하고, 그 결과를 화합물이 없는 대조용 웰중 0D540의 백분율로 나타내었다. 효능은 세포의 성장을 50%까지 억제하는 데 필요한 농도로서 표시하였다(IC50). 약물 전구체 그 자체는 일반적으로 CPG2 존재하의 약물 전구체에 비해 상기 시험에서 활성이 낮아야 한다(즉, CPG2 효소가 약물 전구체를 약물로 활성화하는 데 필요하다). 화학적으로 합성된 약물을 직접 첨가(CPG2 활성화를 필요로 하지 않음)한 것이 상기 분석에서 대조용으로 사용된다.
전술한 방법을 사용하여, 본 발명의 대표적인 시험 화합물을 평가하고, 상기 화합물은 1 시간 후 CPG2가 없는 경우의 활성에 비해 CPG2가 존재하는 경우의 활성이 10배 이상됨을 나타내었는데, 이는 본 발명의 화합물을 사용하는 것이 효과적이라는 것을 증명하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 특징에 따르면, 본 발명은 약물 전구체 성분으로서 1종 이상의 일반식(Ⅰ)의 화합물 또는 상기 화합물의 생리학적으로 허용 가능한 염을 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 함께 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 용이하게 종양 부위에 이미 국소화된 CPG(바람직하게는 CPG2)-종양 선택적 항체 접합체와 함께 사용하고자 하는 유효량의 약물 전구체를 포함하게 된다.
본 발명의 또 다른 특징에 의하면, 본 발명의 약물 전구체 성분으로서 1종 이상의 일반식(Ⅰ)의 화합물 또는 상기 화합물의 생리학적으로 허용 가능한 염을 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 함께 포함하는 주사용 멸균 약학 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 용이하게 유효량의 약물 전구체를 포함할 것이다.
본 발명의 또 하나의 특징에 따르면, 본 발명의 이성분계(二成分系)(각 성분은 타성분과 혼합하여 사용됨)을 제공하는데, 상기 이성분계는
ⅰ) 주어진 항원과 결합할 수 있고, 일반식(Ⅰ)의 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용 가능한 염을 세포 독성 약물로 전환시킬 수 있는 CPG(바람직하게는 카르복시펩티다아제 G2)효소에 접합되는 항체 또는 이의 분절로 이루어진 제1 성분과;
ⅱ) CPG(바람직하게는 카르복시펩티다아제 G2)효소의 영향하에서 세포 독성 약물로 전환될 수 있는 일반식(Ⅰ)의 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 제2 성분을 포함한다.
항체 또는 이의 분절이 종양과 결합된 항원에 결합할 수 있는 것이 바람직하다.
종양과 결합된 항원과 결합할 수 있는 특정 항체는 마우스 단일 클론 항체 A5B7이다. 항체 A5B7은 인간의 암배아성 항원(carcinoembryonic antigen; CEA)에 결합하고, 결장 직장 암종을 표적화하는 데 특히 적합하다. A5B7은 DAKO 리미티드에서 시판한다. 항체 분절은, 예컨대 마리애니(Mariani M.) 등의 문헌[Molecular Immunology 28, 69-77 (1991)]에 기재된 바와 같은 F(ab')2분절과 같은 통상의 수단에 의해 모든 IgG 항체로부터 제조될 수 있다. 일반적으로 항체(또는 항체 분절)-효소 접합체는 최소한 2가 이상이어야 하고, 이는 다시 말하면, 2개 이상의 종양과 결합된 항원(동일 또는 상이할 수 있음)에 결합할 수 있음을 뜻한다. 항체 분자는 공지된 방법, 예컨대 유럽 특허 제EP 239400호에 개시된 바와 같은 "CDR 이식법" 또는 미국 특허 제US 4816567호에 기재된 바와 같은 인체의 불가변부에 완전한 가변부를 이식하는 방법에 의해 인간화할 수 있다. 인간화 항체는 항체 (또는 항체 분절)의 면역원성을 낮추는 데 유용하다. 상기 항체 A5B7의 인간화 형태는 PCT WO 92/01059에 개시되어 있다.
단일 클론성 항체 A5B7을 생성하는 하이브리도마는 영국, 윌츠 에스피 4 오제이쥐, 셀리스버리, 포르톤 다운에 소재한 유럽 동물 세포 배양물 수집소 (Division of Biologics, PHLS Centre for Applied Microbiology and Research)에 1993년 7월 14일 기탁 번호 93071411로 기탁하였다. 항체 A5B7은 프렌지 C, 프라운 E 및 스케걸 K의 문헌 ["배양액 중의 동물 세포로부터 생물학적 제제의 제조 방법" (스피르 RE, 그리피스 주니어 및 메이그니르 B, 편집) Butterworth-Heinemann, 1991, 262~265] 및 앤데르슨 BL 및 구르엔베그 ML의 문헌["단일 클론성 항체의 상업적 생산"(시버 S, 편집), Marcel Dekker, 1987, 175-195]에 기재된 바와 같이 당 분야에서 공지된 표준 기법을 이용하여 침착된 하이브리도마로부터 얻을 수 있다. 높은 수준의 항체 생산을 유지하기 위하여 한계 희석 방법에 의해 상기 세포들을 때때로 재클로닝할 필요가 있다.
ADEPT에 유용한 또 다른 항체에 대한 설명은 다음과 같다. 항체 BW 431/26이 하이스마(Haisma, H.J.) 등의 문헌[Cancer Immunol. Immunother., 34: 343-348 (1992)]에 기재되어 있다. 항체 L6, 96.5, 및 1F5는 유럽 특허 제 302 473호에 개시되어 있다. 항체 16.88은 국제 출원 제WO 90/07929호에 개시되어 있다. 항체 B72.3이 유럽 특허 제392 745호에 개시되어 있다. 항체 CEM231은 유럽 특허 제382 411호에 개시되어 있다. 항체 "HMFG-1 및 HMFG-11(Unipath Ltd., 영국, 한츠, 배싱스토크에 소재)은 우유 지방구 박막상의 뮤신(mucin) 유사 당단백질 분자와 반응하고, 유방암 및 난소암을 표적화하는데 사용될 수 있다. 항체 SM3(영국, 런던 소재의 Chemicon International Ltd.)은 뮤신의 코어 단백질과 반응하고, 유방암 및 난소암을 표적화하는 데 사용될 수 있다. 항체 85A12(Unipath Ltd.) 및 ZCEA1(영국, 체스터에 소재한 Prerce Chemical Company)은 종양 항원 CEA와 반응한다. 항체 PR4D1(영국, 옥스퍼드에 소재한 Serotec)은 결장 종양과 결합된 항원과 반응한다. 항체 E29(영국, 하이 위콤브에 소재한 Dako Ltd.)는 상피막 항원과 반응한다. 항체 C242는 스웨덴의 구텐베르크, CANAG Diagnostics에서 시판하고 있다.
일반적으로, ADEPT에 유용한 항체들은 그들이 인식하는 종양 세포에 의해 불량하게 내재화된다. 이것은 표적화된 약물 전구체 활성 효소를 세포 표면에 존치시키고, 따라서 순환하는 약물 전구체로부터 종양 위치에서 활성 약물을 생성시킨다. 항체의 내재화는 공지의 기법, 예컨대 재프리조우(Jafrezou) 등의 문헌[Cancer Research, 52 : 1352(1992)] 및 프레스(Press) 등의 문헌[Cancer Research, 48 : 2249(1988)]에 개시된 바와 같이 하여 분석할 수 있다.
슈도모나스(Pseudomans) RS-16에서 취한 CPG2의 대량의 정제는 쉬르우드(Sherwood) 등의 문헌 [Eur, J. Biochem., 148, 447-453(1985)]에 기재되어 있다. CPG 효소에 결합된 F(ab1)2및 IgG 항체는 공지의 수단, 예컨대, PCT WO 89/10140에 기재된 방법으로 제조할 수 있다. CPG는 영국, 윌츠 에스피4 오제이쥐, 셀리스버리, 포르톤 다운에 소재한 응용 미생물학 및 연구 센터(Centre for Applied Microbiology and Institute)로부터 얻을 수 있다. CPG2도 역시 재조합 기법에 의해 얻을 수 있다. CPG2에 대한 뉴클레오티드 암호화 서열은 민톤(Minton N.P.) 등의 문헌[Gene, 31 (1984), 31-38]에 공개되어 있다. 암호화 서열의 형질 발현은 이. 콜리(E. coli)[챔버스(Chambers, S.P.) 등의 논문, Appl. Microbiol, Biotechnol. (1988), 29, 572-578)] 및 사카로마이시즈 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)[클라크(Clarke, L.E.) 등의 논문, J. Gen Microbiol, (1985) 131, 897-904)]에 보고된 바 있다. 총유전자 합성은 에드워즈(M. Edwards)의 문헌(Am. Biotech. Lab(1987), 5, 38-44]에 개시되어 있다. 이. 콜리 중의 이종 단백질의 형질 발현은 마르스톤(F.A.O. Marston)의 문헌 [DNA Cloning Vol, Ⅲ, Practical Approach Series, IRL 프레스(D.M. 글로버(Glover) 편집), 1987, 59-88]에 개시되어 있다. 효모 중의 단백질 형질 발현은 문헌 [Methods in Enzymology Volume 194, 아카데믹 출판사 1991, C. 구트리에 및 G R 핀크 편집]에 개시되어 있다.
CPG 효소는 영국, 도르셋, 풀레, 프랜시 로드에 소재한 시그마 케미칼 컴패니로부터 구득할 수 있다. CPG 효소는 골드만(Goldman, P.) 및 레비(Levy, C.C.)의 문헌 [PNAS USA, 58, : 1299-1306(1967)]과 레비 및 골드만의 문헌 [J. Biol. Chem., 242: 2933-2938(1967)]에 개시되어 있다. 카르복시펩티다아제 G3 효소는 야스다(Yasuda, N.) 등의 문헌[Biosci. Biotech. Biochem., 56: 1536-1540 (1992)]에 개시되어 있다. 카르복시펩티다아제 G2 효소는 유럽 특허 제121 352호에 개시되어 있다.
본 발명의 또 하나의 특징에 따르면, 본 발명은 병소에 세포 독성 약물을 전달 하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 제1 성분[주어진 항원과 결합할 수 있고, 일반식(Ⅰ)의 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용 가능한 염을 세포 독성 약물로 전환시킬 수 있는 CPG 효소(바람직하게는 카르복시펩티다아제 G2)에 접합되는 항체 또는 이의 분절을 포함]을 숙주에 투여한 다음, 제2 성분[CPG 효소(바람직하게는 카르복시펩티다아제 G2)의 영향하에서 세포 독성 약물로 전환될 수 있는 일반식(Ⅰ)의 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용 가능한 염을 포함]을 상기 숙주에 투여하는 단계를 포함한다.
세포 독성 약물이 절달되어야 할 분위는 일반적으로 인체와 같은 종양에 걸린 포유류 숙주에 존재하는 종양 세포가 바람직하다.
상기 제1 성분을 종양이 있는 숙주에 투여하는 경우에, 항체 또는 접합체의 항체 분절 부분은 접합체를 종양 부위로 향하게 하여 접합체를 종양 세포에 결합시킨다.
비결합된 접합체를 치료하고자 하는 숙주로부터 실질적으로 제거한 다음, 예컨대 문헌[Br, J. Cancer (1990), 61, 659-662]에 기재된 바와 같이 적당한 시간 경과 후 또는 제거의 촉진 후 숙주로부터 제거한 다음, 제2 성분을 상기 숙주에 투여할 수 있다. 제2 성분을 투여하기 전에 숙주로부터 비결합된 접합체를 실질적으로 제거하는 것이 매우 바람직하며, 이를 제거하지 않는 경우에는 세포 독성 약물이 종양이 아닌 부위에서 생성되어 부위 특이적 독성이 아닌 숙주에 대한 일반적인 독성을 나타내기 때문이다.
본 발명의 화합물은 경구용 정제, 캡슐제 또는 엘리실제, 직장 투여용 좌약, 비경구투여용 또는 근육내 투여용 멸균 용액제 또는 현탁액제 등과 같은 조성물로 이용될 수 있다.
본 발명의 화합물을 상기 치로가 요구되는 환자(동물 및 인간)에게 최적의 약학적 효능을 제공할 수 있는 투여량으로 투여할 수 있다. 투여량은 환자의 특성 및 질병의 경중, 환자의 체중, 특정의 식이 요법, 병행하는 약물 치료법 및 기타 당분야의 숙련자에게 인식될 수 있는 요인들에 따라 달라지지만, 일반적으로 환자, 일회 또는 다회(多回) 용량으로 투여 가능한 투여량의 범위는 약 1 내지 150mg/kg(환자의 체중)/일이다. 투여량 범위는 약 10 내지 75mg/kg/일이 바람직하고, 약 10 내지 40mg/kg/일이 더욱 바람직하다.
당연히, 이들 투여량은 전술한 바와 같이 필요에 따라 분할 투여를 위해 단위 투여량으로 조정될 수 있고, 투여량은 질병의 특성 및 경중, 환자의 체중, 특정의 식이요법 및 기타 요인에 따라 달라지게 된다.
통상적으로, 이들 투여량은 후술하는 바와 같이 약학 조성물로 제제(製劑)할 수 있다.
일반식(Ⅰ)의 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염의 화합물 또는 혼합물 약 50 내지 500mg을 생리학적으로 허용 가능한 매체, 담체, 부형제, 결합제, 방부제, 안정화제, 향미제 등과 함게 배합하여 허용되는 제약 관례에서 필요로 하는 단위 제형을 제조한다. 상기 조성물 또는 제제 중의 활성 물질의 함량은 전술한 범위 내의 적절한 투여량을 얻을 수 있는 양이다.
정제, 캡슐제 등에 배합될 수 있는 보조제의 예로서는 검 트라가칸트, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴 같은 결합제, 미결정질 셀룰로오즈 같은 부형제, 옥수수 전분, 예비 젤라틴화 전분, 알긴산 등과 같은 붕해제 스테아린산마그네슘과 같은 활택제, 자당, 유당 또는 사카린과 같은 감미제, 페파민트, 원터그린 또는 체리 오일과 같은 향미제가 있다. 단위 투여 제형이 캡슐인 경우에, 상기 제형은 상기 유형의 물질외에도 지방성 오일 같은 액상 담체를 함유할 수 있다. 각종 기타 물질들이 코팅제로서 제공되거나, 또는 투여 단위의 물리적 형태를 개질시키기 위해 제공될 수 있다. 예를 들면, 정제는 쉘락, 자당 또는 이들 양자로 코팅될 수 있다. 시럽제 또는 엘릭실제는 활성 성분, 감미제인 자당, 방부제인 메틸 및 프로필 파라벤, 색소 및 체리 또는 오렌지향과 같은 향미제를 함유할 수 있다.
전술한 일반식(Ⅰ)의 화합물 및 이의 생리학적으로 허용되는 염과 전술한 접합체는 정맥내 투여, 복강내 투여, 경구 투여, 림프내 투여 또는 직접 종양내 투여하는 것을 비롯한 통상의 투여 방법을 이용하여 투여될 수 있으나, 이에만 한정되는 것은 아니다. 정맥내 투여, 예컨대 정맥내 주입이 바람직하다.
주사용 또는 주입용 멸균 조성물은 주사용수, 천연 식물유(예: 참기름, 코코넛유, 땅콩유, 면실유 등), 또는 합성 지방 매체(에틸 올레이트 등)와 같은 매체 중에 활성 물질을 용해 또는 현탁시켜 통상의 제약 관례에 따라 제제 수 있다. 완충제, 방부제, 산화 방지제 등을 필요에 따라 혼합할 수 있다. 종래의 제약 관례에 따라 제제된 주사용 또는 주입용의 바람직한 조성물은 염, 자당(특히, 덱스트란), 완충제 및/또는 공용매(특히, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 디메틸 이소소르비드)를 임의로 함유하는 물과 같은 매체 중에 약물 전구체를 용해시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 한 가지 실시예에 있어서, 일반식(Ⅰ)의 화합물은 유기산의 형태로 제공되며, 이 유리산은 환자에게 투여하기 바로 직전에 비경구 투여용 체형으로 제제화할 수 있다. 따라서, 예를 들면 유리산 형태의 일반식(Ⅰ)의 화합물은 환충제와 혼합되고, 이에 의해 그 화합물은 투여하기 바로 직전에 생리학적으로 허용가능한 염으로 전환된다.
본 발명의 화합물의 양호한 단위 투여 제형은 앰플 내에 주사용/주입용 용액으로 재구성되기 위한 멸균 동결 건조된 형태의 일반식(Ⅰ)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다. 앰플은 상기 화합물을 500mg 내지 2g(특히 1g) 함유하는 것이 바람직하다.
이하의 실시예에는 일반식(Ⅰ)의 화합물의 제조 방법 및 이들을 포함하는 약학 조성물의 제조 방법이 예시되어 있으나, 이들 실시예는 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 아니된다. 이들 실시예에 있어서, 특별한 언급이 없는 한 다음의 항목들은 표준 절차이다.
ⅰ) 모든 증발 공정은 진공 중에서 회전 증발로 수행하였고, 처리(work-up) 공정은 여과에 의해 잔류 고체를 제거한 후 수행하였다.
ⅱ) 작업은 실온, 즉 18 내지 25℃ 및 아르곤과 같은 불활성 대기하에서 수행하였다.
ⅲ) 독일, 담스타트에 소재한 이. 머크(E. Merk)로부터 입수한 머크 키셀겔 실리카(Art. 9385) 상에서 (플래쉬 절차에 의한) 컬럼 크로마토그래피를 수행한다.
ⅳ) 수율은 단지 예시용으로만 제공되며, 반드시 극대 값을 얻는 것은 아니다.
ⅴ) 일반식(Ⅰ)의 최종 생성물은 미량 분석 값을 만족하고, 이들의 구조는 NMR 및 질량 분석법에 의해 확인하였다.
ⅵ) 중간 물질은 일반적으로 완전히 특성화하지 않고, 순도는 박층 크로마토 그래피, 적외선(IR) 또는 NMR 분석법에 의해 평가하였다.
ⅶ) 융점은 수정하지 않고, 오일조(槽) 장비를 사용하여 측정하였으며, 일반식(Ⅰ)의 최종 생성물에 대한 융점은 종래의 유기 용매(예: 에탄올, 메탄올, 아세톤, 에테르 또는 헥산)의 단독 또는 이들의 혼합물에서 결정화한 후 측정하였다.
N-(4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]-페녹시카르보닐)-L-글루탐산
에틸 아세테이트(100ml) 중에 디벤질 N-(4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노] 페녹시카르보닐)-L-글루타메이트[반응 도식 1의 (2)참조)를 용해시킨 용액을 탄소에 침지시킨 30% 팔라듐 (0.6g)에서 2 시간 동안 수소화시켰다. 이론적 량의 수소가 흡수되었을 때, 촉매를 여과하여 제거하고 여과액을 증발 건고(乾固)시켰다. 잔사를 고온의 에테르(25ml)에 용해시키고, 혼탁해질 때까지 헥산을 첨가하였다. 냉각시킨 후, N-(4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]-페녹시카르보닐)-L-글루탐산[반응 도식 1의 (3) 참조]을 백색의 결정성 고체(3.4g)로 얻었다.
수율 79% ; m.p. 87-89°.
NMR: 7.0(d)2H ; 6.6(d)2H; 6.2(d)1H; 4.4(m)1H; 4.4(m)1H; 3.5-3.7(m)8H; 2.0-2.6(m)4H.
원소 분석: 이론치 C = 47.2, H = 4.95, N = 6.88
실측치 C = 47.5, H = 5.1, N = 6.7.
또한, 표제 화합물을 에테르에 불용성이고, 융점이 128 내지 130℃인 상이한 동질 이상 형태로 제조하였다.
출발 물질인 디벤질 N-(4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]-페녹시카르보닐)-L-글루타메이트는 다음과 같이 제조하였다.
클로로포름(15ml) 중에 4-니트로페닐-클로로포르메이트(1.43g)를 용해시킨 용액을 4-[비스(2-클로로에틸)아미노)페놀 염산염(Biochem. Pharmacol 17 893(1968) (1.93g), 트리에틸아민(2ml) 및 클로로포름(20ml)의 혼합물에 첨가하였다. 2 시간 후, 상기 혼합물을 상온에서 증발 건고시킨 다음, 잔사를 머크 실리카겔 제품 9385 상에서 크로마토그래피하였다. 헥산/에틸 아세테이트로 용출시킨 후, 벤젠:석유 에테르(3:1)로 재결정하여 생성물인 황색 고체의 O-(4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페닐)-O'-(4-니트로페닐)카르보네이트[반응 도식 1의 (1) 참조](1.4g) (50%)를 얻었다. mp = 66-7°.
클로로포름(40ml) 중에 녹인 상기 생섬루 5.5g 트리에틸아민(3.8ml)을 첨가한 다음, L-글루탐산 디벤질 에스테르 토실레이트(13.75g)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 교반하고 60℃에서 4 시간 동안 가열하고 증발 건고시켰다. 상기 잔사를 시리카겔(머크 제품 9385) 상에서 크로마토그래피하고, 클로로포름 중의 3% 에틸아세테이트로 용출시켜 출발 물질인 백색 고체의 디벤질-2-([비스(2-클로로 에틸)아미노]페녹시카르보닐)글루타메이트(반응 도식 1의(2) 참조] 6.2g(수율 77%)을 얻었다. m.p. = 85-7°.
[실시예 2]
N-(4-N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]-3-메틸페녹시카르보닐)-L-글루탐산
디벤질 N-(4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]-페녹시카르보닐)-L-글루타 메이트 대신 디벤질 N-(4-N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]-3-메틸-페녹시 카르보닐)-L-글루타메이트를 사용하여 실시예 1에 기재된 방법을 반복함으로써 백색 고체인 N-(4-N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]-3-메틸-페녹시카르보닐)-L-글루탐산을 얻었다. m.p. 160-162℃.
NMR: 7.3(d)2H; 6.7(d)2H ; 6.0(d)1H, 4.2(m)1H, 3.7(m)8H; 2.3-2.0(m)4H.
원소 분석: 이론치 C = 47.3; H = 5.2; N = 10.3; Cl = 17.5
실측치 C = 46.8; H = 5.2; N = 10.3 ; Cl = 18.0.
출발 물질로서 사용한 디벤질 N-(4-N,N-(2-클로로에틸)아미노]-3-메틸-페녹시카르보닐)-L-글루타메이트는 4-(N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페놀 대신 4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]-3-메틸-페놀을 사용하여 실시예 1과 유사한 방법으로 얻었다.
4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]-3-메틸-페놀은 다음과 같이 얻었다(반응도식 2 참조).
(a) 에틸렌 옥사이드(40g)를 아세트산/물(1:1)(500ml) 중에 녹은 4-아미노-m-크레졸 (12.3g)의 용액 내에 기포로 통과시켰다. 상기 혼합물을 실온에서 48 시간 동안 유지시킨 다음, 증발 건고시켰다. 잔사를 실리카겔 상에서 크로마토그래피하고 에틸 아세테이트로 용출하여 오일 상태의 4-[N,N-비스(2-히드록시에틸)아미노]-3-메틸페놀 (6.2g)을 얻었다.
NMR: 표 2 참조.
(b) 벤질 브로마이드(4.24g)를 위해서 얻은 생성물(6g), 수산화칼륨 (1.6g) 및 에탄올(40ml)의 혼합물에 첨가하였다. 이 혼합물을 교반하고 2 시간 동안 환류하에 가열하여 냉각시킨 다음 증발 농축시켰다. 잔사를 물(100ml)에 부어 넣고, 에틸 아세테이트로 2회 추출한 다음, 건조 및 증발시켜 고체인 2,2'-(4-벤질옥시-2-톨루이디노)디에탄올(7.2g)을 얻었다. mp = 70-72℃.
NMR: 표 3 참조
(c) 10 내지 20℃의 클로로포름(50ml) 중에 위에서 얻은 생성물(7g)을 녹인 용액에 오염화인(11.4g)을 소량씩 첨가하였다. 이어서, 이 혼합물을 가열하여 90분 동안 환류하에 가열하여 냉각시킨 다음 물에 부었다. 유기상을 분리하고 중탄산나트륨 수용액과 물로 세척하고, 증발 건고시켰다. 전사를 실리카겔 상에서 크로마토그래피하였다. 헥산/에틸 아세테이트(2:1)로 용출시킨 후 오일 상태의 4-벤질옥시-3-메틸-N,N-비스(2-클로로에틸)-아닐린(2.2g)을 얻었다.
NMR: 표 4 참조
상기 반응 대신에 사용할 수 있는 별법은 다음과 같다. 0-5℃에서 피리딘(8ml) 중에 상기 단계 (b)에서 얻은 생성물(2.6g)을 용해시킨 용액에 메탄 설포닐 클로라이드(2.5ml)를 첨가하였다. 이어서, 상기 혼합물을 70℃에서 15분간 가열시킨 다음 냉각하여, 묽은 시트르산 용액(100ml)에 부었다. 상기 혼합물을 에틸 아세테이트로 2회 추출하고, 건조및 증발시켜 오일 상태의 4-벤질옥시-3-메틸-N,N-비스(2-클로로에틸)-아닐린(2.6g)을 얻었다(84%).
NMR: 표 4 참조.
(d) 완전한 용액이 관찰될 때까지 에탄올(25ml) 중에 위에서 얻은 생성물(2g)에 에테르성 HCl(포화)을 첨가하였다. 탄소에 침지시킨 30% 팔라듐 촉매 300mg을 첨가하고, 상기 혼합물을 적당량의 수소가 흡수될 때까지 수소 분위기 하에서 교반하였다. 촉매를 여과에 의해 제거하였고, 여과액을 증발시켜 고체인 4-[N,N-비스(2-클로로에틸)]아미노-3-메틸페놀 염산염 (950mg)을 얻었다. mp = 164-7℃.
[실시예 3]
N-(4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페닐카르바모일)-L-글루탐산 염산염
염화수소의 에테르(120ml) 포화 용액을 에틸 아세테이트(20ml) 중에 디-t-부틸 N-(4-[N,N-비스-(2-클로로에틸)아미노]-페닐카르바모일)-L-글루타메이트 (4.4g)이 용해된 용액에 첨가했다. 1 시간 후, 상온에서 상기 혼합물을 증발시켜 고체를 얻었다. 이 고체를 에테르와 함께 분쇄하여 회색 고체인 N-(4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페닐카르바모일)-L-글루탐산 염산염(3.5g)을 얻었다. m.p=148-150℃ (반응 도식 3 참조).
NMR: 7.2 (d) 2H; 6.7 (d) 2H; 4.2 (n) 1H ; 3.7 (m) 8H; 2.4-1.8 (m) 4H.
원소 분석: 실측치 C = 46.7; H = 6.8; N = 7.0
이론치 C = 47.1; H = 6.5; N = 7.5
출발 물질인 디-t-부틸 N-(4-[N,N-비스-[(2-클로로에틸)아미노]페닐카르바모일)-L-글루타메이트는 다음과 같이 하여 얻었다.
p-플루오로니트로벤젠(14.1g)과 디에탄올아민(30ml)의 혼합물을 교반하고, 130℃에서 2 시간 동안 가열하였다. 이 혼합물을 약 60℃로 냉각시키고 48% 가성 소다 용액 10ml가 함유된 물 1L에 부었다. 15℃로 냉각시킨 후, 침전을 여과하여 제거하고 건조함으로써 2,2'-(4-니트로아닐리노)디에탄올(20.7g)을 얻었다(92%). m.p. = 102-104℃.
냉각시키면서, 티오닐 클로라이드(30ml)를 위해서 얻은 생성물(20g), 디클로로메탄(200ml) 및 피리딘(7ml)의 혼합물에 첨가하였다. 첨가 후, 혼합물을 1 시간 동안 환류하에서 가열하였다. 그 혼합물을 냉각시킨 후, 등량의 디클로로메탄으로 희석하고, 물로 2회 조심스럽게 세척하고, 건조 및 증발시켜 고체인 [N,N-비스(2-클로로에틸)]-4-니트로-아닐린(21g)을 얻었다. m.p. = 81-3℃.
재증류된 테트라히드로푸란(20ml) 중에 위에서 얻은 생성물(0.53g)을 용해한 용액에 탄소에 조심스럽게 30% 팔라듐 촉매(100mg)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 수소 분위기 하에서 2 시간 동안 교반하고, 촉매를 여과 제거하였다. 여과액을 증발 건고시키고 잔사를 에테르(20ml) 중에 용해하며, 에테르 중에 녹인 염화수소 기체의 용액을 약간 과량으로 첨가하였다. 고체인 4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]아닐리늄 클로라이드가 생성되었다. 수득량 = 0.5g. m.p. = 238-40℃(d).
0 내지 5℃에서 클로로포름(10ml) 중에 트리포스겐(알드리치(200mg)을 용해시킨 용액에 위에서 얻은 생성물(539mg), 이어서 트리에틸아민(0.83ml)을 첨가하였다. 실온에서 15분 후, 클로로포름(5ml) 중에 L-글루탐산 디-t-부틸 에스테르(0.31g)를 용해시킨 용액을 첨가하였다. 이 혼합물을 상온에서 18 시간 동안 방지하고, 수세한 후, 건조 및 증발시켜 무수 상태로 하였다. 잔사를 머크 실리카겔 상에서 크로마토그래피 하고, 헥산-에틸 아세테이트(3:1)로 용출시켜 목적하는 출발 물질인 디-t-부틸 4[비스-2-(클로로에틸아미노)]페닐카르바모일-L-글루타메이트(0.44g)를 오일 상태로 얻었다(반응 도식 3 참조).
NMR : δ7.2d 및 δ6.65(dd)4H. 방향족류
δ4.1(m)1H
δ3.66(s)8H
δ1.7-2.2(m)4H
δ1.38(s)9H 및 δ1.42(s)9H
[실시예 4]
N-(4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페닐카르바모일)-L-글루탐산
N-(4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노] 페닐카르바모일)-L-글루탐산을 제조 하기 위한 실시예 3의 별법을 이하에 제시하였다. 출발 물질인 디벤질 N-(4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페닐카르바모일)-L-글루타메이트를 실시예 5에 해당하는 단계와 유사한 방법으로 제조하였다.
DMF(15ml) 중에 디벤질 N-(4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페닐카르바모일)-L-글루타메이트(1.138g)를 용해시킨 용액을 10% Pd/C상에서 16 시간 동안 수소화시켰다. 진공하에서 여과 및 증발시킨후, 잔사를 CHCl3(20ml)에 용해시켰다. 18시간 후 결정성 침전을 여과하여 제거하고 진공하에서 건조시켜 N-(4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페닐카르바모일)-L-글루탐산을 얻었다. 수득량, 730mg(93%), 아세톤/CHCl3로 재결정시켰더니 미세한 막대 모양의 물질이 형성되었다. m.p. = 116-118°.
NMR(CD3COCD3): δ8.0(s)1H; 7.2(d)2H; 6.6(d)2H; 6.2(d)2H NH; 4.4(m)1H; 3.6(m)8H; 2.5-1.9(m)4H.
[실시예 5]
N-(4-[N,N-비스(2-클로로에틸)-아미노]-3-플루오로페닐카르바모일)-L-글루탐산
에틸 아세테이트(10ml) 중에 디벤질 N-(4-[N,N-비스(2-클로로에틸)-아민]-3-플루오로페닐카르바모일)-L-글루타메이트(0.4g)를 용해시킨 용액에 30% Pd/C(수분 50%) (106mg)를 첨가하고, 혼합물을 수소 분위기하에서 1 시간 동안 교반하였다. 촉매를 여과한 후, 여과물을 증발 건조시켰다. 에틸 아세테이트/헥산과 함께 오일성 잔사를 분쇄한 후 N-(4-[N,N-비스(2-클로로에틸)-아민]-3-플루오로페닐카르바모일)-L-글루탐산을 백색 분말(210mg, mp 111-114℃)로서 얻었다. 출발 물질인 디벤질 N-(4-[N,N-비스(2-클로로에틸)-아미노]-3-플루오로페닐카르바모일)-L-글루탐산은 다음과 같이 하여 제조하였다.
에틸 아세테이트 무수물(200ml) 및 탄산칼륨(5.5g) 중에 4-[N,N-비스(2-클로로에틸)-아미노]-3-플루오로아닐리늄 옥살레이트(3.5g)을 현탁시킨 현탁액을 아르곤하에서 5℃로 냉각시켰다. 이 혼합물에 톨루엔(1.9 M ; 5.5ml) 중의 포스겐 용액을 첨가하였다. 첨가 후, 상기 혼합물을 실온에서 10 분간 교반하여 여과하고, 여과액을 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 생성된 건조 여과액을 디벤질 글루타메이트 p-톨루엔설포네이트(5g), 탄산칼륨(2g) 및 에틸 아세테이트(100ml)의 혼합물에 한꺼번에 첨가하였다. 트리에틸아민(2ml)을 첨가하고, 혼합물을 상온에서 20분간 교반하였다. 이 혼합물을 여과하여 여과액을 증발 건고시켰다. 잔사를 에틸 아세테이트/헥산(1:2)으로 용출시키는 실리카겔 상에서 크로마토그래피하여 목적하는 출발 물질을 오일 상태로 얻었고, 이를 결정화하였다. 수득량 = 5.5g, m.p. 81-84℃.
4-[N,N-비스(2-클로로메틸)-아미노]-3-플루오로아닐리늄 옥살레이트를 실시예 3에 기재된 방법으로 제조하였다. 다만 3,4-디플루오로니트로벤젠을 p-플루오로 니트로벤젠 대신 출발 물질로서 사용하여 4-[N,N-비스-(2-히드록시에틸)-아미노] 플루오로니트로벤젠을 얻었다. m.p. = 99-101℃.
이와 같이 하여 얻은 생성물을 실시예 3에 기재된 바와 같이 하여 티오닐 클로라이드로 처리하여 4-[N,N-비스(2-클로로에틸)-3-플루오로니트로벤젠을 생성시켰다. m.p. 66-8℃.
이러한 방법으로 얻은 생성물을 용매로서 에틸 아세테이트를 사용하여 실시예 3에 기재된 바와 같이 수소화시켰다. 혼합물을 여과하고, 여과액을 증발시켜 용량을 줄이고, 에테르에 재용해시켰다. 에테르 중의 옥살산 포화 용액을 과량으로 첨가하여, 목적하는 생성물인 4-[N,N-비스(2-클로로메틸)아미노]-3-플루오로아닐리늄 옥살레이트를 수집하였다. m.p. = 146-8℃.
[실시예 6]
N-(4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]-3-클로로페닐카르바모일-L-글루탐산
30% Pd/C 70mg (수분 50%)을 함유하는 에틸 아세테이트(30 ml) 중에 디벤질 N-(4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]-3-클로로페닐카르바모일)-L-글루타메이트 (350mg)를 용해시킨 용액을 수소 분위기 하에서 1 시간 동안 교반하였다. 상기 촉매를 여과한 후, 여과액을 증발 건고시키고, 잔사를 에테르/에틸 아세테이트와 함께 분쇄하여 오일 상태의 N-(4-[N,N-비스-(2-클로로에틸)아미노]-3-클로로페닐카르바모일)-L-글루탐산을 얻었다.
NMR: 8.7(s) 1H; 7.6(s) 1H ; 7.1-7.4(m) 2H ; 6.5(d) 1H ; 4.2(m), 1H; 3.3-3.6 (m) 8H ; 1.7-2.4(m) 4H.
출발 물질인 디벤질 4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]-3-클로로페닐카르바모일-L-글루메이트는 실시예 3과 유사한 방법으로 제조하였다. 다만, 출발 물질로 4-플루오로니트로벤젠 대신 4-플루오로-3-클로로니트로벤젠을 사용하여 오렌지색 오일 상태의 4-[N,N-비스-(2-히드록시에틸아미노)]-3-클로로-니트로벤젠을 얻었다.
NMR: 8.0-8.2 (m) 2H; 7.3 (1) 1H; 4.7 (t) 2H, 3.5(m), 8H.
이와 같이 하여 얻은 생성물을 실시예 3에 기재된 바와 같이 하여 티오닐 클로라이드로 처리하여 오일 상태의 4-[N,N-비스(2-클로로에틸아미노)-3-플루오로니트로 벤젠을 얻었다.
NMR (CHCl3): 8.3(d)1H; 8.1(q)1H; 7.25(d)1H; 3.8(t)4H; 3.6(t)4H.
이러한 방법으로 얻은 생성물을 용매로 에틸 아세테이트를 사용하여 실시예 3에 기재된 바와 같이 수소화시켰다. 촉매를 여과하여 제거하고, 여과액을 증발시켜 용량을 줄여 에테르에 재용해시키고, 포화 에테르성 옥살산을 과량 첨가하였다. 여과하여 옥살레이트염을 얻었다. m.p. = 118-21℃.
위에서 얻은 생성물을 실시예 5에 기재된 바와 같이 디벤질 N-(4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]-3-클로로페닐카르바모일)-L-글루탐산으로 전환시켜 오일을 얻었다.
NMR: 7.1-7.4(m)13H; 5.1(s)2H; 5.0(s)2H; 4.6(m)1H; 3.5(s)8H; 2.0-2.6(m)4H.
[실시예 7]
본 발명의 화합물을 함유하는 대표적인 약학 조성물
A: 캡슐당 약물 전구체 100mg을 함유한 건식 충전 캡슐제
상기 화합물을 No. 60 분말로 감소시킬 수 있고, 유당 및 스테아린산마그네슘은 상기 분말 위에 놓인 No. 60 압지에 통과시킬 수 있었다. 상기 배합 성분들은 약 10분간 혼합시키고 무수 젤라틴 캡슐 1호에 충전시켰다.
B: 정제
통상의 정제는 화합물(100mg), 예비 젤라틴화 전분 USP (82mg), 미세 결정질 셀룰로오즈(82mg) 및 스테아린산마그네슘(1mg)을 함유한다.
C: 좌약
직장 투여용의 통상적인 좌약 제제는 화합물(50mg), 에데트산 이나트륨칼슘(0.25-0.5mg) 및 폴리에틸렌 글리콜(775-1600mg)을 함유할 수 있다. 다른 좌약 제제는, 예컨대 에데트산 이나트륨칼슘 대신에 부틸화 히드록시톨루엔(0.04-0.08mg)으로 대체하고, 폴리에틸렌 글리콜 대신에 수소화된 식물유(675-1400mg) (예: 수포시르 L, 위코비 FS, 위코비 M, 위텝솔 등)로 대체함으로써 제조될 수 있다.
D : 주사액제
대표적인 주사 제제는 주사액(5.0ml) 중에 활성 화합물(500mg), 벤질 알콜(0.05ml) 및 중탄산나트륨(0.15M)을 함유하고 있다.
[실시예 8] (반응 도식 4 참조)
N-(4-[N-(2-클로로에틸)-N-(2-메실옥시에틸)아미노]페녹시카르보닐)-L-글루탐산
N-(4-[N-(2-클로로에틸), N-(2-메실옥시에틸)]아미노]페녹시카르보닐)-L-글루탐산-디-t-부틸 에스테르(6, 이 때 R1=Cl이고, R2=OSO2Me임) (110mg)를 트리플루오로아세트산(TFA)(2.2ml)에 현탁시키고, 상온에서 40분 동안 교반하였다. TFA를 감압하에서 제거하고; 남아 있는 오일을 에틸 아세테이트 (1ml)로 희석하고 증발시켜, N-(4-[N-(2-클로로에틸)-N-(2-메실옥시에틸)아미노]페녹시카르보닐)-L-글루탐산-1.02 TFA-0.16 EtOAc(9, 이 때, R1=Cl이고, R2=OSO2Me임)(90mg)(수율 95%)을 얻었다.
NMR: -CH2-CH2-OSO2Me/-CH2-CH2Cl
3.15(s)3H; 3.70(m)6H;
기타 4.30(t)1H; 4.49(t)1H;
방향족 6.75(d)2H; 6.92(d)2H;
1.8-.2.3(m)4H; 4.02(m)1H; 7.90(d)1H.
출발 물질인 4-[N-2-클로로에틸), N-(2-메실옥시에틸)]아미노)페닐옥시카르보닐)-L-글루탐산-디-t-부틸 에스테르는 다음과 같이 제조하였다.
무수 클로로포름(30ml) 중에 트리에틸아민(4ml) 및 L-글루탐산 디-t-부틸에스테르 염산염(4.26g)을 용해시킨 용액을 4-니트로페닐클로로포르메이트 (2.92g, 알드리치에서 시판함)의 저온 용액과 함께 5 분간 교반하였다. 상온에서 5 시간 후, 용매를 증발시키고, 잔사를 에틸 아세테이트(70ml) 중에 용해하여 여과하고 증발 건고하였다. 잔사를 실리카겔 상에서 크로마토그래피하고, 클로로포름으로 용출하여 4-니트로페닐옥시카르보닐-L-글루탐산 디-t-부틸 에스테르(2)를 오일로 얻었다.(5.02g)(82%)
NMR: 7.33(d)2H; 8.24(d)2H; 1.46(s)9H; 1.50(s)9H; 2.0-2.4(m)4H; 4.32(m)1H; 5.90(d)1H.
이와 같이 하여 얻은 생성물(2) (5.01g)을 아세트산(30ml) 중에 용해시킨 용액을 10% Pd/C 상에서 3일간 수소화시켰다. 여과 후, 용액을 냉각하여 에틸렌 옥사이드(5ml)를 첨가하고, 상온에서 22 시간 방치하였다. 용매를 증발시키고 잔사를 에틸 아세테이트와 물 사이에 분배시켰다. 유기상을 분리하여 물로 세척하고, 건조(Na2SO4) 및 증발시켜 무수 상태로 하였다. 잔사를 실리카겔 상에서 크로마토그래피하고, 에틸 아세테이트/클로로포름(2:1)으로 용출하여 4-[비스(2-히드록시에틸)아미노]페닐옥시카르보닐-L-글루탐산 디-t-부틸 에스테르(4)(3.93g)를 얻었다. (69%). m.p. = 91-93℃.
피리딘(3ml) 중에 위에서 얻은 생성물(4)(0.86g)이 용해된 용액을 2℃에서 메탄설포닐 클로라이드(0.6ml)와 함께 20 분간 교반한 다음, 50℃에서 10 분간 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 에틸 아세테이트와 물 사이에 분배시켰다. 유기상을 분리하여 수세하고, 건조(Na2SO4) 및 증발시켜 무수 산태로 하였다. 잔사를 실리카겔 상에서 크로마토그래피하고, 에틸 아세테이트/디클로로메탄(1:9)으로 용출시켜 오일 상태의 4-[(2-클로로에틸)[2-(메실옥시)에틸] 아미노페닐옥시카르보닐-L-글루탐산-디-t-부틸에스테르(6)를 얻었다(0.44g)(43%).
NMR: 3.15 (s) 3H; 3.70 (m) 6H; 4.29 (t) WH; 6.75(d) WH; 6.92 (d) 2H; 1.41 (s) 9H; 1.42 (s) 9H; 1.8-2.3 (m) 2H; 3.97 (m), 1H; 7.92 (d) 1H.
[실시예 9-15]
하기 표 1에 수록된 화합물은 실시예 2에 따라 하기 표 2 내지 8에 수록된 출발 물질 및 중간 물질을 사용하여 제조되었다.
따라서, 실시예 9 내지 15의 화합물은 실시예 2에 기재된 것과 유사한 방법으로 제조되었다. 그러므로, 실시예 10의 화합물은 단계 (a)에 4-아미노-m-크레졸 대신에 4-아미노-3-이소프로필페놀[길맨(Gilman, H) 등의 논문, J. Org, Chem. 19, (1954) 1067-78]을 사용하여 제조하였다. 실시예 11의 화합물은 4-아미노-m-크레졸 대신 4-아미노-2-메틸페놀(알드리치에서 시판)을 사용하여 제조하고, 또 실시예 12의 화합물은 4-아미노-m-크레졸 대신 4-아미노-3-플루오로페놀[Journal or the Chemical Socity (1964) p473에 따라 제조함]을 사용하여 제조하였다. 실시예 13의 화합물은 4-아미노-m-크레졸 대신에 4-아미노나프트-1-올(알드리치 케미칼 컴패니 리미티드)을 사용하여 제조하였고, 실시예 14의 화합물은 4-아미노-m-크레졸 대신 4-아미노-2-클로로페놀[Journal of the American Chemical Society 45, 2192, (1923)에 따라 제조함]을 사용하여 제조하였다. 실시예 15의 화합물은 4-아미노-m-크레졸 대신 4-아미노-3-클로로 페놀 (Berichte; p.2065(1938) 및 Organic Synthesis; 제4 권, p148)을 사용하여 제조하였다.
실시예 9 내지 15의 화합물을 제조하는 데 사용된 출발 물질 및 중간 물질과 이들의 특성을 하기 표 2내지 8에 수록하였다.
[실시예 16]
N-(4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페녹시카르보닐)-L-글루탐산-γ-아닐리드
에틸 아세테이트(50ml) 중에 α-벤질 4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페녹시카르보닐-L-글루탐산-γ-아닐리드(2.0g)가 현탁되어 있는 현탁액을 10% Pd/C(0.15g) 상에서 4 시간 동안 수소화시켰다. 촉매를 여과하여 제거하고, 여과액을 35℃의 감압하에서 증발 건고시켰다. 생성물인 4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페녹시카르보닐)-L-글루탐산-γ-아닐리드(반응 도식 6의 1)를 백색의 결정성 고체 (1.4g)로서 수득하였다(83%). m.p. = 110°
원소 분석: 이론치(%) C = 54.8, H = 5.22, N = 8.71
실측치(%) C = 54.5, H = 5.62, N = 8.31
출발 물질인 α-벤질 4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페녹시카르보닐-L-글루탐산-감마-아닐리드는 다음과 같이 제조하였다.
트리에틸아민(2ml)을 디클로로메탄(30ml) 중에 α-벤질-p-토실-L-글루탐산 γ-아닐리드(2.8g) 및 O-(4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페닐-O'-(4-니트로페닐)카르보네이트(2.0g)가 녹은 혼합물에 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 16시간 교반하고 용매를 진공에서 제거하였다. 잔사를 실리카겔 (머크 제품 9385) 상에서 크로마토그래피하고, 10% 에틸 아세테이트/디클로로메탄으로 용출하여 백색 고체인 α-벤질-4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페녹시카르보닐-L-글루탐산-γ-아닐리드(1.9g)를 얻었다(65%).
출발 물질인 O-(4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페닐-O'-(4-니트로페닐)카르보네이트는 다음과 같이 제조하였다.
디클로로메탄(10ml) 중에 트리에틸아민(10ml)을 용히시킨 용액을 디클로로메탄(100ml) 중에 4-니트로페닐-클로로포르메이트(7.25g) 및 4-(N,N-비스(2-클로로 에틸)아미노)페놀 염산염 (10g)이 녹은 혼합물에 2 시간에 걸쳐 첨가하였다. 실온에서 16 시간 교반한 후, 용매를 감압하에서 제거하고, 잔사를 실라카겔 (머크 제품 9385) 상에서 크로마토그래피하여 디클로로메탄으로 용출한 후, 용출액을 증발시켜 적색 오일 상태의 생성물을 얻었다. 헥산과 함께 분쇄하여 황색 고체로 만들고, 이를 벤젠/헥산으로 재결정하여 오렌지색 결정체인 O-(4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노)페놀-O'-(4-니트로페닐)카르보네이트(10.4g)를 얻었다. m.p. = 68°.
출발 물질인 p-토실-α-벤질-L-그루탐산 γ-아닐리드는 다음과 같이 제조하였다.
N-t-BOC-L-글루탐산 α-벤질 에스테르(10g) 및 디시클로헥실카르보디이미드(6.1g)를 디클로로메탄(120 ml) 중에 용해시키고, 실온에서 10분간 교반하였다. 아닐린(2.8 ml)을 상기 혼합물에 첨가하고 실온에서 16 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 여과하고, 침전을 디클로로메탄(2×15ml)으로 세척하였다. 여과물을 포화 NaHCO3용액(2×100ml) 및 물(100ml)의 순서로 세척한 다음 증발시켰다. 생성된 고체를 EtOAc/헥산으로 재결정하여 무색의 판상(板狀) 물질(8.2g)을 얻었다(67%). 벤젠(300ml) 중의 p-톨루엔 설폰산(5.4g) 및 γ-아닐리드(12.0g)를 40분간 환류시킨 다음, 방치하여 밤새 냉각시켰다. 침전을 여과하고, 펌프 건조시키고, EtOAc/MeOH로 재결정하여 무색 판상의 토실-α-벤질-L-글루탐산 γ-아닐리드(8.2g)를 얻었다 (58%).
[실시예 17]
N-(4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페녹시카르보닐)-L-글루탐산-γ-t-부틸아미드
α벤질 4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페녹시카르보닐-L-글루탐산-γ-아닐리드 대신 α-벤질 4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페녹시카르보닐)-L-글루탐산-γ-t-부틸아미드를 사용하여 실시예 16의 방법을 반복하여 4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페녹시카르보닐)-L-글루탐산-γ-t-부틸아미드(반응 도식 6의 2)를 얻고, 이를 에틸 아세테이트/헥산으로 재결정하여 무색 결정을 얻었다. m.p. = 129°.
원소 분석: 이론치(%) C = 51.9, H = 6.32, N = 9.09
실측치(%) C = 52.1, H = 6.33, N = 8.96
α-벤질 4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페녹시카르보닐-L-글루탐산-γ-t-부틸아미드는 γ-아닐리드 유도체에 관하여 실시예 16에 기재된 방법과 유사한 방법으로 생성시켰다.
[실시예 18]
N-(4-(N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]-3-메틸페닐카르바모일)-L-글루탐산
디클로로메탄(6ml) 중에 디-t-부틸 4-(N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]-3-메틸페닐카르바모일-L-글루타메이트(0.6g)를 용해시킨 용액을 0℃로 냉각시키고, 트리플루오로아세트산(15ml)을 첨가하였다. 이어서, 상기 용액을 0℃에서 3 일간 방치하였다. 상기 용액을 증발 건조시켜 오일 상태의 4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]-3-메틸페닐카르바모일-L-글루탐산을 얻었다. 수득량 = 0.49 g.
NMR: 8.46(s)1H; 7.15(m)3H; 6.4(d)1H; 4.18(m)1H; 3.55(m)4H; 3.35(m)4H; 2.3(m)2H; 2.23(s)3H, 2.0(m)2H.
출발 물질인 디-t-부틸 4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]-3-메틸페닐카르바모일)-L-글루타메이트는 다음과 같이 하여 제조하였다.
탄산칼륨(27.5g)을 에틸 아세테이트(150ml) 중의 3-메틸-4-니트로아닐린 [Journal of Organic Chemistry 33, 3498 (1968)](7.6g)의 용액에 첨가한 다음, 온도를 30℃ 이하로 유지하면서 톨루엔(27.5ml) 중에 1.9 M 포스겐이 용해된 1.9M 용액을 적가하였다. 이어서 상기 혼합물을 상온에서 1 시간 교반하였다. L-글루탐산 디-t-부틸 에스테르(13g)를 상기 혼합물에 첨가한 다음, 상온에서 밤새 교반하였다. 이어서, 용액을 여과하여, 수세하고, 유기상을 MgSO4상에서 건조시키고, 증발시켜 오일을 얻었다. 이것을 실리카 상에서 크로마토그래피하고, 헥산:에틸 아세테이트(3:1)로 용출하여 오일 상태의 디-t-부틸(3-메틸-4-니트로페닐카르바모일)-L-글루타메이트를 얻었다. 수득량 = 11.19g (51%).
NMR: 9.16(s)1H; 8.0(d)1H; 7.43(m)2H; 6.70 (d)1H; 4.1(m)1H, 2.51(s)3H; 2.25(m)2H; 1.8(m)2H; 1.41(d)8H.
에틸 아세테이트(125 ml) 중에 디-t-부틸 3-메틸-4-니트로페닐-카르바모일-L-글루타메이트(4.7g)가 용해된 용액을 30% Pd/C(0.5g) 상에서 수소화시켰다. 이어서, 그 혼합물을 셀라이트(정제 및 하소된 규조토-입도는 20-45μm임, 플루카 케미칼스 리미티드로부터 입수됨)를 통해 여과 및 증발시켜 어두운 색의 고체를 얻었다. 상기 고체를 실리카상에서 에틸 아세테이트:헥산(1:1)을 사용하여 크로마토그래피하여 오일 상태의 디-t-부틸 3-메틸-4-아미노페닐카르바모일-L-글루타메이트를 얻었다. 수득량 = 3.71g (83%).
NMR: 7.98(s)1H; 6.9(m)2H; 6.52(d)1H; 6.15(d)1H; 4.53(s)2H; 4.15(m)1H; 2.25(m)2H; 2.04(s)3H; 1.8(m)2H; 1.45(d)18H.
에틸렌 옥사이드(4.8g)를 빙초산(25ml) 및 H2O (25ml) 중에 녹인 디-t-부틸-3-메틸-4-아미노페닐카르바모일-L-글루타메이트(5g)의 용액을 통해 기포로 통과시켰다. 이어서, 용액을 상온에서 24 시간 동안 교반하였다. 증발 건조시킨 후, 잔사를 에틸 아세테이트에 재용해하여, 수세하고, 유기상을 MgSO4상에서 건조 및 증발시켜 디-t-부틸 4-[N,N-비스(2-히드록시에틸)아미노]-3-메틸페닐카르바모일-L-글루타메이트를 얻고, 이것을 더 정제하는 일이 없이 사용하였다.
NMR: 8.35(s)1H; 7.1(m)3H; 6.35(d)1H; 4.15(m)1H; 3.35(m)4H; 3.05(m)4H; 2.25(m)2H; 2.20(s)3H; 1.8(m)2H; 1.45(d)18H.
온도를 30℃ 이하로 유지하면서 메탄설포닐 클로라이드(3.8ml)를 아르곤 분위기 하에서 피리딘(60ml) 중에 디-t-부틸 4-[N,N-비스(2-히드록시에틸)아미노]-3-메틸페닐카르바모일-L-글루타메이트(4g)가 용해된 용액에 적가하였다. 첨가 후, 상기 용액을 80℃에서 2 시간 동안 교반하였다. 용액을 냉각하여 10% 시트르산(500ml)에 부어 넣고, 에틸 아세테이트로 추출하고, 수세하여, MgSO4상에서 유기상을 건조 및 증발시켜 갈색 오일을 얻었다. 상기 오일을 실리카 상에서 크로마토그래피하고 오일 상태의 헥산:에틸 아세테이트(5:1)로 용출하여 오일 상태의 디-t-부틸 4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]-3-메틸페닐카르바모일-L-글루타메이트를 얻었다. 수득량 = 7.23g (28%).
NMR: 8.42(s)1H; 7.1(m)3H; 6.36(d)1H; 4.13(m)1H; 3.50(m)4H; 3.31(m)4H; 2.3(m)2H; 2.23(s)3H; 1.9(m)2H; 1.4(s)9H; 1.35(s)9H.
본 실시예에서 사용한 반응 순서는 반응 도식 7에 도시되어 있다.
[실시예 19]
N-(4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]벤질카르보닐)-L-글루탐산
디-t-부틸 4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]벤질카르보닐-L-글루탐산 (0.5g)을 CH2Cl2(1.5ml)에 용해시키고, 트리플루오로아세트산(1.5ml)을 첨가하였다. 상기 용액을 상온에서 2 시간 동안 교반하였다. 이어서, 상기 용액을 증발시켜 오일 상태의 화합물(0.8g)을 얻었다.
NMR: 8.22(d)1H; 7.10(d)2H; 6.66(d)2H; 4.19(m)1H; 3.69(s)8H; 2.24(m)2H; 1.9(m)2H; 3.32(s)2H.
출발 물질인 디-t-부틸 4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]벤질카르보닐-L-글루타메이트는 다음과 같이 제조하였다.
1-히드록시벤조트리아졸(4.05g)을 디메틸포름아미드(75ml) 중에 4-니트로페닐 아세트산(5.4g)가 용해된 용액에 첨가하였다. 상기 혼합물에 L-글루탐산 디-t-부틸 에스테르(7.77g) 및 디시클로헥실카르보디이미드(6.2g)의 순서로 첨가하였다. 이어서, 상기 혼합물을 상온에서 18 시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 여과하고, 여과액을 중탄산나트륨 포화 용액, 물 및 0.5m 염산으로 세척하고, 건조 증발 시켜 무수 상태로 하였다. 전사를 실리카겔 상에서 크로마토그래피하여 헥산/에틸아세테이트(2:1)로 용출시켜 오일 상태의 디-t-부틸 4-니트로벤질카르보닐-L-글루타메이트(9.7g)를 얻었다(77%).
NMR: 8.2(d)2H; 7.45(d)2H; 6.45(d)1H; 4.45(m)1H; 3.15(s)2H; 2.1(m)4H; 1.4(d)9H; 1.35(s)9H.
에틸 아세테이트(200ml) 중에 디-t-부틸 4-니트로벤질카르보닐-L-글루타 메이트(9.7g)를 용해시킨 용액을 30% Pd/C(900mg) 상에서 수소화시켰다. 상기 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고 증발시켜 황색 오일(디-t-부틸 4-아미노벤질카르보닐-L-글루타메이트)을 얻고, 이 오일을 더 정제하는 일이 없이 사용하였다.
NMR: 8.23(d)1H; 6.92(d)2H; 6.50(d)2H; 4.86(s)2H; 4.15(m)1H; 3.24(s)2H; 2.22(m)2H; 1.8(m)2H; 1.4(d)18H. 수득량 = 8.2g(90%).
에틸렌 옥사이드(7.1g)를 빙초산(40ml) 및 H2O(40ml) 중에 디-t-부틸-4-아미노벤질카르보닐-L-글루타메이트(8.2g)가 용해된 용액에 첨가하였다. 이어서, 그 혼합물을 상온에서 24시간 동안 교반하였다. 상기 용액을 증발 건조시킨 후, 에테르에 재용해하여, 수세하고, 유기상을 MgSO4상에서 건조 및 증발시켜 오일(디 t-부틸 4-[N,N-비스(2-히드록시에틸)아미노]벤질카르보닐-L-글루타메이트)(6.3g)을 얻고, 이 오일을 더 정제하는 일이 없이 사용하였다.
NMR: 8.16(d)1H; 7.02(d)2H; 6.58(d)2H; 4.1(m)1H; 3.4(m)8H; 3.25(s)2H; 2.25(m)2H; 1.8(m)2H; 1.4(s)18H.
온도를 25℃ 이하로 유지하면서 아르곤 분위기 하에서 메탄설포닐 클로라이드(2.91ml)를 피리딘(45ml) 중에 디-t-부틸 4-[N,N-비스(2-히드록시에틸)아미노]벤질카르보닐-L-글루타메이트(2.88g)가 용해된 용액에 적가하였다. 첨가 후, 용액을 80℃에서 1 시간 동안 교반하였다. 이어서, 상기 용액을 냉각하여 10% 시트르산(500ml)에 부어 넣고, 에테르로 추출하고 수세한 다음, MgSO4상에서 유기상을 건조 및 증발시켜 갈색 오일을 얻었다. 상기 오일을 실리카 상에서 크로마토그래피하여 헥산 : 에틸 아세테이트(2:1)로 용출시켜 오일 상태의 디-t-부틸 4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]벤질카르보닐-L-글루타메이트(1.3g)를 얻었다(42%).
NMR: 8.19(d)1H; 7.10(d)2H; 6.66(d)2H; 4.10(m)1H; 3.69(s)8H; 3.32(s)2H; 2.21(m)2H; 1.9(m)2H; 1.37(d)18H. 수득량 = 1.32g(42%).
본 실시예에 대한 반응 순서는 반응 도식 8에 나타내었다.
[실시예 20]
N-(4-[N,N-비스-(2-클로로에틸)아미노]페닐카르바모일)-L-글루탐산
98% 포름산(10ml) 중에 디-t-부틸 4-[N,N-비스-(2-클로로에틸)아미노]페닐카르바모일-L-글루타메이트(실시예 3과 같이 제조함)(500mg)을 상온에서 24시간 방치하였다. 상기 용액을 증발 건고시키고, 잔사를 디클로로메탄/에틸 아세테이트/포름산(7:2:1) 중의 머크 실리카겔 제품 9385 상에서 크로마토그래피하여 오일 상태의 표제 화합물을 얻고, 이를 결정화하였다. m.p. = 117-9℃.
[실시예 21]
N-(4-[N,N-비스(2-브로모에틸)아미노]-3-플루오로페닐카르바모일)-L-글루탐산
에틸 아세테이트(10ml) 중에 디-벤질-4-[N,N-비스(2-브로모에틸)-아미노-3-플루오로페닐카르바모일-L-글루타메이트(0.5g)를 용해시킨 용액 및 30% Pd/C(100mg)를 수소 분위기 하에서 6 시간 동안 교반시켰다. 상기 촉매를 여과하여 제거하고, 여과액을 증발시켜 오일 상태의 표제 화합물을 얻었다.
NMR: 8.6(s)1H; 7.35(dd)1H; 7.1-6.8(m)2H; 6.5(d)1H; 4.2(m)1H; 3.7-3.2(m)8H; 2.4-1.6(m)4H.
상기 반응용 출발 물질은 티오닐 클로라이드 대신 티오닐 브로마이드를 사용하였다는 점을 제외하고는 실시예 5에 제시한 것과 유사한 방법으로 제조되었다.
실시예 23의 화합물에 대한 NMR 데이타는 다음과 같다.
δ8.6(넓음)1H, δ7.6(m)1H, δ7.2(m)2H, δ4.25(m)1H; δ3.6-3.3(m)8H; δ2.4-1.7(m)4H.
실시예 21 내지 24의 화합물을 제조하는 데 사용된 출발 물질 및 중간 물질과 이들의 특성은 하기 표 10 내지 13에 수록되어 있다.
[실시예 25-32]
다음의 화합물들은 이하에서 제시한 사항을 제외하고는 실시에 1에 기재된 바와 유사한 방법으로 제조되었다.
실시예 25 내지 32 화합물의 각각에 대한 NMR 데이타는 하기 표에 제시되어 있다.
실시예 25의 화합물을 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였다. 다만, 수소화 반응 중에 α-벤질-4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페녹시카르보닐-L-글루타민을 사용하였다. 상기 화합물의 제조 방법은 후술한다. 상기 수소화 반응 중에 상기 α-벤질 화합물의 용해를 돕기 위해 테트라히드로푸란을 에틸 아세테이트에 첨가하였다.
실시예 26 및 27의 화합물들은 실시예 1에 기재된 바와 같이 중간 물질 α-벤질-4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페녹시카르보닐-L-메실글루타민 및 α-벤질 4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]ㅍ녹시카르보닐-L-(3-메틸페닐)글루타민 각각을 가수소 분해하여 제조하였다.
실시예 28의 화합물은 실시예 1에 기재된 바와 같이, 벤질 4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페녹시카르보닐--(5-테트라졸릴)-α-아미노-L-부티레이트를 수소화 반응시켜 제조하였다. 실시예 28의 화합물 역시 후술하는 바와 같은 제2의 방법에 의해 제조하였다. 실시예 1에 기재된 것과 유사한 방법을 반복하였으나, O-(4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페닐)-O' -(4-니트로페닐)카르보네이트와의 반응시 L-글루탐산 디벤질 에스테르 대신에 (S)-2-아미노-4-(1H-1,2,3,4-테트라졸-5-일)부티르산[그르존카(Z. Grzonka) 등의 논문, Tetrahedron, 33 : 2299-2302, 1977]을 사용하였다. 상기 반응은 2 당량의 트리에틸아민과 함께 무수 DMF 중에서 25℃로 20 시간 동안 수행되었다. 증발 건고시킨 후, 잔사를 에틸 아세테이트에 용해시키고, 묽은 시트르산으로 세척하고, 건조 및 증발시켜 무수 상태로 만들었다. 에틸 아세테이트로부터 서서히 생성물이 결정화되었다. 상기 잔사를 에틸 아세테이트로 재결정화시켜 실시예 28의 화합물을 얻었다(m.p. 173-5℃).
실시예 29의 화합물을 실시예 28의 제1의 방법에 기재된 바와 유사한 방법으로 제조하였으나, 벤질-4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페녹시카르보닐--(5-테트라졸릴)-α-아미노-L-부티레이트 대신에 1-{4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페녹시카르보닐아미노}-1-벤질옥시카르보닐-2-(5-티오테트라졸)-에탄을 사용하였다. 유사한 반응을 실행하여 검(gum)을 얻고, 이를 실리카 상에서 컬럼 크로마토그래피에 의해 4% 포름산/에틸 아세테이트(부피 단위)로 용출시켜 정제하였다.
또한, 실시예 29의 화합물은 이하에 설명하는 바와같이 제2의 방법에 의해 제조하였다.
1-아미노-1-카르복시-2-(5-티오테트라졸)에탄(600mg, 2.89mM)을 무수 DMF (48ml) 중에 현탁시켜서, 트리에틸아민(0.806ml, 578mM)을 첨가하고, 그 현탁액을 교반하였다. O-(4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]-페닐)-O' -(4-니트로페닐)카르보네이트(1.10g, 2.89mM)는 고체 상태인 채로 한꺼번에 첨가하고, 그 용액을 실온에서 20 시간 동안 교반하였다. 진공하에서 DMF를 제거하였다. 잔사를 에틸 아세테이트 및 묽은 시트르산에 용해시켰다. 에틸 아세테이트층을 수세하고, 황산 나트륨으로 건조하여 여과 및 증발시켰다. 생성된 조(粗) 생성물을 실리카겔 상에서 크로마토그래피하고, 에틸 아세테이트 중의 4% 포름산으로 용출시켜 유리 모양의 고체인 4-[N,N-비스(2-크롤로에틸)아미노]페녹시카르보닐아미노-1-카르복시-2-(5-티오테트라졸)에탄(0.963g)을 얻었다.
NMR(DMSOd6): 3.46(dd, 1H); 3.69(s, 8H); 3.8(dd, 1H); 4.38(m, 1H); 6.72(d, 2H); 6.93(d, 2H); 8.12(d, 1H).
실시예 30 및 31의 화합물은 α-벤질 4-[N,N-비스(2-시클로에틸)아미노] 페녹시카르보닐--[3-(벤질옥시카르보닐메틸)페닐]-L-글루타민 및 α-벤질 4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페녹시카르보닐--[3-(5-테트라졸릴)페닐]-L-글루타민을 각각 수소화 반응시켜 실시예 1에 기재된 바대로 제조하였다.
실시예 32의 화합물은 α-벤질-4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노] 페녹시 카르보닐--[3-(벤질옥시카르보닐아미노)페닐]-L-글루타민을 수소화 반응시켜 실시예 1에 기재된 바대로 제조하였다.
[실시예 25 내지 32의 화합물을 제조하는 데 사용하는 중간 물질]
실시예 25의 화합물을 제조하는 데 사용하는 α-벤질-4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페녹시카르보닐-L-글루타민은 O-(4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페닐)-O'-(4-니트로페닐)카르보네이트에서 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하되, L-글루탐산 디벤질 에스테르 토실레이트 대신에 α-벤질-L-글루타민[제르바스(L.Zerves) 등의 논문, J. Am. Chem. Soc 87 (1), 99-104, 1965]을 사용하였다. 실리카 상에서 80% EtOAc/20% 헥산으로 용출하는 플래시 컬럼 크로마토그래피에 의해 상기 생성물을 정제하였다. 상기 생성물을 에테르와 함께 분쇄하여 백색 고체를 얻었다.
실시예 26의 화합물을 제조하는 데 사용되는 α-벤질 4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페녹시카르보닐-γ-메실 L-글루타민은 다음과 같이 제조하였다.
무수 디클로로메탄(50ml) 중의 N-Boc-α-벤질-L-글루타메이트[클리거(E.Klieger) 등의 논문, Ann. 673, 196-207, 1964](10g)를 디메틸아미노피리딘(DMAP)(3.9g) 및 디클로헥실카르보디이미드(6.73g)로 처리하였다. 이어서, 메탄설폰아미드 (3.04g)를 반응 플라스크에 넣고, 반응을 25℃에서 20 시간 동안 계속하였다. 디클로로메탄을 증발시키고, 잔사를 에틸 아세테이트에 재용해시켰다. 이어서, 상기 에틸 아세테이트 용액을 0.25M 시트르산, 물 순서로 세척하고, Na2SO4(무수물) 상에서 건조시켰다. 에틸 아세테이트 추출물을 증발시켜, 수득한 잔사를 실리카상에서 용출제로 메틸렌 클로라이드, 5% 메탄올/메틸렌 클로라이드 및 10% 메탄올/메틸렌 클로라이드를 순서대로 사용하는 플래시 컬럼 크로마토그래피로 실리카 상에서 정제하여 하기 화학식의 Boc-보호된 아실 설폰아미드를 얻었다.
NMR: δ1.37(s)9H; 1.98(m)2H; 2.34(t)2H; 5.11(d)2H; 7.26(d)1H; 7.36(s)5H; 11.64(s)1H.
Boc-보호된 아실 설폰아미드(3.6g)을 에틸 아세테이트(50ml)에 현탁시킨 다음, 8 당량의 HCl 포화 에틸 아세테이트(3.1M 용액, 22.4ml)를 첨가하였다. 출발 물질 설폰아미드를 상기 용액에 넣고 반응을 25℃, 아르곤 분위기 하에서 20시간 동안 지속하였다. 하기 화학식으로 나타낸 α-벤질 γ-메실-L-글루타민 염산염은 백체고체로 생성되었고, 이를 여과 제거하고 무수 에테르로 세척하여 데시케이터 내에서 건조시켰다.
NMR: δ2.08(m)2H; 2.52(m)2H; 3.20(s)3H; 4.09(t)1H; 5.15-5.35(dd)2H, 7.39-7.50(m)5H, 약 9(넓음)3H.
α-벤질 4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페녹시카르보닐-L-메실글루타민은 O-(4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]-페닐)-O'-(4-니트로페닐)카르보네이트로부터 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였다. 다만, L-글루탐산 디벤질 에스테르 토실레이트 대신에 α-벤질 γ-메실-L-글루타민 염산염을 사용하였다. 상기 반응 생성물을 실리카 상에서 에틸 아세테이트 중의 10%(용량) 포름산으로 용출시키는 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다.
실시예 27의 화합물을 제조하는 데 사용되는 α-벤질 4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페녹시카르보닐--(3-메틸페닐) L-글루타민은 다음과 같이 제조하였다.
α-벤질 4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페녹시카르보닐-L-글루타메이트는 O-(4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노)페닐)-O'-(4-니트로페닐)카르보네이트로부터 실시에 1에 기재된 바와 같이 제조하였다. 다만, L-글루탐산 디벤질 에스테르 대신에 α-벤질-L-글루타메이트[코트서지오고폴로스(C. Courtsogeorgropoulos) 등의 논문, J. Am. Chem. Soc. 83, 1885, 1961]을 사용하였다. 더욱이, 상기 반응은 25℃, 무수 DMF하에서 2 시간 동안 수행하였다. 상기 생성물을 각각, 100% 에틸 아세테이트에 대해 70/30 범위의 에틸 아세테이트/헥산 혼합물을 사용하는 컬럼 크로마토그 래피 (실리카, 머크 제품 9385)로 정제하였다. 상기 생성물의 NMR 데이타는 하기 표 17에 기재하였다.
무수 테트라히드로푸란(5ml) 중의 α-벤질 4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페녹시카르보닐-L-글루타메이트(300mg)를 1.1 당량의 트리에틸아민으로 처리하였다. 무수 THF(10ml) 중의 이소부틸클로로포르메이트(0.08ml, 1.1 당량)를 -25℃에서 반응 혼합물에 서서히 첨가하였다. 15분 후, 무수 테트라히드로푸란(5ml)중의 m-톨루이딘 1.1 당량(0.08ml)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 25℃로 가온시킨 다음, 18 시간 동안 계속 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 여과하고, 여과물을 증발시켜 수득한 잔사를 용출제로 에틸 아세테이트/헥산 혼합물을 사용하는 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 적당한 분획을 증발시켜 α-벤질 4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페녹시카르보닐-Υ-(3-메틸페닐)-L-글루타민을 백색 결정성 고체로서 얻었다. 상기 생성물의 NMR 데이타를 하기 표 17에 기재하였다.
실시예 29의 화합물을 제조하는 데 사용하는 1-{4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페녹시카르보닐아미노}-1-벤질옥시카르보닐-2-(5-티오테트라졸)-에탄은 다음과 같이 제조하였다.
2M 수산화나트륨 용액(230ml)에 β-클로로알라닌(18.50g, 115.6mmol)(시그마 케미칼 컴패티) 및 5-티오테트라졸(11.79g, 115.6mmol)(유럽 특허 공개 번호 제 33965호에 기재된 바대로 제조함)을 교반하면서 첨가함으로써 1-아미노-1-카르복시-2-(5-티오테트라졸)에탄을 제조하였다. 이어서, 상기 반응 혼합물을 실온 내지 90℃로 1 시간 30분간 가열하였다. 다음에, 상기 반응 혼합물을 방치하여 실온으로 냉각한 다음, 얼음/메탄올 냉각조에서 더 냉각시키고, 그 혼합물을 진한 염산으로 pH 4.0까지 산성화하고, 30분동안 계속 교반하였다. 생성된 침전을 여과하여 제거하고, 냉각수 및 에테르의 순서로 세척한 후, 흡입 여과에 의해 건조시켜 생성물 6.9g을 얻었다. 모액의 pH를 재검사한 결과, pH는 약 5.5로 상승되었음을 알 수 있었다. 상기 반응 절차를 반복하여 추가로 생성물 2.3g을 얻었다. 이를 고진공 하에서 건조시켰다.
NMR: δ3.30-3.50 ppm(m)2H; 4.16-4.22 ppm(q)1H; NH2로 교환되는 7.44 ppm (넓은) H2O.
원석 분석: 이론치 C = 23.2 H = 4,4; N = 33.8
(+1 몰의 H2O)
실측치 C = 23.1; H = 4.4; N = 33.7
(9.6% H2O)
1-{4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페녹시카르보닐아미노}-1-벤질옥시시카르보닐-2-(5-티오테트라졸)-에탄은, L-글루탐산 디벤질 에스테르 대신에 γ-(5-티오테트라졸릴)-α-벤질옥시카르보닐-아미노-L-부티르산(Z. 그르존카 등의 논문, Tetrahedron Letters 33 2399-2302, 1977)을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1에 기재된 바와 같이하여 O-(4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페닐)-O'- (4-니트로페닐)카르보네이트로부터 제조하였다. 용매로 무수 디메틸포름아미드를 사용하고, 반응은 25℃에서 수행하였다. 2 시간 후에 상기 반응 혼합물로부터 얻은 생성물을 에틸 아세테이트/메틸렌 클로라이드(3:1 v/v) 중의 2% 포름산으로 구성된 혼합물로 용출시키는 플래시 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 상기 생성물의 NMR 데이타는 하기 표 16에 기재되어 있다.
실시예 27에 사용되는 α-벤질 4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페녹시 카르보닐-γ-[3-(벤질옥시카르보닐메틸)페닐]-L-글루타민은 다음과 같이 제조하였다.
톨루엔(30ml) 중의 벤질 알콜(27.2ml)에 3-아미노페닐아세트산(10g)과 p-톨루엔 설폰산 일수화물(13.2g)을 첨가하여 3-아미노-페닐아세트산 벤질 에스테르 p-톨루엔 설폰산을 제조하였다. 상기 혼합물을 환류하에 가열하고, 형성된 물을 딘-스타크(Dean-Stark) 회수기에 수집하였다. 물이 모두 증류 제거되었을 때, 상기 혼합물을 방치하여 25℃까지 냉각하였다. 디에틸 에테르로 희석시키기 전에 얼음조에서 1 시간 동안 방치하였다. p-톨루엔 설포네이트 결정을 여과 제거하고, 데시케이터에서 건조하였다(23.5g).
NMR: δ2.31(s)3H, 3.82(s)2H, 5.11(s)2H, 7.11(d)2H, 7.25-7.45(m)8H, 7.52(d)2H.
m-톨루이딘 대신에 3-아미노페닐아세트산 벤질 에스테르를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 27에 기재된 방법에 따라 α-벤질-4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페녹시카르보닐-γ-[3-(벤질옥시카르보닐메틸)페닐]-L-그루타민을 제조하였다.
실시예 31에 사용하는 α-벤질 4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페녹시 카르보닐--[3-(5-테트라졸릴)페닐]-L-글루타민은 실시예 27에 기재된 바대로 제조하였다. 다만, m-톨루이딘 대신에 3-(테트라졸-5-일)-아닐린을 사용하였다. 출발 물질로 사용된 3-(테트라졸-5-일)-아닐린은 다음과 같이 제조하였다. 에탄올(2.5ℓ) 중에 5-(3-니트로페닐)테트라졸 [피네간(Finnegan. W.G.), 헨리(Henry, R.A.) 및 롤귀스트(Lolguist R.), J.A.C.S. 80 : 3908(1958)](52g)을 용해시킨 용액에 10% Pd/C (5g)을 첨가하고, 상기 혼합물을 수소 분위기 하에서 16 시간 동안 교반하였다. 촉매를 여과하여 제거하고, 여과액을 증발시켜 목적하는 출발 물질(40.5g; m.p. = 188℃-9℃)을 얻었다.
실시예 32에 사용하는 α-벤질-4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페녹시 카르보닐-γ-[3-(벤질옥시카르보닐아미노)페닐]-L-글루타민은 실시예 27에 기재된 방법에 따라 제조하였다. 다만, m-톨루이딘 대신에 3-(벤조일옥시카르보닐아미노)아닐린을 사용하였다.
NMR:
ClCH2CH2N : 3.68(m)8H
방향족류 : 6.68-7.74(m)1H
ArCH2O : 5.12(s)2H; 5.14(s)2H
αCH : 4.18(m)1H
기타 : 1.9-2.15(m)2H; 2.45(m)2H; 8.12(d)1H; 9.7(s)1H; 9.9(s)1H.
실시예 32의 제조 공정 중에 중간 물질로 사용된 3-(벤조일옥시카르보닐아미노)아닐린은 다음과 같이 제조하였다. 에틸 아세테이트(200ml) 중의 m-페닐렌 디아민(10g)을 용해시킨 저온 용액에 KHCO3수용액(물 300ml 중 9g)을 첨가하였다. 에틸 아세테이트(100ml) 중의 벤질 클로로포르메이트(13.2ml)를 10분에 걸쳐 적가하고, 0℃에서 1 시간 동안 교반한 다음, M.HCl(수용액)을 첨가하여 산성화하였다(pH2). 상기 생성물을 에틸 아세테이트(250ml)로 추출하고, 염수로 세척하여 MgSO4상에서 건조시키고, 진공하에서 감압하여 오일을 얻었다. 상기 오일을 머크실리카겔 제품 9385 상에서 크로마토그래피하고, 헥산/에틸 아세테이트(7:3)로 용출 시켜 저융점 고체인 중간 물질 8g을 얻었다(수율, 36%).
NMR: 9.32(s)1H; 7.30(m)5H; 6.80(t)1H; 6.70(m)1H; 6.50(m)1H; 6.12(m)1H; 5.0(s)2H; 4.88(s)2H.
[실시예 33]
N-(4-[N,N-비스(2-요오도에틸)아미노]페녹시카르보닐)-L-글루탐산
4-[N,N-비스(2-요오도에틸)아미노]페녹시카르보닐-L-글루탐산 디-t-부틸 에스테르(188 mg)(반응 도식 9의 화합물 14)를 트리플루오로아세트산(TFA)(4ml)중에 현탁시키고, 상온에서 30분 동안 교반시켰다. TFA를 감압하에서 제거하고, 남아 있는 오일을 에틸 아세테이트(3ml)로 희석하고 증발시켜서 4-[N,N-비스(2-요오도에틸)아미노]페녹시카르보닐-L-글루탐산-1.4 TFA-0.8 EtOAc(162mg)을 얻었다(82%)(반응 도식 9의 화합물 15).
NMR: 1.84-2.01(m)1H; 2.36(m)2H; 3.31(t)4H; 3.72(t)4H; 4.02(m)1H; 6.66(d)2H; 6.94(d)2H; 7.92(d)1H.
중간 물질로 사용된 4-[N,N-비스(2-요오도에틸)아미노]페녹시카르보닐-L-글루탐산 디-t-부틸 에스테르는 다음과 같이 제조하였다.
a) 아세토니트릴(50ml) 중에 비스(2-메실옥시에틸)아미노]페녹시카르보닐-L-글루탐산 디-t-부틸 에스테르(1.0g)(반응 도식 9의 화합물 11)를 용해시킨 용액을 요오드화나트륨(1.0g)과 함께 70℃에서 20 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 여과물을 진공하에서 농축시켰다. 잔사를 실리카 겔 상에서 크로마토그래피하고, 에틸 아세테이트/시클로헥산(1 : 5)으로 용출하여 오일 상태의 4-[N,N-비스(2-요오도에틸)아미노]페녹시카르보닐-L-글루탐산 디-t-부틸 에스테르(반응 도식 9의 화합물 14)를 얻었다(0.75g)(68%).
NMR: 1.41(s)9H; 1.43(s)9H; 1.81-1.95(m)1H; 2.34(m)2H; 3.31(t)4H; 3.72(t)4H; 4.00(m)1H; 6.67(d)2H; 6.93(d)2H; 7.91(d)1H.
b) 비스(2-메실옥시에틸)아미노페녹시카르보닐-L-글루탐산 디-t-부틸 에스테르
피리딘(9ml) 중에 4-[N,N-비스(2-히드록시에틸)아미노]페녹시카르보닐-L-글루탐산 디-t-부틸 에스테르(2.53g)(실시예 8에 기재된 방법에 따라 생성 - 반응 도식 4 참조)를 용해시킨 용액을 메탄설포닐 클로라이드(1.8ml)와 함께 2℃에서 20 분간 교반한 다음, 80℃에서 11분간 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트와 시트르산/물(10%)사이에서 분배시켰다. 유기상을 분리하여 수세하고, Na2SO4로 건조하여, 무수 상태로 되도록 증발시켰다. 잔사를 실리카 겔 상에서 크로마토그래피고, 에틸 아세테이트/디클로로메탄(1 : 9)으로 용출시켜 오일 상태의 4-[N,N-비스(2-메실옥시에틸)아미노]페녹시카르보닐-L-글루탐산 디-t-부틸 에스테르(반응 도식 9의 화합물 11)를 얻었다(0.95g)(28%).
NMR: 1.41(s)9H; 1.43(s)9H; 1.8-199(m)1H; 2.34(m)2H; 3.16(s)6H; 3.72(t)4H; 3.9(m)1H; 4.31(t)4H; 6.78(d)2H; 6.92(d)2H; 7.9(d)1H.
[실시예 34]
N-(4-[N,N-비스(2-브로모에틸)아미노]페녹시카르보닐)-L-글루탐산
4-[N,N-비스(2-브로모에틸)아미노]페녹시카르보닐)-L-글루탐산 디-t-부틸 에스테르(133mg)(반응 도식 9의 화합물 12 참조)를 TFA(4ml) 중에 현탁시키고, 상온에서 30분간 교반하였다. TFA를 감압하에서 제거하고, 남아 있는 오일을 에틸 아세테이트(3ml)로 희석하고 증발시켜 4-[N,N-비스(2-요오도 에틸)아미노]페녹시카르보닐-L-글루탐산-1.3 TFA-0.9 EtOAc(126mg)을 얻었다(80%)(반응 도식 9의 화합물 13 참조).
NMR: 1.83-2.01(m)1H; 2.36(m)2H; 3.58(t)4H; 3.76(t)4H; 4.03(m)1H; 6.71(d)2H; 6.94(d)2H; 7.92(d)1H.
중간 물질로 사용한 4-[N,N-비스(2-브로모에틸)아미노]페녹시카르보닐-L-글루탐산 디-t-부틸 에스테르는 다음과 같이 제조하였다.
아세토니트릴(30ml) 중에 비스(2-메실옥시에틸)아미노]페녹시카르보닐-L-글루탐산 디-t-부틸 에스테르(0,48g)(반응 도식 9의 화합물 11-실시예 8에 기재된 방법에 따라 생성 - 반응 도식 4 참조)를 용해시킨 용액과 함께 브롬화리튬(0.26g)을 70℃에서 22시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 여과물을 진공하에서 농축하였다. 잔사를 실리카 겔 상에서 크로마토그래피하고, 에틸 아세테이트/디시클로메탄(1 : 5)으로 용출하여 오일 상태의 4-[N,N-비스(2-브로모에틸)아미노]페녹시카르보닐-L-글루탐산 디-t-부틸 에스테르(반응 도식 9의 화합물 12)를 얻었다(0.37g)(83%).
NMR: 1.41(s)9H; 1.43(s)9H; 1.8-1.98(m)1H; 2.34(m)2H; 3.58(t)4H; 3.76(t)4H; 3.97(m)1H; 6.72(d)2H; 6.93(d)2H; 7.93(d)1H.
[실시예 35]
N-(4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]2-플루오로-페닐카르바모일)-L-글루타메이트
표제 화합물[NMR(dmso): 8.0(s)1H; 7.65(t)1H; 6.6(m)3H; 4.2(m)3H; 3.7(s)8H; 2.28(m)2H; 1.8(m)2H]는 실시예 5에 상응하는 단계와 유사한 방법에 따라 중간 물질 디벤질 4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]-2-플루오로-페닐카르바모일-L-글루타메이트[NMR(dmso): 7.62(t)1H; 7.35(s)10H; 6.8(d)1H; 6.57(m)2H; 5.1(d)4H; 4.33(m)1H; 3.7(s)8H; 2.43(m)2H; 2.0(m)2H]로부터 제조하였다.
중간 물질은 다음과 같이 제조하였다.
에틸렌 옥사이드(6.6 g)를 빙초산(30ml) 중의 3-플루오로-4-니트로아닐린(1.3g)에 첨가하고, 상기 반응 혼합물을 밀폐된 플라스크에 넣어 실험실 온도에서 72시간 동안 유지하였다. 상기 용액을 그 용액의 원래 용량의 반으로 될 때까지 감압 증발시키고, 염화나트륨 포화 수용액으로 희석하여, 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 에틸 아세테이트 추출액을 합하여 포화 중탄산나트륨 수용액으로 세척하고, 잔사를 실리카 겔 상에서 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 50%(V/V) 에틸 아세테이트를 함유하는 헥산으로 용출시킨 후, 변하지 않은 출발 물질과 1치환 생성물을 제거하였다. 에틸 아세테이트로 용출하여 생성물인 2',2'-(3-플루오로-4-니트로아닐리노)디에탄올을 얻었다(m.p. = 99-101℃).
이와 같이 하여 얻은 생성물(280mg)을 디클로로메탄(7.5ml) 중에 용해시키고, 피리딘(0.1ml)을 첨가하여, 용액을 얼음/물 욕조에서 냉각시켰다. 티오닐 클로 라이드(0.25ml)를 교반하면서 적가하였다. 첨가한 완결되었을 때, 반응 혼합물을 1시간 동안 환류하에 가열한 다음, 실험실 온도에서 20 시간 동안 방치하였다. 상기 용액을 디클로로메탄(10ml)으로 희석하여 3회 수세하고, 황산나트륨 상에서 건조 및 증발시킨 다음, 잔사를 메탄올로 재결정하여 생성물인 [N,N-비스(2-클로로에틸)]-3-플루오로-4-니트로아닐린을 얻었다(m.p. = 97=98℃).
테트라히드로푸란(7.5ml) 중의 이와 같이 하여 얻은 생성물(200mg)을 팔라듐/목탄(5% w/w, 20mg)의 존재하에 수소 분위기 중에서 16 시간 동안 교반하였다. 촉매를 여과하여 제거하고, 용매를 증발시켰다. 생성된 잔사를 최소 용량의 메탄올 중에 용해시키고, 염산으로 포화된 과량의 디에틸 에테르를 첨가하여 조생성물을 침전시켰다. 메탄올/디에틸 에테르로 재결정화하여 생성물인 4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노-2-플루오로-아닐리늄 클로라이드를 얻었다(m.p. = 195-200℃, d).
생성된 생성물을 실시예 5에 상응하는 단계에 유사한 방법으로 목적하는 중간 물질로 전환시켰다.
[실시예 36-43]
실시예 36 내지 43의 화합물에 대한 구조 및 원소 분석 데이타를 하기 표 17에 기재하였다.
하기 표 17에 기재된 화합물은 실시예 16에 기재된 방법에 따라 제조하였다. 따라서, 실시예 36의 화합물은 실시예 16에서의 아닐린을 사용하는 대신에 벤질-4-아미노벤조에이트(알드리치 케미칼 컴패니 리미티드)를 사용하여 제조하였다. 이와 유사하게, 실시예 37 내지 43의 화합물은 실시예 16에서의 아닐린 대신에 벤질 4-아미노벤조에이트, 2차-부틸아민, n-프로필아민, 이소-프로필아민, 시클로헥실아민, 벤질아민, 또는 p-벤질옥시아닐린을 사용하여 제조하였다.
[실시예 44]
N-[4-N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페닐카르바모일)-L-글루탐산
DMF(15ml) 중에 중간 물질인 디벤질 4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페닐카르바모일-L-글루타메이트(1.138g)를 용해시킨 용액을 10% Pd/C 상에서 16시간 동안 수소화시켰다. 여과한 후, 진공하에서 증발시키고, 잔사를 CHCl3(20ml)에 용해시켰다. 18 시간 후 결정성 침전을 여과하여 제거하고 진공 건조하여 4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페닐카르바모일-L-글루탐산(730mg)을 얻었다(93%). 아세톤/CHCl3으로 재결정한 후 미세한 막대 모양의 생성물을 얻었다. m.p. = 116-118℃.
NMR(CD3COCD3): δ8.0(s)1H; 7.2(d)2H; 6.6(d)2H; 6.2(d)2H NH; 4.4(m)1H; 3.6(m)8H; 2.5-1.9(m)4H.
디벤질 중간 물질은 다음과 같이 제조하였다(반응 도식 10 참조).
무수 메틸렌 클로라이드(10ml) 중에 디벤질 글루타메이트 p-톨루엔설포네이트(Bachem U.K.로부터 구득할 수 있음; 0.25g)를 아르곤 분위기 하에서 용해시키고 0℃로 냉각시켰다. 피리딘(0.162ml)을 첨가한 다음, 신속히 톨루엔 중의 포스겐(1.93 M, 0.311ml)을 첨가하였다. 상기 용액을 0℃에서 2 시간 동안 교반하여, 피리딘(0.05ml)을 첨가한 다음, 4-[N,N-비스(클로로에틸)아미노]아닐리늄 클로라이드를 한꺼번에 첨가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 10분 동안 교반한 다음, 실온에서 18 시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 및 물로 희석하였다. 다음에, 유기상을 묽은 시트르산(2 회), 물 및 포화 염수의 순서로 세척하고 건조 및 증발시켜 목적하는 디벤질 중간 물질을 고체로서 생성시켰다.
상기 디벤질 중간 물질을 얻기 위한 별법은 다음과 같다.
클로로포름(80ml) 중에 트리포스겐(1g)을 용해시킨 용액에 10℃에서 4-(N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]아닐리늄 클로라이드(2.7g)를 첨가하였다. 온도를 10℃로 유지하면서, 트리에틸아민(4.15ml)을 첨가하고, 그 혼합물을 교반하고 상온까지 15분에 걸쳐 가온시켰다. 상기 혼합물에 디벤질 글루타메이트 토실레이트와 트리에틸아민(1.7ml)을 한꺼번에 첨가하였다. 상온에서 1.5 시간 후, 그 혼합물을 클로로포름(100ml)으로 희석하고, 2회 수세하고 건조 및 증발시켜 무수 상태로 만들었다. 잔사를 머크 실리카 겔 제품 9385 상에서 크로마토그래피하여 에틸 아세테이트/헥산으로 용출시켜 디벤질 4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페닐카르바모일-L-글루타메이트(2.5g)를 얻었다. m.p. = 119-122℃.
[실시예 45]
4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페닐카르바모일--[N(3-카르복시메틸)아닐리노]-L-글루타메이트(반응 도식 11의 화합물 7)
표제 화합물은 다음과 같이 제조하였다(반응 도식 11을 참조). THF(20ml) 중에 중간 물질(반응 도식 11의 화합물 6; 1 g)이 용해된 용액을 30% Pd/C(100mg) 상에서 4 시간 동안 수소화시켰다. 이어서, 상기 혼합물을 셀라이트를 통해 여과 및 증발시켜 갈색 오일을 얻었다. 이 오일을 용출제로서 1% 및 3% 포름산/에틸 아세테이트 혼합물을 사용하는 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 정제한 다음, 적당한 분획을 증발시키고 에테르와 반응시켜 표제 화합물(300mg)을 얻었다.
NMR: ClCH2CH2N: 3.66(s)8H; 방향족: 6.66-7.46(m)8H; αCH:4.22(m)1H; 기타: 1.66-2.06(m)2H; 2.39(m)2H; 3.49(s)2H; 6.29(d)1H; 8.33(s)1H; 9.93(s)1H; 12.5(b,s)2H.
중간 물질은 다음과 같이 제조하였다:
(a) 3-아미노-페닐아세트산 벤질 에스테르 p-톨루엔 설폰산은 톨루엔(30ml) 중의 벤질 알콜(27.2ml)에 3-아미노페닐아세트산(10g) 및 p-톨루엔 설폰산 일수화물(13.2g)을 첨가하여 제조하였다. 상기 혼합물을 환류하에서 가열하고 형성된 물을 딘-스타크 회수기에 수집하였다. 물이 모두 증류 제거되었을 때, 그 혼합물을 25℃로 냉각시킨 후, 디에틸 에테르로 희석하여, 얼음조에서 1 시간 동안 방치하였다. 생성된 p-톨루엔 설포네이트 결정을 여과하여 제거하고, 데시케이터에서 건조시켰다(23.5g).
NMR: δ2.31(s)3H, 3.82(s)2H, 5.11(s)2H, 7.11(d)2H, 7.25-7.45(m)8H, 7.52(d)2H.
(b) 5℃에서 무수 DMF(20ml) 중의 N Boc α-벤질 L-글루타메이트(5g)를 히드록시벤조티아졸(HOBT)(1.1 당량: 2.45g)과 함께 가열시키고, 반응 혼합물을 아르곤 분위기하에 상기 온도에서 10분 동안 교반하였다. 이어서, (DCCI)디시클로 헥실카르보디이미드(1.1 당량 ; 3.37g)를 첨가하고, 반응물을 5℃에서 10분간 더 교반한 후, 25℃로 가온시키고, 다시 45분 동안 교반하였다. 무수 DMF(10ml) 중의 1.1 당량 트리에틸아민(2.23ml)과 함께 3 아미노 페닐아세트산 벤질 에스테르 p-톨루엔 설폰산[(a)에서 얻은 생성물](1.1 당량; 6g)을 첨가하고, 반응 혼합물을 25℃에서 20 시간 동안 더 교반하였다. 이어서, 디시클로헥실우레아인 침전을 여과하여 제거하고, DMF 여과액을 증발 건고시켰다. 이어서, 잔사를 EtoAc에서 재용해시켰다. 에틸 아세테이트 용액을 NaHCO3수용액 및 염수의 순서로 세척한 다음, Na2SO4(무수물) 상에서 건조시켰다. 에틸 아세테이트 추출액을 증발시킨 후 잔사를 얻고, 이것을 용출제로서 30%, 40% 및 50% EtoAc/헥산 혼합물을 사용하는 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 적당한 분획을 증발시켜 생성물(반응 도식 11의 화합물 4, 5g)을 얻었다.
NMR: 1.39(s)9H; 1.81-2.10(m)2H; 2.38(m)2H; 3.69(s)8H; 4.03(m)1H; 5.12(m)4H; 6.92(d)1H; 7.21(m)1H; 7.35(m)11H; 7.42(d)1H; 7.52(s)1H; 9.89(s)1H.
(c) 상기 단계 (b)에서 얻은 생성물(5g)을 에테르 10ml에 현탁시켜 디클로로 메탄 5ml를 첨가한 다음(용해를 돕기 위한 것임), 8 당량의 포화 에테르성 HCl을 첨가하였다. 이어서, 반응 혼합물을 25℃에서 20 시간 동안 교반하였다. 이 상태에서 생성물은 비혼화성 오일이었다. 에테르를 증발시키고, 잔사를 톨루엔으로 2 회 공비 증류시켜 에테르를 첨가하고 증발시켜 황색 발포체 상태의 생성물(반응 도식 11의 화합물 5, 5g)을 얻었다.
NMR: CDCl3: δ2.35(m)2H; δ2.65(m)2H; δ3.50(s)2H; δ4.22(b,s)1H; δ5.01(s)2H; δ6.8-7.6(m)14H; δ8.65(bs)3H; δ9.35(s)1H.
(d) 5℃에서 무수 THF(20ml) 중의 1.1 당량(0.66g)의 1,1-카르보닐디 이미다졸을 4-[N,N 비스(2-클로로에틸)아미노]아닐리늄 클로라이드 1g이 함유된 용액으로 처리하였다. 이어서, 반응 혼합물을 5℃에서 15분 동안 교반한 다음, 무수 THF 10ml 중에 1.1 당량(0.56ml)의 트리에틸아민이 함유된 상기 단계 (c)에서 얻은 1 당량(1.84g)의 생성물을 첨가하고, 25℃에서 2 시간 동안 더 교반하였다. 트리에틸아민 염산염 침전을 여과에 의해 제거한 다음. THF 여과물을 증발시키고, 잔사를 EtoAc 중에 재용해시켰다. 이어서, 에틸 아세테이트 용액을 물, 0.25M 시트르산 및 염수의 순서로 세척한 다음, Na2SO4(무수물) 상에서 건조시켰다. 에틸 아세테이트 추출물을 증발시킨 후 잔사를 얻고, 이것을 용출제로서 30%, 40% 및 50% EtoAc/헥산 혼합물을 사용하는 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 적당한 분획을 증발시켜 목적하는 중간 물질(반응 도식 11의 화합물 6)을 얻었다.
NMR: ClCH2CH2N: 365(s)8H; 방향족: 6.63-7.5(m)18H; ArCH2O: 5.10(s)2H; 5.12(s)2H; αCH: 4.32(m)1H; 기타: 1.83-2.13(m)2H; 2.41(m)2H; 6.42(d)1H; 8.25(s)1H; 9.91(s)1H.
[실시예 46]
4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페녹시카르보닐-L-글루탐산--(3,5-디카르복시)아닐리드
α-벤질 4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페녹시카르보닐-L-글루탐산--아닐리드 대신에 α-벤질 4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페녹시카르보닐-L-글루탐산--(3,5-디카르복시벤질)아닐리드를 사용하여 실시에 16의 방법을 반복함으로써 무색 결정인 4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페녹시카르보닐-L-글루탐산--(3,5-디카르복시)아닐리드를 얻었다(m.p. 167-170℃).
원소 분석: 이론치(%) C = 49.6, H = 4.87, N = 6.68
실측치(%) C = 49.7, H = 4.9, N = 6.7
-아닐리노 유도체에 관하여 실시예 16에서 설명한 것과 유사한 방법에 따라 α-벤질 4-벤질 4-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페녹시카르보닐-L-글루탐산--(3,5-디카르복시벤질)아닐리드를 얻었다.

Claims (9)

  1. CPG(카르복시펩티다아제 G) 효소용 약물 전구체 기질인 하기 일반식(Ⅰ)의 화합물 및 이의 염.
    상기 식에서,
    R1및 R2는 각각 독립적으로 염소, 브롬, 요오드 또는 OSO2Me를 나타내고;
    R1a및 R2a는 각각 수소를 나타내며;
    R3및 R4은 각각 수소를 나타내고;
    R5a, R5b, R5c및 R5d는 각각 독립적으로 수소, C1-4알킬, 할로겐 또는 시아노를 나타내거나; 또는
    R5a및 R5b는 함께 -CH=CH-CH=CH-를 나타내며;
    X는 O 또는 NH를 나타내고;
    Y는 O를 나타내며;
    Z는 -V-W를 [여기서 V는 -CH2-T-, T는 -CH2- 또는 -S-를 나타내고,
    W는
    (1) COOH ;
    (2) -(C=O)-NR7R8(여기서, R7및 R8중 하나는 수소이고, 다른 하나는 독립적으로 수소 또는 C1-6알킬, C3-6시클로알킬, 페닐 또는 페닐 C1-3알킬기(여기서, 페닐기는 C1-4알킬, -COOH, -0H, -NH2, -(CH2)1-4-COOH 및 테트라졸-5-일로 이루어진 군 중에서 선택된 1 내지 2개의 치환체에 의하여 탄소상에 치환될 수 있음));
    (3) 테트라졸-5-일기; 또는
    (4) -CONH-SO2R11(여기서, R11은 T가 -S-이고, W가 -COOH가 아닌 조건하에서 C1-6 알킬을 나타냄)]를 나타낸다.
  2. (S)-2-(4-[비스(2-클로로에틸)아미노]페녹시카르보닐아미노)-4-(1H-1,2,3,4-테트라졸-5-일)부티르산 및 이의 염.
  3. N-(4-[비스(2-클로로에틸)아미노]페녹시카르보닐)-L-글루탐산 및 이의 염.
  4. 일반식(Ⅰ)의 화합물(구조식은 제1항의 기재와 동일)의 제조 방법으로서, 하기 일반식(Ia)의 화합물을 탈보호시키고, 필요에 따라 생성된 화합물을 이의 염으로 전환시키는 단계를 포함하는 방법.
    상기 식에서, R1, R2, R1a, R2a, R3, R4, R5a, R5b, R5c, R5d, X 및, Y는 제1항에서 정의한 바와 같고, Z1은 W가 보호된 형태(Pr2로 나타냄)로 존재하는 카르복실기인 조건하에서 제1항에서 정의한 바와 같이 Z를 나타내고, Pr1도 역시 보호된 형태(Pr2와 동일 또는 상이함)의 카르복실기를 나타낸다.
  5. N-(4-[비스(2-클로로에틸)아미노]-3-플루오로페닐카르바모일)-L-글루탐산 및 이의 염.
  6. N-(4-[비스(2-클로로에틸)아미노]페닐카르바모일)-L-글루탐산 및 이의 염.
  7. N-(4-[비스(2-요오도에틸)아미노]페녹시카르보닐)-L-글루탐산 및 이의 염.
  8. N-(4-[비스(2-클로로에틸)아미노]페녹시카르보닐)-L-글루탐산-감마-(3,5-디카르복시)아닐리드 및 이의 염.
  9. 약물 전구체 성분으로서 제1항, 제2항, 제3항, 및 제5항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 따른 일반식(Ⅰ)의 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용 가능한 염 1종 이상과 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 암의 화학 요법에 사용하기 위한 약학 조성물.
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