CZ287028B6

CZ287028B6 - Derivatives of nitrogen mustard with attached amino acid radicals, process of their preparation and pharmaceutical composition and two-component system in which the derivatives are comprised

Info

Publication number: CZ287028B6
Application number: CZ1995151A
Authority: CZ
Inventors: Philip John Burke; Robert Ian Dowell; Anthony Brian Mauger; Caroline Joy Springer
Original assignee: Zeneca Ltd; Cancer Res Campaign Tech
Priority date: 1992-07-23
Filing date: 1993-07-23
Publication date: 2000-08-16
Also published as: RU2129542C1; US6277880B1; CA2101104A1; JP3541037B2; FI115048B; AU681349B2; HUT69288A; DK0651740T3; IL106459A; RU95105246A; MY111635A; HU9500145D0; DE69321729D1; FI950230L; ZW9293A1; GB9314960D0; US5660829A; US5405990A; CZ15195A3; AU4715693A

Description

Deriváty dusíkatého yperitu svázanými zbytky aminokyselin, způsob jejich přípravy a farmaceutická kompozice a dvojsložkový systém tyto deriváty obsahující

Oblast techniky

Vynález se týká derivátů dusíkatého yperitu s vázanými zbytky aminokyselin, sloučenin, použitelných při protilátkou směrované terapii za použití prekurzoru účinné látky a enzymu, který je vázán protilátkou k místu požadovaného účinku a který je schopen konvertovat v místě účinku prekurzor účinné látky na účinnou látku (terapie ADEPT - antibody directed enzyme prodrug therapy), způsobu jejich přípravy, farmaceutického prostředku sjejich obsahem a dvousložkového systému obsahujícího 1) konjugát enzymu a protilátky nebo fragmentu protilátky a 2) sloučeninu podle vynálezu. Uvedené sloučeniny jsou obzvláště zajímavé jako prekurzory farmakologicky účinných látek v kombinaci s karboxypeptidázami G, zejména v kombinaci s karboxypeptidázou G2 CPG2).

Dosavadní stav techniky

Až dosud bylo nalezeno mnoho cytotoxických sloučenin, které jsou potenciálně použitelné při chemoterapii. Dusíkaté yperity tvoří důležitou skupinu takových cytotoxických sloučenin. Klinické použití těchto cytotoxických sloučenin obecně a dusíkatých yperitů zvláště bylo až dosud omezeno vzhledem k nedostatečné selektivitě cytotoxického účinku mezi nádorovými buňkami a normálními zdravými buňkami.

Jedna z možností, jak překonat tento problém, spočívá v použití tak zvaných prekurzorů farmakologicky účinných látek, které jsou deriváty cytotoxických účinných látek, a to často relativně jednoduchými deriváty, a jejichž cytotoxický účinek je ve srovnání s účinkem mateřských účinných látek výrazně redukován. Bylo navrženo podávat pacientovi tyto prekurzory účinných látek v režimu, při kterém se prekurzor konvertuje na farmakologicky účinnou látku pouze v oblasti zamýšleného místa účinku.

Jeden z takových režimů spočívá ve vázání mateřského dusíkatého yperitu s aminokyselinou za vzniku prekurzoru účinné látky, který může být opět převeden na mateřský dusíkatý yperit v místě zamýšleného účinku působením enzymu. Tento režim může být realizován použitím konjugátu protilátka/enzym v kombinaci s prekurzorem účinné látky. Konjugát protilátka/enzym se vytvoří z protilátky, která je selektivní vůči nádoru, a enzymu, který konverzuje prekurzor účinné látky na samotnou cytotoxicky účinnou látku. V klinické praxi se pacientovi nejdříve podá uvedený konjugát protilátka/enzym a tento konjugát se ponechá vázat na nádor. Po uplynutí určité vhodné časové periody, umožňující vyloučení konjugátu protilátka/enzym ze zbývající části těla prosté nádorů, se pacientovi podá prekurzor cytotoxicky účinné látky. Konverze tohoto prekurzoru působením lokalizovaného enzymu na cytotoxickou účinnou látku probíhá takto převážně v oblasti nádoru. Takový systém je popsán v mezinárodní patentové přihlášce PCT/GB88/00181 publikované jako WO88/07378 a v patentu US 4,975,278.

Známé prekurzory cytotoxicky účinných látek pro ADEPT štěpené CGP poskytují jako jejich mateřské účinné látky yperity s vázanou kyselinou benzoovou. Nicméně je zapotřebí, aby bylo možné štěpením karboxypeptidázami produkovat další účinné látky za účelem zvýšení terapeutické potence vůči nádorovým buňkám. Dále je třeba zvýšit selektivitu terapie ADEPT s CPG, tzn. zvýšit poměr toxicity vůči rakovinným buňkám k toxicitě vůči zdravým buňkám.

-1 CZ 287028 B6

Podstata vynálezu

Vynález je založen na nalezení nových prekurzorů účinných látek pro použití při terapii ADEPT, které jsou štěpitelné karboxypeptidázami G a které takto poskytují významně účinnější cytotoxicky účinné látky, než jakými jsou produkty CPG-katalyzovaných reakcí. PG přirozeně působí jako enzym odbourávající foláty, které specificky hydrolyzuje kyselinu glutamovou a kyselinu asparagovou zfolátových derivátů (Sherwood, R. F. a kol., Eur. J. Biochem. (1985), 148, 447-453). Karboxypeptidázy G nerozpoznávají neklasické folátové analogické deriváty (Kalghatgi, K. K. a kol., Cancer Research (1979), 39, 3441-3445) a jsou proto považovány v ohledu specifikujícím specifičnost k substrátu za konzervativní. S překvapením bylo zjištěno, že prekurzory účinných látek podle vynálezu představují substráty pro karboxypeptidázy G, jakými jsou CPG1, avšak zejména CPG2. Enzym CPG2 je expopeptidázou specifickou pro Lglutamát. Je známé hydrolyzovat zbytek kyseliny glutamové od kyseliny listové a jejích analogů a kyseliny glutamyl-p-aminobenzoové štěpením v úrovni -CO-NH- parciální struktury aromatický kruh- CO-NH-Glu. V rámci vynálezu je parciální strukturou pro srovnávací účely aromatický kruh-X-CO-NH-Glu, ve které X znamená skupinu -NH-, -O- nebo CH₂-, čímž se změní vzdálenost mezi místem štěpení a aromatickým kruhem a distribuce elektronů podél vazby -CO-NH-, zejména v případě, kdy X znamená NH nebo O. Nemohlo být předem zřejmé, že karboxypeptidáza G2 bude schopna přizpůsobit se i těmto prostorovým a elektronovým rozdílům. Sloučeniny, ve kterých X znamená skupinu -CH₂-, byly popsány vChemical Abstracts 75 (5), 2. 8. 1971, abstract č. 36603m a v Karpavicius a kol., Izv. Acad. Nauk. SSSR, Ser Khim. č. 9, 1970, 2150-2153 (viz sloučeniny VI, VIII, IX a XI v tabulce 1).

Předmětem vynálezu jsou sloučeniny, které jsou prekurzorovými substráty pro karboxypeptidázy G a které mají obecný vzorec I

ve kterém

R¹ a R² každý nezávisle znamená atom chloru, atom bromu, atom jodu, skupinu OSO₂Me nebo OSCLfenyl, kde fenylový zbytek je případně substituován 1,2,3,4 nebo 5 substituenty, které jsou nezávisle zvoleny z množiny zahrnující alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, atom halogenu, skupinu -CN a skupinu -NO₂,

R^laaR^2a každý nezávisle znamená atom vodíku, alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy nebo halogenalkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy,

R³ a R⁴ každý nezávisle znamená atom vodíku, alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy nebo halogenalkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy,

R^5a, R^5b, R^5c a R^5d každý nezávisle znamená atom vodíku, alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, která případně obsahuje jednu dvojnou vazbu nebo jednu trojnou vazbu, alkoxy-skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, atom halogenu, kyanoskupinu, skupinu -NH₂, skupinu -CONR⁷R⁸, ve které R⁷ a R⁸ mají níže uvedený

-2CZ 287028 B6 význam, skupinu -NH-alkyl, ve které alkylový zbytek obsahuje 1 až 4 uhlíkové atomy, skupinu -N-(alkyl)₂, ve které každý alkylový zbytek obsahuje 1 až 4 uhlíkové atomy, a alkanoylovou skupinu obsahující 2 až 5 uhlíkových atomů nebo

R'^a a R^5b společně znamenají

a) alkylenovou skupinu obsahující 4 uhlíkové atomy, která případně má jednu dvojnou vazbu,

b) alkylenovou skupinu obsahující 3 uhlíkové atomy nebo

c) skupinu -CH=CH-CH=CH- skupinu -CH=CH-CH₂- nebo skupinu -CH₂CH=CH-, přičemž každá z těchto skupin je případně substituována 1,2,3 nebo 4 substituenty z nichž každý je nezávisle zvolen z množiny zahrnující alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, alkoxy-skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, atom halogenu, kyano-skupinu, nitro-skupinu, alkanoylovou skupinu obsahující 2 až 5 uhlíkových atomů a skupinu -CONR⁷R⁸, ve které R⁷ a R⁸mají níže uvedené významy,

X znamená atom kyslíku, skupinu NH nebo skupinu -CH₂-,

Y znamená atom kyslíku,

Z znamená skupinu -V-W, ve které V znamená skupinu CH₂-T-, ve které T znamená skupinu -CHr-, -O-, -S-, -(SO)- nebo -(SO₂)-, s výhradou spočívající v tom, že když V jako druhý atom obsahuje atom síry nebo atom kyslíku, potom W je jiný než -COOH, přičemž uvedená skupina V případně dále nese na uhlíku jeden nebo dva substituenty Q¹ nebo/a Q², přičemž Q¹ a Q² každý nezávisle znamená alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy nebo atom halogenu nebo když Q¹ a Q² jsou vázány k přilehlým uhlíkovým atomům, potom mohou Q¹ a Q² dodatečně znamenat alkylenovou skupinu obsahující 3 nebo 4 uhlíkové atomy, která je případně substituována 1, 2, 3 nebo 4 substituenty, které jsou nezávisle zvoleny z množiny zahrnující alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy a atom halogenu, a

W znamená

A) skupinu COOH,

B) skupinu -(C=O)-O-R⁶, ve které R⁶ znamená alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, cykloalkylovou skupinu obsahující 3 až 6 uhlíkových atomů nebo arylovou skupinu definovanou níže v C),

C) skupinu -(C=O)-NR⁷R⁸, ve které R⁷ a R⁸ každý nezávisle znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, cykloalkylovou skupinu obsahující 3 až 6 uhlíkových atomů, arylovou skupinu, heteroarylovou skupinu připojenou k dusíku přes uhlík nebo aralkylovou skupinu obsahující 7 až 9 uhlíkových atomů, přičemž arylová skupina znamená fenylovou skupinu, heteroarylová skupina znamená 5nebo 6—člennou kruhovou skupinu obsahující 1 až 3 heteroatomy zvolené z množiny zahrnující atom dusíku a atom síry, samotný arylový zbytek, heteroarylový zbytek a arylový zbytek aralkylové skupiny může být na uhlíku substituován 1 až 4 substituenty zvolenými z množiny zahrnující skupinu -COOH, skupinu -OH, skupinu NH₂, skupinu -CH₂-NH₂, skupinu -(CH2)i_4-COOH, tetrazol-5-ylovou skupinu a skupinu -SO₃H a alky lový zbytek může případně nést methylovou skupinu,

D) skupinu -SO₂NHR⁹, ve kterém R⁹ má význam uvedený pro R⁷ a navíc znamená skupinu -CF₃, skupinu -CH₂CF₃ nebo výše uvedenou arylovou skupinu,

E) skupinu SO₃R¹⁰, ve které R¹⁰ znamená atom vodíku, alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů nebo cykloalkylovou skupinu obsahující 3 až 6 uhlíkových atomů,

F) skupinu PO₃R^I0R¹⁰, ve které symboly R¹⁰, které mohou být stejné nebo odlišné, mají výše uvedený význam,

G) tetrazol-5-ylovou skupinu,

H) skupinu -CONH-SO₂Rⁿ, ve které R¹¹ znamená

a) cykloalkylovou skupinu obsahující 3 až 7 uhlíkových atomů,

b) alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, která je případně substituována substituenty zvolenými z množiny zahrnující níže definovanou arylovou skupinu, alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, skupinu CF₃ nebo atom halogenu a

c) perfluoralkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, přičemž arylová skupina znamená fenylovou skupinu nebo fenylovou skupinu mající 1 až 5 substituentů, které jsou zvoleny z množiny zahrnující atom halogenu, skupinu -NO₂, skupinu -CF₃, alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, alkoxy-skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, skupinu -NH₂, skupinu -NHCOCH₃, skupinu -CONH₂, skupinu -OCH₂COOH, skupinu -NH-alkyl, ve které alkylový zbytek obsahuje 1 až 4 uhlíkové atomy, skupinu -N-(alkyl)₂, ve které každý alkylový zbytek obsahuje 1 až 4 uhlíkové atomy, skupinu -NHCOOalkyl, ve které alkylový zbytek obsahuje 1 až 4 uhlíkové atomy, skupinu -OH, skupinu -COOH, skupinu -CN a skupinu -COO-alkyl, ve které alkylový zbytek obsahuje 1 až 4 uhlíkové atomy, a skupinu -M-Het, ve které M znamená S, SO nebo SO₂ a Het znamená 5- nebo 6-členný heterocyklický aromatický kruh, který je připojen k M přes uhlíkový atom aromatického kruhu, přičemž uvedený aromatický kruh obsahuje 1, 2, 3 nebo 4 heteroatomy zvolené z množiny zahrnující atom kyslíku, atom dusíku a atom síry a je případně substituován na uhlíkových atomech kruhu 1, 2, 3 nebo 4 substituenty zvolenými z množiny zahrnující skupinu -OH, -SH, -CN, -CF₃, NH₂ a atom halogenu, s výhradou spočívající v tom, že do rozsahu sloučenin obecného vzorce I nespadají kyselina 2-(2-/4-/bis-(2-chlorpropyl)amino/fenyl/acetylamino)pentadiová, 5-methylester kyseliny 2-(2-/4-/bis-(2-chlorethyl)amino/fenyl/acetylamino)pentadiové, kyselina 2-(2-/4-/bis-(2-chlorethyl)amino/fenyl/acetylamino)pentadiová,

5-ethylester kyseliny 2-(2-/4-/bis-(2-chlorethyl)amino/fenyl/acetylamino)pentadiové a kyselina 2-(2-/4-/bis-(2-chlorethyl)amino/fenyl/acetylamino)-4-karbamoylmáselná.

Sloučeniny obecného vzorce I mají alespoň jeden asymetrický uhlíkový atom, který je uhlíkový atom nesoucí substituent -COOH v obecném vzorci I. Kromě toho sloučeniny obecného vzorce I v závislosti na významech obecných symbolů R¹, R², R³, R⁴, Q* a Q² mohou obsahovat další asymetrické uhlíkové atomy. Je samozřejmé, že vynález zahrnuje všechny takové formy sloučenin obecného vzorce I, včetně jejich racemických forem a individuálních optických izomerů, které mají využitelné fyziologické vlastnosti zde definovaných kompozic podle vynálezu, přičemž pro odborníka je známou skutečností, jakými způsoby mohou být takové izomery odděleny a jakými způsoby lze stanovit jejich fyziologické vlastnosti. Sloučeniny podle vynálezu mají výhodně konfiguraci L na uhlíkovém atomu nesoucím substituent -COOH v obecném vzorci I.

Vynález zahrnuje i soli sloučenin obecného vzorce I. Je třeba uvést, že pro farmaceutické použití musí být tyto soli farmaceuticky přijatelné, i když ostatní soli mohou být použity například při

-4CZ 287028 B6 přípravě sloučenin obecného vzorce I a jejich farmaceuticky přijatelných solí. Také mohou být připraveny polymorfní formy sloučenin podle vynálezu a tyto formy rovněž tvoří součást vynálezu.

V případě, že některý ze zde uvedených obecných substituentů obsahuje alkylovou skupinu, potom takovou skupinou může být přímá nebo rozvětvená alkylová skupina. V případě, že některý ze zde uvedených obecných substituentů znamená nebo obsahuje alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, potom taková skupina výhodně obsahuje 1 až 4 uhlíkové atomy a znamená například methylovou skupinu, ethylovou skupinu, n-propylovou skupinu nebo isopropylovou skupinu, výhodně methylovou skupinu a ethylovou skupinu, avšak zejména methylovou skupinu. V případě, že některý ze zde uvedených obecných substituentů znamená nebo obsahuje alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, potom takovou skupinou může například být methylová skupina, ethylová skupina, n-propylová skupina nebo isopropylová skupina, výhodně methylová skupina a ethylová skupina, avšak zejména methylová skupina.

Výhodnými významy pro obecné symboly R¹ a R² jsou atom jodu, atom bromu, atom chloru, skupina OSO2Me a OSO2-fenyl, kde fenyl je substituován 1 nebo 2 (zejména 1) substituenty, které zde byly definovány, v poloze 2 nebo/a v poloze 4. Obzvláště výhodnými významy obecných symbolů R¹ a R² jsou atom jodu, atom bromu, atom chloru a skupina -SO2Me. Výhodným významem obecných symbolů R^la a R^2a je atom vodíku nebo skupina -CH₃, avšak zejména atom vodíku.

Výhodnými významy obecných symbolů R³ a R⁴ jsou atom vodíku, methylová skupina a skupina CF₃, avšak zejména atom vodíku.

Výhodnými významy obecných symbolů R^5a až R^5d jsou atom vodíku, atom fluoru, atom chloru, methylová skupina, skupina -CONH₂ a skupina CN. V případě, že existuje substituce na fenylovém kruhu tak, že alespoň jeden z R'^a, R^5b, R^5c a R'^d je jiný než atom vodíku, potom je výhodné, když pouze jeden nebo dva z R^5a, R^5b, R^3C a R^5d jsou jiné než atom vodíku. Za těchto okolností je dále výhodné, když R^5b a R^5d znamenají atom vodíku a když R^3a nebo/a R^5c jsou jiné než atom vodíku.

Výhodnými významy obecných symbolů X jsou atom kyslíku nebo skupinu NH, zejména atom kyslíku. V rámci jiného provedení vynálezu je obzvláště výhodné, jestliže X znamená skupinu NH.

Výhodným významem obecného symbolu V je skupina -CH₂-CH2-. V rámci dalšího provedení podle vynálezu je výhodným významem obecného symbolu V v případě, že W znamená tetrazol5-ylovou skupinu, skupina -CH₂-S-

V případě, že W znamená skupinu podle C), potom je arylovou skupinou výhodně substituovaná fenylová skupina a heteroarylovou skupinou je výhodně 5- nebo 6-členný kruh obsahující 1 nebo 2 heteroatomy, jakými jsou výhodně atomy dusíku, jakým je pyridylový nebo pyrimidinylový kruh. Výhodnými substituenty samotného arylového zbytku, heteroarylové zbytku nebo arylového zbytku aralkylové skupiny jsou skupina -COOH, skupina -CH₂-COOH nebo tetrazol-5-ylová skupina.

V případě, že W znamená skupinu podle Hb), kde W znamená alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, která je případně substituována arylovým zbytkem, potom je případně substituovanou arylovou skupinou výhodně fenylová skupina substituovaná skupinou -CONH₂, skupinou -OCHr-COOH nebo/a skupinou -COOH, avšak zejména nesubstituovaná fenylová skupina.

-5CZ 287028 B6

V případě, že W znamená skupinu podle I), potom Het výhodně znamená 5- nebo 6-členný heterocyklický aromatický kruh obsahující 1, 2, 3 nebo 4 dusíkové atomy. Výhodně je dusík jediným přítomným heteroatomem v kruhu. Specifické skupiny takto zahrnují pyridylovou skupinu, pyrrolylovou skupinu, 1, 2,3-triazinylovou skupinu a 1,2,4-triazinylovou skupinu.

Obzvláštními významy obecného symbolu W jsou významy uvedené v A), B), ), E), F), G) a I) a výhodnými významy obecného symbolu W jsou významy uvedené v A), B), C), G) a I), kteréžto významy byly detailně vymezeny výše.

Zvláštnější významy obecného symbolu W jsou:

-COOH,

-CONH₂,

-CONHR⁸, kde R⁸ má výše definovaný význam, zejména kde R⁸ znamená fenylovou skupinu, tetrazol-5-yl,

-CONH-SO2R¹¹, kde R¹¹ má významy podle výše uvedených definic b) a c) a

-M-Het, kde M znamená atom síry a Het znamená 5-členný heterocyklický aromatický kruh se 3 nebo 4 heteroatomy, který je případně substituován na uhlíku, když heterocyklický kruh obsahuje 3 heteroatomy, atomem halogenu nebo kyano-skupinou.

V případě, že W znamená skupinu -CONH-SO₂R^h, ve které R¹¹ znamená perfluoralkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, potom má tato perfluoralkylová skupina výhodně 1 až 4 uhlíkové atomy, zejména 1 nebo 2 uhlíkové atomy.

Zvláštnějšími významy obecného symbolu W jsou skupina -COOH, tetrazol-5-ylová skupina nebo skupina -CONH-aryl, ve které má arylový zbytek význam uvedený ve výše uvedené definici C). V tomto kontextu arylová skupina výhodně znamená substituovanou fenylovou skupinu, přičemž výhodnými substituenty v tomto případě jsou skupina -COOH, skupina -CH2COOH nebo tetrazol-5-ylová skupina.

Výhodnými specifickými sloučeninami podle vynálezu, pokud jde o jejich použitelnost v terapii ADEPT, jsou:

kyselina (S)-2-(4-/bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonylamino)-4-(lH-l,2,3,4-tetrazol-5yl)máselná a její soli, kyselina N-(4-/bis(2-chlorethyl)amino/-3-fluorfenylkarbamoyl)-L-glutamová a její soli, kyselina N-(4-/bis(2-chlorethyl)amino/fenylkarbamoyl)-L-glutamová a její soli, přičemž obzvláště výhodnou sloučeninou je kyselina N-(4-/bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl)-L-glutamová a její soli. Dalšími výhodnými sloučeninami, které při testech vykazovaly dobrou účinnost, jsou kyselina N-(4/bis-(2-jodethyl)amino/fenoxykarbonyl)-L-glutamová a její soli a gama-(3,5-dikarboxy)anilidem kyseliny 4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-glutamové a jeho soli.

Zajímavé specifické podskupiny sloučenin podle vynálezu mohou být získány zvolením libovolné z výše uvedených specifických nebo generických definic obecných symbolů R¹ a R⁴, R^5a až R^5d, X, Y, W, Q¹ nebo Q² a to buď samostatně nebo v kombinaci s libovolnou další specifickou nebo generickou definicí obecných symbolů R¹ až R⁴, R^5a až R^?d, X, Y, W, Q¹ nebo Q² a to buď samostatně nebo v kombinaci s libovolnou další specifickou nebo generickou definicí obecných symbolů R¹ až R⁴, R^5a až R^5d, X, Y, W, Q¹ nebo Q².

-6CZ 287028 B6

Navíc jsou farmakologicky účinné látky produkované CPG-štěpením testovaných sloučenin podle vynálezu v rámci účinné terapie ADEPT méně stabilní za fyziologických podmínek, než známé léčivové produkty reakcí katalyzovaných CPG2. Tato snížená stabilita zaručuje nižší toxicitu pro zdravé buňky, než je tomu v případě léčiv majících stabilitu, která je obdobná se stabilitou známých produktů reakcí katalyzovaných CPG v rámci terapie ADEPT, a to v případě, kdy určité množství účinné látky produkované v nádorovém místě uniká do celkového krevního oběhu. Provedené testy ukázaly, že dokonce 15 minut po intravenózním podání účinné látky (jde o účinnou látku a nikoliv o její prekurzor) nebylo možné tuto účinnou látku v krevní plazmě detekovat.

Sloučeniny podle vynálezu tvoří soli s různými anorganickými a organickými kyselinami a bázemi a tyto soli tvoří rovněž součást vynálezu. Uvedené soli zahrnují amonné soli, soli alkalických kovů, jako sodné a draselné soli, solí kovů alkalických zemin, jako vápenaté a hořečnaté soli, soli s organickými bázemi, například dicyklohexylaminové soli a N-methyl-Dglukaminové soli, soli s aminokyselinami, jakými jsou arginin, lysin, a podobně. Také mohou být připraveny soli s organickými a anorganickými kyselinami, jakými jsou například kyselina chlorovodíková, kyselina bromovodíková, kyselina sírová, kyselina fosforečná, kyselina methansulfonová, kyselina toluensulfonová a kyselina kafrsulfonová. Výhodně jsou těmito kyselinami silné kyseliny mající pK_a menší nebo rovnou 2 a zejména mající pK_a menší nebo rovnou 1. Výhodné jsou fyziologicky přijatelné soli, i když užitečné jsou i ostatní soli, například pro izolaci nebo přečištění získaných produktů.

Tyto soli mohou být připraveny konvenčními způsoby, například reakcí produktu ve formě volné báze nebo volné kyseliny s jedním nebo více ekvivalenty příslušné kyseliny nebo příslušné báze v rozpouštědle nebo v prostředí, ve kterém je vytvořená sůl nerozpustná, nebo v rozpouštědle, jakým je voda, která se potom odstraní za vakua nebo lyofilizací, nebo výměnou kationtu jedné soli za jiný kation na vhodné iontoměničové pryskyřici.

Předmětem vynálezu je dále způsob přípravy sloučenin obecného vzorce I a jejich solí, jehož podstata spočívá v odstranění ochranných skupin ve sloučenině obecného vzorce la

ve kterém R¹, R², R^la, R^2a, R³, R⁴, R^5a, R^5b, R^5c, R^sd, X, Y, Q¹ a Q² mají výše uvedené významy a Z¹ znamená výše definovaný Z s výhradou spočívající v tom, že když W znamená karboxylovou skupinu, potom je tato skupina přítomna v chráněné formě (jako Pr²) a Pr¹ rovněž znamená karboxylovou skupinu v chráněné formě (může být stejná s Pr² nebo odlišná od Pr²), a v případném převedení takto získané sloučeniny obecného vzorce na její sůl.

Pr¹ a Pr² mohou takto například znamenat benzyloxykarbonylové skupiny, terc.butyloxykarbonylové skupiny, 2-(trimethylsilyl)ethylesterové skupiny, dimethyl-terc.butylsilylesterové skupiny, difenylmethylesterové skupiny, tetrahydropyranesterové skupiny, methoxyethoxymethylesterové skupiny nebo benzyloxymethylesterové skupiny nebo jiné obecně známé ochranné skupiny karboxylové funkce, například esterotvomé ochranné skupiny, přičemž odstranění těchto ochranných skupin se provádí hydrogenolýzou nebo kyselou katalýzou (Greene, T. W. a Wuts, P. G. M. in Protective Groups in Organic Synthesis, 2. vyd. WileyInterscience, 1990).

V případě, že Pr¹ nebo/a Pr² znamená benzyloxykarbonylovou skupinu, potom se odstranění ochranné skupiny výhodně provádí hydrogenací. Tato hydrogenace může být provedena libovolným vhodným způsobem, například v přítomnosti platiny nebo Raneyova niklu, avšak výhodně se tato hydrogenace provádí za použití hydrogenačního katalyzátoru tvořeného paladiem na uhlí. Hydrogenace se výhodně provádí v přítomnosti inertního rozpouštědla, výhodně v přítomnosti aprotického rozpouštědla, zejména v přítomnosti ethylacetátu, tetrahydrofuranu nebo polárního aprotického rozpouštědla, jakým je dimethylformamid, výhodně při teplotě 0 až 100 °C, výhodněji při teplotě 15 až 50 °C a zejména při okolní teplotě. Hydrogenace se výhodně provádí po dobu 1 až 24 hodin.

V případě, že Pr¹ nebo/a Pr² znamená terc.butyloxykarbonylovou skupinu, potom může být odstranění ochranných skupin provedeno v přítomnosti kyseliny, výhodně v přítomnosti silné kyseliny, jakou je kyselina trifluoroctová, kyselina chlorovodíková, kyselina bromovodíková, kyselina jodovodíková nebo kyselina mravenčí. V případě, že je žádoucí použít rozpouštědlo, potom jsou výhodnými rozpouštědly inertní aprotická rozpouštědla, jako methylenchlorid nebo diethylether. Reakce se vhodně provádí při teplotě 0 až 100 °C, vhodněji při teplotě 0 až 30 °C a zejména při okolní teplotě.

Sloučeniny obecného vzorce la, ve kterém X znamená atom kyslíku a Y znamená atom kyslíku, a jejich soli mohou být připraveny tak, že se sloučenina obecného vzorce II

(II), ve kterém R¹, R², R^la, R^2a, R³, R⁴, R^5a, R^5b, R^5c a R^5d mají výše uvedené významy, X znamená atom kyslíku, Y znamená atom kyslíku a L znamená odlučitelný atom nebo odlučitelnou skupinu, uvede v reakci se sloučeninou obecného vzorce III

Pr¹

I

NH₂-CH-Z' (III), ve kterém Pr¹ a Z¹ mají výše uvedené významy, za vzniku sloučeniny obecného vzorce la, načež se takto získaná sloučenina obecného vzorce la případně převede na její sůl. Výhodně L znamená atom chloru, atom bromu, atom jodu, 4-nitrofenoxy-skupinu. Vhodně se reakce provádí v přítomnosti rozpouštědla při teplotě -10 až 100 °C, a výhodně se tato reakce provádí při teplotě 20 až 50 °C.

Výhodně se reakce provádí v přítomnosti organického rozpouštědla (zejména chloroformu, ethylacetátu, toluenu, dimethylformamidu a methylenchloridu, výhodně při teplotě 5 až 50 °C a výhodně po dobu 1 až 24 hodin. Sloučeniny obecného vzorce II tvoří také součást vynálezu, přičemž tyto sloučeniny mohou být například připraveny reakcí odpovídajícího fenolu obsahujícího anilinoyperitovou skupinu buď s arylchlorformiátem, například nitrofenyl

-8CZ 287028 B6 chlorformiátem (zejména 4-nitrofenylchlorformiátem) nebo s fosgenem za vzniku sloučeniny obecného vzorce II.

Reakce se výhodně provádí v přítomnosti organického rozpouštědla (zejména ethylacetátu nebo chloroformu), výhodně při teplotě 15 až 50 °C (zejména při okolní teplotě), výhodně po dobu 1 až 10 hodin.

Sloučeniny obecného vzorce III, ve kterém W znamená výše definovanou skupinu C), mohou být připraveny ze sloučenin obecného vzorce III, ve kterém W znamená výše definovanou skupinu B) za použití standardních reakčních podmínek. Výhodné reakční podmínky zahrnují reakci s dusíkatými nukleofilními činidly (zejména s amoniakem nebo primárním nebo sekundárním aminem), výhodně při teplotě 25 až 50 °C a výhodně po dobu asi 24 hodin.

Sloučeniny obecného vzorce III, ve kterém W znamená tetrazol-5-ylovou skupinu, mohou být připraveny zodpovídajícího nitrilu známými postupy, například postupem popsaným W. G. Finneganem a kol. v JACS, 80, 1978,3909, a následným odstraněním ochranné skupiny aminové funkce (Pr³) za vzniku sloučenin obecného vzorce III, ve kterém W znamená tetrazol-5-ylovou skupinu.

Sloučeniny obecného vzorce ΙΠ, ve kterém W znamená výše definovanou skupinu I), mohou být připraveny redukcí sloučenin obecného vzorce XV, který je definován dále, na odpovídající primární alkohol za použití standardních reakčních podmínek (zejména za použití diboranu nebo směsného anhydridu a následné redukce borohydridem sodným). Odpovídající primární alkohol se konvertuje standardními postupy, například za použití methansulfonylchloridu a trimethylaminu při teplotě 0 °C v přítomnosti methylenchloridu, na odlučitelnou skupinu, jakou je atom bromu, atom jodu nebo mesylátová skupina, přičemž tato skupina se vytěsní skupinou obecného vzorce XVI

HS-Het (XVI), ve kterém Het má výše uvedený význam pro W = I), čímž se po zpracování za oxidačních podmínek získají sloučeniny obecného vzorce XVII

Pr³

I

Pr¹ - CH-Z¹ (XVII), ve kterém Z¹¹¹ znamená výše definovaný Z s výhradou spočívající v tom, že W znamená -S-Het, ~(S=O)-Het nebo -SCL-Het a Pr¹ a Pr³ jsou chráněnými karboxylovými skupinami resp. skupinami -NH₂, které byly definovány výše. Vhodné oxidační podmínky zahrnují působení oxidačního činidla, zejména působení kyseliny 3-chlorperbenzoové. Odstranění ochranné skupiny -NH₂ ve sloučeninách obecného vzorce XVII se provádí za výše definovaných standardních podmínek za vzniku sloučeniny obecného vzorce III, ve kterém W znamená výše definovanou skupinu I).

Sloučeniny obecného vzorce la, ve kterém X znamená skupinu NH a Y znamená atom kyslíku, a jejich soli mohou být připraveny tak, že se sloučenina obecného vzorce IV

-9CZ 287028 B6 (IV),

ve kterém R¹, R², R^la, R^2a, R³, R⁴ a R^5a až R^5d mají výše uvedené významy, nebo její sůl uvede v reakci s výše definovanou sloučeninou obecného vzorce III za vzniku sloučeniny. Ia, načež se tato sloučenina případně převede na její sůl. Tato reakce může být například provedena v přítomnosti organického rozpouštědla, výhodně polárního aprotického rozpouštědla, zejména methylenchloridu nebo ethylacetátu, výhodně při okolní teplotě a výhodně po dobu asi 1 až 5 hodin.

Sloučeniny obecného vzorce IV a jejich soli mohou být připraveny tak, že se sloučenina

(V), ve kterém

R¹, R², R^la, R^2a, R³, R⁴ a R^5a až R^5d mají výše uvedené významy, uvede v reakci se sloučeninou obecného vzorce

L'-(C=O)-L², ve kterém L¹ a L² znamenají odštěpitelné skupiny, za vzniku sloučeniny obecného vzorce IV. Významy L¹ a L² zahrnují atom chloru, skupinu CC1₃, imidazolylovou skupinu a aryloxyskupinu, zejména fenoxy-skupinu. Výhodně se reakce provádí v přítomnosti organického rozpouštědla, výhodně polárního aprotického rozpouštědla, zejména ethylacetátu, při teplotě 5 až 25 °C a po dobu asi 15 minut.

Sloučeniny obecného vzorce Ia, ve kterém X znamená skupinu -CH2- a Y znamená atom kyslíku, a jejich soli se připraví tak, že se sloučenina obecného vzorce II nebo její sůl, která byly definovány výše, s výhradou spočívající v tom, že X znamená skupinu -CH2-, Y znamená atom kyslíku a L výhodně znamená pentafluorfenoxy-skupinu, atom chloru, skupinu -O-(CO)-alkyl, ve které alkylový zbytek obsahuje 1 až 6 uhlíkových atomů, výhodně rozvětvenou alkylovou skupinu, zejména alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, a produkt odpovídající kyseliny fenyloctové obsahující anilino-yperit zreagovaný s karbodiimidem (zejména dicyklohexylkarbodiimidem) uvede v reakci svýše definovanou sloučeninou obecného vzorce III za standardních reakčních podmínek (například provedením reakce v přítomnosti polárního aprotického rozpouštědla, jakým je dimethylformamid, ethylacetát nebo tetrahydrofuran, po

-10CZ 287028 B6 dobu 1 až 2 hodin při teplotě 20 až 50 °C za vzniku sloučeniny obecného vzorce la, načež se takto získaná sloučenina obecného vzorce la případně převede na její sůl.

Sloučeniny obecného vzorce II mohou být připraveny za použití standardních postupů z odpovídajících fenyloctových sloučenin obsahující anilino-yperitovou skupinu.

Sloučeniny obecného vzorce la, ve kterém W znamená skupinu H) /(tj. skupinu -CONHSO2R¹¹), nebo její soli se připraví tak, že se sloučenina obecného vzorce III, který byl definován výše, s výhradou spočívající vtom, že W znamená pouze skupinu H), uvede v reakci svýše definovanou sloučeninou obecného vzorce II za použití o sobě známých reakčních podmínek za vzniku sloučeniny obecného vzorce la, ve kterém W znamená skupinu H), načež se takto získaná sloučenina obecného vzorce la případně převede na její sůl. Tato reakce se výhodně provádí v přítomnosti organického rozpouštědla, výhodně polárního aprotického rozpouštědla, zejména ethylacetátu nebo dichlormethanu, výhodně při teplotě 5 až 50 °C, zejména při okolní teplotě, a výhodně po dobu 1 až 5 hodin.

Sloučeniny obecného vzorce III mohou být připraveny odstraněním ochranné skupiny aminové funkce ve sloučenině obecného vzorce XI

Pr³

I

Pr¹ - CH-Z¹ (XI), ve kterém Pr¹ znamená karboxylovou skupinu ve výše definované chráněné formě, Pr³ znamená skupinu -NH2 v chráněné formě, zejména benzyloxykarbonylový derivát nebo ftalimido-derivát této skupiny, a Z¹ znamená výše definovaný obecný symbol Z s výhradou spočívající v tom, že W znamená skupinu H), za o sobě známých reakčních podmínek, Čímž se získá sloučenina obecného vzorce III, ve kterém W znamená skupinu H), načež se takto získaná sloučenina obecného vzorce III případně převede na její sůl. Tato reakce se výhodně provádí hydrogenací v přítomnosti paladia na uhlí a v organickém rozpouštědle, výhodně v polárním aprotickém rozpouštědle, zejména v ethylacetátu nebo tetrahydrofuranu, výhodně při okolní teplotě a výhodně po dobu 1 až 24 hodin. Uvedené odstranění ochranné skupiny může být rovněž výhodně provedeno v přítomnosti kyseliny bromovodíkové v kyselině octové, výhodně při okolní teplotě a výhodně po dobu 1 až 24 hodin.

Sloučeniny obecného vzorce XI mohou být připraveny reakcí sloučeniny obecného vzorce XV

Pr³

I

Pr¹ - CH-Z¹¹ (XV), ve kterém Pr¹ a Pr³ mají výše uvedené významy a Z¹¹ znamená výše uvedený obecný symbol Z s výhradou spočívající v tom, že W znamená pouze skupinu COOH, se sloučeninou obecného vzorce

R¹¹SO₂NH₂ ve kterém R¹¹ má význam definovaný v definici W = H), za vzniku sloučeniny obecného vzorce XI, přičemž se použijí standardní reakční podmínky. Tyto standardní reakční podmínky zahrnují provedení reakce v inertním rozpouštědle, zejména v dichlormethanu, v přítomnosti karbodiimidu, zejména dicyklohexylkarbodiimidu, a báze, zejména 4-(N,N-dimethylamino)piperidinu.

-11CZ 287028 B6

Dalším předmětem vynálezu je způsob přípravy sloučenin obecného vzorce I, ve kterém W znamená následující výše definované skupiny: D) (tj. -SO₂NHR⁹), E) (tj. -SO3R¹⁰) a F) (tj. -PO3R^I0R¹⁰), jehož podstata spočívá v tom, že se sloučenina obecného vzorce XVIIIa

NH₂I

HOOC-CH-Z¹¹¹¹ (XVIIIa), ve kterém Z¹¹¹¹ znamená výše definovaný obecný symbol Z s výhradou spočívající v tom, že W znamená následující výše definované skupiny: D) (tj. -SO₂NHR⁹), E) (tj. -SO3R¹⁰) a F) (tj. -PO3R¹⁰R¹⁰), uvede v reakci svýše definovanou sloučeninou obecného vzorce II za standardních podmínek nebo s výše definovanou sloučeninou obecného vzorce V za standardních podmínek, přičemž se získá sloučenina obecného vzorce I, ve kterém W znamená skupiny D), E) a F), načež se takto získaná sloučenina obecného vzorce I případně převede na její sůl. Uvedené standardní podmínky zahrnují provedení reakce sbází, zejména s triethylaminem, v přítomnosti organického rozpouštědla, výhodně aprotického polárního rozpouštědla, zejména dichlormethanu, výhodně při okolní teplotě.

Sloučeniny obecného vzorce XVIIIa jsou známými sloučeninami (komerčně jsou dostupné u firmy Sigma Chemical Co.), nebo mohou být připraveny standardními metodami.

Sloučeniny výše definovaného obecného vzorce Ia, ve kterém X znamená skupinu NH nebo atom kyslíku, Y znamená atom kyslíku, R¹ a R² znamenají atom chloru, atom bromu, atom jodu nebo skupinu OSO₂Me, zejména atom chloru, R^la znamená atom vodíku, R^2a znamená atom vodíku, R³znamená atom vodíku a R⁴ znamená atom vodíku, a jejich solí, jehož podstata spočívá v tom, že se sloučenina obecného vzorce XIX

HO

(XIX), ve kterém R^5a až R^5d a Z¹ mají výše definované významy a X znamená atom kyslíku nebo skupinu NH, uvede v reakci buď s fosforečným halogenačním činidlem, jakým je zejména chlorid fosforečný, nebo s thionylchloridem v přítomnosti organického rozpouštědla, kterým je výhodně nepolární aprotické rozpouštědlo, zejména methylenchlorid, výhodně za zahřívání na teplotu varu pod zpětným chladičem po dobu 1 až 2 hodin, zejména po dobu 90 minut, nebo s methylsulfonylchloridem v přítomnosti organického rozpouštědla, kterým je výhodně polární aprotické rozpouštědlo, zejména pyridin, za vzniku sloučeniny obecného vzorce Ia, ve kterém X znamená atom kyslíku nebo skupinu NH,

Y znamená atom kyslíku, R¹ a R² znamenají atom bromu, atom jodu, skupinu OSO₂Me nebo atom chloru, R^la znamená atom vodíku, R^2a znamená atom vodíku, R³ znamená atom vodíku a R⁴znamená atom vodíku, načež se takto získaná sloučenina obecného vzorce Ia převede na její sůl.

V případě, že se použije methylsulfonylchlorid, mohou být hydroxy-skupiny ve sloučenině obecného vzorce XIX převedeny buď na atom chloru nebo/a na skupinu OSO₂Me v závislosti na použité reakční teplotě. Dichlorované sloučeniny (tj. když R¹ = R² = Cl) mohou být vhodně

-12CZ 287028 B6 získány provedením uvedené reakce při teplotě 70 °C po dobu 15 minut, zatímco odpovídající sloučenina, ve které R¹ znamená atom chloru a R² znamená skupinu OSO₂Me mohou být vhodně získány provedením reakce při teplotě 50 °C po dobu 10 minut.

V případě, že R¹ a R² znamenají atom bromu a R¹ a R² znamenají atom jodu, potom se methansulfonylchlorid výhodně nahradí methansulfonylanhydridem, čímž se eliminují problémy související s konkurencí halogenů při reakci. Sloučenina obecného vzorce XIX (0,002M) se rozpustí v chloroformu (30 ml). Při okolní teplotě se přidá triethylamin (1,12 ml) a methylsulfonylanhydrid (0,008M) a směs se míchá po dobu 2 hodin, načež se promyje vodou, ío Takto získaný produkt se vysuší nad síranem hořečnatým, zfiltruje a odpaří za vzniku oleje. Tento olej se rozpustí v bezvodém dimethylformamidu a k získanému roztoku se přidá lithiumbromid (nebo brom, 0,005M) a směs se míchá při teplotě 80 °C po dobu 2 hodin, načež se ochladí, nalije do vody a extrahuje etherem. Takto získaný produkt se vysuší nad síranem hořečnatým, zfiltruje, odpaří k suchu a přečistí mžikovou sloupcovou chromatografií.

Sloučeniny obecného vzorce XIX mohou být připraveny reakcí sloučeniny obecného vzorce XX

(XX), ve kterém R’^a až R^5d mají výše uvedené významy, R* znamená skupinu -N=C=O nebo skupinu -O-CO-L, kde L znamená výše definovanou odlučitelnou skupinu, se sloučeninou obecného vzorce III za vzniku sloučeniny obecného vzorce XXI

(XXI), ve kterém R^5a až R^5d, Pr¹ a Z¹ mají výše uvedené významy a X znamená atom kyslíku nebo skupinu NH. Takto získaná sloučenina se hydrogenuje, výhodně v přítomnosti paladia na uhlí, za vzniku sloučeniny odpovídající obecnému vzorci XXI, avšak se skupinou -NH₂ na místo skupiny -NO₂. Takto získaná sloučenina se uvede v reakci s ethylenoxidem za kyselých vodných 30 podmínek, výhodně v přítomnosti kyseliny octové a vody v poměru 1:1, výhodně po dobu 1 až 2 dnů, výhodně při okolní teplotě, za vzniku sloučeniny obecného vzorce XIX. Příklad takového postupuje ilustrován reakčním schématem 5.

Způsob přípravy sloučenin obecného vzorce I, ve kterém W znamená tetrazol-5-ylovou skupinu, spočívá v tom, že se sloučenina obecného vzorce XVIIIb

NH₂

I

HOOC - CH - Z¹¹¹¹ (XVIIIb), ve kterém Z¹¹¹¹ znamená výše definovaný symbol Z s výhradou spočívající v tom, že W znamená tetrazol-5-ylovou skupinu, uvede v reakci s výše definovanou sloučeninou obecného vzorce II

-13CZ 287028 B6 za standardních podmínek za vzniku sloučeniny obecného vzorce I, ve kterém W znamená tetrazol-5-ylovou skupinu, načež se takto získaná sloučenina obecného vzorce I případně převede na její sůl. Uvedené standardní podmínky zahrnují provedení reakce v polárním aprotickém rozpouštědle, zejména v dimethylformamidu, v přítomnosti báze, výhodně 5 dimethylaminopyridinu, zejména triethylaminu, po dobu alespoň 2 hodin, výhodně po dobu 20 hodin, při teplotě 20 až 50 °C, zejména při teplotě 25 °C).

Cytotoxická potence prekurzorů a účinných látek in vitro

Cytotoxická potence prekurzorů, prekurzorů plus enzymu a účinných látek in vitro byla měřena testem na stanovení cytotoxicity, který je analogický s testem, který byl popsán Skehanem a kol. vJ. Nati. Cancer Inst 82, 1107-1112, 1990. Buňky LoVo (ECACC No: 87060101) se zředí v médiu DMEM (obsahujícím 10 % fetálního telecího séra, 1 % glutaminu a 0,2 % gentamycinu) distribuovaného na 96 jamkové mikrotitrační plotně, přičemž každá jamka obsahuje 2500 buněk, načež se plotna inkubuje při teplotě 37 °C v atmosféře s 5% obsahem oxidu uhličitého. K těmto buňkám se přidají různé koncentrace prekurzorů, odpovídající účinné látky jakožto kontrolní pokus nebo prekurzorů plus enzymu (1 jednotka CPG2-aktivity/jamka, přičemž jedna jednotka enzymu je množství potřebné k hydrolýze 1 pmolu methotrexaátu/min/ml při 37 °C), načež se buňky inkubují buď 1 hodinu nebo 24 hodin a potom se promyjí. Přidá se čerstvé médium a 20 buňky se inkubují při teplotě 37 °C v atmosféře obsahující 5 % oxidu uhličitého. Tři dny po přidání sloučeniny se k buňkám přidá TCA (16% finální koncentrace), načež se přidáním barviva SRB vyhodnotí množství buněčného proteinu adhezujícího k plotně (Skehan a kol.). Měří se optická hustota při 540 nm a tato se vyjádří jako procentický podíl z OD540 v kontrolních jamkách, do kterých nebyla přidána žádná sloučenina. Potence byla vyjádřena jako koncentrace 25 nezbytná k redukci buněčného růstu na 50 % (IC50). Samotný prekurzor by měl obecně mít při testu nízkou účinnost ve srovnání s účinností prekurzorů v přítomnosti CPG2 (enzym CPG2 je nezbytný ke konverzi prekurzorů na účinnou látku). Přímé přidání chemicky syntetizované účinné látky (zde již není zapotřebí konverze pomocí CPG2) představuje při tomto testu kontrolní pokus.

Za použití výše popsané metody byly vyhodnoceny reprezentativní testované sloučeniny podle vynálezu, přičemž bylo zjištěno, že tyto sloučeniny vykazují po 1 hodině poměr účinnosti v přítomnosti CPG2 k účinnosti v nepřítomnosti CPG2, který je roven alespoň 10, čímž je prokázáno, že sloučeniny podle vynálezu budou v rámci výše uvedené terapie účinné a 35 použitelné.

Dalším předmětem vynálezu je farmaceutická kompozice, jejíž podstata spočívá vtom, že obsahuje alespoň jednu sloučeninu obecného vzorce I nebo její fyziologicky přijatelnou sůl jako prekurzor léčivé (účinné) látky v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem.

Tato kompozice bude vhodně obsahovat účinné množství prekurzorů, kteiý je určen k použití s konjugátem CPG (výhodně CPG2)-protilátka selektivní na nádor, který je již lokalizován na nádoru.

Uvedená kompozice může mít formu sterilní kompozice pro injekci obsahující alespoň jednu 45 sloučeninu obecného vzorce I nebo fyziologicky přijatelnou sůl uvedené sloučeniny jako prekurzor léčivé látky v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem. Tato kompozice bude vhodně obsahovat účinné množství prekurzorů.

Dalším předmětem vynálezu je dvousložkový systém, jehož jedna složka je určena k použití 50 s druhou složkou a jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje

i) první složku, kterou je protilátka nebo její fragment, které jsou schopné vázat se k danému antigenu, přičemž tato protilátka nebo její fragment jsou konjugovány s enzymem CPG

-14CZ 287028 B6 (výhodně s karboxypeptidázou G2), který je schopný převést sloučeninu obecného vzorce I nebo její fyziologicky přijatelnou sůl na cytotoxickou léčivou látku, a ii) druhou složku, kterou je sloučenina obecného vzorce I nebo její fyziologicky přijatelná sůl, které jsou konvertovatelné působením CPG (výhodně karboxypeptidázy G2) na cytotoxickou léčivou látku.

Uvedená protilátka nebo její fragment jsou výhodně schopné vázat se na antigen sdružený s nádorem.

Protilátkou, která je schopná vázat se na antigen sdružený s nádorem, je myší monoklonální protilátka A5B7. Tato protilátka A5B7 se váže k lidskému karcinoembryonálnímu antigenu (CEA - carcinoembryonic antigen) a tato protilátka je obzvláště vhodná pro zaměření (cílení) kolorektálních karcinomů. Protilátka A4B7 je komerčně dostupná u firmy DAKO Ltd., 16 Manor Courtyard, Hughenden Avenue, Hign Wycombe, Bucks HP 13 5RE, Anglie. Fragmenty protilátky mohou být připraveny z celé IgG-protilátky konvenčním způsobem, jako například fragmenty F(ab')₂, popsané Mariani-m M. a kol. (1991), Molecular Immunology 28, 69-77. Obecně by konjugát protilátka (nebo fragment proti látky )-enzym měl být alespoň dvouvalenční, tj. aby byl schopný vázat se alespoň na 2 antigeny sdružené s nádorem (které mohou být stejné nebo odlišné). Molekuly protilátky mohou být humanizovány známými postupy, například „CDRroubováním“ popsaným v EP239400 nebo roubováním kompletních variabilních oblastí na lidské konstantní oblasti, popsaným v patentu US 4816567. Tyto humanizované protilátky mohou být použity za účelem snížení imunogenicity protilátky (nebo fragmentu protilátky). Humanizovaná verze protilátky A5B7 byla popsána v PCT W092/01059.

Hybridomy, které produkují monoklonální protilátku A5B7, jsou uloženy v Evropské sbírce živočišných buněčných struktur (European Collection of Animal Cell Cultures, Division of Biologics, PHLS Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Velká Británie). Tyto hybridomy byly deponovány 14. července 1993 a bylo jim přiděleno depozitní číslo 9307411. Protilátka A5B7 může být z deponovaných hybridomů získána známými standardními postupy, které jsou například popsány C. Fenge-m, E. Fraune-m a K. Schurgerl-em v „Production of Biologicals from Animal Cells in Culture“ (vyd. JR. Griffiths a B. Meignier) Butterworth-Heinemann, 1991, 262-265 a BL. Anderson-em a ML. Gruenberger-em v „Comercial Production of Monoclonal Antibodies“ (vyd. S. Seaver), Marcel Dekker, 1987, 175-195. Tyto buňky mohou čas od času vyžadovat reklonování limitováním zředění za účelem dobré úrovně produkce protilátky.

Byly také popsány další protilátky, které jsou vhodné pro použití v rámci terapie ADEPT. Protilátka BW 431/26 je popsána H. J. Haisma-em a kol. v Cancer Immunol. Immunother., 34: 343-348 (1992). Protilátky L6, 96.5 a 1F5 byly popsány v evropském patentu 302 473. Protilátka 16.88 byla popsána v mezinárodní patentové přihlášce W090/07929. Protilátka CEM231 byla popsána v evropském patentu 382 411. Protilátky HMFG-1 a HMFG-11 (Unipath Ltd, Basingstoke, Hants, Velká Británie) reagují s mucinoidní glykoproteinovou molekulou na mléčnětukových globulámích membránách a mohou být použity pro zaměření rakoviny prsu a rakoviny vaječníků. Protilátka SM3 (Chemicon Intemational Ltd, Londýn, Velká Británie) reaguje s jádrovým proteinem mucinu a může být použita pro zaměření rakoviny prsu a rakoviny vaječníků. Protilátka 85A12 (Unipath Ltd., Basingstoke, Hants, Velká Británie) a ZCEA1 (Pierce Chemical Company, Cester, Velká Británie) reaguje s nádorovým antigenem CEA. Protilátka PR4D1 (Serotec, Oxford, Velká Británie) reaguje s antigenem sdruženým s nádorem v tračníku. Protilátka E29 (Dako Ltd., High Wycombe, Velká Británie) reaguje s epitheliálním membránovým antigenem. Protilátka C242 je dostupná u firmy CANAG Diagnostics, Gothenberg, Švédsko.

-15CZ 287028 B6

Obecně jsou protilátky použitelné v rámci terapie ADEPT málo intemalizovány nádorovými buňkami, které tyto protilátky zaměřují (rozpoznávají). To umožňuje depozici enzymu schopného konvertovat cílený prekurzor na jeho léčivou látku na buněčném povrchu a takto tvořit léčivou látku v místě nádoru z cirkulujícího prekurzoru účinné látky. Uvedená intemalizace protilátky může být stanovena známými technikami, které jsou například popsané Jafrezou-em a kol. vCancer Research 52: 1352 (1992) a Press-em a kol. vCancer Research, 48:2249 (1988).

Purifikace CPG2 zPseudomonas RS-16 ve velkém měřítku byla popsána Sherwood-em a kol. vEur. J. Biochem., 148, 447-453, (1985). Příprava F(ab’)₂ a IgG protilátek kopulovaných k enzymu CPG může být provedena známými postupy a byla například popsána v PCT WO 89/10140. CPG může být získán z Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Velká Británie. CPG2 může být rovněž získán rekombinantními technikami. Nukleotid kódující sekvenci pro CPG2 byl publikován N. P. Minton-em a kol. v Gene, 31 (1984), 31-38. Exprese kódující sekvence byla indikována v E.coli (S. P. Chambers a kol. Appl. Microbiol. Biotechnol. (1988), 29, 572-578) a v Saccharomyces cerevisiae (L. E. Clarke a kol. J. Gen Microbiol, (1985), 131, 897-904). Celková syntéza genu byla popsána M Edwards-em v Am. Biotec. Lab (1987), 5, 38-44. Exprese heterologových proteinů v E.coli byla popsána F. A. O. Marston-en v DNA Cloning, sv. III, Practical Approach Series, IRL Press (ed. D. M. Glover), 1987, 59-88. Exprese proteinů v kvasinkách byla popsána vMethods in Enzymology, sv. 194, Academie Press 1991, ed. C. Guthrie a G. R. Fink.

Enzym CPG je dostupný u firmy Sigma Chemical Company, Fancy Road, Poole, Dorset, Velká Británie. CPG enzym byl popsán P. Goldman-em a C. C. Levy-m v PNAS USA, 58: 1299-1306 (1967) a C. C. Levy-m a P. Goldman-em vJ. Biol. Chem., 242: 2933-2938(1967). Enzym karboxypeptidáza G3 byl popsán N. Yasuda-em a kol. vBiosci. Biotech. Biochem., 56: 1536— 1540 (1992). Enzym karboxypeptidáza G2 byl popsán v evropském patentu 121 352.

Dodání cytotoxické léčivé látky do určitého místa se provádí tak, že se pacientovi nejdříve podá první složka, která obsahuje protilátku nebo fragment protilátky, které jsou schopné vázat se na daný antigen, přičemž tato protilátka nebo fragment protilátky jsou konjugovány k enzjmu CPG (výhodně ke karboxypeptidáze G2), který je schopen konvertovat sloučeninu obecného vzorce I nebo její fyziologicky přijatelnou sůl na cytotoxickou léčivou látku, načež se pacientovi podá druhý složka, která obsahuje sloučeninu obecného vzorce I nebo její fyziologicky přijatelnou sůl, které jsou konvertovatelné působením enzymu CPG (výhodně působením karboxypeptidázy G2) na cytotoxickou léčivou látku.

Místem, na které má být cytotoxická léčivá látka dodána, jsou výhodně nádorové buňky, které budou obecně přítomny v savčím hostiteli nesoucím nádor, jakým je člověk.

Když se uvedenému hostiteli nesoucímu nádor podá uvedená první složka, směruje protilátka nebo fragment protilátky tvořící součást konjugátu s enzymem tento konjugát na místo, ve kterém se nachází nádor a váže tento konjugát k nádorovým buňkám.

Když došlo k odstranění nevázaného konjugátu z léčeného hostitele, například spontánní likvidací v hostiteli po uplynutí určité vhodné doby nebo akcelerovanou likvidací, která je například popsána vBr. J. Cancer (1990), 61, 559-662, může být pacientovi podána druhá složka. Je velmi žádoucí odstranit podstatnou část nevázaného konjugátu z těla pacienta ještě před podáním uvedené druhé složky, neboť v opačném případě může být léčivá cytotoxická látka produkována také jinde v těle pacienta než v místě nádoru, což má za následek obecnou toxicitu produkované cytotoxické účinné látky, tj. toxicitu jak pro nádorové, tak také pro zdravé buňky, a tedy nikoliv požadovanou specifickou toxicitu pouze pro nádorové buňky.

-16CZ 287028 B6

Sloučeniny podle vynálezu mohou být použity ve formě kompozic, jakými jsou tablety, kapsle nebo elixíry pro perorální podání, čípky pro rektální podání, sterilní roztoky a suspenze pro parenterální nebo intramuskulámí podání a podobně.

Sloučeniny podle vynálezu mohou být podávány pacientům (živočichům nebo lidem), kteří takové léčení potřebují, v dávkách, které zajistí optimální farmaceutickou účinnost. I když se dávky budou měnit od pacienta k pacientovi v závislosti na povaze a vážnosti léčené nemoci, pacientově hmotnosti, speciálních dietách, které je pacient nucen držet, dalších lécích, které jsou pacientovi podávány za účelem léčení jiných nemocí a dalších faktorech, budou se podávané dávky obecně pohybovat od asi 1 do asi 150 mg na kilogram pacientovy hmotnosti a den a tato množství mohou být podávána v jediné souhrnné denní dávce nebo v několika denních dílčích dávkách. Výhodně se podávaná dávka bude pohybovat od asi 10 do asi 75 mg na kilogram pacientovy hmotnosti a den. Výhodně se tyto dávky budou pohybovat od asi 10 do asi 40 mg na kilogram pacientovy hmotnosti a den.

Tato dávková rozmezí mohou být přirozeně formulována v jednotkové dávkovači formě tak, aby bylo možné podávat denní dávku v několika dílčích dávkách a aby bylo možné podávat dávky přizpůsobené povaze a vážnosti léčené choroby, hmotnosti pacienta, speciálním dietám a ostatních faktorech, jak již to bylo uvedeno výše.

Typicky budou tyto dávky formulovány do farmaceutických kompozic, které budou popsány v následujícím textu.

Asi 50 až 500 mg sloučeniny nebo směsi sloučenin obecného vzorce I nebo jejich solí se smísí s fyziologicky přijatelným vehikulem, nosičem, excipientem, pojivém, konzervačním činidlem, stabilizátorem, chuťovou přísadou a podobně do jednotkové dávkové formy obvyklou odpovídající farmaceutickou metodou. V těchto kompozicích nebo přípravcích je obsaženo takové množství účinné látky, aby se dosáhlo vhodného dávkování v indikovaném rozmezí.

Ilustrativními příklady přísad, které mohou být zabudovány do tablet, kapslí a podobných formulací, jsou: pojivo jako tragant, akácie, kukuřičný škrob nebo želatina, excipient jako mikrokrystalická celulóza, desintegrační činidlo jako kukuřičný škrob, preželatinační škrob, kyselina algová a podobně, mazivo jako stearát hořečnatý, sladidlo jako sacharóza, laktóza nebo sacharin, chuťová přísada jako máta pepmá a olej z libavky položené a třešňové aroma. Je-li jednotkovou dávkovači formou kapsle, potom tato kapsle může kromě obvyklých materiálů výše uvedeného typu obsahovat také kapalný nosič, jakým je mastný olej. Mohou být ale obsaženy i různé další materiály, například ve formě povlaků nebo látek jinak modifikujících fyzikální formu dávkové jednotky. Tak například tablety mohou být ovrstveny šelakem nebo/a cukrem. Sirup nebo elixír mohou obsahovat účinnou látku, sacharózu jako sladidlo, methyl- a propylparaben jako konzervační činidlo, barvivo a třešňové nebo pomerančové aroma jako chuťovou přísadu.

Jak již bylo uvedeno výše, mohou být sloučeniny obecného vzorce I a jejich fyziologicky přijatelné soli, jakož i výše uvedené konjugáty podávány za použití konvenčních způsobů podání, které neomezujícím způsobem zahrnují intravenózní podání, intraperitoneální podání, perorální podání, intralymfatické podání nebo podání přímo do nádoru. Výhodné je intravenózní podání, například intravenózní infuze.

Sterilní kompozice pro injekci nebo infuzi mohou být formulovány za použití konvenčního farmaceutického postupu rozpuštěním nebo suspendováním účinné látky ve vehikulu, jakým je voda pro injekci, přírodně se vyskytující olej, jako sezamový olej, kokosový olej, podzemnicový olej, olej z bavlníkových semen a podobně, nebo syntetické mastné vehikulum, jako ethyloleát nebo podobně. V případě potřeby mohou být zabudovány také pufry, konzervační prostředky, antioxidační přísady a podobně. Výhodnými sterilními kompozicemi pro injekci nebo infuzi

-17CZ 287028 B6 formulovanými konvenčním farmaceutickým postupem zahrnují kompozice získané rozpouštěním prekurzoru léčivé látky ve vehikulu, jakým je voda, která případně obsahuje soli, cukr (zejména dextran), pufrovací činidla nebo/a korozpouštědla (zejména polyethylenglykol, propylenglykol nebo dimethylisosorbid).

V rámci jednoho provedení vynálezu je sloučenina obecného vzorce I použita ve formě volné kyseliny, která může být formulována do formy pro parenterální podání bezprostředně před podáním pacientovi. Takto může být například sloučenina obecného vzorce I ve formě volné kyseliny smíšena s pufrem, čímž se převede na fyziologicky přijatelnou sůl bezprostředně před podáním.

Výhodnou jednotkovou dávkovou formou sloučeniny podle vynálezu je sloučenina obecného vzorce I nebo její farmaceuticky přijatelná sůl ve sterilní lyofilizované formě vampuli, připravené pro rekonstituci injikovatelného roztoku nebo roztoku podatelného infuzí. Taková ampule výhodně obsahuje 500 mg až 2 g (zejména 1 g) uvedené sloučeniny.

V následujících příkladech provedení bude ilustrována příprava sloučenin obecného vzorce I a jejich zabudování do farmaceutických kompozic, přičemž tyto příklady mají pouze ilustrační charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu. V těchto příkladech je použito, pokud není výslovně uvedeno jinak, následujících standardních technik:

i) všechna odpaření byla provedena v rotační odparce za vakua a zpracování rezultujících směsí byla provedena až po odstranění zbylého pevného podílu filtrací, ii) jednotlivé operace byly provedeny při okolní teplotě, tj. v rozmezí 18 až 25 °C, a pod atmosférou inertního plynu, jakým je argon, iii) sloupcová chromatografie (je použito mžikové chromatografie) byla provedena na silikagelu Měrek Kieselgel (Art. 9385), který je komerčně dostupný u firmy E. Měrek, Darmstadt, Spolková republika Německo, iv) výtěžky jsou uvedeny pouze pro ilustraci a tyto výtěžky nepředstavují maximálně dosažitelné výtěžky, kterých by se dosáhlo optimalizací preparativních postupů,

v) finální produkty mají uspokojivé výsledky elementární mikroanalýzy a jejich struktury jsou potvrzeny nukleární magnetickorezonanční spektroskopií a hmotovou spektroskopií, vi) získané meziprodukty nejsou obecně zcela charakterizovány a jejich čistota byla stanovena chromatografíí na tenké vrstvě, infračervenou spektroskopií nebo nukleární magnetickorezonanční spektroskopií, vii) teploty tání nejsou korigované a byly stanoveny za použití zařízení s olejovou lázní, přičemž teploty tání finálních produktů obecného vzorce I byly stanoveny po krystalizaci z vhodného organického rozpouštědla, jakým je ethanol, methanol, aceton nebo hexan, a to buď samotný, nebo ve směsi s ostatními rozpouštědly.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Kyselina N-(4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl)-L-glutamová

-18CZ 287028 B6

Roztok dibenzyl-N-(4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl)-L-glutamátu (viz 2 v reakčním schématu 1) (6 g) v ethylacetátu (100 ml) se hydrogenuje v přítomnosti 30% paladia na uhlí (0,6 g) po dobu 2 hodin. Když se spotřebuje teoretické množství vodíku, hydrogenační katalyzátor se odstraní filtrací a filtrát se odpaří k suchu. Zbytek se vyjme horkým etherem (25 ml) a přidá se hexan až do zakalení. Po ochlazení se získá kyselina N-(4-/N,N-bis(2chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl)-L-glutamová (viz 3 v reakčním schématu 1) ve formě bílého krystalického produktu.

Výtěžek: 3,4 g (79 %), teplota tání: 87 až 89 °C, nukleární magnetickorezonanční spektrum: 7,0(d) 2H,

6,6(d) 2H,

6,2(d) 1H, 4,4(m) 1H, 3,5-3,7(m) 8H, 2,0-2,6(m) 4H), elementární analýza

C(%) H(%) N(%) vypočteno 47,2 4,95 6,88 nalezeno 47,5 5,1 6,7.

Tato sloučenina může být rovněž připravena v odlišné polymorfní formě, která je nerozpustná v etheru a má teplotu tání 128 až 130 °C.

Výchozí dibenzyl-N-(4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl)-L-glutamát se připraví následujícím způsobem.

Roztok 4-nitrofenylchlorformiátu (1,43 g) v chloroformu (15 ml) se přidá ke směsi 4—/bis(2— chlorethyl)amino/fenol-hydrochloridu (Biochem. Pharmacol 17 893 (1968)) (1,93 g), triethylaminu (2 ml) a chloroformu (20 ml). Po dvou hodinách při okolní teplotě se směs odpaří k suchu a zbytek se chromatografuje na silikagelu Měrek Art. 9385. Po eluci eluční soustavou tvořenou směsí hexanu a ethylacetátu a rekrystalizaci ze směsi benzenu a petroletheru v poměru 3:1 se získá 0-(4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenyl)-0'-(4-nitrofenyl)karbonát (viz 1 v reakčním schématu 1) ve formě nažloutlého pevného produktu.

Výtěžek: 1,4 g (50 %) teplota tání: 66 až 67 °C.

K takto získanému produktu (5,5 g) v chloroformu (40 ml) se přidá triethylamin (3,8 ml a potom dibenzylestertosylát kyseliny L-glutamové (13,75 g). Získaná směs se míchá a zahřívá na teplotu 60 °C po dobu 4 hodin, načež se odpaří k suchu. Zbytek se chromatografuje na silikagelu (Měrek Art. 9385), přičemž se eluce provádí 3% ethylacetátem v chloroformu. Z odpovídající frakce eluátu se získá požadovaný výchozí dibenzyl-2-(/bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl)glutamát (viz 2 v reakčním schématu 1) ve formě bílého pevného produktu.

Výtěžek: 6,2 g (77 %), teplota tání: 85 až 87 °C.

Příklad 2

Kyselina N-(4—/N,N-bis(2-chlorethyl)-amino/-3-methylfenoxykarbonyl)-L-glutamová

-19CZ 287028 B6

Způsob popsaný v příkladu 1 se opakuje za použití dibenzyl-N-(4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/-3-methylfenoxykarbonyl)-L-glutamátu namísto dibenzyl-N-(4-/N,N-bis(2chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl)-L-glutamátu, přičemž se získá N-(4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/-3-methylfenoxykarbonyl)-L-glutamová kyselina ve formě bílého pevného produktu.

Teplota tání: 160 až 162 °C,

nukleární magnetickorezonanční spektrum:	7,3(d)2H, 6,7(d) 2H, 6,0(d) 1H), 4,2(m) 1H, 3,7(m) 8H, 2,3-2,0(m) 4H,
elementární analýza:
	C(%)	H(%) N(%)	Cl(%)
vypočteno	47,3	5,2 10,3	17,5
nalezeno	46,8	5,2 10,3	18,0.

Dibenzyl-N-(4-/N,N-(2-chlorethyl)amino/-3-methylfenoxykarbonyl)-L-glutamát, použitý jako výchozí látka, se připraví způsobem, který je analogický se způsobem popsaným v příkladu 1 za použití 4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/-3-methylfenolu namísto 4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenolu.

4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/-3-methylfenol se získá následujícím způsobem (viz reakční schéma 2).

a) Ethylenoxid (40 g) se zavede probubláváním do roztoku 4-amino-m-kresolu (12,3 g) ve směsi kyseliny octové a vody v poměru 1:1 (500 ml). Tato směs se potom ponechá při okolní teplotě po dobu 48 hodin, načež se odpaří k suchu. Zbytek se chromatografuje na silikagelu, přičemž se eluce provádí ethylacetátem. Zodpovídající frakce eluátu se získá 4-/N,N-bis(2hydroxyethyl)amino/-3-methylfenol ve formě oleje.

Výtěžek: 6,2 g), nukleární magnetickorezonanční spektrum: viz tabulku 2.

b) Benzylbromid (4,24 g) se přidá ke směsi takto získaného produktu (6 g), hydroxidu draselného (1,6 g) a ethanolu (40 ml). Tato směs se potom míchá a zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem po dobu 2 hodin, načež se ochladí a zahustí odpařením. Zbytek se nalije do vody (100 ml), dvakrát extrahuje ethylacetátem, vysuší a odpaří, přičemž se získá 2,2'-(4-benzyloxy2-toluidino)diethanolu ve formě pevného produktu.

Teplota tání: 70 až 72 °C, výtěžek: 7,2 g, nukleární magnetickorezonanční spektrum: viz tabulka 3.

c) K takto získanému produktu (7 g) v chloroformu (50 ml) se při teplotě 10 až 20 °C po částech přidá chlorid fosforečný (11,4 g). Směs se potom zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem po dobu 90 minut, načež se ochladí a nalije do vody. Organická fáze se oddělí a promyje vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vodou a odpaří k suchu. Zbytek se chromatografuje na silikagelu. Po eluci směsí hexanu a ethylacetátu v poměru 2:1 se získá 4-benzyloxy-3-methylN,N-bis-(2-chlorethyl)anilin ve formě oleje.

-20CZ 287028 B6

Výtěžek: 2,2 g, nukleární magnetickorezonanční spektrum: viz tabulka 4.

Namísto bezprostředně výše uvedené reakce lze použít následující alternativní reakci. K roztoku produktu získaného v reakčním stupni b) (2,6 g) v pyridinu (8 ml) se při teplotě 0 až 5 °C přidá methansulfonylchlorid (2,5 ml). Získaná směs se potom zahřívá na teplotu 70 °C po dobu 15 minut, načež se ochladí a nalije do zředěného roztoku kyseliny citrónové (100 ml). Směs se potom dvakrát extrahuje ethylacetátem, vysuší a odpaří, přičemž se získá 4-benzyloxy-3methyl-N,N-bis(2-chlorethyl)anilin ve formě oleje.

Výtěžek: 2,6 g (84 %), nukleární magnetickorezonanční spektrum: viz tabulka 4.

d) K takto získanému produktu (2 g) v ethanolu (25 ml) se přidává ether nasycený chlorovodíkem až do okamžiku, kdy se získá roztok, tj. kdy dojde k rozpuštění veškerého pevného podílu. K roztoku se přidá 300 mg 30% paladia na uhlí ve funkci hydrogenačního katalyzátoru a získaná směs se míchá pod atmosférou dusíku až do okamžiku, kdy je spotřebováno příslušné množství vodíku. Hydrogenační katalyzátor se potom odstraní filtrací a filtrát se odpaří, přičemž se získá 4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino-3-methylfenolhydrochlorid ve formě pevného produktu.

Výtěžek: 950 mg, teplota tání: 164 až 167 °C.

Příklad 3

Hydrochlorid kyseliny N-(4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenylkarbamoyl)-L-glutamové

Nasycený roztok chlorovodíku v etheru (120 ml) se přidá k roztoku diterc.butyl-N-(4-(N,Nbis(2-chlorethyl)amino/fenylkarbamoyl)-L-glutamátu (4,4 g) v ethylacetátu. Po jedné hodině při okolní teplotě se směs odpaří k suchu. Získaný pevný produkt se rozetře s etherem, přičemž se získá hydrochlorid kyseliny N-(4-7N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenylkarbamoyl)-L-glutamové ve formě šedé pevné látky.

Výtěžek: 3,5 g, teplota tání: 148 až 150 °C (viz reakční schéma 3), nukleární magnetickorezonanční spektrum: 7,2(d) 2H,

6,7(d)2H) 4,2(n) 1H, 3,7(m) 8H, 2,4-l,8(m) 4H, elementární analýza:

C(%) H(%) N(%) vypočteno 46,7 6,8 7,0 nalezeno 47,1 6,5 7,5.

Výchozí ditercbutyl-N-(4-/N,N-bis-/(2-chlorethyl)amino/fenylkarbamyl)-L-glutamát se získá následujícím způsobem.

Směs p-fluomitrobenzenu (14,1 g) a diethanolaminu (30 ml) se míchá a zahřívá na teplotu 130 °C po dobu 2 hodin. Směs se potom ochladí na teplotu asi 60 °C, načež se nalije do 1 litru

-21CZ 287028 B6 vody obsahující 10 ml 48% louhu sodného. Po ochlazení na teplotu 15 °C se sraženina odfiltruje a vysuší, přičemž se získá 2,2'-(4-nitroanilmo)diethanol.

Výtěžek: 20,7 g (92 %), teplota tání: 102 až 104 °C.

Ke směsi takto získaného produktu (20 g), dichlormethanu (200 ml) a pyridinu (7 ml) se za chlazení přidá thionylchlorid (30 ml). Po ukončení přídavku se směs zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem po dobu jedné hodiny. Po ochlazení se směs zředí stejným objemem dichlormethanu, načež se pečlivě dvakrát promyje vodou, vysuší a odpaří, přičemž se získá /N,N-bis(2-chlorethyl)/-4-nitroanilin ve formě pevného produktu.

Výtěžek: 21 g, teplota tání: 81 až 83 °C.

K roztoku takto získaného produktu (0,53 g) v redestilovaném tetrahydrofuranu (20 ml) se přidá 30% paladium na uhlí ve funkci hydrogenačního katalyzátoru (100 mg). Získaná směs se míchá pod atmosférou vodíku po dobu dvou hodin, načež se hydrogenační katalyzátor odstraní filtrací. Filtrát se odpaří k suchu a zbytek se opětovně rozpustí v ether (20 ml) a k roztoku se přidá mírný přebytek roztoku chlorovodíku v etheru. 4—/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/aniliniumchlorid, získaný ve formě pevného produktu, se vysuší.

Výtěžek: 0,5 g, teplota tání: 238 až 240 °C (za rozkladu).

K roztoku trifosgenu (od firmy Aldrich, 200 mg) v chloroformu (10 ml) se přidá takto získaný produkt (539 mg) a potom ještě triethylamin (0,83 ml). Po 15 minutách při okolní teplotě se přidá roztok diterc.butylesteru kyseliny L-glutamové (0,31 g) v chloroformu (5 ml). Směs se ponechá stát při okolní teplotě po dobu 18 hodin, načež se promyje vodou, vysuší a odpaří k suchu. Zbytek se chromatografuje na silikagelu Měrek za použití eluční soustavy tvořené směsí hexanu a ethylacetátu v poměru 3:1, načež se zodpovídající frakce eluátu izoluje požadovaný výchozí diterc.butyl-4-/bis-2-(chlorethylamino)/fenylkarbamoyl-L-glutamát ve formě oleje (viz reakční schéma 3).

Výtěžek: 0,44 g, nukleární magnetickorezonanční spektrum: 7,2(d) a 6,65(dd) 4H aromatik

4,l(m) 1H,

3,66(S) 8H, l,7-2,2(m) 4H, l,38(s) 9Ha l,42(s) 9H.

Příklad 4

Kyselina N-(4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenylkarbamoyl)-L-glutamová

V tomto příkladu bude popsán alternativní způsob přípravy kyseliny N-(4—/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenylkarbamoyl)-L-glutamové. Tento způsob představuje alternativu ke způsobu popsanému v příkladu 3. Výchozí dibenzyl-N-(4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenylkarbamoyl)-L-glutamát byl připraven způsobem, který je analogický s odpovídajícím stupněm v příkladu 5.

-22CZ 287028 B6

Roztok dibenzyl-N-(4-/N,N-bis-(2-chlorethyl)amino/fenylkarbamoyl)-L-glutamátu (1,138 g) v dimethylformamidu (15 ml) se hydrogenuje v přítomnosti 10% paladia na uhlí po dobu 16 hodin. Po filtraci a odpaření za vakua se zbytek rozpustí v chloroformu (20 ml). Po 18 hodinách se krystalická sraženina odfiltruje a vysuší za vakua, přičemž se získá kyselina N-(4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenylkarbamoyl)-L-glutamová.

Výtěžek: 730 mg (93 %).

Po rekiystalizaci ze směsi acetonu acetonu a chloroformu se získá produkt tvořený mikroskopickými tyčinkami.

Teplota tání: 116 až 118 °C, nukleární magnetickorezonanční spektrum: 8,0(s) 1H,

7,2(d)2H,

6,6(d) 2H,

6,2(d) 2HNH, 4,4(m) 8H, 3,6(m) 8H, 2,5-l,9(m) 4H.

Příklad 5

Kyselina N-(4-/N,N-bis(2-chlorethyl)-amino/-3-fluorfenyl-karbamoyl)-L-glutamová

K roztoku dibenzyl-N-(4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amin/-3-fluorfenylkarbamoyl)-L-glutamátu (0,4 g) v ethylacetátu (10 ml) se přidá 30% paladium na uhlí (50% vlhkost) (160 mg) a získaná směs se míchá pod vodíkovou atmosférou po dobu 1 hodiny. Po odfiltrování hydrogenačního katalyzátoru se filtrát odpaří k suchu. Kyselina N-(4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amin/-3-fluorfenylkarbamoyl-L-glutamová se získá po rozetření olejovitého zbytku ve směsi ethylacetátu a hexanu ve formě bílého prášku.

Výtěžek: 210 mg, teplota tání: 111 až 114 °C.

Výchozí kyselina dibenzyl-N-(4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/-3-fluorfenylkarbamoyl)-Lglutamová se získá následujícím způsobem.

Suspenze 4-/N,N-bis-(2-chlorethyl)amino/-3-fluoraniliniumoxalátu (3,5 g) v bezvodém ethylacetátu (200 ml) a uhličitanu draselném (5,5 g) se ochladí na teplotu 5 °C pod argonovou atmosférou. K této směsi se přidá roztok fosgenu v toluenu (1,9M, 5,5 ml). Po ukončení přídavku se směs míchá při okolní teplotě po dobu 10 minut, načež se zfiltruje a filtrát se vysuší nad síranem horečnatým. Vysušený filtrát se potom najednou přidá ke směsi dibenzylglutamát-ptoluensulfonátu (5 g), uhličitanu draselného (2 g) a ethylacetátu (100 ml). Přidá se triethylamin (2 ml) a získaná směs se míchá po dobu 20 minut při okolní teplotě. Směs se potom zfiltruje a filtrát se odpaří k suchu. Zbytek se chromatografuje na silikagelu, přičemž eluce se provádí eluční soustavou tvořenou směsí ethylacetátu a hexanu v poměru 1:2 a zodpovídající frakce eluátu se získá požadovaná výchozí látka ve formě oleje, který krystalizuje.

Výtěžek: 5,5 g, teplota tání: 81 až 84 °C.

4-/N,N-bis(2-chlormethyl)amino/-3-fluoranililiniumoxalát se připraví postupem popsaným v příkladu 3 s výjimkou spočívající vtom, že se jako výchozí látka použije 3,4

-23CZ 287028 B6 difluomitrobenzen namísto p-fluomitrobenzenu za vzniku 4-/N,N-bis-(2-hydroxyethyl)amino/fluomitrobenzenu.

Teplota tání: 99 až 101 °C.

Takto získaný produkt se uvede v reakci s thionylchloridem za podmínek uvedených v příkladu 3 za vzniku 4-/N,N-bis(2-chlorethyl)-3-fluomitrobenzenu.

Teplota tání: 66 až 68 °C.

Takto získaný produkt se hydrogenuje za podmínek uvedených v příkladu 3, přičemž se jako rozpouštědlo použije ethylacetát. Směs se zfiltruje a filtrát se odpaří na malý objem a opětovně rozpustí v etheru. Přidá se přebytek nasyceného roztoku kyseliny oxalové v etheru a izoluje se požadovaný 4-/N,N-bis(2-chlormethyl)amino/-3-fluoraniliniumoxalát.

Teplota tání: 146 až 148 °C.

Příklad 6

Kyselina N-(4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/-3-chlorfenylkarbamoyl)-L-glutamová

Roztok dibenzyl-N-((4-/N,N-bis-(2-chlorethyl)amino/-3-chlorfenylkarbamoyl))-L-glutamátu (350 mg) v ethylacetátu (30 ml) obsahující 30% paladium na uhlí (70 mg, zvlhčený na 50 %) se míchá pod vodíkovou atmosférou po dobu jedné hodiny. Po filtraci hydrogenační směsi za účelem odstranění hydrogenačního katalyzátoru se filtrát odpaří k suchu a zbytek se rozetře se směsí etheru a ethylacetátu, přičemž se získá kyselina N-(4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/-3-chlorfenylkarbamoyl)-L-glutamová ve formě oleje.

Nukleární magnetickorezonanční spektrum: 8,7(s) 1H,

7,6(s) 1H,

7,l-7,4(m) 2H,

6,5(d) 1H, 4,2(m) 1H, 3,3-3,6(m) 8H, l,7-2,4(m) 4H.

Výchozí dibenzyl-4-/N,N-bis-(2-chlorethyl)amino-3-chlorkarbamoyl)-L-glutamát se získá postupem, který je analogický s postupem popsaným v příkladu 3, s výjimkou spočívající vtom, že se jako výchozí látka použije 4-fluor-3-chlomitrobenzen namísto 4-fluomitrobenzenu za vzniku 4-/N,N-bis-(2-hydroxyethylamino)/-3-chlomitrobenzenu ve formě oranžového oleje.

Nukleární magnetickorezonanční spektrum: 8,0-8,2(m) 2H,

7,3(1) 1H,

4,7(t)2H,

3,5(m) 8H.

Takto získaný produkt se uvede v reakci s thionylchloridem za podmínek popsaných v příkladu 3 za vzniku 4-/N,N-bis-(2-chlorethylamino)-3-chlomitrobenzenu ve formě oleje.

Nukleární magnetickorezonanční spektrum (CHC1₃): 8,3(d) 1H,

8,l(q) 1H,

7,25(d) 1H,

3,8(t)4H,

-24CZ 287028 B6

3,6(t) 4H.

Takto získaný produkt se hydrogenuje postupem popsaným v příkladu 3 za použití ethylacetátu jako rozpouštědla. Hydrogenační katalyzátor se odstraní filtrací a filtrát se odpaří na malý objem, zbytek se opětovně rozpustí v etheru a k získanému roztoku se přidá přebytek nasyceného roztoku kyseliny oxalové v etheru. Oxalátová sůl se oddělí filtrací.

Teplota tání: 118 až 121 °C.

Takto získaný produkt se převede na kyselinu dibenzyl-N-(4-/N,N-bis-(2-chlorethyl)amino/3-chlorfenylkarbamoyl)-L-glutamovou za podmínek popsaných v příkladu 5. Získá se produkt ve formě oleje.

Nukleární magnetickorezonanční spektrum: 7,l-7,4(m) 13H,

5,l(s)2H,

5,0(s) 2H,

4,6(m) 1H,

3,5(s) 8H, 2,0-2,6(m) 4H.

Příklad 7

Typické farmaceutické kompozice obsahující sloučeninu podle vynálezu

A) Suché plněné kapsle obsahující 100 mg prekurzoru léčivé látky v kapsli

Složka Množství obsažené v kapsli ___________________________________________________________(mg)__________________ Sloučenina100

Laktóza149

Stearát hořečnatý1

Kapsle (velikost č. 1)250

Sloučenina může být desintegrována na prášek č. 60 a do takto získaného prášku se potom zavede skrze tkaninu č. 60 laktóza a stearát hořečnatý. Sloučené složky mohou být potom míšeny po dobu asi 10 minut, načež se naplní do suchých želatinových kapslí č. 1.

B) Tableta

Typická tableta by měla obsahovat sloučeninu (100 mg), preželatinační škrob (82 mg), mikrokrystalickou celulózu (82 mg) a stearát hořečnatý (1 mg).

C) Čípek

Typická čípková formulace pro rektální podání může obsahovat sloučeninu (50 mg), dinatriumkalciumdetát (0,25-0,5 mg) a polyethylenglykol (775-1600 mg). V jiných čípkových formulacích může být dinatriumkalciumedetát nahrazen butylovaným hydroxytoluenem (0,04 až 0,08 mg) a polyethylenglykol může být nahrazen hydrogenovaným rostlinným olejem (675 až 1400 mg), jakým je Supocire L, Wecobee FS, Wecobee M, Witepsols a podobně.

-25CZ 287028 B6

D) Injekce

Typická injikovatelná formulace bude obsahovat sloučeninu (500 mg), benzylalkohol (0,05 ml) a 0,15M hydrogenuhličitan pro injekci (5,0 ml).

Příklad 8 (viz reakční schéma 4)

Kyselina N-(4-/bí-(2-chlorethyl)-N-(2-mesyloxyethyl)amino/fenoxykarbonyl}-L-glutamová

N-(4-(/N-(2-Chlorethyl), N-(2-mesyloxyethyl)/amino)fenyloxykarbonyl)-L-glutamová kyselina ve formě di-terc.butylesteru (6, kde R’-C1 a R² = OSO2Me) (110 mg) se suspenduje v kyselině trifluoroctové (2,2 ml) a získaná suspenze se míchá po dobu 40 minut při okolní teplotě. Kyselina trifluoroctová se odežene za sníženého tlaku a zbylý olej se zředí ethylacetátem (1 ml) a odpaří, přičemž se získá kyselina N-(4-/N-(2-chlorethyl)-N-(2-mesyloxyethyl)amino/fenoxykarbonyl)-L-glutamová ve formě solvátu s 1,02-kyselinou trifluoroctovou a 0,16-ethylacetátem (9, kde R¹ = Cl a R²=OSO2Me).

Výtěžek: 90 mg (95 %), nukleární magnetickorezonanční spektrum:

-CH₂-CH₂-OSO₂Me/-CH₂-CH₂Cl
další	3,15(s)3H, 3,70(m) 6H, 4,30(t) 1H,
aromatika	4,49(t) 1H, 6,75(d) 2H,
	6,92(d) 2H, l,8-2,3(m) 4H, 4,02(m) 1H, 7,90(d) 1H.

Výchozí di-terc.butylester kyseliny 4-(/N-(2-chlorethyl)-N-(2-mesyloxyethyl)/amino)fenyl— oxykarbonyl-L-glutamové se připraví následujícím způsobem.

Roztok hydrochloridu di-terc.butylesteru kyseliny L-glutamové (4,26 g) a triethylaminu (4 ml) v bezvodém chloroformu (30 ml) se míchá s chladným roztokem 4-nitrofenylchlorformiátu (2,92 g, dostupný u firmy Aldrich). Po 5 hodinách při okolní teplotě se rozpouštědlo odpaří a zbytek se rozpustí v ethylacetátu (70 ml), načež se roztok zfiltruje a filtrát se odpaří k suchu. Zbytek se chromatografuje na silikagelu za použití elučního činidla tvořeného chloroformem, přičemž se zodpovídající frakce eluátu získá di-terc.butylester kyseliny 4-nitrofenyloxykarbonyl-L-glutamové (2) ve formě oleje.

Výtěžek: 5,02 g (82 %), nukleární magnetickorezonanční spektrum: 7,33(d) 2H,

8,24(d) 2H, l,46(s) 9H, l,50(s) 9H,

2,0-2,4(m) 4H,

4,32(m) 1H,

5,90(d) 1H.

-26CZ 287028 B6

Roztok takto získaného produktu (2) (5,01 g) v kyselině octové (30 ml) se hydrogenuje v přítomnosti 10% paladia na uhlí po dobu tří dnů. Po zfiltrování se roztok ochladí a k takto ochlazenému roztoku se přidá ethylenoxid (5 ml) a směs se ponechá v klidu při okolní teplotě po dobu 22 hodin. Rozpouštědlo se odpaří a zbytek se rozdělí mezi ethylacetát a vodu. Organická fáze se oddělí, promyje vodou, vysuší nad síranem sodným a odpaří k suchu. Zbytek se chromatografuje na silikagelu za použití eluění soustavy tvořené směsí ethylacetátu a chloroformu v poměru 2:1, načež se z odpovídající frakce eluátu získá di-terc.butylester kyseliny 4-/bis(2-hydroxyethyl)amino/fenyloxykarbonyl-L-glutamové (4).

Výtěžek: 3,93 g (69 %), teplota tání: 91 až 93 °C.

Roztok takto získaného produktu (4) (0,86 g) v pyridinu (3 ml) se míchá s methansulfonylchloridem (0,6 ml) při teplotě 2 °C po dobu 20 minut a potom ještě při teplotě 50 °C po dobu 10 minut. Reakční směs se potom rozdělí mezi ethylacetát a vodu. Organická fáze se oddělí, promyje vodou, vysuší nad síranem sodným a odpaří k suchu. Zbytek se chromatografuje na silikagelu za použití eluční soustavy tvořené směsí ethylacetátu a dichlormethanu v poměru 1:9, načež se z odpovídající frakce eluátu získá di-terc.butylester kyseliny 4-/(2-chlorethyl)-/2(mesyloxy)ethyl/aminofenyloxykarbonyl-L-glutamové (6) ve formě oleje.

Výtěžek: 0,44 g (43 %), nukleární magnetickorezonanční spektrum: 3,15(s) 3H,

3,70(m) 6H,

4,29(t) 2H,

6,75(d) 2H,

6,92(d) 2H, l,41(s) 9H, l,42(s)9H, l,8-2,3(m) 2H, 3,97(m) 1H, 7,92(d) 1H.

Příklady 9 až 15

Následující sloučeniny uvedené v tabulce 1 byly připraveny postupem popsaným v příkladu 2 za použití výchozích látek a meziproduktů uvedených v dále zařazených tabulkách 2 až 8.

Tabulka 1

Př.č.	_R5a-t>	T.t.	C1CH₂CH₂M-	Aromatika	aCH	-CH₂CH₂-
9	CH₃(R^áa)	160ažl62 °C	3,34-3,54(m)8H	6,9-7,22(m)3H;	4,l(m)lH	2,0-2,5 (m)4H
10	PrXR⁵’)	156ažl58°C	3,32-3,55(m)8H	6,95-7,28(m)3H;	4,l(m)lH	2,0-2,49(m)4H
11	CH₃(R^sb)	124ažl26 °C	3,7(m)8H	6,5-6,9(m)3H	4,l(m)lH	l,9-2,3(m)4H
12	F(R^Sa)		3,6(m)8H	6,8-7,2(tn)3H	4,l(m)lH	2,0-2,49(m)4H
13	-CH=CH-CH=CH- (_R5a-b)	3,6(m)8H	6,6-8,0(m)6H	4,2(m)lH	2,l-2,5(m)4H
14	C1(R^51>)	106ažl08 °C	3,6(m)8H	6,7-7, l(m)3H	4,l(m)lH	l,9-2,4(m)4H
15	CÍ(R^Sa)	148ažl50 °C	3,4—3,54(m)8H	7,0-7,4(m)3H	4,l(m)lH	1.9-2,36(m)4H

Ostatní 2,27(s)3H CH₃3,7(m)lH CH l,14(d)2H(CH₃)₂2,l(s)3HCH₃

Sloučeniny z příkladů 9 až 15 byly tedy připraveny způsobem, který je analogický s postupem popsaným v příkladu 2. Sloučenina z příkladu 10 byla takto připravena náhradou 4-amino-3isopropylfenolu (Gilman H. a kol., J. Org. Chem. 19 (1954) 1067-78) za 4-amino-m-kresol použitý ve stupni a). Sloučenina z příkladu 11 byla připravena náhradou 4-amino-2methylfenolu (dostupný u firmy Aldrich) za 4-amino-m-kresol a sloučenina z příkladu 12 byla připravena náhradou 4-amino-3-fluorfenolu (připraveného podle Joumal of the Chemical Society (1964) str. 473) za 4-amino-m-kresol. Sloučenina z příkladu 13 byla připravena náhradou 4-aminonft-l-olu (Aldrich Chemical Co, Ltd.) za 4-amino-m-kresol a sloučenina z příkladu 14 byla připravena náhradou 4-amino-2-chlorfenolu (připraveného podle Joumal of the Američan Chemical Socienty 45, 2192 (1923)) za 4-amino-m-kresol. Sloučenina z příkladu 15 byla připravena náhradou 4-amino-3-chlorfenolu (Berichte, str. 2065 (1938) a Organic Synthesis, sv. 4, str. 148) za 4-amino-m-kresol.

Použité výchozí látky a meziprodukty v příkladech 9 až 15 a jejich vlastnosti jsou uvedeny v dále zařazených tabulkách 2 až 8.

Tabulka 2

R5^a nebo^b	T.t. nebo NMR	Odkaz
Me (R5^a)	176 až 179 °C	Aldrich
Pr' (R5^a)	172 až 175 °C
Cl (R5_a)	6,5-6,7(m)3H aromatika	J. Chem. Soc. (1928), 2703
	8,8(s)lHOH; 4,6(br s)2H NH₂; 159,5 °C
Me (R5^b)	174 až 176 °C	Aldrich
Cl (R5_b)	146 až 148 °C
F (R5_a)	6,6-6.9(m)3H aromatika 9,4(s)lHOH; 4,4(m)2HNH₂

DiCH₃ (R5^a = R5^b = 260 až 262 °C (jako hydrochlorid od firmy Aldrich) (R5^a and R5^b 273 °C (jako hydrochlorid od firmy Aldrich) společně znamenají -CH=CH-CH=CH-)

-28CZ 287028 B6

Tabulka 3

HO

R5^a-b HOCH2CH2N-Aromatika Ostatní

Me (R5^a)	2,8-3,3 (m) 8H	6,4- 6,9 (m) 3H	2,03(s)3H CH₃
Pr¹ (R5^a)	3,0-3,4 (m) 8H	6,6-7,1 (m)3H	3,6(m)lH; l.l(d)6HPr‘
Cl (R5^a)	3,15-3,54 (m) 8H	6,7- 7,2 (m) 3H
CH₃ (R5^b)	3,3-3,5(m) 8H	6,4- 6,6 (m) 3H	2,06(s)3H CH₃
Cl (R5^b)	3,2-3,6 (m) 8H	6,5-6,8 (m)3H
F (R5^a)	3,1-3,4 (m) 8H	6,5- 6,9 (m) 3H
di CH₃	2,9-3,4 (m) 8H	6,6- 7,0 (m) 3H	2,0(s)3H; 2,2(s)3H CH₃
(R5^a = R5^b =CH₃)
(R5^a a R5^b	3,2-3,4 (m) 8H	6,8-8,3 (m) 11H
společně znamenají
-CH=CH-CH=CH-

Tabulka 4

10 R5^a~^b	HO HO HOCH₂CH₂N-	R^5a R^5b // 4
	Ostatní
Aromatika	-ch₂-
Me (R5^a)	3,0-3,2 (m) 8H	6,8-7,5 (m) 8H	5,0(s) 2H	2,2(s)3H; CH₃
Pr' (R5^a)	2,9-3,3 (m) 8H	6,8-7,5 (m) 8H	5,0(s) 2H	3,6(m)lH; l.l(d)6HPr*
Cl (R5^a)	3,05-3,35 (m) 8H	6,9-7,5 (m) 8H	5,l(s) 2H	2,2(s)3H CH₃
CH₃ (R5^b)	3,1-3,4 (m) 8H	6,9-7,3 (m) 8H	5,0(s) 2H
Cl (R5^b)	3,3-3,5 (m) 8H	6,8-7,4 (m) 8H	5,0(s) 2H
F (R5^a)	3,2-3,4 (m) 8H	6,8-7,5 (m) 8H	5,0(s) 2H
Di CH₃	2,9-3,3 (m) 8H	6,8-7,4 (m) 8H	5,0(s) 2H	2,2(s)3H; 2,l(s)3HCH₃
(R5^a=R5^b=CH₃)
(R5^a a R5^b	3,2-3,4 (m) 8H	6,9-8,3 (m) 6H	5,3(s) 2H

společně znamenají -CH=CH-CH=CH~)

-29CZ 287028 B6

Tabulka 5

0-Clí₂-Ph

R5³”¹¹	R¹	R²	-ch₂ch₂n-	-CHr-	Aromatika	Ostatní
Me(R5^a)	Cl	Cl	3,3-3,5 (m) 8H	5,08(s) 2H	6,8-7,4 (m) 8H	2,3 (s) 3H Me
Pr'(R5^a)	Cl	Cl	3,2-3,5 (m) 8H	5,04(s) 2H	6,8-7,4 (m) 8H	3,7(m)lH; l,l(d)6H
Cl(R5^a)	Cl	Cl	3,4-3,6 (m) 8H	5,l(s) 2H	6,9-7,4 (m) 8H
CH₃(R5^b)	Cl	Cl	3,3-3,6 (m) 8H	5,l(s) 2H	6,9-7,4 (m) 8H
Cl(R5^b)	Cl	Cl	3,6(m) 8H	5,l(s) 2H	6,8-7,4 (m) 8H
F(R5^b)	Cl	Cl	3,4-3,6 (m) 8H	5,06(s) 2H	6,8-8,4 (m) 8H
Di CH₃	Cl	Cl	3,2-3,5 (m) 8H	5,06(s) 2H	6,8-7,4 (m) 7H	2,2(s)3H;2,l(s)3HCH
(R5^a=R5^b=CH₃
(R5^a a R5^b	Cl	Cl	3,4-3,7 (m) 8H	5,3(s) 2H	7,1-8,3 (m) 11H

společně znamenají -CH=CH-CH=CHTabulka 6

____________________R5^a~^b

Pr' (R5^a)

Me (R5^a)

Me (R5^b)

Cl (R5^b)

F (R5^a) (R5^a=R5^b=CH₃) di-CH₃

R⁵ a R5^b společně znamenají -CH=CH-CH=CHC1 (R^5a)

T.t. HCl-soli (°C)

124 až 127

164 až 167

122 až 124

156 až 158

123 až 125

144 až 146

180 až 184

119 až 121

-30CZ 287028 B6

Tabulka 7

Cl	0 II
z'”' Cl

R_5a-^b	-CICH2CH2N-	Aromatika	Ostatní
CH₃(R5^a)	3,57(m)4H; 3,35(m)4H	7,2-8,4(m)7H	2,32(s)3HCH₃
Pr'(R^5a)	3,5(m)4H; 3,34(m)4H	7,2-8,4(m)7H	3,7(m)lHCH; l,l(d)2H(CH₃)
CH₃(R^5b)	3,7(m)4H; 3,32(m)4H	6,7-8,4(m)7H	2,2(s)3HCH₃
3F	3,5-3,7(m)8H	7,2-8, l(m)7H
1,4-naftyl	3,5-3,5(m)8H	7,2-8,4(m)10H
2C1	3,75(m)8H	6,7-8,4(m) 7H

Tabulka 8

Cl _Rsa-b -C1ch₂CH₂N- Aromatika ArCH₂O «CH -CH₂CH₂- ostatní

CH₃(R^5a) Pr'(R^5b)	3,42(m)8H	7,35-6,9(m)13H	5,2(s)2H 5,l(s)2H	4,4(m)lH	2,5-2, l(m)4H	2,3(s)^3HCH₃
3,5(m) 3,3(m)8H	7,35-6,7(m)13H	5,2(s)2H	4,3(m)lH	2,5-2, l(m)4H	3,6(m)lHCH
			5,l(s)2H			1,1 (d6H 2xCH₃
CH₃(R^5b)	3,7(m) 3,3(m)8H	6,6-7,4(m)13H	5,14(s)2H	4,2(m)lH	2,5-2, l(m)4H	2,l(s)3H
			5,09(s)2H			ch₃
3F	3,60(m)8H	6,7-7,4(m)13H	5,13(s)2H 5,08(s)2H	4,2(m)lH	2,5-2, l(m)4H
1,4-naftyl		7,l-8,4(m)16H	5,l(s)2H 5,16(s)2H	4,2(m)lH	2,5-2, l(m)4H
2C1	3,7(m)8H	6,7-7,4(m)13H	5,09(s)2H 5,15(s)2H	4,2(m)lH	2,5-2, l(m)4H
Cl(R5^a)	3,45-3,62(m)8H	6,98-7,36(m)13H	5,09(s)2H 5,16(s)2H	4,2(m)lH	2,l-2,5(m)4H

Příklad 16 gama-Anilid kyseliny N-(4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl)-L-glutamové

-31CZ 287028 B6

Suspenze alfa-benzyl-4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-glutamové kyseliny ve formě gama-anilidu (2,0 g) v ethylacetátu (50 ml) se hydrogenuje v přítomnosti paladia na uhlí (0,15 g) po dobu 4 hodin. Hydrogenační katalyzátor se odstraní filtrací a filtrát se odpaří k suchu za sníženého tlaku při teplotě 35 °C. gama-Anilid kyseliny 4-/N,N-bis(2chorethyl)amino/-fenoxykarbonyl-L-glutamové (1 v reakčním schématu 6) se získá ve formě bílé krystalické látky.

Výtěžek: 1,4 g (83 %), teplota tání: 110 °C, elementární analýza: vypočteno nalezeno

C(%) H(%) N(%)

54,8 5,22 8,71

54,5 5,62 8,31.

Výchozí gama-anilid kyseliny alfa-benzyl-4-/N,N-bis-(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonylL-glutamové se připraví následujícím způsobem.

Ke směsi gama-anilidu kyseliny alfa-benzyl-p-tosyl-L-glutamové (2,8 g) a O-(4-/N,N-bis(2chlorethyl)amino/fenyl-O'-(4-nitrofenyl)karbonátu (2,0 g v dichlormethanu (30 ml) se přidá triethylamin (2 ml). Získaná směs se míchá při okolní teplotě po dobu 16 hodin, načež se rozpouštědla odstraní za vakua. Zbytek se chromatografuje na silikagelu (Měrek Art. 9385) za použití eluční soustavy tvořené 10% ethylacetátem vdichlormethanu, načež se zodpovídající frakce eluátu získá gama-anilid kyseliny alfa-benzyl-4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-glutamové ve formě bílé pevné látky.

Výtěžek: 1,9 g (64 %).

Výchozí 0-(4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenyl-0'-(4-nitrofenyl)karbonát se připraví následujícím způsobem.

Ke směsi 4-nitrofenylchlorformiátu (7,25 g) a 4-(N,N-bis-(2-chlorethyl)amino)fenolhydrochloridu (10 g) v dichlormethanu (100 ml) se v průběhu dvou hodin přidá roztok triethylaminu (10 ml) v dichlormethanu (10 ml). Po 16 hodinovém míchání při okolní teplotě se rozpouštědla odeženou za sníženého tlaku a zbytek se chromatografuje na silikagelu (Měrek Art. 9385). Po eluci dichlormethanem a odpaření eluátu se získá produkt ve formě červeného oleje. Rozetřením tohoto oleje s hexanem se získá žlutý pevný produkt, který se rekrystalizuje ze směsi benzenu a hexanu, přičemž se získá O-(4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino)penol-O'-(4-nitrofenyl)karbonát ve formě oranžových krystalů.

Výtěžek: 10,4 g(71 %), teplota tání: 68 °C.

Výchozí gama-anilid kyseliny p-tosyl-alfa-benzyl-L-glutamové se připraví následujícím způsobem.

alfa-Benzylester kyseliny N-t-BOC-L-glutamové (10 g) a dicyklohexylkarbodiimid (6,1 g) se rozpustí v dichlormethanu (120 ml) a získaný roztok se míchá při okolní teplotě po dobu 10 minut. Přidá se anilin (2,8 ml) a směs se míchá při okolní teplotě po dobu 16 hodin. Směs se zfiltruje a sraženina se promyje dichlormethanem (2x15 ml). Filtrát se postupně promyje nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (2x100 ml) a vodou (100 ml), načež se odpaří. Získaný pevný podíl se rekrystalizuje ze směsi ethylacetátu a hexanu, přičemž se získají bezbarvé destičky.

Výtěžek: 8,2 g (67 %).

-32CZ 287028 B6 gama-Anilid (12,0 g) a kyselina p-toluensulfonová (5,4 g) v benzenu (300 ml) se zahřívají na teplotu varu pod zpětným chladičem po dobu 40 minut, načež se ponechají přes noc vychladnout. Sraženina se odfiltruje, vysuší odsáváním a rekrystalizuje ze směsi ethylacetátu a methanolu, přičemž se získají bezbarvé destičky gama-anilidu kyseliny tosyl-alfabenzyl-L-glutamové.

Výtěžek: 8,2 g (58 %).

Příklad 17 gama-terc.Butylamid kyseliny N-(4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl)-L-glutamové

Opakuje se postup popsaný v příkladu 16 za použití gama-terc.butylamidu kyseliny alfa-benzyl4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-glutamové namísto gama-anilidu kyseliny alfa-benzyl-4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-glutamové za vzniku gamaterc.butylamidu kyseliny 4—/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-glutamové (2 v reakčním schématu 6), kteiý se rekiystalizuje ze směsi ethylacetátu a hexanu, přičemž se získají bezbarvé krystaly.

Teplota tání: 129 °C, elementární analýza: vypočteno nalezeno

C(%) H(%) N(%)

51,9 6,32 9,09

52,1 6,33 8,96.

gama-terc.Butylamid kyseliny alfa-benzyl—4-/N,N-bis-(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonylL-glutamové se získá způsobem, který je analogický se způsobem popsaným v příkladu 16 pro gama-anilidový derivát.

Příklad 18

Kyselina N-(4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/-3-methylfenylkarbamoyl)-L-glutamová

Roztok di-terc.butyM-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/-3-methylfenylkarbamoyl-L-glutamátu (0,6 g) v dichlormethanu (6 ml) se ochladí na teplotu 0 °C a k takto ochlazenému roztoku se přidá kyselina trifluoroctová (15 ml). Tento roztok se potom ponechá při teplotě 0 °C po dobu 3 dnů. Roztok se potom odpaří k suchu, přičemž se získá kyselina (4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/-3-methylfenylkarbamoyl-L-glutamová ve formě oleje.

Výtěžek: 0,49 g, nukleární magnetickorezonanční spektrum:

8,46(s) 1H, 7,15(m)3H, 6,4(d) 1H, 4,18(m) 1H, 3,55(m) 4H, 3,35(m) 4H, 2,3(m) 2H, 2,23(s) 3H, 2,0(m) 2H.

Výchozí di-terc.butyl-4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/-3-methylfenylkarbamoyl-L-glutamát se připraví následujícím způsobem.

-33CZ 287028 B6

K roztoku 3-methyl-4-nitroanilinu (joumal of Organic Chemistry 33, 3498 (1968) (7,6 g) v ethylacetátu (150 ml) se přidá uhličitan draselný (27,5 g), načež se ke směsi po kapkách přidá 1,9M roztok fosgenu v toluenu (27,5 ml), přičemž se udržuje teplota nižší než 30 °C. Směs se potom míchá při okolní teplotě po dobu jedné hodiny. Ke směsi se přidá di-terc.butylester kyseliny L-glutamové (13 g) a směs se míchá přes noc při okolní teplotě. Roztok se potom zfiltruje, promyje vodou a organická vrstva se vysuší nad síranem hořečnatým a odpaří, přičemž se získá produkt ve formě oleje. Tento olej se potom chromatografuje na silikagelu za použití eluční soustavy tvořené směsí hexanu a ethylacetátu v poměru 3:1, načež se z příslušné frakce eluátu získá terc.butyl(3-methyl-4-nitrofenylkarbamoyl-L-glutamát ve formě oleje.

Výtěžek: 11,19 g (51 %), nukleární magnetickorezonanční spektrum: 9,16(s) 1H,

8,0(d) 1H, 7,43(m) 2H, 6,70(d) 1H, 4,l(m) 1H, 2,5 l(d) 3H, 2,25(m) 2H, l,8(m) 2H, l,41(d) 8H.

Roztok di-terc.butyl-3-methyl-4-nitrofenylkarbamoyl-L-glutamátu (4,7 g) v ethylacetátu (125 ml) se hydrogenuje v přítomnosti paladia na uhlí (0,5 g). Získaná směs se potom zfiltruje přes Celíte (přečištěná a kalcinovaná rozsivková zemina, velikost částic 20 až 45 pm, komerčně dostupná mezi jinými také u firmy Fluka Chemicals Ltd.) a filtrát se odpaří, přičemž se získá tmavý pevný produkt. Tento produkt se chromatografuje na silikagelu za použití eluční soustavy tvořené směsí ethylacetátu a hexanu v poměru 1:1, načež se z eluátu získá di-terc.butyl-3methyl—4-aminofenylkarbamoyl-L-glutamát ve formě oleje.

Výtěžek: 3,7 1 g (83 %), nukleární magnetickorezonanční spektrum: 7,98(s) 1H,

6,9(m) 2H,

6,52(d) 1H, 6,15(d) 1H, 4,53(s) 2H, 4,15(m) 1H, 2,25(m) 2H, 2,04(s) 3H, l,8(m) 2H, l,45(d)18H.

Do roztoku di-terc.butyl-3-methyl-4-aminofenylkarbamoyl-L-glutamátu (5 g) v ledové kyselině octové (25 ml) a vodě (25 ml) se zavede probubláním ethylenoxid (4,8 g). Roztok se potom míchá při okolní teplotě po dobu 24 hodin. Po odpaření k suchu se zbytek opětovně rozpustí v ethylacetátu, promyje vodou a organická vrstva se vysuší nad síranem hořečnatým a odpaří, přičemž se získá di-terc.butyl-4-/N,N-bis(2-hydroxyethyl)amino/-3methylfenylkarbamoyl-L-glutamát, který se použije bez dalšího čistění.

Nukleární magnetickorezonanční spektrum: 8,35(s) 1H,

7,l(m)3H,

6,35(d) 1H, 4,15(m) 1H, 3,3 5(m) 4H,

-34CZ 287028 B6

3,05(m) 4H, 2,25(m) 2H, 2,20(s) 3H, l,8(m) 2H, l,45(d) 18H.

K roztoku di-terc.butyl-4-/N,N-bis(2-hydroxyethyl)amino/-3-methylfenylkarbamoyl-L-glutamátu (4 g) v pyridinu (60 ml) se pod argonovou atmosférou a při udržování teploty pod 30 °C po kapkách přidá methansulfonylchlorid (3,8 ml). Po ukončení uvedeného přídavku se roztok míchá při teplotě 80 °C po dobu dvou hodin. Roztok se potom ochladí a nalije do 10% kyseliny citrónové (500 ml), extrahuje ethylacetátem, promyje vodou a organická vrstva se vysuší nad síranem hořečnatým a potom odpaří, přičemž se získá hnědý olej. Tento olej se chromatografuje na silikagelu za použití eluční soustavy tvořené směsí hexanu a ethylacetátu v poměru 5:1, přičemž se získá di-terc.butyl-4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/3-methylfenylkarbamoyl-Lglutamát ve formě oleje.

Výtěžek: 7,23 g (28 %), nukleární magnetickorezonanční spektrum:

8,42(s) 1H, 7,l(m) 1H, 6,36(d) 1H, 4,13(m) 1H, 3,50(m) 4H, 3,3 l(m) 4H, 2,3(m) 2H, 2,23(s) 3H, l,9(m)2H, l,4(s)9H, l,35(s) 9H.

Reakční sekvence pro tento příklad je uvedena v reakčním schématu 7.

Příklad 19

Kyselina N-(4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/benzylkarbonyl)-L-glutamová

Di-terc.butyl-4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/benzylkarbonyl-L-glutamát (0,5 g) se rozpustí v methylenchloridu (1,5 ml) a k získanému roztoku se přidá kyselina trifluoroctová (1,5 ml). Roztok se míchá při okolní teplotě po dobu dvou hodin. Roztok se potom odpaří, přičemž se získá požadovaná sloučenina ve formě oleje.

Výtěžek: 0,8 g, nukleární magnetickorezonanční spektrum:

8,22(d) 1H, 7,10(d) 2H, 6,66(d) 2H, 4,19(m) 1H, 3,69(s) 8H, 2,24(m) 2H, l,9(m) 2H, 3,32(s) 2H.

Výchozí di-terc.butyl-4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/benzylkarbonyl-L-glutamát se připraví následujícím způsobem.

-35CZ 287028 B6

K roztoku kyseliny 4-nitrofenyloctové (5,4 g) v dimethylformamidu (75 ml) se přidá 1hydroxybenzotriazol (4,05 g). K získané směsi se přidá di-terc.butylester kyseliny L-glutamové (7,77 g) a potom dicyklohexylkarbodiimid (6,2 g). Směs se potom míchá při okolní teplotě po dobu 18 hodin. Směs se zfiltruje a filtrát se promyje nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vodou a 0,5M kyselinou chlorovodíkovou, načež se vysuší a odpaří k suchu. Zbytek se chromatografuje na silikagelu za použití eluční soustavy tvořené směsí hexanu a ethylacetátu v poměru 2:1, načež se z eluátu získá di-terc.butyl-4-nitrobenzylkarbonyl-L-glutamát ve formě oleje.

Výtěžek: 9,7 g (77 %), nukleární magnetickorezonanční spektrum: 8,2(d) 2H,

7,45(d)2H,

6,45(d) 1H, 4,45(m) 1H, 3,15(s) 2H, l,4(d)9H, l,35(s) 9H.

Roztok di-terc.butyl-4-nitrobenzylkarbonyl-L-glutamátu (9,7 g) v ethylacetátu (200 ml) se hydrogenuje v přítomnosti 30% paladia na uhlí (900 mg). Směs se potom zfiltruje přes Celíte a filtrát se odpaří, přičemž se získá žlutý olej (di-terc.butyl-4-aminobenzylkarbonyl-L-glutamát), který se použije bez dalšího čistění.

Nukleární magnetickorezonanční spektrum: 8,23(d) 1H, 6,92(d) 2H, 6,50(d) 2H, 4,86(s) 2H, 4,15(m) 1H, 3,24(s) 2H, 2,22(m) 2H, l,8(m) 2H, l,4(d) 18H, výtěžek: 8,2 g (90 %).

K roztoku di-terc.butyl-4-aminobenzylkarbonyl-L-glutamátu (8,2 g) v ledové kyselině octové (40 ml) a vodě (40 ml) se přidá ethylenoxid (7,1 g). Směs se potom míchá při okolní teplotě po dobu 24 hodin. Roztok se odpaří k suchu a zbytek se opětovně rozpustí v etheru, promyje vodou a organická vrstva se vysuší nad síranem hořečnatým a odpaří, přičemž se získá produkt ve formě oleje (di-terc.butyl-4-/N,N-bis(2-hydroxyethyl)amino/benzylkarbonyl-L-glutamát, 6,3 g), který se použije bez dalšího čistění.

Výtěžek: 6,3 g, nukleární magnetickorezonanční spektrum: 8,16(d) 1H,

7,02(d) 2H, 6,85(d) 2H, 4,l(m) 1H, 3,4(m) 8H, 3,25(s) 2H, 2,25(m) 2H, l,8(m) 2H, l,4(s) 18H.

K roztoku di-terc.butyl-4-/N,N-bis(2-hydroxyethyl)amino/benzylkarbonyl-L-glutamátu (2,88 g) v pyridinu (45 ml) se pod atmosférou argonu po kapkách přidá methansulfonylchlorid

-36CZ 287028 B6 (2,91 ml), přičemž se udržuje teplota nižší než 25 °C. Po ukončení přídavku se roztok míchá po dobu jedné hodiny při teplotě 80 °C. Roztok se potom ochladí a nalije do 10% kyseliny citrónové (500 ml), extrahuje etherem, promyje vodou a organická vrstva se vysuší nad síranem hořečnatým a potom odpaří, přičemž se získá hnědý olej. Tento olej se chromatografuje na silikagelu za použití eluční soustavy tvořené směsí hexanu a ethylacetátu v poměru 2:1, přičemž se získá di-terc.butyl-4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/benzylkarbonyl-L-glutamát ve formě oleje.

Výtěžek: 1,3 g (42 %), nukleární magnetickorezonanční spektrum:

8,19(d) 1H, 7,10(d) 2H, 6,66(d) 2H, 4,10(m) 1H, 3,69(s) 8H, 3,32(s) 2H, 2,2 l(m) 2H, l,9(m) 2H, l,37(d) 18H,

výtěžek: 1,32 g (42 %).

Reakční sekvence pro tento příklad je uvedena v reakčním schématu 8.

Příklad 20

Kyselina N-(4-/N,N-bis-(2-chlorethyl)amino/fenylkarbamoyl)-L-glutamová

Roztok di-terc.butyl-4-/N,N-bis-(2-chlorethyl)amino/fenylkarbamoyl-L-glutamátu (připraven postupem popsaným v příkladu 3) (500 mg) v 98% kyselině mravenčí (10 ml) se ponechá stát při okolní teplotě po dobu 24 hodin. Roztok se potom odpaří k suchu a zbytek se chromatografuje na silikagelu Měrek Art. 9385 za použití eluční soustavy tvořené směsí dichlormethanu, ethylacetátu a kyseliny mravenčí v poměru 7:2:1, přičemž se získá požadovaná sloučenina ve formě oleje, který krystalizuje.

Teplota tání: 117 až 119 °C.

Příklad 21

Kyselina N-(4-/N,N-bis(2-bromethyl)amino/-3-fluorfenylkarbamoyl)-L-glutamová

Roztok dibenzyl-4/N,N-bis(2-bromethyl)amino-3-fluorfenylkarbamoyl-L-glutamátu (0,5 g) v ethylacetátu (10 ml) a 30% paladium na uhlí (100 mg) se míchá pod atmosférou vodíku po dobu 6 hodin. Katalyzátor se odfiltruje a filtrát se odpaří, přičemž se získá olej, tvořící požadovanou sloučeninu.

Nukleární magnetickorezonanční spektrum:

8,6(s) 1H, 7,35(dd) 1H, 7,l-6,8(m) 2H, 6,5(d) 1H, 4,2(m) 1H, 3,7-3,2(m) 8H, 2,4-l,6(m) 4H.

Výchozí látka pro tuto reakci se připraví postupem, který je analogický s postupem popsaným v příkladu 5 s výjimkou spočívající v tom, že se použije thionylbromid namísto thionylchloridu.

Tabulka 9

X

CO-H i ²NH-CO-NH-CH-CH₂-CH₂-CO₂H

Příklad č.	X	R	Teplota tání
22	Cl	F	111 až 114 °C
23	Cl	Cl	olej
24	Cl	CN	105 až 107 °C

Nukleární magnetickorezonanční spektrum sloučeniny 23:

8,6(šir.) 1H, 7,6(m) 1H, 7,2(m) 2H, 4,25(m) 1H, 3,6-3,3(m) 8H, 2,4-l,7(m) 4H.

Výchozí látky a meziprodukty použité při přípravě sloučenin podle příkladů 21 až 24 a jejich vlastnosti jsou uvedeny v následujících tabulkách 10 až 13.

Tabulka 10

R F Cl CN

Teplota tání až 101 °C olej⁺⁾

151 až 154 °C

+) NMR(DMSOd₆: 8,15(d) 1H, 8,05(q) 1H, 7,3(d) 1H, 4,65(t)2H(OH), 3,5(m) 8H.

-38CZ 287028 B6

Tabulka 11

X

Cl

F Cl CN

Teplota tání až 68 °C Olej⁺⁾

106 až 109 °C

Br až 68 °C

+)NMR(CDC1₃): 8,3(d) 1H, 8,l(q) 1H, 7,25(d) 1H, 3,75(t) 4H, 3,6(t) 4H.

Tabulka 12

X	R	Teplota tání (oxalátové soli)
Cl	F	146 až 148 °C
Cl	Cl	118 až 121 °C
Cl	CN	112 až 116°C
Br	F	134 až 136 °C

Tabulka 13

X Cl Cl Cl Br

R F Cl CN

F

Teplota tání až 84 °C olej⁺⁾olej⁴“¹) olej^w>)

+) NMR(CDC1₃): 7,4(m) 1H, 7,3(m) 10H, 7,l(m) 2H, 5,2(s) 2H, 4,6(m), 1H, 3,5-3,4(m)

8H, 2,6-2,0(m) 4H

-39CZ 287028 B6

++) NMR(CDC1₃):	8,25(s) 1H, 7,6(m) 2H, 7,4-7,2(m) 10H, 7,l(d) 1H, 6,2(d)lH(NH), 5,2(s) 2H, 5,l(s) 2H, 5,l(s) 2H, 4,6(m) 1H, 3,7-3,5(m) 8H, 2,7-2,2(m) 4H
+++) NMR:	7,4-6,8(m) 13H, 5,7(d) 1H, 5,2(s) 2H, 5,l(s) 2H, 4,6(m) 1H, 3,7-3,3(m)
5	8H, 2,6-1,9(m) 4H.

Příklady 25 až 32

Způsobem, který je analogický s postupem popsaným v příkladu 1, avšak s výjimkami ío uvedenými dále, se připraví následující sloučeniny.

C0,H η I ²

O-C-NH-C-Z

H

Tabulka 14

Příklad č, ________________-Z

O

II -ch₂-ch₂-c-nh₂o

II

H // ^N

-ch₂-s—/ || \ ^.N

N·^

H

NH₂

-40CZ 287028 B6

Nukleární magnetickorezonanční spektra sloučenin z příkladů 25 až 32 jsou uvedena v následující tabulce 15.

Př. č.	C1CH₂CH₂N-	Aromatika	aCH	ch₂-x	Ostatní
25	3,69(m)8H	6,7-6,9(m)4H	3,97(m)lH	l,79-l,99(m)2H	2,2(t)2H 6,7(bs)lH 7,27(bs)lH 7,89(bs)lH
26	3,70(s)8H	6,70-6,93(-)4H	4,0(m)lH	l,85-2,2(m)2H	2,42(m)2H 3,19(s)3H 7,90(d)lH
27	3,71(s)8H	6,69-7,3 8(m)8H	4,04(m)lH	l,9-2,l(m)2H	2,45(m)2H 2,26(s)3H 7,89(d)lH 9,83(s)lH
28	3,73(s)8H	6,7-6,9(m)4H	4,08(m)lH	2,l-2,27(m)2H	3,03(t)2H 8,03(d)lH 12,79(bs)lH
29	3,69(s)8H	6,72-6,93 (m)4H	4,38(m)lH	3,46-3,8(m)2H	8,12(d)lH
30	3,70(s)8H	6,6-7,6(m)8H	4,05(m)lH	l,8-2,3(m)2H	2,45(m)2H 3,50(s)2H 7,0(d)lH 9,9(s)lH 12,5(šir. s)
31⁺⁾	3,67(s)8H	6,5-8,5(m)8H	4,10(m)lH	l,8-2,3(m)2H	2,5(m)2H
32	3,70(s)8H	6,22-7,2 l(m)	4,03(m)lH	l,8-2,2(m)2H	2,50(m)2H

7,79(d)lH

9,52(s)lH

+) NMR s přidaným CD₃CO₂D

Sloučenina z příkladu 25 se připraví postupem, který je popsán v příkladu 1 s výjimkou spočívající vtom, že se při hydrogenační reakci použije alfa-benzyl-4-/N,N-bis(2chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-glutamin, jehož příprava je popsána dále. K ethylacetátu v hydrogenační směsi se přidá tetrahydrofuran za účelem podpoření rozpuštění výše uvedené alfa-benzylové sloučeniny.

Sloučeniny z příkladů 26 a 27 se připraví postupem popsaným v příkladu 1 hydrogenolýzou meziprodukčního alfa-benzyM—/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-mesylglutaminu resp. alfa-benzyl-4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-(3-methylfenyl)glutaminu.

Sloučenina z příkladu 28 se připraví postupem popsaným v příkladu 1 hydrogenací benzyl/N,N-bis-(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-gama-(5-tetrazolyl)-alfa-amino-L-butyrátu.

Sloučenina z příkladu 28 se rovněž připraví druhou metodou, popsanou bezprostředně dále. Postupuje se stejně jako v příkladu 1 avšak za použití kyseliny (S)-2-amino-4-(lH-l,2,3,4tetrazol-5-yl)máselné (Z. Grzonka a kol. Tetrahedron, 33: 2299-2302, 1977) namísto dibenzylesteru kyseliny L-glutamové při reakci s O-(4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenyl)θ'-(4—nitrofenyl)karbonátem. Tato reakce se provádí v bezvodém dimethylformamidu s 2 ekvivalenty triethylaminu po dobu 20 hodin při teplotě 25 °C. Po odpaření k suchu se zbytek rozpustí v ethylacetátu, promyje zředěnou kyselinou citrónovou, vysuší a odpaří k suchu.

-41CZ 287028 B6

Produkt pozvolna vykrystalizuje z ethylacetátu. Zbytek se rekrystalizuje z ethylacetátu, přičemž se získá sloučenina z příkladu 28.

Teplota tání: 173 až 175 °C.

Sloučenina z příkladu 29 se připraví postupem, který je analogický s postupem podle příkladu 28 pro první přípravu produktu, přičemž se však použije l-/4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonylamino/-l-benzyloxykarbonyl-2-(5-thiotetrazol)ethan namísto benzyl-4/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-gama-(5-tetrazolyl)-alfa-amino-L-butyrátu. Obdobným zpracováním reakční směsi se získá gumovitý produkt, který se přečistí chromatografií na silikagelu za použití eluční soustavy tvořené 4% kyselinou mravenčí v ethylacetátu (objemově).

Sloučenina z příkladu 29 se také připraví druhou metodou, která je uvedena bezprostředně v následujícím textu.

l-Amino-l-karboxy-2-(5-thiotetrazol)ethan (600 mg, 2,89 mM) se suspenduje v bezvodém dimethylformamidu (48 ml) a k získané suspenzi se přidá triethylamin (0,806 ml, 578 mM), načež se suspenze míchá. V jediné dávce a v pevném stavu se potom přidá O-(4-/N,N-bis(2chIorethyl)amino/fenyl)-0^I-4-nitrofenyl)karbonát (1,10 g, 2,89 mM) a roztok se míchá při okolní teplotě po dobu 20 hodin. Dimethylformamid se odstraní za vakua. Zbytek se rozpustí v ethylacetátu a zředěné kyselině citrónové. Ethylacetátová vrstva se promyje vodou, vysuší nad síranem sodným, zfiltruje a odpaří. Získaný surový produkt se chromatografuje na silikagelu za použití eluční soustavy tvořené 4% kyselinou mravenčí v ethylacetátu, přičemž se získá 4-/N,Nbis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonylamino-l-karboxy-2-(5-thiotetrazol)ethan ve formě sklovitého pevného produktu.

Výtěžek: 0,963 g, nukleární magnetickorezonanční spektrum (DMSOd₆): 3,46(dd, 1H),

3,69(s 8H), 3,8(dd, 1H), 4,38(m, 1H), 6,72(d,2H), 6,93(d, 2H), 8,12(d, 1H).

Sloučeniny z příkladů 30 a 31 se připraví postupem popsaným v příkladu 1 hydrogenací alfabenzyl-4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-gama-/3-(benzyloxykarbonylmethyl)fenyl/-glutaminu a alfa-benzyl-4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-gama//3-(5tetrazolyl)fenyl-L-glutaminu.

Sloučenina z příkladu 32 se připraví postupem popsaným v příkladu 1 hydrogenací alfa-benzyl4-/N,N-bis(2-chlorethyI)amino/fenoxykarbonyl-gama-/3-(benzyloxykarbonylamino)fenyl/-Lglutaminu.

Meziprodukty pro použití při přípravě sloučenin z příkladů 25 až 32 alfa-Benzyl-4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyI-L-glutamin použitelný při přípravě sloučeniny z příkladu 25 se připraví postupem popsaným v příkladu 1 z O-(4-/N,Nbis-(2-chlorethyl)amino/fenyl)-O'-(4-nitrofenyl)karbonátu, přičemž se však alfa-benzyl-Lglutamin (L. Zervas a kol. J. Am. Chem. Soc. 87 (1), 99-104, 1965) použije namísto dibenzylestertosylátu kyseliny L-glutamové. Produkt se přečistí mžikovou chromatografií na

-42CZ 287028 B6 silikagelu za použití eluční soustavy tvořené směsí 80 % ethylacetátu a 20 % hexanu. Produkt se získá ve formě bílé pevné látky po rozetření s etherem.

alfa-Benzyl-4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-gama-mesyl-L-glutamin použitelný pro přípravu sloučeniny z příkladu 26 se připraví následujícím způsobem.

K N-Boc-alfa-benzyl-L-glutamátu /E. Klieger a kol., Ann. 673, 196-207, 1964/ (10 mg) v 50 ml bezvodého dichlormethanu se přidá dimethylaminopyridin (DMAP, 3,9 g) a dicyklohexylkarbodiimid (6,73 g). Do reakční baňky se potom zavede methansulfonamid (3,04 g) a v reakci se pokračuje při teplotě 25 °C po dobu 20 hodin. Dichlormethan se odpaří a zbytek se opětovně rozpustí v ethylacetátu. Ethylacetátový roztok se potom promyje 0,25M kyselinou citrónovou a potom vodou, načež se vysuší nad síranem sodným (bezvodým). Po odpaření ethylacetátového extraktu se získá zbytek, který se přečistí na silikagelu mžikovou sloupcovou chromatografií za použití eluční soustavy tvořené nejdříve methylenchloridem, potom 5% methanolem v methylenchloridu a nakonec 10% methanolem v methylenchloridu, načež se z eluátu získá acylsulfonamid chráněný skupinou Boc:

CO₂Bz

I tBoc-NH-CH-CH₂-CH₂-CO-NHSO₂Me (L)

Nukleární magnetickorezonanční spektrum: 1,98(s) 9H, l,98(m) 2H, 2,34(t) 2H, 5,1 l(d) 2H, 7,26(d) 1H, 7,36(s) 5H, 1 l,64(s) 1H.

3,6 g Boc-chráněného acylsulfonamidu se suspenduje v 50 ml ethylacetátu, načež se k získané suspenzi přidá 8 ekvivalentů HC1 ve formě nasyceného roztoku v ethylacetátu (22,4 ml 3,1M roztoku). Výchozí sulfonamid přejde do roztoku a v reakci se pokračuje pod argonovou atmosférou při teplotě 25 °C po dobu 20 hodin. alfa-Benzyl-gama-mesyl-Lglutaminhydrochlorid vzorce:

CO₂Bz

I

Cl.NH₃-CH-CH₂-CH₂-CO-NHSO₂Me se získá ve formě bílého pevného produktu, který se odfiltruje a promyje bezvodým etherem, načež se vysuší v exsikátoru.

Nukleární magnetickorezonanční spektrum: 2,08(m) 2H,

2,52(m) 2H,

3,20(s) 3H, 4,09(t) 1H, 5,15-5,3 5(dd) 2H, 7,39-7,50(m) 5H, asi 9(šir.) 3H.

alfa-Benzyl-4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-mesylglutamin se připraví postupem popsaným v příkladu 1 z O-(4-N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenyl)-O'-(4nitrofenyl)-karbonátu, přičemž dibenzylestertosylát kyseliny L-glutamové se nahradí alfa

-43CZ 287028 B6 benzyl-gama-mesyl-L-glutamin-hydrochloridem. Produkt této reakce se přečistí sloupcovou chromatografií na silikagelu za použití eluční soustavy tvořené 10% kyselinou mravenčí v ethylacetátu (objemově).

alfa-Benzyl-4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-gama-(3-methylfenyl)-L-glutamin použitelný při přípravě sloučeniny z příkladu 27 se připraví následujícím způsobem.

alfa-Benzyl—4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-glutamát se připraví postupem popsaným v příkladu 1 z 0-(4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenyl}-O'-(4-nitrofenyl)-karbonátu, přičemž se však dibenzylester kyseliny L-glutamové nahradí alfa-benzyl-L-glutamátem (Ref. C. Coutsogeorgopoulos a kol. J. Am. Chem. Soc. 83, 1885, 1961). Navíc se reakce provádí v bezvodém dimethylformamidu při teplotě 25 °C po dobu dvou hodin. Získaný produkt se přečistí sloupcovou chromatografií na silikagelu (Měrek Art. 9385) za použití eluční soustavy tvořené nejdříve směsí ethylacetátu a hexanu v poměru 70:30 až postupně 100% ethylacetátem. Nukleární magnetickorezonanční spektrum tohoto produktu je uvedeno v tabulce 17.

K alfa-Benzyl-4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-glutamátu (300 mg) v bezvodém tetrahydrofuranu (5 ml) se přidá 1,1 ekvivalentu triethylaminu. K reakční směsi se pozvolna při teplotě -25 °C přidá Isobutylchlorformiát (0,08 ml, 1,1 ekv.) v bezvodém tetrahydrofuranu (10 ml). Po 15 minutách se přidá 1,1 ekvivalentu (0,08 ml) m-toluidinu v bezvodém tetrahydrofuranu (5 ml). Reakční směs se potom ponechá ohřát na teplotu 25 °C, načež se plynule míchá po dobu 18 hodin. Reakční směs se potom zfiltruje a filtrát se odpaří, přičemž se získaný zbytek přečisti mžikovou sloupcovou chromatografií za použití eluční soustavy tvořené směsí ethylacetátu a hexanu. Po odpaření příslušných frakcí se získá alfa-benzyl-4-/N,N-bis(2chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-gama-(3-methylfenyl)-L-glutamin ve formě bílé krystalické pevné látky. Nukleární magnetickorezonanční spektrum tohoto produktu je uvedeno v tabulce 17.

l-/4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonylamino/-l-benzyloxykarbonyl-2-(5-thiotetrazol)ethan použitelný při přípravě sloučeniny z příkladu 29 se připraví následujícím způsobem.

l-Amino-l-karboxy-2-(5-thiotetrazol)ethan se připraví přidáním beta-chloranilinu (18,50 g, 115,6mmolu) (Sigma Chemical Co.) a 5-thiotetrazolu (11,79 g, 115,6mmolu, připraven postupem popsaným v evropské patentové zveřejněné přihlášce 33965) k 230 ml 2M roztoku hydroxidu sodného, přičemž se tento přídavek provádí za míchání. Reakční směs se potom zahřeje v průběhu 1,5 hodiny z okolní teploty na teplotu 90 °C. Reakční směs se potom ponechá vychladnout na okolní teplotu a potom se ochladí dále na lázni ledu a methanolu. Směs se okyselí na pH 4,0 koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou a míchá ještě po dobu 30 minut. Získaná sraženina se odfiltruje, promyje chladnou vodou a potom etherem a vysuší filtrací a odsáváním, přičemž se získá 6,9 g produktu. Změřením pH matečného louhu se zjistí, že došlo k jeho zvýšení na asi 5,5. Výše popsaný postup se opakuje, přičemž se získá další 2,3 g podíl produktu. Produkt se vysuší za hlubokého vakua.

Nukleární magnetickorezonanční spektrum: 3,3O-3,5O(m) 2H,

4,16-4,22(q) 1H,

7,47(šir.) H₂O vyměň, s NH₂, elementární analýza:

	C(%)	H(%)	N(%)
vypočteno	23,2	4,4	33,8 (+lmol H₂O)
nalezeno	23,1	4,4	33,7 (9,6% H₂O).

-44CZ 287028 B6 l-/4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonylamino/-l-benzyIoxykarbonyl-2-(5-thiotetrazol)ethan se připraví postupem popsaným v příkladu 1 z O-(4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/-fenyl)-O'-(4-nitrofenyl)karbonátu, přičemž se však dibenzylester kyseliny Lglutamové nahradí kyselinou gama-(5-thiotetrazolyl)-alfa-benzyloxykarbonylamino-Lmáselnou (Ref. Z. Grzonka a kol., Tetrahedron Letters 33 2399-2302, 1977). Jako rozpouštědlo se použije bezvodý dimethylformamid a reakce se provede při teplotě 25 °C. Reakční směs se zpracuje po 2 hodinách a produkt se přečistí mžikovou sloupcovou chromatografií na silikagelu za použití eluční soustavy tvořené 2% kyselinou mravenčí ve směsi ethylacetátu a methylenchloridu v objemovém poměru 3:1. Nukleární magnetickorezonanční spektrum tohoto produktu je uvedeno v tabulce 16.

alfa-Benzyl-4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-gama-/3-(benzyloxykarbonylmethyl)fenyl/-L-glutamin použitelný pro přípravu produktu z příkladu 27 se připraví následujícím způsobem.

Benzylester kyseliny 3-aminofenyloctové a kyseliny p-toluensulfonové se připraví přidáním kyseliny 3-aminofenyloctové (10 g) a monohydrátu kyseliny p-toluensulfonové (13,2 g) k benzylalkoholu (27,2 ml) v toluenu (30 ml). Směs se zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem a vytvořená voda se jímá v Dean-Starkově kolektoru. Když veškerá voda oddestilovala, směs se ponechá vychladnout na teplotu 25 °C, načež se zředí diethyletherem a uloží na dobu jedné hodiny na ledovou lázeň. Krystalický p-toluensulfonát se odfiltruje a vysuší v exsikátoru.

Výtěžek: 23,5 g, nukleární magnetickorezonanční spektrum: 2,31 (s) 3H,

3,82(s) 3H,

5,ll(s)2H, 7,ll(d)2H, 7,25-7,45(m) 8H, 7,52(d) 2H.

alfa-Benzyl-4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-gama-/3-(benzyloxykarbonylmethyl)fenyl/-L-glutamin se připraví postupem popsaným v příkladu 27, přičemž se však mtoluidin nahradí benzylesterem kyseliny 3-aminofenyloctové.

alfa-BenzyM-/N,N-bis(2-chlorethyI)amino/fenoxykarbonyl-gama-/3-(5-tetrazolyl)fenyl/-Lglutamin použitelný v příkladu 31 se připraví postupem popsaným v příkladu 27, přičemž se však m-toluidin nahradí 3-(tetrazol-5-yl)anilinem. Výchozí 3-(tetrazol-5-yl)anilin se připraví následujícím způsobem. K roztoku 5-(3-nitrofenyl)tetrazolu (Finnegan W. G., Henry R. A. a Lolquist R., J.A.C.S. 80:3908 (1958) (52 g) v ethanolu (2,5 1) se přidá 10% paladium na uhlí (5 g) a směs se míchá pod atmosférou vodíku po dobu 16 hodin. Katalyzátor se odstraní filtrací a filtrát se odpaří, přičemž se získá požadovaná výchozí látka.

Výtěžek: 40,5 g, teplota tání: 188 až 189 °C.

alfa-Benzyl-4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-gama-/3-(benzyloxykarbonylamino)fenyl/-L-glutamin použitelný v příkladu 32 se připraví postupem popsaným v příkladu 27, přičemž se však m-toluidin nahradí 3-(benzoyloxykarbonylamino)anilinem.

Nukleární magnetickorezonanční spektrum:

C1CH₂N: 3,68(m) 8H, aromatika: 6,68-7,74(m) 1H,

-45CZ 287028 B6

ArCH₂O: 5,12(s) 2H, 5,14(s) 2H, alfa-CH: 4,18(m) 1H, ostatní: l,9-2,15(m) 2H, 2,45(m) 2H, 8,12(d) 1H, 9,7(s) 1H, 9,9(s) 1H.

3-(Benzyloxykarbonylamino)anilin, použitý při přípravě produktu z příkladu 32, se získá následujícím způsobem. K chladnému roztoku (0 °C) m-fenylendiaminu (10 g) v ethylacetátu (200 ml) se přidá vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného (9 g ve 300 ml vody), přičemž tento přídavek se provádí za míchání. Potom se v průběhu deseti minut po kapkách přidá benzylchlorformiát (13,2 ml) v ethylacetátu (100 ml) a směs se míchá při teplotě 0 °C po dobu jedné hodiny, načež se okyselí (na pH2) přidáním 1M vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové. Produkt se extrahuje ethylacetátem (250 ml), promyje solankou, vysuší nad síranem hořečnatým a zahustí za vakua, přičemž se získá olejovitý produkt. Tento olej se chromatografuje na silikagelu Měrek Art. 9385 za použití eluční soustavy tvořené směsí hexanu a ethylacetátu v poměru 7:3, přičemž se získá 8 g meziproduktu ve formě nízkotajícího pevného produktu.

Výtěžek: 36 %, nukleární magnetickorezonanční spektrum:

9,32(s) 1H, 7,30(m) 5H, 6,80(t) 1H, 6,50(m) 1H, 6,12(m) 1H, 5,0(s) 2H, 4,88(s) 2H.

Tabulka 16

X	cich₂ch₂n-	Aromatika	ArCH₂O
ch₂co₂h	3,63(m)8H	6,62-7,31 (m)9H	5,1 l(s)2H
ch₂conh₂	3,71(m)8H	6,7-7,3(m)9H	5,15(s)2H
CH₂CONHSO₂Me	3,71(m)8H	6,7-7,37(m)9H	5,15(s)2H
CH₂CONH-	3,71(m)8H	6,69-7,42(m)13H	5,18(s)lH
ch₂-	3,71(m)8H	6,7-7,37(m)9H	5,17(s)2H
ch₂conh-	3,70(m)8H	6,6-7,6(m)18H	5,10(s)2H 5,17(s)2H
	3,70(s)8H	6,6-8,5(m)13H	5,15(s)2H

ch₂conh-

aCH	ch₂-x	Ostatní
4,14(m)IH	l,8-2,05(m)2H	7,89(d)lH 2,35(m)2H
4,13(m)lH	l,8-2,03(m)2H	2,23(t)2H 6,77(s)lH 7,28(s)lH 8,08(d)lH
4,15(m)lH	l,8-2,l(m)2H	2,49(m)2H 3,19(s)3H 1 l,7(bs)lH 8,l(d)lH
4,19(m)lH	l,9~2,2(m)2H	2,49(m)2H 2,25(s)3H 8,1 l(d)lH 9,83(s)lH
4,23(m)lH	2,l-2,3(m)2H	8,23(m)2H 3,03(t)2H
4,19(m)lH	l,9-2,3(m)2H	2,45(m)2H 3,67(s)2H 8,13(d)lH 9,90(s)lH
4,2(m)lH	l,9-2,3(m)2H	2,15(m)2H 8,15(d)lH 10,2(s)lH

-46CZ 287028 B6

Příklad 33

Kyselina N-(4-/N,N-bis(2-jodethyl)amino/fenoxykarbonyl)-L-glutamová

Di-terc.butylester kyseliny 4-/N,N-bis(2-jodethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-glutamové (188 mg) (viz reakční schéma 9 - sloučenina 14) se suspenduje v kyselině trifluoroctové (4 ml) a získaná suspenze se míchá po dobu 30 minut při okolní teplotě. Kyselina trifluoroctová se odežene za sníženého tlaku a zbylý olej se zředí ethylacetátem (3 ml) a odpaří, přičemž se získá kyselina 4-/N,N-bis(2-jodethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-glutamová ve formě solvátu s 1,4 kyselinou trifluoroctovou a 0,8 ethylacetátem.

Výtěžek: 162 mg (82 %),

(sloučenina 15 z reakčního schématu 9), nukleární magnetickorezonanční spektrum:

1,84-2,0 l(m) 1H, 2,36(m) 2H, 3,31(t)4H, 3,72(t)4H, 4,02(m) 1H, 6,66(d) 2H, 6,94(d) 2H, 7,92(d) 1H.

Di-terc.butylester kyseliny 4-/N,N-bis(2-jodethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-glutamové, který je použit jako meziprodukt, se připraví následujícím způsobem.

a) Roztok di-terc.butylesteru kyseliny bis(2-mesyloxyethyl)amino/fenoxykarbonyl-Lglutamové (1,0 g) (viz reakční schéma 9 - sloučenina 11) v acetonitrilu (50 ml) se míchá s jodidem sodným (1,0 g) při teplotě 70 °C po dobu 20 hodin. Reakční směs se zfiltruje a filtrát se zahustí za vakua. Zbytek se chromatografuje na silikagelu za použití eluční soustavy tvořené směsí ethylacetátu vcyklohexanu v poměru 1:5, přičemž se zeluátu získá di-terc.butylester kyseliny 4-/N,N-bis(2-jodethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-glutamové (viz reakční schéma 9 sloučenina 14) ve formě oleje.

Výtěžek: 0,75 g (68 %), nukleární magnetickorezonanční spektrum:

l,41(s)9H, l,43(s) 9H, l,91-l,95(m) 1H, 2,34(m) 2H, 3,31(t)4H, 3,72(t)4H, 4,00(m) 1H, 6,67(d) 2H, 6,93(d) 2H, 7,9 l(d) 1H.

b) Di-terc.butylester kyseliny bis(2-mesyloxyethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-glutamové

Roztok di-terc.butylesteru kyseliny 4-/N,N-bis(2-hydroxyethyl)amino/fenoxykarbonyl-Lglutamové (2,53 g) (získaný postupem v příkladu 8, viz také reakční schéma 4) v pyridinu (9 ml) se míchá s methansulfonylchloridem (1,8 ml) při teplotě 2 °C po dobu 20 minut a potom ještě při teplotě 80 °C po dobu 11 minut. Reakční směs se potom rozdělí mezi ethylacetát a 10% vodný roztok kyseliny mravenčí. Organická fáze se oddělí, promyje vodou, vysuší nad síranem sodným a odpaří k suchu. Zbytek se chromatografuje na silikagelu za použití eluční soustavy tvořené

-47CZ 287028 B6 směsí ethylacetátu a dichlormethanu v poměru 1:9, načež se zeluátu získá di-terc.butylester kyseliny 4-/N,N-bis(2-mesyloxyethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-glutamové (sloučenina 11 v reakčním schématu 9) ve formě oleje.

Výtěžek: 0,95 g (28 %, nukleární magnetickorezonanční spektrum:

l,41(s) 9H, l,43(s) 9H, l,8-l,99(m) 1H, 2,34(m) 2H, 3,16(s) 6H, 3,72(t) 4H, 3,9(m) 1H, 4,3 l(t) 1H, 4,31(t)4H, 6,78(d) 2H, 6,92(d) 2H, 7,9(d) 1H.

Příklad 34

Kyselina N-(4-/N,N-bis(2-bromethyl)amino/fenoxykarbonyl)-L-glutamová

Di-terc.butylester kyseliny 4-/N,N-bis(2-bromethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-glutamové (133 mg) (viz reakční schéma 9 - sloučenina 12) se suspenduje v kyselině trifluoroctové a získaná suspenze se míchá po dobu 30 minut při okolní teplotě. Kyselina trifluoroctová se odežene za sníženého tlaku a zbylý olej se zředí ethylacetátem (3 ml), přičemž se získá kyselina 4-/N,N-bis(2-bromethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-glutamová ve formě solvátu s 1,3 kyselinou trifluoroctovou a 0,9 ethylacetátem.

Výtěžek: 126 mg (80 %)

(viz reakční schéma 9 - sloučenina 13), nukleární magnetickorezonanční spektrum:

l,83-2,01(m) 1H, 2,36(m) 2H, 3,58(t) 4H, 3,76(t) 4H, 4,03(m) 1H, 6,7 l(d) 2H, 6,94(d) 2H, 7,92(d) 1H.

Di-terc.butylester kyseliny 4-/N,N-bis(2-bromethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-glutamové, použitý jako meziprodukt, se připraví následujícím způsobem.

Roztok di-terc.butylesteru kyseliny bis(2-mesyloxyethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-glutamové (0,48 g) (sloučenina 11 v reakčním schématu 9, získaná postupem popsaným v příkladu 8; viz rovněž reakční schéma 4) v acetonitrilu (30 ml) se míchá s bromidem lithným (0,26 g) při teplotě 70 °C po dobu 22 hodin. Reakční směs se zfiltruje a filtrát se zahustí za vakua. Zbytek se chromatografuje na silikagelu za použití eluční soustavy tvořené směsí ethylacetátu a dichlormethanu v poměru 1:5, načež se z eluátu získá di-terc.butylester kyseliny 4-/N,N-bis(2bromethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-glutamové (sloučenina 12 v reakčním schématu 9) ve formě oleje.

Výtěžek: 0,37 g (83 %),

-48CZ 287028 B6 nukleární magnetickorezonanční spektrum:

l,41(s)9H, l,43(s) 9H, l,8-l,98(m) 1H, 2,34(m) 2H, 3,58(t)4H, 3,76(t)4H, 3,97(m) 4H, 6,72(d) 2H, 6,93(d) 2H, 7,93(d) 1H.

Příklad 35

N-(4-/N,N-bis-(2-chlorethyl)amino/-2-fluorfenylkarbamoyl)-L-glutamát

Požadovaná sloučenina mající následující nukleární magnetickorezonanční spektrum (DMSO):

se připraví z meziprodukčního karbamoyl-L-glutamátu, majícího (DMSO):

8,0(s), 1H, 7,65(t) 1H, 6,6(m) 3H, 4,2(m)3H, 3,7(s) 8H, 2,28(m) 2H, l,8(m) 2H, dibenzyl-4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/-2-fluorfenylnásledující nukleární magnetickorezonanční spektrum 7,62(t) 1H, 7,35(s) 10H, 6,8(d) 1H, 6,57(m) 2H, 5,l(d)4H, 4,33(m) 1H, 3,7(s) 8H, 2,43(m) 2H, 2,0(m) 2H,

způsobem, který je analogický s odpovídajícím stupněm příkladu 5.

Meziprodukt se připraví následujícím způsobem.

Ethylenoxid (6,6 g) se přidá k 3-fluor-4-nitroanilinu (1,3 g) v ledové kyselině octové (30 ml), načež se získaná reakční směs udržuje v uzavřené baňce při okolní teplotě po dobu 72 hodin. Roztok se odpaří za sníženého tlaku na polovinu svého původního objemu, zbytek se zředí nasyceným vodným roztokem chloridu sodného a třikrát extrahuje ethylacetátem. Ethylacetátové extrakty se sloučí, promyjí nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a odpaří, načež se zbytek přečistí mžikovou sloupcovou chromatografií na silikagelu. Po eluci hexanem obsahujícím 50 % (obj./obj.) ethylacetátu za účelem odstranění nezreagované výchozí látky a monosubstituovaného produktu poskytne eluce ethylacetátem 2',2'-(3-fluor-4-nitroanilino)diethanol.

Teplota tání: 99 až 101 °C.

-49CZ 287028 B6

Takto získaný produkt (280 mg) se rozpustí v dichlormethanu (7,5 ml), načež se k roztoku přidá pyridin (0,1 ml) a roztok se ochladí na lázni ledu a vody. Potom se za míchání přidá po kapkách thionylchlorid (0,25 ml). Po ukončení tohoto přídavku se reakční směs zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem po dobu 1 hodiny, načež se ponechá při okolní teplotě po dobu 20 hodin. Roztok se zředí dichlormethanem (10 ml) a třikrát promyje vodou, vysuší nad síranem sodným, odpaří a zbytek se rekiystalizuje z methanolu, přičemž se získá /N,N-bis(2-chlorethyl/-3-fluor4-nitroanilin.

Teplota tání: 97 až 98 °C.

Takto získaný produkt (200 mg) se míchá v tetrahydrofuranu (7,5 ml) po dobu 16 hodin pod vodíkovou atmosférou v přítomnosti paladia na uhlí (20 mg 5% paladia na uhlí (hmotnostně)). Po ukončení hydrogenace se hydrogenační katalyzátor odfiltruje a filtrát se odpaří. Rezultující zbytek se rozpustí v minimálním objemu methanolu a surový produkt se vysráží přidáním přebytku diethyletheru nasyceného chlorovodíkem. Po rekrystalizaci ze směsi methanolu a diethyletheru se získá 4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino-2-fluoraniliniumchlorid.

Teplota tání: 195 až 200 °C (za rozkladu).

Rezultující produkt se převede na požadovaný meziprodukt postupem, který je analogický s odpovídajícím stupněm v příkladu 5.

Příklady 36 až 43

Chemické struktury a elementární analýzy sloučenin z příkladů 36 až 43 jsou uvedeny v tabulce 17.

Sloučeniny uvedené v tabulce 17 se připraví postupy popsanými v příkladu 16. Takto se sloučenina z příkladu 36 připraví náhradou benzyl^l-aminobenzoátu (Aldrich Chemical Co. Ltd.) za anilin v příkladu 16. Obdobně se připraví sloučeniny z příkladů 37 až 43 náhradou benzyl-4-aminobenzoátu, sek.butylaminu, n-propylaminu, iso-propylaminu, cyklohexylaminu, benzylaminu nebo p-benzyloxyanilinu za anilin v příkladu 16.

Tabulka 17

COOH cich₂ch₂ cich₂ch₂ '

OCONHCH ch₂ch₂v

Příklad č. W Vypočteno(%)Nalezeno(%)

	C	H	N	C	H	N
36	-CO-NH-p-C₆H₅COOH	51,5	5,26	7,83	51,7	5,10	7,50
37	-CO-NH-n-C₄H₉	51,9	6,32	9,09	52,0	6,38	8,97
38	-CO-NH-sec-C₄H₉	51,9	6,32	9,09	52,2	6,34	9,09
39	-CO-NH-n-C₃H₇	50,9	6,07	9,37	50,6	6,35	8,95
40	-CO-NH-i-C₃H₇	50,9	6,07	9,37	51,1	6,07	9,40
41	-CO-NH-C₆H_u	54,1	6,40	8,60	54,3	6,73	8,72
42	-co-hn-ch₂c₆h₅	55,6	5,48	8,46	56,0	5,52	8,21
43	-CO-NH-p-C₆H₅OH	53,0	5,06	8,43	53,0	5,24	7,90

-50CZ 287028 B6

Příklad 44

Kyselina 4-(4-N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenylkarbamoyl)-L“glutamová

Roztok meziprodukčního dibenzyl-4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenylkarbamoyl-L-glutamátu (1,138 g) v dimethylformamidu (15 ml) se hydrogenuje v přítomnosti 10% paladia na uhlí po dobu 16 hodin. Po filtraci a odpaření za vakua se zbytek rozpustí v chloroformu (20 ml). Po 18 hodinách se vyloučená sraženina odfiltruje a vysuší za vakua, přičemž se získá 4-/N,N-bis-(2chlorethyl)amino/fenylkarbamoyl-L-glutamová. Po rekrystalizaci ze směsi acetonu a chloroformu se získá produkt ve formě mikroskopických tyčinek.

Teplota tání: 116 až 118 °C, nukleární magnetickorezonanční spektrum (CD3COCD3): 8,0(s) 1H,

7,2(d)2H,

6,6(d) 2HNH, 4,4(m) 1H, 3,6(m) 8H, 2,5-l,9(m) 4H.

Dibenzylový meziprodukt se připraví následujícím způsobem (viz reakční schéma 10)

Dibenzylglutamát-p-toluensulfonát (dostupný u firmy Bachem, Velká Británie, 0,25 g) se rozpustí vbezvodém methylenchloridu (10 ml) pod atmosférou argonu a roztok se ochladí na teplotu 0 °C. K roztoku se přidá pyridin (0,162 ml) a potom rychle fosgen v toluenu (1,93M, 0,311 ml). Roztok se míchá při teplotě 0 °C po dobu 2 hodin, načež se přidá pyridin (0,05 ml) a potom v jediné porci 4-/N,N-bis(chlorethyl)amino/aniliniumchlorid. Získaná směs se míchá po dobu 10 minut při teplotě 0 °C a potom po dobu 18 hodin při okolní teplotě. Reakční směs se potom zředí ethylacetátem a vodou. Organická vrstva se potom promyje zředěnou kyselinou citrónovou (dvakrát), vodou a nasycenou solankou, načež se vysuší a odpaří, přičemž se získá požadovaný dibenzylový meziprodukt ve formě pevné látky.

Uvedený dibenzylový meziprodukt může být alternativně připraven následujícím způsobem.

K roztoku trifosgenu (1 g) v chloroformu (80 ml) se při teplotě 10 °C přidá 4-/N,N-bis-(2chlorethyl)amino/anilinium chlorid (2,7 g). Při udržování teploty 10°C se přidá triethylamin (4,15 ml) a získaná směs se míchá a ponechá ohřát na okolní teplotu po dobu 15 minut. Ktéto směsi se přidá v jedné porci dibenzylglutamáttosylát a triethylamin (1,7 ml). Po 1,5 hodině při okolní teplotě se směs zředí chloroformem (100 ml), dvakrát promyje vodou, vysuší a odpaří k suchu. Zbytek se chromatografuje na silikagelu Měrek Art. 9385 za použití eluční soustavy tvořené směsí ethylacetátu a hexanu, přičemž se získá dibenzyl-4-/N,N-bis(2chlorethyl)amino/-fenylkarbamoyl-L-glutamát.

Výtěžek: 2,5 g, teplota tání: 119 až 122 °C.

Příklad 45

4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenylkarbamoyl-gama-/N(3-karboxymethyl)anilino/-L-glutamát (sloučenina 7 v reakčním schématu 11)

-51CZ 287028 B6

Tato sloučenina se připraví následujícím způsobem (viz reakční schéma 11). Roztok meziproduktu (sloučenina 6 v reakčním schématu 11, 1 g) ve 20 ml tetrahydrofuranu se hydrogenuje v přítomnosti 30% paladia na uhlí (100 mg) po dobu 4 hodin. Směs se potom zfiltruje přes Celíte a odpaří, přičemž se získá hnědý olej, který se potom přečistí mžikovou sloupcovou chromatografií za použití 1% a 3% směsi kyseliny mravenčí a ethylacetátu jako eluční soustavy, načež se odpaření příslušných frakcí a působení etheru získá 300 mg požadované sloučeniny.

Nukleární magnetickorezonanční spektrum:

C1CH₂CH₂N: 3,66(s) 8H, aromatika: 6,66-7,46(m) 8H, alfa-CH: 4,22(m) 1H, ostatní: l,66-2,06(m) 2H, 2,39(m) 2H, 3,49(s) 2H, 6,29(d) 1H, 8,33(s) 1H, 9,93(s) 1H, 12,5(šir.s) 2H.

Meziprodukt se připraví následujícím způsobem.

a) Benzylester kyseliny 3-aminofenyloctové a kyseliny p-toluensulfonové se připraví přidáním kyseliny 3-aminofenyloctové (10 g) a monohydrátu kyseliny p-toluensulfonové (13,2 g) k benzylalkoholu (27,2 ml) v toluenu (30 ml). Získaná směs se zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem, přičemž se vytvořená voda jímá v Dean-Starkově kolektoru. Když byla oddestilována veškerá voda, směs se ponechá vychladnout na teplotu 25 °C, načež se zředí diethyletherem a uloží na ledovou lázeň po dobu 1 hodiny. Krystalický p-toluensulfonát se odfiltruje a produkt se vysuší v exsikátoru.

Výtěžek: 23,5 g, nukleární magnetickorezonančn í spektrum: 2,31 (s) 3 H,

3,82(s) 2H, 5,ll(s)2H, 7,U(d)2H, 7,25-7,45(m) 8H, 7,52(d) 2H.

b) N-Boc-alfa-benzyl-L-glutamát (5 g) ve 20 ml bezvodého dimethylformamidu o teplotě 5 °C se zahřívá s hydroxybenzothiazolem (HOBT, 1,1 ekv., 2,45 g) a reakční směs se míchá při této teplotě po dobu 10 minut. Potom se přidá Dicyklohexylkarbodiimid (DCCI, 1,1 ekv., 3,37 g) a reakční směs se míchá po dobu dalších 10 minut při teplotě 5 °C, načež se ponechá ohřát na teplotu 25 °C a míchá při této teplotě po dobu dalších 45 minut. Benzylester kyseliny 3-aminofenyloctové a p-toluensulfonové (produkt získaný v reakčním stupni a)) (1,1 ekv., 6 g) společně s 1,1 ekvivalentu triethylaminu (2,23 ml) v 10 ml bezvodého dimethylformamidu se přidají k reakční směsi a reakční směs se míchá při teplotě 25 °C po dobu dalších 20 hodin. Sraženina dicyklohexylmočoviny se potom odfiltruje a tetrahydrofuran se odežene odpařením. Zbytek se potom opětovně rozpustí v ethylacetátu. Ethylacetátový roztok se potom promyje vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a potom solankou, načež se vysuší nad síranem sodným (bezvodým). Po odpaření ethylacetátového extraktu se získá zbytek, který se potom přečistí mžikovou sloupcovou chromatografií za použití eluční soustavy tvořené 30%, 40% a 50% ethylacetátem v hexanu. Po odpaření příslušných frakcí se získá 5 g produktu (sloučenina 4 v reakčním schématu 11).

Nukleární magnetickorezonanční spektrum: 1,3 9(s) 9H, l,81-2,10(m) 2H,

2,3 8(m) 2H,

3,69(s) 8H, 4,03(m) 1H,

-52CZ 287028 B6

5,12(m)4H,

6,92(d) 1H,

7.2 l(m) 1H,

7.3 5(m) 11H,

7,42(d) 1H, 7,52(s) 1H, 9,89(s) 1H.

Produkt získaný vreakčním stupni b) se suspenduje v 10 ml etheru a 5 ml dichlormethanu (posledně uvedené rozpouštědlo je přidáno jako solubilizační promotor) a k suspenzi se přidá 8 ekvivalentu chlorovodíku ve formě nasyceného roztoku chlorovodíku v etheru. Reakční směs se potom míchá po dobu 20 hodin při teplotě 25 °C. V tomto stádiu má produkt formu neutišitelného oleje. Ether se potom odpaří a zbytek se dvakrát azeotropně destiluje s toluenem, načež se přidá ether, který se potom odpaří, přičemž se získá 5 g produktu (sloučenina 5 v reakčním schématu 11) ve formě žluté pěny.

Nukleární magnetickorezonanční spektrum (CDC1₃): 2,35(m) 2H,

2,65(m) 2H,

3,50(s) 2H, 4,22(šir.s) 1H, 5,0 l(s) 2H, 6,8-7,6(m) 14H, 8,65(šir.s) 3H, 9,35(s) 1H.

d) K roztoku obsahujícímu 1 g 4-/N,N-bis-(2-chlorethyl)amino/aniliniumchloridu se při teplotě 5 °C přidá 1,1 ekvivalent (0,66 g) karbonyldiimidazolu ve 20 ml bezvodého tetrahydrofuranu. Reakční směs se potom míchá při teplotě 5 °C po dobu 15 minut, načež se přidá 1 ekvivalent (1,84 g) produktu získaného vreakčním stupni c) s 1,1 ekvivalentem (0,56 ml) triethylaminu v 10 ml bezvodého tetrahydrofuranu. Směs se míchá po dobu dalších dvou hodin při teplotě 25 °C. Triethylaminhydrochlorid se potom odstraní filtrací a tetrahydrofuranový filtrát se odpaří a zbytek se opětovně rozpustí v ethylacetátu. Ethylacetátový roztok se potom promyje vodou, dále 0,25M roztokem kyseliny citrónové a nakonec solankou, načež se vysuší nad síranem sodným (bezvodým). Po odpaření ethylacetátu se získá zbytek, který se přečistí mžikovou chromatografíí za použití eluční soustavy tvořené 30%, 40% a 50% roztokem ethylacetátu v hexanu. Po odpaření příslušných frakcí eluátu se získá požadovaný meziprodukt (sloučenina 6 v reakčním schématu 11).

Nukleární magnetickorezonanční spektrum:

C1CH₂CH₂N: 3,65(s) 8H, aromatika: 6,63-7,5(m) 18 H, ArCH₂O: 5,10(s) 2H, 5,12(s) 2H, alfa-CH: 4,32(m) 1H, ostatní: l,83-2,13(m) 2H, 2,4l(m) 2H, 6,42(d) 1H, 8,25(s) 1H, 9,9l(s) 1H.

Příklad 46 gama-(3,5-Dikarboxy)anilid kyseliny 4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-Lglutamové

Opakuje se postup popsaný v příkladu 16 za použití gama-(3,5-dikarboxybenzyl)anilidu kyseliny 4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-glutamové namísto gama-anilidu kyseliny alfa-benzyl-4-(N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-glutamové, přičemž se

-53CZ 287028 B6 získá gama-(3,5-dikarboxy)anilid kyseliny 4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-Lglutamové ve formě bezbarvých krystalů.

Teplota tání: 167 až 170 °C, elementární analýza:

C(%) H(%) N(%) vypočteno 49,6 4,87 6,68 nalezeno 49,7 4,9 6,7.

gama-(3,5-dikarboxybenzyl)anilid kyseliny alfa-benzyl-4-benzyM—/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-glutamové se získá postupem, který je analogický s postupem popsaným v příkladu 16 pro gama-anilino-derivát.

Reakční schéma 1

-54CZ 287028 B6

Reakční schéma 2

OH

-55CZ 287028 B6

Reakční schéma 3

OH

-56CZ 287028 B6

Reakční schéma 4

Cl, Br, I, OSO₂Me

-57CZ 287028 B6

Reakční schéma 5

CO

O

X

Z

X

O

C4

O z

³co

-58CZ 287028 B6

Reakční schéma 6

CONHPh

CO₂Bz

CONHPh

-59CZ 287028 B6

Reakční schéma 7

NHCONH

-60CZ 287028 B6

Reakční schéma 8

-61CZ 287028 B6

Reakční schéma 9

-62CZ 287028 B6

Reakční schéma 10

NI-ICONH

-63CZ 287028 B6

Reakční schéma 11

-64CZ 287028 B6

Prekurzory jako substráty pro karboxypeptidázu G2

Cl

X-CO-Glu

Cl

X Km (μΜ)

+)	3,4
0	1,9
NH	3
ch₂	16

+) z WO 88/07378

Potence léčivých látek vytvořených z jejich prekurzorů

X-CO-Glu

Účinnost po 1 h léči vé látky proti kolo rektálním nádorovým známá⁺⁾ nová

R¹Cl Cl I

Cl Cl Cl Cl

Cl buňkám (LoVo)- IC50V

R²	R³	X	μΜ
Cl	H	-	vyšší, než 500
mesyl	H	-	86
I	H	0	0,26
Cl	Me	0	0,75
Cl	F	NH	2,38
Cl	H	0	0,3-3
Cl	H	NH	0,3-3
Cl	H	ch₂	40

+) z WO 88/07378

-65CZ 287028 B6

Srovnávací údaje týkající se poločasu léčivé látky v pufru a plazmě (z nahé myši)

R

X-CO-Glu

	Prekurzor léčivé látkv	Poločas 11/2 (min)
R	R²	X	Pufr	Plazma
známý⁰
	Cl	mesyl	-	17	30
nový	Cl	Cl	0	4,5	kratší ± než 5^{1 2)}
	Cl	Cl	NH	2,8	kratší ± než 5²⁾
	I	I	0	0,3	—

1) zW0 88/07878

2) nedetekována při 5 min (nejkratší měřitelný čas)

Srovnávací údaje týkající se poločasu léčivé látky

R²

X

Poločas 11/2 (min)

NaC10₄ myši

R¹

známý⁰	Cl	Cl	-	324	97
nový	Cl	Cl	O	13	kratší ± než 5°
	Cl	Cl	NH	8	kratší ± než 5²⁾

1) z WO 88/07878

2) nedetekována při 5 min (nejkratší měřitelný čas)

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Deriváty dusíkatého yperitu, které jsou prekurzorovými substráty pro karboxypeptidázy G a které mají obecný vzorec I ve kterém

R¹ a R² každý nezávisle znamená atom chloru, atom bromu, atom jodu, skupinu OSO₂Me nebo OSO₂fenyl, kde fenylový zbytek je případně substituován 1,2,3,4 nebo 5 substituenty, které jsou nezávisle zvoleny z množiny zahrnující alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, atom halogenu, skupinu -CN a skupinu -NO₂,

R^la a R^2a každý nezávisle znamená atom vodíku, alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy nebo halogenalkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy,

R³ a R⁴ každý nezávisle znamená atom vodíku, alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy nebo halogenalkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy,

R^5a, R^5b, R^5c a R^5d každý nezávisle znamená atom vodíku, alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, která případně obsahuje jednu dvojnou vazbu nebo jednu trojnou vazbu, alkoxy-skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, atom halogenu, kyanoskupinu, skupinu -NH2, skupinu -CONR⁷R⁸, ve které R⁷ a R⁸ mají níže uvedený význam, skupinu -NH-alkyl, ve které alkylový zbytek obsahuje 1 až 4 uhlíkové atomy, skupinu -N-(alkyl)2, ve které každý alkylový zbytek obsahuje 1 až 4 uhlíkové atomy, a alkanoylovou skupinu obsahující 2 až 5 uhlíkových atomů, nebo

R^5a a R^5b společně znamenají

a) alkylenovou skupinu obsahující 4 uhlíkové atomy, která případně má jednu dvojnou vazbu,

b) alkylenovou skupinu obsahující 3 uhlíkové atomy nebo

c) skupinu -CH=CH-CH=CH-, skupinu -CH=CH-CH₂- nebo skupinu -CH₂CH=CH-, přičemž každá z těchto skupin je případně substituována 1,2,3 nebo 4 substituenty, z nichž každý je nezávisle zvolen z množiny zahrnující alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, alkoxy-skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, atom halogenu, kyano-skupinu, nitro-skupinu, alkanoylovou skupinu obsahující 2 až 5 uhlíkových atomů a skupinu -CONR⁷R⁸, ve které R⁷ a R⁸ mají níže uvedené významy,

X znamená atom kyslíku, skupinu NH nebo skupinu -CH₂-67CZ 287028 B6

Y znamená atom kyslíku,

Z znamená skupinu -V-W, ve které V znamená skupinu CH₂-T-, ve které T znamená skupinu -CHr-, -O-, -S-, -(SO)- nebo -(SO₂)-, s výhradou spočívající v tom, že když V jako druhý atom obsahuje atom síry nebo atom kyslíku, potom W je jiný než -COOH, přičemž uvedená skupina V případně dále nese na uhlíku jeden nebo dva substituenty Q¹ nebo/a Q², přičemž Q¹ a Q² každý nezávisle znamená alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy nebo atom halogenu, nebo když Q¹ a Q² jsou vázány k přilehlým uhlíkovým atomům, potom mohou Q¹ a Q² dodatečně znamenat alkylenovou skupinu, obsahující 3 nebo 4 uhlíkové atomy, která je případně substituována 1, 2, 3 nebo 4 substituenty, které jsou nezávisle zvoleny z množiny zahrnující alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy a atom halogenu, a

W znamená

A) skupinu COOH,

B) skupinu -(C=O)-O-R⁶, ve které R⁶ znamená alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, cykloalkylovou skupinu obsahující 3 až 6 uhlíkových atomů nebo arylovou skupinu definovanou níže v C),

C) skupinu -(C=O)-NR⁷R⁸, ve které R⁷ a R⁸ každý nezávisle znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, cykloalkylovou skupinu obsahující 3 až 6 uhlíkových atomů, arylovou skupinu, heteroarylovou skupinu připojenou k dusíku přes uhlík nebo aralkylovou skupinu obsahující 7 až 9 uhlíkových atomů, přičemž arylová skupina znamená fenylovou skupinu, heteroarylová skupina znamená 5- nebo 6-člennou kruhovou skupinu obsahující 1 až 3 heteroatomy zvolené z množiny zahrnující atom dusíku a atom síry, samotný aiylový zbytek, heteroarylový zbytek a arylový zbytek aralkylové skupiny může být na uhlíku substituován 1 až 4 substituenty zvolenými z množiny zahrnující skupinu -COOH, skupinu -OH, skupinu NH₂, skupinu -CH₂-NH₂, skupinu -(CH₂)_M-COOH, tetrazol-5-ylovou skupinu a skupinu -SO₃H a alkylový zbytek může případně nést methylovou skupinu,

D) skupinu -SO₂NHR⁹, ve kterém R⁹ má význam uvedený pro R⁷ a navíc znamená skupinu -CF₃, skupinu -CH₂CF₃ nebo výše uvedenou arylovou skupinu,

E) skupinu SO₃R¹⁰, ve které R¹⁰ znamená atom vodíku, alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů nebo cykloalkylovou skupinu obsahující 3 až 6 uhlíkových atomů,

F) skupinu PO₃R¹⁰R¹⁰, ve které symboly R¹⁰, které mohou být stejné nebo odlišné, mají výše uvedený význam,

G) tetrazol-5-ylovou skupinu,

H) skupinu -CONH-SO₂R^h, ve které R¹¹ znamená

a) cykloalkylovou skupinu obsahující 3 až 7 uhlíkových atomů,

b) alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, která je případně substituována substituenty zvolenými z množiny zahrnující níže definovanou arylovou skupinu, alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, skupinu CF₃ nebo atom halogenu a

c) perfluoralkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, přičemž arylová skupina znamená fenylovou skupinu nebo fenylovou skupinu mající 1 až 5 substituentů, které jsou zvoleny z množiny zahrnující atom halogenu, skupinu

-68CZ 287028 B6

-NO₂, skupinu -CF₃, alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, alkoxy-skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, skupinu -NH₂, skupinu -NHCOCH3, skupinu -CONH₂, skupinu -OCH₂COOH, skupinu -NH-alkyl, ve které alkylový zbytek obsahuje 1 až 4 uhlíkové atomy, skupinu -N-(alkyl)₂, ve které každý alkylový zbytek obsahuje 1 až 4 uhlíkové atomy, skupinu -NHCOOalkyl, ve které alkylový zbytek obsahuje 1 až 4 uhlíkové atomy, skupinu -OH, skupinu -COOH, skupinu -CN a skupinu -COO-alkyl, ve které alkylový zbytek obsahuje 1 až 4 uhlíkové atomy, a

I) skupinu -M-Het, ve které M znamená S, SO nebo SO₂ a Het znamená 5- nebo 6členný heterocyklický aromatický kruh, který je připojen k M přes uhlíkový atom aromatického kruhu, přičemž uvedený aromatický kruh obsahuje 1, 2, 3 nebo 4 heteroatomy zvolené z množiny zahrnující atom kyslíku, atom dusíku a atom síry a je případně substituován na uhlíkových atomech kruhu 1, 2, 3 nebo 4 substituenty zvolenými z množiny zahrnující skupinu -OH, -SH, -CN, -CF₃, NH₂ a atom halogenu, a soli uvedených sloučenin obecného vzorce I, s výhradou spočívající v tom, že do rozsahu sloučenin obecného vzorce I nespadají kyselina 2-(2-/4-/bis-(2-chlorpropyl)amino/fenyl/acetylamino)pentandiová,

5-methylester kyseliny 2-(2-/4-/bis-(2-chlorethyl)amino/fenyl/acetylamino)pentandiové, kyselina 2-(2-/4-/bis-(2-chlorethyl)amino/fenyl/acetylamino)pentandiová,

5-ethylester kyseliny 2-(2-/4-/bis-(2-chlorethyl)amino/fenyl/acetylamino)pentandiové a kyselina 2-(2-/4-/bis-(2-chlorethyl)amino/fenyl/acetylamino)-4-karbamoylmáselná.
2. Deriváty dusíkatého yperitu podle nároku 1 obecného vzorce I, ve kterém R¹ a R² nezávisle znamenají atom jodu, atom bromu, atom chloru, skupinu OSO₂Me a skupinu OSOr-fenyl, ve které je fenylový zbytek substituován v poloze 2 nebo/a 4 1 nebo 2 substituenty definovanými v nároku 1.
3. Deriváty dusíkatého yperitu podle nároku 1 nebo nároku 2 obecného vzorce I, ve kterém R¹a R² nezávisle znamenají skupinu -CH₃ nebo atom vodíku.
4. Deriváty dusíkatého yperitu podle některého z předcházejících nároků obecného vzorce I, ve kterém R³ a R⁴ nezávisle znamenají atom vodíku, methylovou skupinu a skupinu CF₃.
5. Deriváty dusíkatého yperitu podle některého z předcházejících nároků obecného vzorce I, ve kterém R^5a a R^5d nezávisle znamenají atom vodíku, atom fluoru, atom chloru, methylovou skupinu, skupinu -CONH₂ a skupinu CN.
6. Deriváty dusíkatého yperitu podle některého z předcházejících nároků obecného vzorce I, ve kterém R^5a až R^5d nezávisle znamenají atom vodíku.
7. Deriváty dusíkatého yperitu podle některého z předcházejících nároků obecného vzorce I, ve kterém X znamená atom kyslíku nebo skupinu NH.

-69CZ 287028 B6
8. Deriváty dusíkatého yperitu podle některého z předcházejících nároků obecného vzorce I, ve kterém V je zvolen z množiny zahrnující skupinu -CH2-CH2 a když W znamená tetrazol-5ylovou skupinu, potom také skupinu -CH₂-S-.
9. Deriváty dusíkatého yperitu podle některého z předcházejících nároků obecného vzorce I, ve kterém W má významy uvedené v definicích A), B), C) G) a I).
10. Deriváty dusíkatého yperitu podle některého z předcházejících nároků obecného vzorce I, ve kterém W znamená skupinu -COOH, tetrazol-5-ylovou skupinu nebo skupinu -CONH-aryl, ve které arylový zbytek má význam definovaný v definici C) nároku 1.
11. Deriváty dusíkatého yperitu podle nároku 1 obecného vzorce I z množiny zahrnující

a) kyselinu (S)-2-(4-/bis-(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyIamino)-4-(lH-l,2,3,4-tetrazol5-yl)máselnou a její soli,

b) kyselinu N-(4-/bis-(2-chlorethyl)amino/-3-fluorfenylkarbamoyl)-L-glutamovou a její soli,

c) kyselinu N-(4-/bis-(2-chlorethyl)amino/fenylkarbamoyl)-L-glutamovou a její soli a

d) kyselinu N-(4-/bis-(2-jodethyl)amino/fenoxykarbonyl)-L-glutamovou a její soli.
12. Derivát dusíkatého yperitu podle nároku 1 obecného vzorce I, kterým je kyselina N-(4/bis-(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl)-L-glutamová a její soli.
13. Derivát dusíkatého yperitu podle nároku 1 obecného vzorce I, kterým je kyselina N-(4/bis-(2-jodethyl)amino/fenoxykarbonyl)-L-glutamová a její soli.
14. Derivát dusíkatého yperitu podle nároku 1 obecného vzorce I, kterým je kyselina 4-/N,Nbis-(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-glutamová a její soli.
15. Způsob přípravy derivátů dusíkatého yperitu obecného vzorce I podle nároku 1 a jejich solí, vyznačený tím, že se

a) odstraní ochranné skupiny ve sloučenině obecného vzorce Ia ve kterém R¹, R², R^la, R^2a, R³, R⁴, R^5a, R^5b, R^5c, R^5d, X, Y a Q² mají výše uvedené významy a Z¹znamená výše definovaný obecný symbol Z s výhradou spočívající v tom, že když W znamená karboxylovou skupinu, potom je tato skupina přítomna v chráněné formě, která je označena jako Pr², a Pr' rovněž znamená karboxylovou skupinu v chráněné formě, která může být stejná jako Pr² nebo odlišná od Pr², načež se takto získaná sloučenina obecného vzorce I případně převede na její sůl, nebo se

-70CZ 287028 B6

b) v případě přípravy sloučenin obecného vzorce I, ve kterém W znamená následující výše definované skupiny: D), tj. skupinu -SO2NHR⁹, E), tj. skupinu -SO3R¹⁰ a F), tj. skupinu -PO3R¹⁰R¹⁰, uvede v reakci sloučenina obecného vzorce XVIIIa

NH₂

I

HOOC-CH-Z¹¹¹¹ (XVIIIa), ve kterém Z¹¹¹¹ znamená výše definovaný obecný symbol Z s výhradou spočívající v tom, že W znamená následující výše definované skupiny: D), tj. -SO2NHR⁹, E), tj. -SO3R¹⁰ a F), tj. -PO3R¹⁰R¹⁰, se sloučeninou výše definovaného obecného vzorce II (II), ve kterém R¹, R², R^la, R^2a, R³, R⁴, R^5a až R^5d, X a Y mají výše uvedené významy a L znamená odlučitelný atom nebo odlučitelnou skupinu, nebo se sloučeninou obecného vzorce V (V), ve kterém R¹, R², R^la, R^2a, R³, R⁴, R^5a až R^5d mají výše uvedené významy, za vzniku sloučeniny obecného vzorce I, ve kterém W znamená skupinu D), E) a F), načež se takto získaná sloučenina obecného vzorce I případně převede na její sůl nebo se

c) v případě přípravy sloučenin obecného vzorce I, ve kterém W znamená tetrazol-5-ylovou skupinu, uvede v reakci sloučenina obecného vzorce XVIIIb

NH₂

I

HOOC-CH-Z¹¹¹¹ (XVIIIb), ve kterém Z¹¹¹¹ znamená výše definovaný obecný symbol Z s výhradou spočívající v tom, že W znamená tetrazol-5-ylovou skupinu, se sloučeninou výše definovaného obecného vzorce II za vzniku sloučeniny obecného vzorce I, ve kterém W znamená tetrazol-5-ylovou skupinu, načež se takto získaná sloučenina obecného vzorce I případně převede na její sůl, s výhradou spočívající v tom, že do rozsahu sloučenin obecného vzorce I nespadají

-71CZ 287028 B6 kyselina 2-(2-/4-/bis-(2-chlorpropyl)amino/fenyl/acetylamino)pentandiová,

5-methylester kyseliny 2-(2-/4-/bis-(2-chlorethyl)amino/fenyl/acetylamino)pentandiové,

5 kyselina 2-(2-/4-/bis-(2-chlorethyl)amino/fenyl/acetylamino)pentandiová,

5-ethylester kyseliny 2-(2-/4-/bis-(2-chlorethyl)amino/fenyl/acetylamino)pentandiové a kyselina 2-(2-/4-/bis-(2-chlorethyl)amino/fenyl/acetylamino)-4-karbamoylmáselná.
16. Farmaceutická kompozice, vyznačená tím, že jako prekurzor léčivé látky obsahuje alespoň jeden derivát dusíkatého yperitu obecného vzorce I podle nároku 10, 13 nebo 14 nebo fyziologicky přijatelnou sůl uvedeného derivátu v kombinaci s farmaceuticky přijatelným

15 nosičem nebo ředidlem, s výhradou spočívající v tom, že do rozsahu sloučenin obecného vzorce I nespadají kyselina 2-(2-/4-/bis-(2-chlorpropyl)amino/fenyl/acetylamino)pentandiová,

20 5-methylester kyseliny 2-(2-/4-/bis-(2-chlorethyl)amino/fenyl/acetylamino)pentandiové, kyselina 2-(2-/4-/bis-(2-chlorethyl)amino/fenyl/acetylamino)pentandiová,

5-ethylester kyseliny 2-(2-/4-/bis-(2-chlorethyl)amino/fenyl/acetylamino)pentandiové a kyselina 2-{2-/4-/bis-(2-chlorethyl)amino/fenyl/acetyIamino)-4—karbamoylmáselná.
17. Dvojsložkový systém, ve kterém je jedna složka určena pro použití s druhou složkou, 30 vyznačený tím, že zahrnuje

i) první složku, kterou je protilátka nebo její fragment, které jsou schopné vázat se s daným antigenem, přičemž tato protilátka nebo její fragment jsou konjugovány s enzymem karboxypeptidázou G, který je schopen převést sloučeninu obecného vzorce I nebo její

35 fyziologicky přijatelnou sůl na cytotoxickou léčivou látku a ii) druhou složku, kterou je derivát dusíkatého yperitu obecného vzorce I podle nároku 10, 13 nebo 14 nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl, které jsou konvertovatelné působením enzymu karboxypeptidázy G na cytotoxickou léčivou látku.